بررسی تغییرات غلظت پروتئین متالوتیونین بعنوان یک نشانگر زیستی (بیومارکر) در کرم پرتار گونه Glycinde bonhourei تحت تأثیر پدیده مانسون و برخی فلزات سنگین (مس، روی و کادمیوم) در پهنه زیر جزر و مدی خلیج چابهار

مهران لقمانی^1*، احمد سواری²، بابک دوست­شناس²، بیتا ارچنگی² و کیوان کبیری³

¹ چابهار، دانشگاه دریانوردی و علوم دریایی چابهار، دانشکده علوم دریایی، گروه زیست‌شناسی دریا

² خرمشهر، پژوهشگاه ملی اقیانوس‌شناسی و علوم جوی، دانشگاه علوم و فنون دریایی خرمشهر، دانشکده علوم دریایی، گروه زیست‌شناسی دریا 

³  تهران، پژوهشگاه ملی اقیانوس شناسی و علوم جوی 

تاریخ دریافت: 5/2/95                  تاریخ پذیرش: 17/2/96

چکیده

در میان اکثر بیومارکرهایی بیوشیمیایی که برای ارزیابی آلودگی‌های محیط‌های دریایی استفاده می‌شوند، پروتئین متالوتیونین به‌عنوان یکی از ابزارهای بسیار مهم و مفید در رابطه با شاخص‌های بیوشیمیایی فلزات به شمار می‌رود. تغییرات بیومارکر متالوتیونین در شرایط طبیعی در پرتار Glycinde bonhoureiدر ۹ ایستگاه درخلیج چابهار با در نظر گرفتن فصول پیش از مانسون، مانسون و پس مانسون و غلظت فلزات مس، روی و کادمیوم در بافت در سال ۹۳-۱۳۹۲ در منطقه زیر جزرومدی بررسی گردید. میانگین کل غلظت فلزات مس و روی و کادمیوم در پیش از مانسون به ترتیب 04/2±39/6، 51/4±95/20، 04/0± 136/0 میکروگرم برگرم وزن خشک بوده و در فصل مانسون 46/1±51/3، 65/2±84/11، 01/0±059/0 میکروگرم برگرم وزن خشک بدست آمد و در پس مانسون  44/1±98/4، 58/3±51/16، 01/0±152/0 محاسبه گردید که آزمون تحلیل واریانس یک‌طرفه میان ایستگاه‌ها و نیز بین فصول اختلافات معنی‌داری را نشان داد (05/0P<). مقادیر میانگین کل پروتئین متالوتیونین در پیش از مانسون 2/5±33/28، مانسون9/4 ±50/15و پس مانسون 37/4±39/21 میکروگرم برگرم بدست آمد که میان ایستگاه‌ها و فصول اختلافات معنی‌داری را نشان می‌دهد (05/0P<). در بررسی ارتباط فلزات با نوسانات بیومارکر با کمک آزمون پیرسون، در هیچیک از فصول و ایستگاه‌ها همبستگی معنی‌داری مشاهده نگردید. این بررسی نشان می‌دهد که تغییرات بیومارکر متالوتیونین بیش از آنکه متأثر از تغییرات غلظت فلزات سنگین باشد، می‌تواند بیشتر به دلیل شرایط زیست‌محیطی خاص این منطقه و تغییراتی است که در اثر مانسون در خلیج ایجاد می‌شود.   

واژه­های کلیدی: متالوتیونین، خلیج چابهار، مانسون، فلزات سنگین، Glycinde bonhourei 

