اثر روی­کلراید بر رفتار­های اضطرابی و افسردگی موش­های صحرایی اواریکتومی شده در دوره قبل از بلوغ 

پوران قهرمانی^*، هومن اسحق هارونی، سید رضا فاطمی طباطباییو احمدعلی معاضدی

اهواز،دانشگاهشهیدچمراناهواز، دانشکدهعلوم، گروهزیست‌شناسی

تاریخ دریافت: 8/7/95                  تاریخ پذیرش: 1/3/96

چکیده

در تحقیقات قبلی نشان داده‌شده که روی­کلراید اثر ضد اضطرابی متفاوتی در موش­های نر و ماده گنادکتومی شده بعد از بلوغ دارد. لذا این تحقیق به بررسی اثر روی­کلراید بر اضطراب و افسردگی در موش­های بالغ اواریکتومی شده قبل از بلوغ پرداخته است. در این آزمایش 50 سر موش ماده در روز 22-21 پس از تولد اواریکتومی شدند و در روز 75 پس از تولد، نیم­ساعت قبل از تست اضطراب (دستگاه ماز بعلاوه مرتفع) و تست افسردگی (آزمون شنای اجباری) روی­کلراید صفر، 5، 10، 20 میلی­گرم/کیلوگرم به‌صورت درون صفاقی دریافت کردند. اواریکتومیدرصد زمان حضور در بازوی باز را بطور معنی­داری در گروه اواریکتومی شده نسبت به گروه شاهد آن کاهش داد (05/0P<). افزایش معنی­داری در درصد تعداد ورود به بازوی بازبین گروه اواریکتومی صفر میلی­گرم/کیلوگرم و گروه دریافت کننده روی­کلراید 5 میلی­گرم/کیلوگرم مشاهده شد (05/0P<). گروه اواریکتومی ازنظر تأخیر در توقف اولیه و زمان بی­تحرکی کل نسبت به گروه شاهد آن اختلاف معنی­داری نداشت. کاهش معنی­داری ازنظر تأخیر در توقف اولیه بین گروه اواریکتومی صفر میلی­گرم/کیلوگرم و روی­کلراید10 و 20 میلی­گرم/ کیلوگرم وجود دارد (05/0P<). همچنین بین گروههای ذکرشده ازنظر زمان بی­تحرکی کل افزایش معنی­داری نسبت به گروه اواریکتومی صفر میلی­گرم/کیلوگرم مشاهده گردید (05/0P<، 01/0P<). یافته­های این تحقیق نشان می­دهند که اواریکتومی میزان اضطراب را افزایش می­دهد اما این افزایش اضطراب با افسردگی همراه نیست. تزریق روی­کلراید اثر ضداضطرابی و افسردگی را نشان داد. بنابراین بنظر می­رسد روی­کلراید تأثیر متفاوتی بر رفتار افسردگی اواریکتومی شده­های قبل و بعد از بلوغ داشته باشد.

واژه­های کلیدی: اضطراب، اواریکتومی، قبل از بلوغ، گنادکتومی، روی­کلرید

* نویسنده مسئول،  تلفن: 06133331045 ، پست الکترونیکی:  p.ghahramani1393@gmail.com

