نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 کارشناس ارشد بیوشیمی ، دانشگاه پیام نور واحد تهران شرق، تهران،ایران
2 دانشجوی دکتری بیوشیمی ، دانشگاه پیام نور واحد تهران شرق ، تهران ، ایران
3 استاد دانشگاه پیام نور، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، تهران، ایران
4 استادیار دانشگاه پیام نور، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، تهران، ایران
5 دانش آموخته دامپزشکی،دانشکده دانپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد گرمسار، گرمسار، ایران
چکیده
مقدمه: با توجه به اهمیت آهن و نقش استرس اکسیداتیو در بروز سمیت آن، در مطالعه حاضر تاثیر نانوذرات آهن و نقش اسانس آویشن شیرازی در تعدیل مسمومیت حاد ناشی از نانوذرات آهن و کاهش سطح فعالیت مارکرهای بیوشیمیایی کبدی و کاهش سطح فعالیت آنزیمهای CYP450 و GST مورد بررسی قرار گرفتند.
مواد و روش ها: موش های صحرایی نر بالغ به 5 گروه و 3 زیر گروه، کنترل منفی دریافت کننده نرمال سالین، کنترل مثبت دریافت کننده mg/kg 200 نانوذرات آهن و گروه های تیمار با اسانس آویشن شیرازی تقسیم شدند. حیوانات به مدت 3 روز mg/kg b.w 100 و 200 اسانس آویشن را به صورت درون صفاقی دریافت کرده و سپس، موش ها کشته شده و بافت کبد به منظور بررسی های پاتولوژیکی و بیوشیمیایی برداشته شد.
یافته ها: نتایج این تحقیق نشان داد که در بین مارکر های سرمی، سطح ASTسرم پس از تزریق نانو ذرات آهن افزایش یافته که نشان دهنده آسیب هپاتوسیتها می باشد، همچنین تزریق نانوذزات پس از 72 ساعت نیز باعث کاهش سطح فعالیت آنزیمهای CYP450 و GST شده است. تیمار حیوانات با اسانس آویشن باعث بازگشت سطح فعالیت مارکر کبدی AST و بازگشت فعالیت آنزیم GST گردید و کانون های نکروتیک ناشی از آسیب نانوذرات آهن در هپاتوسیتها تحت تاثیر تیمار با اسانس آویشن کاهش یافت.
نتیجه گیری: استفاده از نانوذرات آهن موجب آسیب به بافت کبدی و افزایش متابولیسم گزنوبیوتیک ها و تیمار با اسانس آویشن می تواند در جلوگیری و بهبود این آسیبها موثر باشد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Considering the Zataria multiflora essential oil effect on the xenobiotic metabolism in acute toxicity induced by iron nanoparticle
نویسندگان [English]
2 Payame Noor University
3 Professor, Payame Noor University
چکیده [English]
Introduction: Considering the importance of iron and the role of oxidative stress in its toxicity, the purpose of this study was to compare the effect of iron nanoparticle and Zataria multiflora essential oils on the activity of biochemical markers of the liver, also activity of CYP450 and GST enzymes was examined in this study.
Materials & Methods: The adult male rats were divided into 5 groups and 3 subgroups, including negative control group receiving normal saline, positive control group receiving 200 mg/kg of iron nanoparticles, and treatment group receiving Zataria multiflora essential oils. The rats received 100 mg/kg b.w, and 200 mg/kg b.w of Zataria multiflora E.O intraperitoneally. Then rats were killed, and their liver tissue was removed for pathologically and biochemically analyze.
Results: In the analysis of AST marker after 72 hours, the injection of iron nanoparticles resulted in an increase in activity of these markers, which shows the hepatocellular injury, and the injection of nanoparticles after 72 hours reduced the activity of CYP450 and GST enzymes. It was found that the treatment of rat animal with Zataria multiflora E.O reactivated the liver marker and GST enzyme. Necrotic foci developed by the damage to iron nanoparticles in hepatocytes were reduced by the treatment with Zataria multiflora E.O.
Conclusion: The use of iron nanoparticles results in damages to the liver tissue and increases in metabolism of xenobiotics, and the treatment with the Zataria multiflora essential oil can prevent and resolve these damages.