* نویسنده مسئول، تلفن: 09151889544 ، پست الکترونیکی: Loghmani_mehran@yahoo.com

مقدمه

در سال 1960 برای اولین بار از پرتاران (گروهی از کرمهای حلقوی) به‌عنوان شاخص برای بررسی اثرات آلودگی در اجتماعات بسترهای نرم استفاده گردید (13). به دلیل قدرت تحمل بالا و توانایی تجمع آلاینده در بدن، بیشتر مطالعات بوم‌ سمیت‌شناسی پرتاران در مورد نقش آنها در انتقال آلودگی در شبکه‌های غذایی بوده است (29). پرتاران در داخل بستر یا نزدیک بستر زیست می‌کنند و دریافت‌کننده نهایی انواع آلاینده‌های آلی و غیرآلی‌اند و این موجودات به دلیل رفتار تغذیه‌ای خود (تغذیه از میان رسوبات بستر) نقش مهمی در شبکه غذایی محیط دریایی دارند که این امر سبب به گردش درآمدن مجدد آلاینده‌های ته‌نشین شده در میان رسوبات می‌گردد (14). به همین خاطر تعداد زیادی از نشانگرهای زیستی (بیومارکرها) به‌صورت بیوشیمیایی، فیزیولوژیک و پاسخ‌های رفتاری در پرتاران مورد مطالعه قرارگرفته است (10). متالوتیونین یک خانواده از پروتئین‌های غنی از سیستئین و مقاوم‌ به ‌گرما با وزن مولکولی پایین (بین 3500 تا 14000 دالتون) و فاقد ریشه‌های آروماتیک است. این پروتئین توانایی اتصال به هر دو نوع فلزات ضروری (مثل روی، مس و سلنیوم) و غیرضروری (مثل کادمیوم، نقره، جیوه و آرسنیک) را داراست. در حقیقت با اندازه‌گیری میزان متالوتیونین بعنوان بیومارکر شاخص می‌توان اطلاعاتی را در ارتباط با آلوده شدن موجود به فلزات و عملکرد بیولوژیک آن به دست آورد (20).در میان اکثر بیومارکرهایی بیوشیمیایی که برای ارزیابی آلودگی‌های محیط‌های دریایی استفاده می‌شوند، متالوتیونین‌ها (MTs) ابزارهای بسیار مهم و مفیدی به‌عنوان شاخص‌های بیوشیمیایی ویژه برای فلزات به شمار می‌روند (15) ولی از سویی دیگر گاهی نوسانات بالا در میزان دما، اکسیژن و شوری در محیط‌زیست موجودات آبزی می‌تواند سبب افزایش غلظت متالوتیونین سلولی می‌گردد که می‌بایست در مطالعات بوم‌سم‌شناسی مدنظر قرار گیرد (34). اکوسیستم آبی خلیج چابهار به‌عنوان منطقه حساس ساحلی، به دلیل قرارگرفتن در حدفاصل بین دو بوم‌سازگان خشکی و دریا از هر دو منبع، آلاینده دریافت می‌کند، همواره دو عامل مهم بر جوامع ماکروبنتیک در خلیج چابهار تأثیرگذار هستند، پدیده مانسون که تحت تأثیر تغییرات دمایی بخش مرکزی قاره‌ی آسیا و اقیانوس هند به وجود آمده و منطقه‌ی هند تا بخشهایی از دریای عمان و تنگه‌ی هرمز را تحت تأثیر خود قرار می‌دهد. این پدیده سالانه در یک دوره زمانی خاص (خرداد تا شهریور) به‌عنوان یک عامل محیطی طبیعی تغییرات شدیدی را در اکوسیستم خلیج ایجاد می‌کند و دوم که تأثیر عامل انسانی بر زیستگاه‌های آبزیان خلیج با واردکردن انواع آلاینده‌ها (برای مثال: تردد شناورها در محیط دریایی منطقه و آلودگی‌های نفتی ناشی از آنها، تأسیسات بندری و ضایعات آنها، آلودگی‌های ناشی از تخلیه و بارگیری کالا) می‌باشد. ازآنجاکه اغلب مطالعات در ارتباط با بیومارکرها، تغییرات یک فاکتور در شرایط آزمایشگاهی تحت کنترل دنبال شده در حالیکه در شرایط محیط طبیعی عوامل تأثیرگذار دیگری ممکن است باعث تغییرات بیومارکرها شوند و لذا هدف از این تحقیق بررسی اثرگذاری شرایط محیطی بر تغییرات سطوح متالوتیونین (به‌عنوان بیومارکر فلزات در سطح بیوشیمیایی) در سه دوره زمانی پیش­مانسون، مانسون و پس مانسون در پرتار  Glycinde bonhourei بوده است. فرضیه تحقیق بالا رفتن غلطت بیومارکر متالوتیونین در زمان مانسون است.

جدول 1- نام و موقعیت جغرافیایی ایستگاه‌های نمونه‌برداری در خلیج چابهار

مواد و روشها

نمونه‌برداری از رسوبات بستر به‌وسیله گرب ون-وین با مساحت 025/0 مترمربع (16) در طول سه فصل پیش­مانسون در اواخر اسفند 1392، مانسون مرداد 1393و پس­مانسون در آبان 1393 از نقاط مختلف با تعیین 9 ایستگاه در منطقه زیر جزرومدی خلیج چابهار انجام گرفت (شکل 1).

شکل 1- موقعیت ایستگاه‌های نمونه‌برداری در خلیج چابهار

سنجش فلزات سنگین (مس و روی) در پرتار Glycinde bonhourei: هضم نمونه‌های بافتی گونه پرتار G.bonhouri طبق روش سان و ژو(2007) انجام پذیرفت. نمونه‌ها را بعد از جداسازی با آب دو بار تقطیر شسته، سپس در دمای 60 درجه سانتی‌گراد قرارداده تا خشک شوند نمونه‌های خشک‌شده را به‌دقت وزن نموده و با توجه به نسبت وزنی (یک گرم بافت، 10 سی‌سی اسید) به آن اسید نیتریک غلیظ (HNO₃) اضافه گردید و در هات پلیت در دمای 100 درجه سانتی‌گراد برای مدت 2 ساعت قرارداده شدند. پس از هضم کامل نمونه‌ها به‌اندازه دو برابر حجم نمونه به آن آب مقطر دو بار تقطیر اضافه کرده و از کاغذ فیلتر واتمن 42 عبور داده و محلول فیلتر شده را برای سنجش فلزات به دستگاه جذب اتمی شعله‌ای منتقل شد.

محاسبه غلظت نهایی فلزات با استفاده از معادله زیر برحسب میکروگرم برگرم وزن خشک محاسبه گردید(2):

M=(C.V.D)W

M = غلظت فلز موجود در نمونه برحسب میکروگرم برگرم

C = مقدار فلز موردنظر (ثبت‌شده توسط دستگاه) برحسب میلی‌گرم برلیتر

V = حجم نهایی نمونه برحسب میلی‌لیتر

D = ضریب رقیق‌سازی

W = وزن نمونه خشک‌شده جهت هضم برحسب گرم

سنجش میزان متالوتیونین: اندازه‌گیری میزان متالوتیونین براساس روش تغییریافته اسپکتروفتومتری ویارگنو و همکاران (1999) انجام شد (35 و7). نمونه‌های پرتار(G.bonhouri) جداسازی شده در آزمایشگاه بلافاصله در داخل منبع نیتروژن مایع 80- قرار داده‌شده و به فریزر 80- درجه تا زمان آنالیز انتقال داده شد.