مقدمه 

اضطراب شامل ترس یا احساس نگرانی است (23). حدود 500 میلیون نفر از مردم جهان از اختلال اضطراب رنج می‍برند (13). افسردگی یک اختلال شایع و مزمن و مکرر، با برخی خصوصیاتی نظیر کاهش شناخت است و واکنش­های عاطفی را با سطح بالا به بیماران و سیستم درمانی تحمیل می­کند (23 و 15). معادل 85 درصد افرادی که از افسردگی عمده رنج می­برند دارای اضطراب نیز هستند (11). زنان بیش از دو برابر مردان به اختلالات خلقی مبتلا می­شوند. مطالعات نشان داده که زنان بیشتر اختلالات اضطراب و افسردگی را در دوره تغییرات هورمونی مانند بلوغ، یائسگی و دوره بعد از زایمان تجربه می­کنند (16). افسردگی اغلب با اختلال اضطراب همراه است (10)، چندین گزارش اخیراً فعالیت ضدافسردگی و ضداضطرابی روی را در هر دو مطالعات بالینی و پیش کلینیکی نشان داده­اند و امیدوارند برای درمان روی در بیمارانی که از اضطراب و یا بیماری­های همراه اضطراب و افسردگی رنج می­برند، استفاده شود ( 29،28،19 و 17). بسیاری از مطالعات بالینی کاهش غلظت روی خون (سرم، پلاسما) را در بیماران افسرده نشان می­دهند (24). به‌رغم تفاوت اندکی بین مطالعات اخیر (که برای مثال، همبستگی منفی میان شدت افسردگی و غلظت روی را در همه آنها نشان نمی­دهد)، متاآنالیز اهمیت غلظت پایین روی خون را در پاتولوژی افسردگی نشان می­دهد (27). مطالعات بالینی شواهد مهمی مبنی بر اثرات روی درمانی در تقویت درمان ضدافسردگی ارائه می­دهند (27 و 14). با توجه به اینکه در مطالعات قبلی اثر روی­کلراید بر رفتار اضطرابی موش­های بالغ گنادکتومی و اواریکتومی شده بررسی گردید و ارتباط هورمونهای جنسی با اضطراب و نیز اثرات متفاوت روی­کلراید در موش­های نر و ماده را نشان داد (4،2 و 3)، مطالعه حاضر به بررسی اثر تزریق روی­کلراید بر اضطراب و افسردگی در موش­های بالغ اواریکتومی شده قبل از بلوغ پرداخته است.

مواد و روشها

در این مطالعه از تعداد 15 سر موش صحرایی ماده و 5سر موش صحرایی نر با وزن تقریبیgr 25±225استفاده گردید.موش­ها از مرکز پرورش حیوانات آزمایشگاهی دانشکده دامپزشکی اهواز تهیه و در قفس­های پلکسی­گلاس تحت شرایط کنترل‌شده آزمایشگاهی با دمای ثابت 2±22درجه سانتی­گراد مجهز به سیستم 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی، همراه با تهویه مناسب در همان مرکز نگهداری شدند. در طول مدت نگهداری و آزمایش، حیوانات بدون محدودیت به آب‌لوله‌کشی شهر و غذای مخصوص فشرده (پلت) دسترسی داشتند. هر 3 سر موش ماده به همراه یک موش نر در یک قفس قرارگرفتند. موش­های نر،بیش از دو دوره سیکل استروس (14 روز) در کنار موش­های ماده قرارگرفته و سپس از موش­های ماده جدا شدند. موش­های ماده در روز 17 پس از جفت­اندازی به قفس­های انفرادی انتقال داده شدند. زاده­ها در روز 21 به دنیا آمدند. در 22-21 روز پس از تولد زاده­ها از مادر جدا و برای جراحی به آزمایشگاه منتقل شدند. مخلوطی از کتامین (100 میلی­گرم/کیلوگرم) و زایلازین (25 میلی­گرم/کیلوگرم) به‌عنوان داروی بیهوشی 1 میلی­لیتر/ کیلوگرم به ازاء وزن موش تزریق شد. بعد از بیهوشی کامل، محل جراحی با بتادین ضدعفونی شد. سپس در قسمت شکمی یک سانتی‌متر بالاتر از آلت تناسلی برشی افقی زده شد، و تخمدان­ها از محل موردنظر خارج شدند و محل جراحی با نخ بخیه دوخته شد. در آخر کار هم مجدداً محل جراحی با بتادین ضدعفونی­شد. بعد از بهبودی کامل، آنها علامت‌گذاری می­شدند و به خانه حیوانات منتقل و تا75 روزگی از آنها نگهداری می­شد. در زمان بلوغ به 6 گروه زیرتقسیم شدند: (گروه کنترل، گروه شاهد(حلال سالین)، 4 گروه اواریکتومی( صفر، 5، 10 و20 میلی­گرم در هر کیلوگرم روی­کلراید)). روی­کلراید به‌صورت درون صفاقی نیم­ساعت قبل از تست  تزریق می­شد (2). سپس آزمون اضطراب با استفاده از ماز بعلاوه مرتفع و آزمون افسردگی به روش شنای اجباری گرفته می­شد. لازم به ذکر است که موش­های هر گروه از زاده­های مادران مختلف انتخاب شدند.

