سرطان یکی از شایع ترین علل مرگ و میر در جوامع بشری است و بر اساس گزارش سازمان جهانی بهداشت، مسئول حدود 13 درصد از کل مرگ و میرها در سراسر جهان محسوب می شود. سرطان پروستات شایعترین نوع بدخیمی در مردان است. سرطان پروستات یک بیماری چند عاملی است که عوامل ژنتیکی ومحیطی در آن نقش دارند(6). این نوع سرطان با الگوهای رشد هتروژن مشخص می‌شود که شامل تومور‌هایی با رشد آهسته تا آسیب‌های متاستاتیک با رشد بسیار زیاد می باشد(18). چندین مطالعه، تجمع خانوادگی از سرطان پروستات را نشان داده‌اند و دلیل اصلی برای این تجمع به ارث بردن ژن‌های درگیراست. در ایران، بیماری در 40 تا 50 درصد از مبتلایان بـه سرطان پروستات در مـراحل ابتدایی تشخیص داده می‌شود، اما صرف هزینه‌های زیاد برای پرتودرمانی، دارو درمانی و جراحی بافت مهاجم مشکلات زیادی را برای بیماران به وجود می‌آورد،  لذا جایگزین کردن روش‌ها و ترکیبات جدید کم هزینه  با اثرات  جانبی کمتر می‌تواند بسیار حائز اهمیت باشد. طی سالیان متمادی گیاهان دارویی، اساس و در برخی موارد تنها راه درمان محسوب می‌شدند (19). تاکنون گیاهان دارویی متعددی شناسایی شده‌اند که می‌توانند در حفظ سلامت بدن فرد نقش مهمی داشته از آن در مقابل انواع بیماری‌ها از جمله سرطان بدون هیچ عارضه سمی محافظت نمایند(18).  سداب ها گونه هایی از تیره سدابیا (مرکبات) از  راسته سداب (روتال = تربنتال)هستند. طبق دسته بندی علمی لینه سه نوع سداب وجود دارد: Ruta chalepensis L., Ruta graveolens L,. Ruta montana L. در کتاب معروف قانون ابن سینا، از قول دیسقوریدوس نقل شده که سداب سه نوع بیابانی، کاشتنی و کوهی دارد که احتمال دارد همان سه نوع سداب دسته بندی علمی لینه باشد به ویژه که Montana به معنای » کوهی «است(19). در مطالعه حاضر سداب مورد استفاده از نوع کاشتنی و با نام علمی Ruta graveolens L می­باشد. سداب گیاهی است چند ساله علفی، پایا به ارتفاع 30 تا 80 سانتی متر، عاری از کرک و دارای قاعده چوبی می­باشد(19). منشا اصلی سداب، نواحی جنوبی اروپا تشخیص داده شده است که امروزه با پراکندگی وسیع در غالب مناطق مدیترانه و نواحی دیگر اروپا و آسیا یافت می­شود. در ایران این گیاه، در نواحی شمال کشور به طور خود رو می­روید و در بعضی نواحی پرورش می­یابد(18). در این پژوهش اثر سایتوتوکسیک عصاره های آبی و هیدروالکلی گیاه سداب  بر روی رده سلولی پروستات DU145 با استفاده از روش MTT بررسی گردید.