طبق پروتکل، به نمونه‌های پرتاران هموژن شده با نسبت ثابت یک گرم بافت، 3میلی‌لیتر بافری که شامل ساکاروز 5/0 مولار، 20 میلی مول اسیدکلریدریک تریس (6/8pH )، 006/0 میلی مول لئوپپتین (سیگما)، 5/0 میلی مول PMSF (سیگما) به‌عنوان عوامل جلوگیری کننده از تجزیه پروتئین و بتا-مرکاپتواتانول (سیگما) 01/0 درصد به‌عنوان یک عامل احیاء کننده اضافه شد. محلول هموژن شده در دور g 30000 برای 20 دقیقه به سانتریوفیوژ یخچال دار منتقل شد. محلولی با دو فاز تشکیل می‌شود که مایع بالایی حاوی پروتئین‌ متالوتیونین است. به ازای 1 میلی‌لیتر مایع حاوی پروتئین متالوتیونین در هر لوله 05/1 میلی‌لیتر اتانول سرد (20- درجه) و 80 میکرولیتر کلروفرم اضافه گردید. نمونه‌ها برای 10 دقیقه در دمای 4-0 درجه سانتی‌گراد در دور  g6000 سانتریفیوژ شدند. به فاز بالایی محلول سانتریوفیوژ شده 40 میکرولیتر اسیدکلریدریک 37 درصد اضافه شد و در دمای 20- درجه برای یک ساعت ذخیره و سپس برای 10 دقیقه با دور g6000 سانتریوفیوژ شد. رسوب باقی‌مانده حاوی پروتئین متالوتیونین با بافر هموژن کننده شامل اتانول 87 درصد، کلروفرم 1 درصد، شسته شدند که این امر سبب خارج ساختن تیولهای سولفید می‌گردد، سپس مجدداً سانتریوفیوژ شدند (1).

به رسوب مقدار 150 میکرولیتر محلول 25/0 مولار کلرید سدیم و 150 میکرولیتر از محلول یک نرمال اسیدکلریدریک - 4 میلی مول EDTA اضافه گردید. قبل از آنالیز با دستگاه، 43/0 میلی مول از DTNB را در بافر فسفات 2/0 مول (8 pH ) و کلرید سدیم 2 مول حل‌شده و به نمونه‌ها اضافه گردید، محلول در دمای اتاق و در محل تاریک نگهداری شد. در مرحله پایانی نمونه‌ها  در دمای اتاق برای مدت 5 دقیقه در دور g3000 سانتریوفیوژ شده و سپس توسط دستگاه اسپکتروفتومتری مدل UV-2100 در طول‌موج 412 نانومتر سنجیده شدند. برای تعیین غلظت متالوتیونین از منحنی استاندارد و مرجع گلوتاتیون (GSH) استفاده شد محلول مادر را به‌صورت 1میلی‌گرم بر میلی‌لیتر در کلرید سدیم 25/. نرمال آماده کرده و حداقل 3 استاندارد مرجع 20، 40، 80 میکرولیتر و یک شاهد از آن تهیه گردید. به هرکدام از استاندارها ولوله شاهد مقادیر مختلفی از کلرید سدیم 25/0 نرمال، مخلوط اسیدکلریدریک 1 نرمال و EDTA، محلول DTNB طبق روش کار ویارگنو و همکاران اضافه گردید. در محاسبه نهایی میزان متالوتیونین با فرض 30 درصد سیستئین صورت گرفت (35).

نتایج

تغییرات غلظت فلزات در بافت پرتار G.bonhouri:مس: در فصل پیش مانسون، میانگین تغییرات غلظت فلز مس 04/2±39/6 میکروگرم برگرم وزن خشک بوده که بیشترین مقدار در ایستگاه 1 با 1/15 و کمترین مقادیر در ایستگاه‌های 21 و 22 بترتیب 5/0 و 32/0 میکروگرم برگرم وزن خشک به‌دست آمد. آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه اختلاف آماری معنی‌داری را بین ایستگاه‌ها نشان داد (05/0P<) (شکل۲). در دوره مانسون با توجه به میانگین کل 46/1±51/3 میکروگرم برگرم وزن خشک نسبت به میانگین کل دوره قبل، تجمع فلز مس در بافت کاهش داشته است و ایستگاه‌های 21 و 22 کمترین مقادیر و ایستگاه 1 با 78/11 میکروگرم برگرم بیشترین میزان تجمع را دارا بودند. آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه اختلاف آماری معنی‌داری را بین ایستگاه‌ها نشان داد (05/0P<) (شکل۲). در دوره پس­مانسون در اغلب ایستگاه‌ها افزایش میزان فلز مس در بافت ثبت گردید و میانگین کل در این فصل 44/1±98/4 میکروگرم برگرم وزن خشک بود که نسبت به دوره مانسون افزایش داشته ولی از دوره پیش مانسون کمتر بوده است. ایستگاه 1 با 89/10 بیشترین و ایستگاه 22 با 34/0 میکروگرم برگرم کمترین مقادیر فلز مس را دارا بودند. آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه اختلاف معنی‌داری را بین ایستگاه‌ها نشان داد (05/0P<) (شکل۲).

روی: دامنه تغییرات این فلز در پرتار از 7/7 تا 2/43 میکروگرم برگرم وزن خشک متغیر بوده است.

شکل 2- مقایسه میانگین (میانگین±انحراف معیار) تغییرات غلظت فلز مس در بافت پرتار G.bonhouriدر ایستگاه‌ها و فصول مختلف. حروف مشابه نشان‌دهنده عدم معنی‌داری با یکدیگراست (05/0P>).

میانگین فلز در کل ایستگاه‌ها برابر با 51/4±95/20 میکروگرم برگرم وزن خشک به‌دست آمد. آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه اختلاف آماری معنی‌داری را بین ایستگاه‌ها نشان داد و پس‌آزمون توکی مشخص نمود که به‌جز ایستگاه‌های 20،21 و 21 که باهم اختلاف آماری معنی‌داری ندارند (05/0P>) در سایر موارد ایستگاه‌ها اختلاف آماری معنی‌داری داشتند (05/0P<)(شکل 3).در دوره مانسون دامنه تغییرات در این فصل از 24/25 در ایستگاه 15 تا 57/1 میکروگرم برگرم وزن خشک در ایستگاه 22 متغیر بود و میانگین غلظت فلز در کل ایستگاه‌ها 65/2±84/11 میکروگرم برگرم ثبت شد که نسبت به دوره پیش مانسون کاهش داشته است. آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه اختلاف آماری معنی‌داری را در سطح اطمینان 95 درصد، بین ایستگاه‌ها نشان داد (شکل 3). در فصل پس­مانسون در میانگین کل در ایستگاه‌ها 58/3±51/16 میکروگرم برگرم وزن خشک ثبت و دامنه تغییرات از 21/2 تا 92/31 میکروگرم برگرم متغیر بود که در ایستگاه‌های 2 و 22 مشاهده گردید. آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه اختلاف آماری معنی‌داری بین ایستگاه‌ها نشان داد (05/0P<) (شکل 3).