سنجش اضطراب: دستگاه ماز بعلاوه مرتفع به‌عنوان یک مدل غیرشرطی جهت تولید و سنجش اضطراب در جوندگان محسوب می­گردد. اجزای تشکیل‌دهنده این دستگاه شامل دو بازوی باز و دو بازوی بسته مقابل هم می­باشند. هر چهار بازو دارای سقف باز می­باشند. طول هر بازو40 سانتی­متر و پهنای آن 10 سانتی­متر می­باشد. بازوهای بسته دارای دیواره­ای به ارتفاع 40 سانتی­متر می­باشندو در مرکز نیز مربع 10×10 سانتی­متر بازوها را به هم مرتبط می­کند. دستگاه به میزان 50 سانتی­متر از سطح زمین ارتفاع داشته و5/1 متر بالاتر از آن‌یک لامپ 20 واتی با پردازش نوری یکنواخت قرارگرفته استدر ابتدای آزمون هر حیوان به‌گونه‌ای درون دستگاه قرارداده می­شد که سر آن به‌طرف بازوی بسته قرارداشته باشد و سپس به حیوان اجازه داده می­شد به مدت 5 دقیقه در دستگاه گردش کند. جهت جلوگیری از یادگیری هر حیوان تنها یک‌بار تست می­گردید (5).  پس از هر آزمون، دستگاه توسط پنبه و الکل تمیز و خشک می­گردید تا آثار به‌جامانده از هر حیوان در آزمون حیوان بعدی تداخلی ایجاد نکند. قبل از انجام تست به‌منظور افزایش رفتارهای اکتشافی حیوان، هر موش به مدت 5 دقیقه در جعبه چوبی با ابعاد 50×50 سانتی­متر قرارمی­گرفت. معیارهای موردسنجش در آزمون اضطراب درصد ورود به بازوی باز (OAE) (Open Arm Entries) و درصد زمان حضور در بازوی باز (OAT) (Open Arm Time) بودند. 

100 ×  مدت زمان حضور در بازوی بسته + مدت زمان حضور در بازوی باز / مدت زمان حضور در بازوی باز =  %OAT 

100 × تعداد ورود به بازوی بسته + تعداد ورود به بازوی باز /  تعداد ورود به بازوی باز = %OAE 

تمام حیوانات در فاصله زمانی 9 صبح تا 2 ظهر مورد تست اضطراب قرارگرفتند و شرایط محیط آزمون برای آنها یکسان فراهم گردید. بعدازاینکه تمامی حیوانات هر گروه (منظور زاده­های که به سن 75 روزگی رسیده بودند) موردسنجش تست اضطراب قرارمی­گرفتند، بلافاصله مرحله آموزش تست افسردگی شروع می­شد.

سنجش افسردگی: آزمون شنای اجباری برای سنجش میزان افسردگی حیوان مورد استفاده قرارمی­گیرد. در ابتدا موش­ها به‌صورت انفرادی، به مدت 15 دقیقه در یک مخزن استوانه­ای (جنس پلی وینیل کلراید) به ابعاد 40×20 سانتی­متر حاوی آب تمیز به عمق 25 سانتی­متر و دمای25 درجه سانتی­گراد قرارگرفتند. 24 ساعت بعد به مدت 5 دقیقه مورد آزمایش قرارگرفتند و زمانی که حیوان برای اولین بار بدون حرکت می­ماند، تأخیر در توقف اولیه و مجموع زمان­های بی­تحرکی یا زمان بی­تحرکی کل، به‌عنوان شاخص­های رفتارهای افسردگی ثبت شد. هرچه میزان تأخیر در توقف اولیه کمتر و زمان بی­تحرکی کل بیشتر باشد نشان­دهنده افزایش افسردگی می­باشد و برعکس. پس از شنا باید حیوان را از آب خارج کرده  و به

مدت 15 دقیقه زیر لامپ خشک کرد (25).