مواد و روشها 

گیاه سداب (Ruta graveolens) از طریق مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان اصفهان در پاییز سال 1393 تهیه گردید و مورد تایید هرباریوم این مرکز قرار گرفت . در تاریکی در مجاورت هوا به طور کامل خشک گردید و سپس آسیاب شد (19).عصاره ی آبیبا استفاده از آب دیونیزه استریل و به روش خیساندن تهیه گردید و عصاره هیدروالکلی با استفاده از اتانول 80 درصد و به روش خیساندن آماده گردید (18) .رده سلولی DU-145 بصورت فلاسک از انستیتو پاستور ایران تهیه گردید و در محیط کشت RPMI1640 حاوی 10% سرم جنین گاوی (FBS) و تریپسین و آنتی بیوتیک کشت داده شدو در انکوباتور CO2 دار و در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه، تعویض محیط کشت هر 2 روز یکبار انجام گردید(18). تعویض محیط کشت هر 2 روز یک بار انجام گردید. اثر سیتوتوکسیک عصاره‌های تهیه شده بر روی سلول‌های سرطان پروستات انسانی با روش رنگ سنجی با استفاده از  3-(4-5dimethyl thiazoly1)-2,5 diphenyl tetraxolium bromide در مقایسه با گروه کنترل بررسی شد. این روش بر فعالیت آنزیم سوکسینات دهیدروژناز در میتوکندری سلول‌های زنده استوار است که محلول زرد رنگ MTT را به کریستال‌های نامحلول فورمازان بنفش رنگ تبدیل می‌کند، که می‌توان پس از حل کردن در DMSO با دستگاه الایزا ریدر سنجش نمود(18). بطور خلاصه 180 میکرولیتر سوسپانسیون سلولی (104×5 سلول در هر میلی لیتر محیط کشت) در میکروپلیت‌های 96 خانه کشت داده شد و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه گردید. سپس 20 میکرولیتر غلظت‌های مختلف تهیه شده از عصاره‌ها اضافه شد. دوکسوروبیسین بعنوان کنترل مثبت استفاده شد محیط کشت فاقد عصاره به عنوان کنترل مفید استفاده شد. میکروپلیت‌های حاوی عصاره و سلول در بازه زمانی 24،48،72 ساعت انکوبه گردیدند. سپس 20 میکرولیتر محلول MTT به هر چاهک اضافه گردید و به مدت 3 ساعت انکوبه گردید. 200 میکرولیتر DMSO جایگزین محیط انکوبه شده با MTT شد و برای حل کردن کریستال‌های فورمازان به آرامی پیپت گردید. جذب نوری در طول موج 560 نانومتر با دستگاه الایزا ریدر سنجیده شد. اثر غلظت هر عصاره در سه بازه زمانی ارزیابی شد. درصد بقاء سلولی در گروه کنترل منفی 100 منظور شد(19). درصد بقاء سلول‌هایی که تحت تاثیر غلظتی خاص از دارو قرار گرفته اند با تقسیم جذب چاهک های تیمار شده به جذب کنترل منفی ضربدر 100 محاسبه گردید. غلظتی از ترکیب مورد آزمایش که درصد حیات سلولی را به نصف تقلیل دهد بعنوان IC50 در نظر گرفته شد (19).

برای انجام آنالیز آماری اطلاعات گروه‌های آزمایشی مختلف از نرم افزار SPSS استفاده گردید. نتایج گروه‌های مختلف با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه، مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. از آزمون یک طرفه ANOVA برای بدست آوردن واریانس داده‌ها جهت تعیین معنی دار بودن یا نبودن اختلافات استفاده گردید. سطح معنی دار بودن اختلافات P

نتایج

مرفولوژی سلول‌های DU145: سلول‌های DU145 بلافاصله پس از قرارگیری در محیط کشت و قبل از چسبیدن به کف منظره‌ای گرد و شناور دارند. این سلول‌ها پس از 24 ساعت قرارگرفتن در محیط کشت در صورت مناسب بودن شرایط به کف فلاسک می‌چسبند و شروع به تقسیم شدن می‌کنند.

شکل 1- رده سلولی DU-145

اثر سیتوتوکسیک عصاره‌های مختلف بر سلول‌های سرطان پروستات انسانی (DU145): نمونه هایی که باعث حداقل مهار رشدی معادل 50 درصد گردیدند بعنوان نمونه های سیتوتوکسیک در نظر گرفته شدند. نتایج حاصل از این مطالعه اینگونه بیان می­کند که عصاره‌ی آبی گیاه سداب در طی 24 ،48، 72 ساعت اثر سیتوتوکسیک جزئی داشته است. چنانچه بیشترین تاثیر را در 48 ساعت در غلظت 100 و 500 میکرولیتر و 72 ساعت در غلظت 750 و 1000 میکرولیتر با حداکثر 20 درصد کاهش رشد همراه بوده است.  (نمودار1-3). عصاره‌ی هیدرو الکلی نیز مانند عصاره آبی دارای اثر جزئی بوده و بیشترین تاثیر رادر 72 ساعت با حداکثر 15 درصد کاهش رشد همراه بوده است. (نمودار4-6).