شکل 3- مقایسه میانگین (میانگین±انحراف معیار) تغییرات غلظت فلز روی در بافت پرتار G.bonhouriدر ایستگاه‌ها فصول مختلف. حروف مشابه در ستون‌های هر فصل عدم معنی‌داری با یکدیگر را نشان می‌دهد (05/0P>).

کادمیوم:در این فصل غلظت کادمیوم در بافت کرم پرتار برخی از ایستگاه‌ها بسیار پایین بود و توسط دستگاه جذب اتمی شعله‌ای قابل‌سنجش نبودند (ND). میانگین کل در این دوره برای ایستگاه‌هایی که دارای مقادیر قابل‌سنجش بودند 04/0± 136/0 میکروگرم برگرم وزن خشک بود که بیشترین مقدار در ایستگاه 2 با 165/0 میکروگرم برگرم به‌دست آمد و ایستگاه‌های 20،21 و 22 مقادیر بسیار پایینی را دارا بودند. آنالیز واریانس یک‌طرفه بین ایستگاه‌ها اختلاف آماری معنی‌داری را نشان داد (05/0P<) (شکل4).در دوره مانسون تعداد ایستگاه‌هایی که مقادیر بسیار پایینی از کادمیوم را که توسط دستگاه در بافت کل پرتار G.bonhouri قابل‌سنجش نبود (ND) به نسبت دوره پیش مانسون بیشتر بوده و ازنظر میانگین کل 01/0±059/0 میکروگرم برگرم پایین‌تر بوده است. ایستگاه 15 با 07/0 میکروگرم برگرم وزن خشک غلظت کادمیوم بالاتری داشته است. آزمون آماری اختلاف معنی‌داری بین ایستگاه‌ها نشان داد (05/0P<) (شکل4).در فصل پس­مانسون اندازه‌گیری‌ها نشان داد که میانگین غلظت کادمیوم در بافت پرتار نسبت به دوره مانسون و نیز دوره پیش مانسون افزایش داشته است (01/0±152/0 میکروگرم برگرم). ایستگاه 16 با 31/0 میکروگرم برگرم بیشترین مقدار فلز داشته و در 4 ایستگاه مقادیر بسیار پایین بود  بطوریکه توسط دستگاه جذب اتمی قابل‌سنجش نبود. آزمون آماری اختلاف معنی‌داری را بین ایستگاه‌ها نشان داد (05/0P<) (شکل4).

شکل 4- مقایسه میانگین (میانگین±انحراف معیار) تغییرات غلظت فلز کادمیوم در بافت پرتار G.bonhouriدر ایستگاه‌ها و فصول مختلف در هر فصل ستون‌های دارای حروف متفاوت اختلاف معنی‌داری را نشان می‌دهند (05/0P<). 

تغییرات بیومارکر پروتئین متالوتیونین:در فصل پیش مانسون دامنه تغییرات غلظت پروتئین متالوتیونین از 3/13 تا 63/58 میکروگرم برگرم وزن‌تر گزارش گردید که بیشترین و کمترین مقدار به ترتیب در ایستگاه‌های 15 و 17 ثبت شد. میانگین کل غلظت متالوتیونین پرتار G.bonhouri 2/5±33/28 میکروگرم برگرم وزن‌تر بوده و آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه در تفاوت آماری معنی‌داری در ایستگاه‌ها نشان داد (شکل ۵). در دوره مانسون ایستگاه 6 با 14/38 میکروگرم برگرم وزن‌تر بیشترین میزان و ایستگاه 17 با 12/4 میکروگرم برگرم وزن‌تر کمترین میزان غلظت متالوتیونین را دارا بودند. میانگین غلظت این پروتئین در این منطقه در این دوره 9/4 ±50/15 میکروگرم برگرم بوده که در مقایسه با دوره قبل از میانگین کمتری برخوردار بوده‌ است. آنالیز واریانس یک‌طرفه تفاوت معنی‌داری را میان ایستگاه‌ها نشان داد (05/0P<)(شکل ۵). در دوره پس مانسون که تغییرات زیست‌محیطی کاهش‌یافته و اصطلاحاً دوره آرامش محسوب می‌گردد، با توجه به تغییرات ایجادشده که بر ارگانیسم‌ها نیز مؤثر است، نتایج نشان می‌دهد که در اغلب ایستگاه‌ها غلظت این پروتئین افزایش‌یافته است، به‌طوریکه دامنه تغییرات آن با میانگین کل این دوره با 37/4±39/21 میکروگرم برگرم در این دوره از 7/37 میکروگرم برگرم در ایستگاه 2 تا 01/11 میکروگرم برگرم که کمترین مقدار محسوب می‌شود در ایستگاه 21 متغیر بوده است. آزمون آنالیز واریانس برای تعیین معنی‌داری تفاوت‌ها بین ایستگاه‌ها، اختلاف معنی‌داری را نشان داد (05/0P<) (شکل ۵). در مقایسه میانگین کل در سه فصل مختلف با آزمون آنالیز واریانس تفاوت معنی‌داری بدست آمد (05/0P<) که پس‌آزمون توکی این اختلاف را بین فصل مانسون و پیش مانسون نشان داد.