روش آماری: داده­های حاصل با استفاده از نرم­افزار SPSS نسخه 16 به روش آنالیز واریانس یک­طرفه موردبررسی قرارگرفتند. آزمون Post Hoc - LSD جهت تشخیص معنی­داری بین گروه­های چند­تایی و آزمون t-مستقل جهت بررسی بین گروه­های دوتایی مورد استفاده قرارگرفتند. در تمام آزمایش­ها سطح معنی­داری (05/0P<) در نظر گرفته شد.

نتایج 

اثر اواریکتومی بر رفتار اضطراب: در ابتدا برای بررسی تأثیر اواریکتومی بر روی رفتار اضطراب، گروه کنترل را با گروه شاهد و گروه اواریکتومی شدهکه هر دو حلال سالین به‌صورت درون صفاقی دریافت کرده بودند مقایسه کردیم. اختلاف­ معنی­داری در مقایسه گروه شاهد با گروه کنترل دردرصد زمان حضور در بازوی باز و تعداد ورود به بازوی باز مشاهده نگردید. بنابراین می­توان نتیجه گرفت که داروی بیهوشی و بخیه کردن در جراحی و همچنین دریافت سالین اثر معنی­داری بر میزان اضطراب نداشته است. اما مقایسه گروه اواریکتومی با گروه شاهد آن کاهش معنی­داری دردرصد زمان حضور در بازوی بازنشان داد (05/0P<)، که این نشان می­دهد اضطراب در ماده­های اواریکتومی شده افزایش‌یافته است اما در درصد تعداد ورود به بازوی باز اختلاف­ها معنی­دار نبود (شکل 1). 

اثر روی­کلراید بر رفتار اضطراب گروه­های اواریکتومی شده: در این آزمایش30 دقیقه پس از تزریق روی­کلراید به‌صورت درون صفاقی، شاخص­های اضطراب موردبررسی قرارگرفت. تغییرات معنی­داری دردرصد زمان حضور در بازوی بازبین گروه اواریکتومی و گروه­های دریافت کننده روی­کلراید مشاهده نشد. اما افزایش معنی­داری دردرصد تعداد ورود به بازوی بازبین گروه اواریکتومی و گروه دریافت کننده روی­کلراید 5 میلی­گرم/کیلوگرم مشاهده شد (05/0P<)(شکل 2). با توجه به شکل 2 مشاهده می­گردد که کمترین دوز روی­کلراید اضطراب را کاهش داده است.

شکل 1- مقایسه شاخص­های اضطرابی گروه کنترل، شاهد و اواریکتومی: ستون­ها میانگین ± خطای انحراف از معیار را نشان می­دهند (05/0P<) *=

شکل 2-  مقایسه اثر روی­کلراید برشاخص­های اضطراب:ستون­ها میانگین ± خطای انحراف از معیار را نشان می­دهند (05/0P<) *=

اثر اواریکتومی بر رفتار افسردگی: با توجه به شکل 3 :اختلاف­ معنی­داری در مقایسه گروه شاهد با گروه کنترل ازنظر تأخیر در توقف اولیه و زمان بی­تحرکی کل وجود ندارد. همچنین در گروه اواریکتومی ازنظر تأخیر در توقف اولیه و زمان بی­تحرکی کل، نسبت به گروه شاهد آن اختلاف معنی­داری مشاهده نمی­گردد. این یافته­ها نشان می­دهد بااینکه اضطراب در ماده­های اواریکتومی شده افزایش‌یافته، اما افسردگی ندارند. این نتایج یافته­های دیگر محققان را در مورد همراه بودن اضطراب با افسردگی رد می­کند.

اثر روی­کلراید بر رفتار افسردگی گروه­های اواریکتومی شده: براساس آنالیز آماری در گروههای دریافت کننده روی­کلراید10 و 20 میلی­گرم/کیلوگرم ازنظر تأخیر در توقف اولیه کاهش معنی­داری نسبت به گروه اواریکتومی مشاهده گردید (05/0P<). همچنین ازنظر زمان بی­تحرکی کل در گروههای ذکرشده افزایش معنی­داری نسبت به گروه اواریکتومی نشان داد (05/0P<، 01/0P<) (شکل 4 الف­و­ب). با توجه به شکل 4 الف و ب مشاهده می­شود که روی­کلراید10 و 20 میلی­گرم/کیلوگرم افسردگی را افزایش داده است.