کلیدواژهها [English]
بررسی تأثیر اسانس آویشن شیرازی بر روی متابولیسم گزنوبیوتیکها در مسمویت حاد ناشی از نانوذرات آهن
حدیث کوهی نژاد1، آزاده رسولی1، رضا حاجی حسینی2*، آتوسا وزیری2 و میثم صغیری3
1 تهران، دانشگاهپیامنورواحدتهران شرق، گروهبیوشیمی
2 تهران، دانشگاه پیام نور، دانشکده علوم پایه، گروه زیستشناسی
3 گرمسار، دانشگاه آزاد اسلامی واحد گرمسار، دانشکده دامپزشکی، گروه دامپزشکی
تاریخ دریافت: 11/11/95 تاریخ پذیرش: 17/4/96
چکیده
با توجه به اهمیت آهن و نقش استرس اکسیداتیو در بروز سمیت آن، در مطالعه حاضر تأثیر نانوذرات آهن و نقش اسانس آویشن شیرازی در تعدیل مسمومیت حاد ناشی از نانوذرات آهن و کاهش سطح فعالیت مارکرهای بیوشیمیایی کبدی و کاهش سطح فعالیت آنزیمهای CYP450 و GST مورد بررسی قرارگرفتند. موشهای صحرایی نر بالغ به 5 گروه و 3 زیرگروه، کنترل منفی دریافتکننده نرمال سالین، کنترل مثبت دریافتکننده mg/kg 200 نانوذرات آهن و گروههای تیمار با اسانس آویشن شیرازی تقسیم شدند. حیوانات به مدت 3 روز mg/kg b.w 100 و 200 اسانس آویشن را بهصورت درون صفاقی دریافت کرده و سپس، موشها کشتهشده و بافت کبد بهمنظور بررسیهای پاتولوژیکی و بیوشیمیایی برداشته شد. نتایج این تحقیق نشان داد که در بین مارکرهای سرمی، سطح ASTسرم پس از تزریق نانوذرات آهن افزایشیافته که نشاندهنده آسیب هپاتوسیتها میباشد، همچنین تزریق نانوذرات پس از 72 ساعت نیز باعث کاهش سطح فعالیت آنزیمهای CYP450 و GST شده است. تیمار حیوانات با اسانس آویشن باعث بازگشت سطح فعالیت مارکر کبدی AST و بازگشت فعالیت آنزیم GST گردید و کانونهای نکروتیک ناشی از آسیب نانوذرات آهن در هپاتوسیتها تحت تأثیر تیمار با اسانس آویشن کاهش یافت. بنابراین استفاده از نانوذرات آهن موجب آسیب به بافت کبدی و افزایش متابولیسم گزنوبیوتیکها و تیمار با اسانس آویشن میتواند در جلوگیری و بهبود این آسیبها مؤثر باشد.
واژههای کلیدی: اسانس آویشن شیرازی، آنزیم متابولیز کننده داروها، نانو ذرات آهن، کبد
* نویسنده مسئول، تلفن: 02122441511 ، پست الکترونیکی: hosseini@pnu.ac.ir
مقدمه
کبد بزرگترین اندام در بدن است .یکی از مهمترین اعمال کبد سمزدایی مواد آلودهکننده محیطی و داروهایی شیمیایی است (6). سلولهای کبدی با استفاده از آنزیمهای شبکه آندوپلاسمی صاف خود و به طریق اکسیداسیون و متیلاسیون، مواد متعددی نظیر الکل، استروئیدها و باربیتوراتها را غیرفعال میسازند. در اکثر موارد، در طی عمل سمزدایی، فعالسازی متابولیکی توسط آنزیمهای سیتوکروم p450 میکروزومهای کبدی، باعث ایجاد متابولیتهای سمی و فعال میشود که این امر میتواند موجب آسیب بافتهای مختلف ازجمله کبد شود (29).
80 درصد سلولهای کبدی را هپاتوسیتها تشکیل میدهند. ثبات و درستی غشای هپاتوسیتها لازمهی اعمال حیاتی کبد میباشد (30). نانوذرات اکسید آهن با توجه به خصوصیات فیزیکوشیمیایی که دارند این ثبات را بر هم زده و موجب بروز اختلال در عملکرد کبد میگردند (44). نانوذرات به علت اندازه منحصربهفردشان با خصوصیات فیزیکوشیمیایی ویژه بسیاری تولید میشوند و بدینوسیله میتوانند خطرات پیشبینینشدهای را برای سلامتی انسان داشته باشند. واکنش شیمیایی بیشتر نانو مواد منجر به افزایش تولید رادیکالهای آزاد ازجمله رادیکالهای واکنشگر اکسیژن (ROS) میشود. تولید ROS در محدوده متنوعی از نانو مواد شامل فولرن، نانولولههای کربنی و نانوذرات اکسید فلزی مشاهدهشده است (21). رادیکالهای آزاد به غشای سلول آسیب میرسانند و با افزایش پراکسیداسیون لیپیدها و شاخصهای استرس اکسیداتیو منجر به التهاب بافت و مرگ سلولها میشوند (19 و 36). با تولید نانوذرات آهن شناسایی سمیت و عوارض آن ضروری به نظر میرسد. لذا، در این مطالعه سمیت نانوذره آهنبر روی آنزیمهای کبد موشهای صحرایی مورد بررسی قرارگرفت.