شکل 5- تغییرات غلظت (میانگین±انحراف معیار) پروتئین متالوتیونین پرتار G.bonhouri در ایستگاه‌ها و فصول مختلف خلیج چابهار. حروف همنام عدم معنی‌داری را نشان می‌دهد (05/0P>).

همبستگی غلظت فلزات کادمیوم- روی و مس در بافت پرتار G.bonhouri با میزان بیوسنتز متالوتیونین: در فصل پیش­مانسون همبستگی معنی‌داری میان غلظت فلزات در بافت با سطوح متالوتیونین به دست نیامد (05/0<P) ولی فلزات روی و مس بافت در این فصل همبستگی مثبت متوسطی را با غلظت متالوتیونین نشان دادند که این روند را در دو فصل دیگر مانسون و پس­مانسون ما شاهد هستیم (جدول 2) و تغییرات مقادیر فلزات در بافت پرتار در ایستگاه‌ها و فصول مختلف ارتباط مثبت با منفی معنی‌داری با یکدیگر نداشتند (05/0<P). در شکل 6 نمودار همبستگی میان غلظت‌های فلزات سنگین در کل فصول با غلظت‌های متالوتیونین قابل‌ملاحظه است.

جدول 2- همبستگی پیرسون غلظت فلزات مس و روی و کادمیوم در بافت پرتار G.bonhouriبا غلظت متالوتیونین در سه دوره زمانی

شکل 6- نمودار رگرسیونی غلطت فلز مس و روی در بافت با مقادیر متالوتیونین پرتار G.bonhouri در کل فصول

بحث

بسیاری از مطالعاتی که برای استفاده از متالوتیونین‌ها به‌عنوان بیومارکر فلزات انجام پذیرفته در شرایط آزمایشگاهی و بکار بردن غلظت‌ فلزات در مقادیر بالا و غیرمعمول بوده است که با مقادیر فلزات در شرایط محیط طبیعی فاصله بسیاری دارد (30). اگرچه بسیاری از مطالعات نشان می‌دهد که القاء بیومارکر متالوتیونین در مهره‌داران و بی‌مهرگان بوسیله فلزات صورت می‌گیرد، ولی فاکتورهای زیستی و غیرزیستی محیطی دیگری غیراز فلزات مثل جابجایی، گرسنگی، کمبود اکسیژن، دما و شوری، چرخه تولیدمثلی، اندازه و وزن در سنتز متالوتیونین مؤثر می‌باشند (3 و 23).

بررسی نتایج، الگوی تغییرات میزان غلظت فلز مس در کل دوره و در فصول مختلف را به‌صورت پیش­مانسون>پس­مانسون> مانسون نشان داد. فصل پیش­مانسون با 49/5 میکروگرم برگرم بیشترین مقدار را در خلیج دارا بوده است. درحالیکه مقادیر فلز روی در بافت پرتار نتایج مشابهی داشته و به‌صورت پیش­مانسون>پس­مانسون> مانسون بوده است. در فصل پیش­مانسون میانگینی برابر 40/21 میکروگرم برگرم برای فلز روی به‌دست آمد، اما برای فلز کادمیوم نتایج متفاوت بوده و مقادیر پایینی ثبت شد. بطوریکه در برخی ایستگاه‌ها (22 و 23) مقادیر از حد تشخیص دستگاه در هر سه دوره پایین‌تر بوده است که نشان‌دهنده عدم تأثیرپذیری محیط از منبع آلاینده است. میانگین‌ها در فصول برای این فلز به‌صورت پس­مانسون>پیش­مانسون>مانسون بوده است که فصل پس­مانسون با 14/0 میکروگرم برگرم بیشترین مقدار را دارا بود. در این فصل ثبت مقدار 31/0 میکروگرم برگرم از ایستگاه 16 که بالاترین مقدار ثبت‌شده در کل دوره‌ها بوده، سبب فاصله گرفتن میانگین این فصل از دو فصل دیگر شده است و سبب شده تا آزمون آماری تفاوت معنی‌داری را نشان دهد (05/0>P). تجمع فلزات مس و روی نیز در نمونه‌های آنالیز شده در ایستگاه‌های 21 و 22 کمترین مقادیر را دارا بوده‎ است و با توجه به نتایج آنالیز فلزات رسوبات در این نقاط می‎توان گفت این ایستگاه‌ها از تجمع آلاینده‌‎های کمتری نسبت به سایر ایستگاه‌ها برخوردارند. جنس بستر (شنی ریز) و عدم ریزش پساب‌ها در این ایستگاه‌ها می‌تواند دلیل این مسأله باشد. از طرفی دیگر تفاوت در میان ایستگاه‌ها به میزان تغذیه پرتار ارتباط دارد. در بسترهایی که تجمع رسوب کمتری داشته باشند فلزات کمتری وارد بدن پرتار می‎شود. پرتار G. bonhourei رژیم غذایی کف‌خواری و همه چیزخواری دارد. همچنین تجمع در بدن پرتار به فاکتورهای مختلفی مثل متابولیسم، شرایط محیطی آلاینده‌ها و فاکتورهای غیرزیستی دیگر ارتباط دارد (27). در مطالعه یوداکومار و همکاران (2011) در بررسی فلزات مس، کادمیوم و روی در پرتار Glycer longipinisغلظت برای هر سه فلز در فصول به‌صورت پیش­مانسون>پس­مانسون>مانسون بوده است که مشابه تحقیق حاضر در مورد فلز مس و روی می‌باشد. در این تحقیق برای فلز مس دامنه 08/27-21/2 و فلز روی 30/82-84-42 و کادمیوم 38/1-04/0 میکروگرم برگرم گزارش نمودند که بالاتر از میانگین غلظت‌ها در مطالعه حاضر (مس 2/15-1/0 و روی 2/43-57/1 و کادمیوم 31/0-03/0 میکروگرم برگرم (مقادیر قابل‌تشخیص دستگاه) بوده است. تجمع فلز در پرتار به مقدار فلز تجمع یافته در رسوب و میزان تغذیه کرم بستگی دارد که در مطالعه یوداکومار و همکاران (2011) نیز به این نکته اشاره‌شده است. این محققین علت تجمع بالای فلزات در پرتار و رسوبات منطقه را ورود حجم زیادی از پساب‌های خانگی و کارخانجات صنعتی و پالایشگاه‌های اطراف سواحل ذکر کرده‏اند. دورا و همکاران (2007) در بررسی غلظت فلزات سنگین مس و کادمیوم در پرتار Hediste diversicolorمیانگین 05/0 میکروگرم برگرم وزن‌تر برای کادمیوم و 15/10 برای مس به‌دست آوردند که مقادیر آنها در رسوب به‎ترتیب 27/0 و 70/27 میکروگرم برگرم بوده در جدول 3 مقادیر فلزات سنگین در پرتار G.bonhouri خلیج چابهار با پرتاران سایر نقاط دنیا مقایسه شده است.