شکل 1- تأثیر همزمان دو عصاره آبی و هیدروالکلی گیاه سداب طی زمان­های 24، 48 و 72 ساعت بر رده سلولی DU-145

همانطور که در شکل 1 مشاهده می­شود، میانگین درصد بقاء سلول­های سرطانی رده DU-145 در طول زمان آزمایش، در هیچ یک از دو عصاره آبی و هیدروالکلی، به زیر 50% نرسیده است.

مقایسه دو عصاره آبی و هیدروالکلی گیاه سداب بر اساس زمان: میانگین درصد بقاء سلول­های سرطانی رده DU-145 در 24 ساعت اول و دوم در دو عصاره آبی و هیدروالکلی گیاه سداب اختلاف معنادار دارند. در 24 ساعت اول، میانگین درصد بقاء سلول­های سرطانی در عصاره هیدروالکلی کمتر است اما در 24 ساعت دوم (زمان 48 ساعت) نتیجه عکس می­شود. در زمان 72 ساعت، میانگین­های درصد بقاء در دو عصاره تفاوت معناداری ندارند. نتایج در شکل 2 قابل مشاهده است.

مقایسه دو عصاره آبی و هیدروالکلی گیاه سداب بر اساس غلظت: مقادیر میانگین و انحراف استاندارد درصد بقاء سلول­های سرطانی رده DU-145 عصاره­های آبی و هیدروالکلی گیاه سداب در پنج غلظت 100، 250، 500، 750 و 1000 میکروگرم بر میلی لیتر بررسی گردید.

شکل 2- مقایسه دو عصاره آبی و هیدروالکلی گیاه سداب طی زمان­های 24، 48 و 72 ساعت بر رده سلولی DU-145

با توجه به نتایج بدست آمده ، در هیچ کدام از غلظت­ها، میانگین درصد بقاء سلول­های سرطانی در دو عصاره آبی و هیدروالکلی گیاه سداب تفاوت معناداری ندارند. نتایج در شکل 3 قابل مشاهده­اند.

شکل 3- مقایسه دو عصاره آبی و هیدروالکلی گیاه سداب بر اساس غلظت­های مختلف بر رده سلولی  DU-145

مقایسه اثر آنتی اکسیدانی عصاره‌های آبی و هیدروالکلی گیاه سداب:

نمودار 1- بررسی اثر آنتی اکسیدانی عصاره‌های آبی و هیدروالکلی

 گیاه سداب در مقایسه با توان آنتی اکسیدانی BHT به عنوان استاندارد

مقایسه ی میزان مهار رادیکال های آزاد به روش DPPH توسط BHT، عصاره های آبی، هیدروالکلی وگیاه سداب:

نمودار 2- مقایسه IC₅₀ و فعالیت آنتی اکسیدانی BHT ، عصاره های آبی، هیدروالکلی گیاه سداب در آزمایش مهار رادیکال های آزاد DPPH

همانطور که در نمودار 2 مشاهده می­شود خاصیت آنتی اکسیدانی عصاره آبی و هیدروالکلی گیاه سداب بسیار نزدیک به BHT که یک آنتی اکسیدان قوی محسوب می­شود، می­باشد.

بحث و نتیجه گیری

با توجه به این که پیشرفت تومور ارتباط بسیار نزدیکی با التهاب و استرس اکسیداتیو دارد، ترکیبی که خواص ضد التهابی یا آنتی اکسیدانی داشته باشد، می­تواند یک عامل آنتی کارسینوژن باشد بسیاری از گیاهان و ادویه جات دارای خاصیت فارماکولوژیک و بیوشیمیایی شامل، خاصیت آنتی اکسیدانی و ضد التهاب می­باشند که به نظر می­رسد در فعالیت های آنتی کارسینوژینک و آنتی موتاژنیک دخالت دارند(1). امروزه گیاهان دارویی نقش حیاتی در درمان بسیاری از بیماری ها از جمله سرطان دارند. گیاهان تنها دیگر فقط در طب سنتی مطرح نیستند بلکه آن ها توانسته اند، یک خط صنعتی از فرآورده های طبیعی را نیز به خود اختصاص دهند(19). اغلب مشاهده شده است که مسیر های بیوسنتز فنیل پروپانوئید، فلاونوئید و تری ترپن هابه دنبال تیمار بافت گیاه یا سلولهای کشت شده با القاء کننده ها القاء می­شوند(2). .دودمان‌های سلولی متنوعی از سرطان پروستات جدا شده که می‌تواند در اولین گام‌های توسعه دودمان سرطان پروستات مورد استفاده قرار بگیرد. از جمله این دودمان‌های سلولی می‌توان به دودمان DU-145 که در سال 1979 توسط استون جداسازی شده است اشاره کرد (19). از خصوصیات مهم این دودمان این است که می‌توان آن‌ را به دو صورت کشت تک لایه و اسفروئید کشت داد.