امروزه مصرف گیاهان دارویی باهدف دستیابی به داروهای کمخطر و با حداقل عوارض جانبی روزبهروز در حال افزایش است و این به دلیل به اثبات رسیدن اثربخشی بسیاری از این مواد در مجامع علمی و مقبولیت آن در اکثر جوامع بشری است (40). یکی از بزرگترین خانوادههای گیاهی، خانواده نعناعیان (Lamiaceae) است که دارای پراکنش جهانی میباشد (36). آویشن شیرازی بانام علمی ، Zataria multifloraاز خانواده نعنائیان میباشد که در مناطق مرکزی و جنوبی ایران وجود دارد (44). از آویشن در صنایع غذایی، دارویی، بهداشتی و آرایشی استفاده متنوعی میشود. روغن آویشن دارای خواصی نظیر ضداسپاسم، بادشکن، ضدقارچ، ضدعفونی کننده، ضدکرم، ضدرماتیسم و خلطآور میباشد. اسانس آویشن ازجمله ده اسانس معروف است که دارای خواص ضدالتهابی و ضدباکتریایی و ضدقارچی، آنتیاکسیدان، نگهدارنده طبیعی غذا وتاخیردهنده پیری پستانداران میباشد و جایگاه خاصی در تجارت جهانی دارد (25 و 28). همچنین آویشن در انواع غذاها استفاده میشود و بهعنوان ترکیبات معطر در اکثر فرآوردههای غذایی مهم نظیر مشروبات و دسرهای لبنیاتی استفاده میشود (26). با توجه به مطالعات انجامشده استفاده از راهکارهای درمانی بهمنظور کاهش اثرات مسمویتی نانوذرات مختلف ضروری به نظر میرسد. به همین دلیل در این مطالعه اثرات اسانس آویشن در تعدیل آسیبهای کبدی ایجادشده توسط نانو ذرات و همچنین تأثیر آن در پارامترهای دخیل در متابولیسم گزنوبیوتیک ها و همچنین پارامترهای آسیبهای کبدی در رت های تحت تیمار برای اولین بار مورد بررسی قرارگرفته است.
مواد و روشها
تهیه اسانس آویشن شیرازی: تهیه اسانس آویشن شیرازی به روش تقطیر با آب توسط دستگاه تقطیر کلونجر (Clevenger): آویشن شیرازیبهصورت تازه از شهر شیراز جمعآوری و توسط دکتر عصری شناسایی شد (Voucher Number: 41754) و مطابق با روش زیر اسانس آن بهوسیله دستگاه تقطیر با آب کلونجراستخراج شد. در این روش، 50 گرم از دانهها توسط دستگاه مخلوطکن تبدیل به پودر شدند. سپس دانههای پودر شده در بالن یک لیتری دستگاه ریخته شد و با افزودن 700 میلیلیتر آب مقطر به مدت 90 دقیقه جوشانده شد. سپس در قسمت نزولی دستگاه کلونجر، فاز روغنی یا اسانس از آب جدا گردید (17 و20).
آنالیز اسانس آویشن شیرازی به روش (GC-MS)Gas Chromatography – Mass Spectroscopy : در این روش، اسانس بهدستآمده از آویشن بهوسیله دستگاه کروماتوگرافی گازی مجهز به آشکارساز یونی شعلهای، جدا سازی میشود. آنالیز نمونهها بر اساس نرمافزار
Euro Chrom 2000 (47) توسط روش نرمالیزه کردن سطح و با استفاده از ستون سیلیکای مذاب
DB-5 (mµ 25/0 ضخامت فیلم، mm 25/0× m30) و برنامه دماییC 250ْْ-40 در میزان c/mm 4ْ، دمای انژکتوری C 250ْ، دمای آشکارساز C 265ْ و گاز حامل هلیم (99/99%) انجام میگیرد. دستگاه GC/MS شامل کروماتوگرافی گازی همراه با آشکارساز بوده و ستون مورداستفاده نیز همانند ستون GCبا شرایط فوقالذکر است. اجزاء و ترکیبات نمونهها توسط مقایسه طیفسنجی جرمی با استانداردهای موجود شناسایی میشوند. شناسایی ترکیبات مجهول توسط مقایسه شاخصهای بازداری آنها با ترکیبات استاندارد انجام میگردد (17 و20).