جدول 3- مقایسه مقادیر فلزات سنگین(μg.g^-1) در پرتار G.bonhourei. خلیج چابهار با پرتاران سایر نقاط دنیا

در مقایسه با سایر نقاط، مقادیر میانگین غلظت‌های فلزات مس و روی در مطالعه حاضر در هر سه دوره پایین‌تر از مقادیر ثبت‌شده از پرتاران مناطق دیگر دنیا بوده است که می‎تواند با توجه به نتایج ذکرشده عوامل مؤثری همچون متفاوت بودن گونه، رژیم تغذیه‌ای، اثرات فصل و میزان دسترسی زیستی آلاینده‌ها را برای آن ذکر نمود. تغییرات فصلی-زمانی بر شکل جریان، دما و ایجاد آشوب در محیط دریایی اثر گذاشته که سبب تفاوت‌ها در تجمع فلزات و اثر بر چرخه حیات و تولیدمثل اجتماعات بنتیک می‌شود (5)، در بررسی ایستگاهی مشخص شد که ایستگاه‌های 1 و 15 (اسکله‎های هفت‌تیر و کلانتری) بیشترین میزان غلطت فلزات را در هر سه دوره داشته و میانگین کلی و دامنه تغییر برای آنها به‎ترتیب برای مس (2/15-89/10)6/12 و (5/12-2/7) 66/9 میکروگرم بر گرم و برای فلز روی (2/43-2/18)24/28 و (24/25-12) 65/19 بوده است. مقادیر فلز مس از میانگین به‌دست‌آمده در دریای Barents و Plentzia بالاتر بوده که با توجه به بالا بودن مقادیر فلزات سنگین در رسوبات اسکله‎ها می‎توان دسترسی زیستی را عامل مؤثرتری در خلیج چابهار دانست. میانگین ثبت‌شده برای فلز کادمیوم در فصول پیش­مانسون و مانسون پایین‌تر از مقادیر بدست آمده در سایر نقاط می‎باشد و فقط در فصل پس­مانسون دارای میانگین بالاتری نسبت به خورهای Bidasoa بوده است. در این فصل ایستگاه 16 دارای میانگین ثبت‌شده 31/0 بوده که اختلاف معنی‌دار و فاصله عددی زیادی با ایستگاه‌های دیگر داشته است. با توجه به اینکه ایستگاه مذکور در خارج از اسکله کنارک بوده و مقادیر فلزات رسوبات در آن کمتر بوده و منبع آلاینده شدیدی ندارد، احتمالاً خطای نمونه‎برداری و سنجش بی‌تأثیر نبوده است. به طوریکه با حذف این مقدار از داده‌ها علاوه بر نزدیک شدن نرمال شدن داده‌ها ، میانگین کل این فصل 09/0 میکروگرم برگرم خواهد بود که پایین‌تر از مقادیر ثبت شده سایر نقاط دنیا است. چرخه زیستی، وزن و استراتژی تغذیه در میزان جذب فلز کادمیوم توسط پرتار نیز اثرگذار است (28) و سبب تغییرات در میزان فلزات رسوب و بدن موجود می‌گردد.