شکل 3- مقایسه گروه کنترل، شاهد و اواریکتومی بر شاخص­های افسردگی: ستون­ها میانگین ± خطای انحراف از معیار را نشان می­دهند.

بحث

در این پژوهش اثر اواریکتومی قبل از بلوغ بر روی رفتارهای اضطرابی و افسردگی مطالعه شده است. تحقیقات قبل نشان داده­اند که اواریکتومی بعد از بلوغ در رفتار اضطراب نقش دارد. بطوریکه موسوی و همکاران (1394) نشان دادند که  اواریکتومی­های یک­ماهه و دو­ماهه تغییرات معنی­داری در اضطراب آنها مشاهده نشد اما در اواریکتومی­های سه‌ماهه افزایش اضطراب به سطح معنی­داری رسید. یعنی هرچه از زمان اواریکتومی بگذرد به همان نسبت اضطراب هم افزایش می­یابد. در ادامه نشان دادند که تزریق روی­کلراید در دوز 15 میلی­گرم/کیلوگرم توانست اضطراب را در اواریکتومی­های دوماهه به‌طور معنی­داری کاهش دهد (3). در تأیید این نظر فریک و همکاران (1999)و مورگان و همکاران (2002) جداگانه اثر استروژن بر فعالیت ترس و اضطراب را بررسی کردند و مشاهده کردند که اواریکتومی در موش­ها با فعالیت اضطرابی همراه است (18 و 8) هرچه از زمان اواریکتومی بگذرد نشانه­ها و اثرات اضطراب بیشتر می­شود بطوریکه در فواصل زمانی اولیه تفاوت­ها بی­معنی و سپس معنی­دار می­شود و نسبت به گذر زمان مقدار اضطراب افزایش می­یابد (8). همچنین خاکپای و همکاران (1385) نشان دادند که گنادکتومی در موش­های صحرایی نر بالغ باعث کاهش درصد ورود به بازوی باز، کاهش درصد زمان سپری‌شده در بازوی باز و نیز کاهش فعالیت حرکتی می­شود که نشان­دهنده افزایش اضطراب می­باشد (1). نتایج بدست آمده در این پژوهش نیز نشان می­دهد که اواریکتومی موجب کاهش مدت زمان سپری‌شده در بازوی باز می­شود که نشان‌دهنده افزایش اضطراب می­باشد. بنظر می­رسد که اواریکتومی قبل از بلوغ در موش­های صحرایی ماده روند افزایش اضطراب را سریع­تر پیش می­برد، یا عدم زمینه­سازی به‌وسیله پروژسترون و استروژن به دلیل برداشتن تخمدان­ها قبل از بلوغ باعث تأثیر متفاوتی شده است. مطالعات پیشین نشان داده­اند که اواریکتومی سطح سرمی روی را به‌طور قابل‌توجهی کاهش می­دهد (12).

در این مطالعه تزریق روی­کلراید در دوز 5 میلی­گرم/کیلوگرم توانست تعداد ورود به بازوی باز را افزایش و رفتار اضطراب ناشی از اواریکتومی را کاهش دهد. این داده­ها نشان می­دهند که روی در کاهش اضطراب نقش دارد. این تئوری توسط نوابی و همکاران(1390)، ترابی و همکاران(2013)، تأیید شد که با تزریق روی کاهش رفتارهای اضطرابی و افسردگی در موش­های صحرایی نر بالغ و سالم مشاهده کردند. اما در موش­های بالغ و سالم ماده باعث افزایش اضطراب شد که این افزایش اضطراب با افزایش غلظت روی­کلراید نیز افزایش یافت (30 و 4).

شکل4- مقایسه اثر روی­کلراید بر شاخص­های افسردگی:الف) تأخیر در توقف اولیه. ب)زمان بی­تحرکی کل. ستون­ها میانگین ± خطای انحراف از معیار را نشان می­دهند. (05/0P< =*)، (01/0P< =**)