سرعت رشد سرطان پروستات و متاستاز آن از بیماری به بیمار دیگر متفاوت است. پیشرفت این بیماری وابسته به تغییرات ژنتیکی درون تومور(18) و اندرکنش بین تومور و بخش محیطی است (19).   این در حالتی است که بسیاری از مکانیسم‌های خاص مولکولی، بصورت نامعلوم باقی مانده است. هنگامی که توده سرطانی دچار متاستاز می‌شود انتخاب روش درمانی محدود می‌شود.

در مطالعه‌ای سلول‌های DU-145 از رده سلول‌های سرطان پروستات انسانی به دو روش اسفروئید و تک لایه رشد داده شدند. سپس سلول‌های کشت اسفروئید ئر مراحل مختلفی از رشد تحت هایپرارومیا قرار گرفت و مقاومت حرارتی این سلول‌ها و سلول‌های کشت تک لایه را با توانایی تشکیل کلنی این سلول‌ها مورد سنجش قرار دادند. هرچند مقاومت حرارتی سلول‌ها بستگی به سن و در نتیجه سایز اسفروئیدها دارد، نتایج نشان داد که سلول‌های کشت اسفروئید در همه مراحل رشد نسبت به سلول‌های تک لایه مقاومت بیشتری در برابر حرارت داشته‌اند(18،19).

هدف از تحقیق حاضر، بررسی میزان مهار رشد سلول‌های رده سلولی DU-145 توسط عصاره‌های آبی، هیدروالکلی گیاه سداب بود. میزان رشد در نمونه‌های شاهد منفی 100 درصد در نظر گرفته شد و بررسی میزان رشد سلول‌ها در مجاورت 5 غلظت از عصاره‌ها صورت گرفت. نمونه‌هایی که باعث حداقل مهار رشدی معادل 50 درصد گردیدند به عنوان نمونه‌های سیتوتوکسیک در نظر گرفته شدند. نتایج حاصل از این مطالعه اینگونه بیان می­کند که عصاره‌ی آبی گیاه سداب در طی 24 ،48، 72 ساعت اثر سیتوتوکسیک جزئی داشته است. چنانچه بیشترین تاثیر را در 48 ساعت در غلظت 100 و 500 میکرولیتر و 72 ساعت در غلظت 750 و 1000 میکرولیتر با حداکثر 20 درصد کاهش رشد همراه بوده است. احتمالا وجود ترکیبات ترپنی در عصاره و کاهش میزان آن با گذشت زمان، سبب کاهش اثرات سیتوتوکسیک آن می­شود.

عصاره‌ی هیدرو الکلی نیز مانند عصاره آبی دارای اثر جزئی بوده و بیشترین تاثیر رادر 72 ساعت با حداکثر 15 درصد کاهش رشد همراه بوده است. نتایج حاصل از بررسی این دو عصاره، عدم وابستگی به زمان رانشان می­دهد.

در یک مطالعه به بررسی اثر عصاره های آبی، دی کلرومتان و متانولی ریشه کاسنی بر سرطان پروستات در شرایط آزمایشگاهی پرداخته شده است؛ این مطالعه بر روی سه دودمان سلولی سرطان پروستات(PC-3، DU-145،AT3B-1) آزمایش شده است و نتیجه حاصل نشان دهنده اثرات ضد سرطانی این عصاره ها می­باشد(19).هر چند در هر دوگیاه ترکیباتی نظیر فلاونوئید و کومارین وجود داشته ولی نتایج متفاوت بوده که این تفاوت احتمالا بدلیل وجود ترکیبات دیگر در عصاره تام گیاه سداب می باشد.

نتیجه گیری

بطور کلی عصاره‌ی آبی و هیدروالکلی گیاه سداب تا حدودی دارای اثر سیتوتوکسیک می‌باشند.از طرفی خاصیت آنتی اکسیدانی عصاره‌ی آبی و هیدروالکلی گیاه سداب به یک نسبت می باشد.