تغییرات سطوح بیومارکر پروتئین متالوتیونین(MT) در پرتار G. bonhourei:در استفاده از بیومارکرها همواره تفاوت‎های اساسی در نتایج بدست آمده از اثرات کوتاه مدت آزمایشگاهی تا اثرات بلندمدت در شرایط محیطی در موجودات وجود دارد (8). بیومارکرها معمولاً برای یک نوع آلاینده در زمانی خاص قابل استناد هستند در حالیکه در شرایط محیطی ممکن است موجود همزمان تحت اثر چندین استرس باشد (17). برای مثال کاسون در سال 2000 در مطالعه‎ای آزمایشگاهی گونه دوکفه‌ای Crassostera gigas را در معرض چند فلز (کادمیوم، مس، روی، جیوه و نقره) قرارداد و در تمام فلزات همبستگی معنی‌داری بین فلز و متالوتیونین بدست آمد. درحالیکه در مطالعه میدانی توسط پلرین و آمیارد (2009) در بررسی اثرات فلزات جیوه، کادمیوم، مس و روی بر میزان القاء متالوتیونین در دوکفه‎ای Mya arenariaدر دو منطقه آلوده و غیرآلوده، تنها فلز کادمیوم در منطقه آلوده همبستگی معنی‌دار مثبت را نشان داد. بنابراین در چنین مواقعی که احتمال تأثیر چندین نوع استرس وجود دارد، استفاده از پایشگرهای زیستی پیشنهاد می‌گردد (19). نتایج بدست آمده از بررسی سطوح غلظت‌های پروتئین متالوتیونین در بافت پرتار G.bonhourei در فصول مختلف در خلیج چابهار تفاوت‎های معنی‌داری بین فصل مانسون و دو فصل دیگر نشان داد. طبق نتایج به‎ترتیب مقادیر متالوتیونین در فصول پیش­مانسون>پس­مانسون>مانسون بیشتر بوده که میانگین‌های آنها شامل: پیش­مانسون 08/5±87/28، مانسون 94/4±50/15 و در پس­مانسون 41/3±39/21 میکروگرم برگرم وزن‌تر بوده است. مقدار خطای استاندارد در فصل مانسون نشان‎دهنده پراکنده بودن مقادیر ثبت‌شده در این دوره است. محققین زیادی تغییرات فصلی غلظت‌های متالوتیونین را در بی‌مهرگان دریایی گزارش داده‎اند ازجمله: بادوریمونت و همکاران (1997)، حمزه-چافای و همکاران (1999)، سرا و همکاران (1999)، ببیانو و همکاران (2000)، راسپور و همکاران (2004)، جفارد و همکاران (2005) و نهایتاً تغییرات فیزیولوژیک و محیطی را دارای بیشترین تأثیر در نوسانات MT گزارش نموده‌اند. در بررسی ایستگاه‌ها در فصل پیش­مانسون اختلاف معنی‌داری میان ایستگاه‌ها مشاهده گردید و ایستگاه‌های 1 و 15 با مقادیر 97/41 و 63/58 میکروگرم برگرم وزن‌تر با سایر ایستگاه‌ها اختلاف معنی‌داری داشته‌اند. به‌طورکلی ایستگاه‌هایی که در بخش شمالی خلیج قرار داشتند، از سطوح متالوتیونین پایین‎تری برخوردار بودند. در فصل مانسون که فاکتور غالب آن آشفتگی زیست‌محیطی است، ایستگاه 1 و 6 با 21/36 و 14/38 میکروگرم برگرم بیشترین مقادیر غلطت متالوتیونین را دارا بودند. در این فصل نیز ایستگاه‌های بخش‌های شمالی و جنوب‌غربی تفاوت معنی‌داری را با ایستگاه‌های جنوب‌شرقی داشتند و هرچقدر از سمت جنوب­شرق خلیج به سمت جنوب­غربی پیش‌روی شد، از مقدار متالوتیونین کاسته شد. در دوره پس­مانسون نسبت به فصل قبل، مقادیر متالوتیونین در اغلب ایستگاه‌ها افزایش داشته و ایستگاه‌ها با یکدیگر اختلافات معنی‌داری نشان دادند که تفاوت زیاد در دامنه تغییرات مقادیر غلظت‌های پروتئین در ایستگاه‌ها را نشان می‎دهد. ایستگاه‌های 2 و 1 با 7/37 و 15/31 بیشترین غلظت پروتئین را در این فصل دارا بودند و همانند دو فصل قبل ایستگاه‌های بخش‌های شمالی خلیج چابهار از مقادیر پایین‌تری برخوردار بودند. تنها مطالعه‎ای که در ایران در مورد این بیومارکر در بی‌مهرگان آبزی صورت گرفته مربوط به مطالعه عظیمی و همکاران (1391) در مورداستفاده از متالوتیونین به‌عنوان نشانگر زیستی فلزات سنگین (جیوه، مس، سرب و کادمیوم) در دوکفه‎ای Crassostra gigasدر بندر امام خمینی بوده که در این مطالعه مقادیر متالوتیونین از 49/7±67/141 تا 34/7±75/184 میکروگرم برگرم متغیر بوده است. در این مطالعه مقادیر مس و سرب برخلاف کادمیوم در بافت از حد استاندارد بالاتر بوده است (به ترتیب550 و 440 میکروگرم برگرم)، اما همبستگی معنی‌دار با متالوتیونین نداشته‌اند. این پروتئین درنهایت به‌عنوان بیومارکر کادمیوم در این منطقه برای این دوکفه‌ای معرفی شد. طبق نتایج مطالعات لادهار-چابونی  و همکاران (2012) و آمیارد و همکاران (2008) فاکتورهای زیستی و غیرزیستی در برخی موجودات اثرات قابل‌توجهی بر سطوح غلظت‌های متالوتیونین می‌گذارند که ممکن است باعث سردرگمی در تحلیل نتایج سم‌شناسی غلظت‌های این پروتئین در محیط طبیعی گردد و به همین دلیل نتایج بدست آمده در یک‌گونه یا در یک منطقه برای بیومارکر قابل‌تعمیم به همه مناطق نیست. ارتباط تغییرات سطوح متالوتیونین G.bonhourei با فلزات کادمیوم، مس و روی ازجمله فلزاتی بوده که سبب القاء بیوسنتز پروتئین متالوتیونین در بدن بی‌مهرگان و مهره‎داران می‌شوند (26). در بررسی نتایج همبستگی اسپیرمن در فصول مختلف در هیچ‌یک از فصل‌های پیش­مانسون، مانسون و پس­مانسون همبستگی معنی‌داری میان غلظت‌های فلزات مس، روی و کادمیوم در بافت و رسوب با نوسانات مشاهده‌شده در غلظت‌های متالوتیونین بدست نیامد. این امر می‌تواند بیانگر تأثیر برخی دیگر از فاکتورهای زیست‌محیطی(مثل دما، شوری و وزن) بر تغییرات سطوح متالوتیونین باشد. پویریر و همکاران (2006) در مطالعه خود ارتباط معنی‌داری میان پروتئین متالوتیونین و فلزات سنگین (Cd, Zn, Pb, Ag) در کرم پرتار Nereis diversicolorدرخور بدست نیاوردند، لذا متالوتیونین را بیومارکر مناسب نداشتند. همچنین لیو و وانگ (2011) در مطالعه خود در دوکفه‌ای اسکالوپ به دلیل نوسانات غلظت‌های متالوتیونین در غلظت‌های مختلف کادمیوم این بیومارکر را در دوکفه‎ای فوق‌الذکر برای پایش محیطی مناسب ندانسته و اثرات دما، تغذیه و اندازه را تأثیرگذار دانسته‎اند. لازم به ذکر است مقادیر دو فلز مس و روی در بافت در دو فصل پیش­مانسون و پس­مانسون با پروتئین همبستگی متوسطی (50<r<40) را نشان دادند ولی فاقد معنی‌داری بوده‎اند. بررسی ایستگاه‌ها در فصل پیش­مانسون برای فلز روی نشان می‎دهد، میزان تجمع این فلز در بافت پرتار G.bonhourei در ایستگاه 15 کمتر از ایستگاه 1 بوده ولی ازنظر مقادیر غلظت متالوتیونین مقادیر آن در ایستگاه 15، 63/58 میکروگرم برگرم و در ایستگاه 1، 97/41 میکروگرم برگرم بوده و یا در ایستگاه 16 مقدار غلظت فلز در این ایستگاه از ایستگاه‌های 2 و 6 و 17 و 20 و 22 بالاتر بوده اما غلظت متالوتیونین کمتری ثبت شده است. همچنین در مورد فلز مس در این فصل ایستگاه 1 و 15 ازنظر مقادیر غلظت‌های مس و متالوتیونین برخلاف یکدیگر بودند. در برخی از ایستگاه‌های دیگر مثل 21 و 22 که کمترین میزان تجمع فلز مس را داشته‌اند، مقادیر غلظت‌های پروتئین القاء شده در آنها بیشتر از ایستگاه‌های 16 و 17 است. این در حالیست که ایستگاه‌های 21 و 22 ازنظر مقادیر غلظت‌های فلز در بافت کمترین مقادیر را دارا بودند. در این دوره میانگین غلظت‌های متالوتیونین نسبت به فصول دیگر اختلاف معنی‌داری داشت و علی‌رغم ثبت کاهش غلظت‌های هر دو پارامتر فلزات و پروتئین متالوتیونین نسبت به فصل قبل، همبستگی معنی‌داری بین آنها مشاهده نگردید. در این فصل هم تغییرات نامنظم بین مقادیر پروتئین و غلظت فلزات در ایستگاه‌ها مشاهده گردید. مثلاً ایستگاه‌های 21 و 22 کمترین میزان فلز روی را در بافت داشتند ولی مقادیر پروتئین در آنها بالاتر از ایستگاه‌ها 16، 17 و 20 بوده است. یا ایستگاه 15 که بیشترین مقدار فلز روی را در بافت نشان داد، غلظت متالوتیونین کمتری از ایستگاه‌های 1 و 6 داشته است. در مورد فلز مس و کادمیوم هم این شرایط وجود داشته است، برای مثال در مورد فلز مس مقادیر غلظت فلز در دو ایستگاه 2 و 6 کمتر از ایستگاه 15 بوده ولی نسبت به آن مقادیر بسیار بالا و معنی‌داری از متالوتیونین در بافت ثبت گردید که تغییرات مشابهی برای فلز کادمیوم نیز بدست آمد. بنابراین در این فصل هم تغییرات پروتئین در ایستگاه‌ها نمی‌تواند تنها متأثر از فلزات سنگین باشد. در دوره پس­مانسون باوجود همبستگی مثبت متوسط میان دو فلز روی و مس در بافت با متالوتیونین، اما آزمون همبستگی معنی‌دار نبوده است که نشان‎دهنده وجود ایستگاه‌هایی است که تغییرات متفاوتی همانند فصول قبل داشته‌اند. فلز مس در ایستگاه 2 دارای بیشترین مقدار متالوتیونین در بافت می‎باشد (7/37 میکروگرم برگرم) ولی ازنظر مقدار غلظت فلز از ایستگاه‌های 1 و 15 کمتر است در مورد ایستگاه‌های 6 و 16 نیز شرایط مشابهی وجود دارد. فلز روی و کادمیوم در این فصل مانند مس تغییرات متفاوت بین ایستگاهی را نشان می‎دهند، ایستگاه 1 مقدار متالوتیونین بالاتری نسبت به ایستگاه 6 داشته ولی ازنظر غلظت فلز روی در بافت ایستگاه 6 مقادیر بالاتری نسبت به ایستگاه 1 دارا بود. ایستگاه‌های 21 و 22 کمترین مقادیر فلزات روی، مس و کادمیوم و متالوتیونین را در این فصل داشتند. پلارین و آیمارد (2009) اثر تغییرات فصلی را در میزان القاء متالوتیونین در دوکفه‎ای Mytilus galloprovincialis در سواحل ایتالیا مطالعه کرده که طبق نتایج فصول اختلاف معنی‌داری گزارش شد. نتایج این مطالعه همانند مطالعه حاضر است. این محققین تغییرات بین فصول را ناشی از تغییرات فیزیولوژیکی موجود مثل کاهش دسترسی به غذا دانسته‌اند. در مطالعه حاضر در فصل مانسون به‎دلیل شرایط نامساعد محیطی و ناپایداری بستر و استرس شدید محیطی احتمالاً بر روند تغذیه پرتار اثرگذار بوده است. این امر می‌تواند یکی از دلایل کاهش معنی‌دار غلظت‌های متالوتیونین در مانسون باشد. موبیانا  و همکاران (2005)، آمیارد و همکاران (1996)، وانگ و همکاران (1999) نیز به نتایج مشابهی اشاره کرده‏اند. جدول4 نتیجه بررسی برخی ز مطالعات میدانی پرتارانی که فلزات مس، روی و کادمیوم در آنها القاکننده پروتئین متالوتیونین بوده یا نبوده را نشان می‌دهد. طبق این جدول در اکثر گونه‌ها همانند مطالعه حاضر، فلزات در شرایط محیطی القاء کننده متالوتیونین و درنتیجه برای آن فلزات بیومارکر محسوب نمی‌گردند.

جدول 4- نتایج بررسی پرتاران در شرایط محیطی برای القاء پروتئین متالوتیونین