گروههای تیمار و نمونهگیری: در این تحقیق، از 112 سر موش صحرایی نر بالغ با وزن متوسط 100 گرم استفاده گردید که از مرکز نگهداری حیوانات آزمایشگاهی از انستیتو پاستور ایران خریداری شدند. غذای حیوانات از کارخانجات فرآوردههای غذایی تهران تهیهشده که بهصورت پلت (Pellet) با فرمول استاندارد بود. حیوانات بالغ نیز دسترسی آزاد به غذا و آب آشامیدنی از طریق بطری داشتند. تیمار حیوانات بهصورت زیر انجام شد.
- گروه کنترل منفی (5 سر): حیوانات به مدت سه روز نرمال سالین (حلال نانوپارتیکل) و حلال اسانس (DMSO) بهطور همزمان بهصورت i.p دریافت میکنند.
- گروه کنترل مثبت (5 سر): حیوانات به مدت سه روز، هرروز mg/kg 200 نانوذره آهن و حلال اسانس (DMSO) بهطور همزمان بهصورت i.p دریافت میکنند.
- گروههای تیمار با اسانس آویشن شیرازی (Z. multiflora Boiss. L.): حیوانات به مدت سه روز mg/kg 200 نانوذره آهن و mg/kg b.w 100 و 200 اسانس آویشن بهطور همزمان بهصورت i.p دریافت کرده و سپس، پس از سه روز موشها کشتهشده و بافت کبد بهمنظور بررسیهای پاتولوژیکی و بیوشیمی برداشته میشود.
انجام آزمایشات بیوشیمیایی: تهیههموژنبافتکبد: 150 میلیگرم بافت تهیهشده در5/1 میلیلیتر بافر فسفات mM 100 با 7PH = هموژن میگردد .هموژن بافت به مدت 5 دقیقه در g 3000 سانتریفوژ میشود، سپس محلول رویی به چند میکروتیوپ منتقلشده و در فریزر نگهداری میشود.
اندازهگیریمیزانآنزیم CYP 450 درهموژنبافتکبد: میزان پروتئین Cyp450 در هموژن بافت کبد طبق پروتکل، کیت خریداریشده از شرکت Biossay Technology به روش ELISA اندازهگیری شد.
اندازهگیریفعالیتآنزیم GST درهموژنبافتکبد: در این روش ابتدا محلول 1-کلرو2،4-دی نیتروبنزن (CDNB: 1-chloro-2,4-dinitrobenzene) 20 میلیمولار و محلول 20 گلوتاتیون میلیمولار تهیه میگردد. سپس هموژن بافت کبد سانتریفوژ شده و به محلول فوق اضافه میگردد. درنهایت میزان جذب نور در زمانهای 1،2 و3 دقیقه پس از مخلوط کردن نمونه با محلولها در طولموج nm340 قرائت میگردد. درنهایت فعالیت آنزیم با توجه به فاکتور فعالیت محاسبهشده و فعالیت ویژه آنزیم نیز با تقسیم فعالیت آنزیم بر میزان پروتئین در هر نمونه محاسبه گردید.
اندازهگیریمیزانپروتئین کل بهروشبرادفورددرهموژنبافتکبد(12): ابتدا هموژن بافت کبد سانتریفوژ شده و پس از رقیقسازی نمونهها و همچنین محلولهای استاندارد آلبومین سرم گاوی (BSA: Bovine Serum Albumin ) به محلول برادفورد اضافه میشوند. پس از گذشت 19 دقیقه میزان جذب نور در طولموج nm 595 قرائت شد. درنهایت غلظت پروتئین هر نمونه از روی منحنی استاندارد محاسبه گردید.
اندازهگیریسطحمارکرهایآسیبکبدیدرپلاسما: پس از خونگیری از قلب توسط سرنگ هپارینه، نمونه خون در 3000 دور به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شده و پلاسما جداسازی و در میکروتیوپ به فریزر منتقل شد.
اندازهگیری ALP و ALT و AST درپلاسما: سطح ALP و ALT و ASTدر پلاسما توسط کیت اندازهگیری خریداری شده از شرکت پارس آزمون ایران و طبق پروتکل کیت اندازهگیری شد.
بررسیهیستوپاتولوژیکبافتکبد: بلافاصله پس از بیهوش کردن حیوان و خونگیری، بخشی از بافت کبد در بافر فرمالین قرارداده شده و پس از فیکس شدن بافت، تهیه لام و رنگآمیزی آن، آسیبهای هیستوپاتولوژیک توسط متخصص آسیبشناسی بررسی شد.
تجزیهوتحلیل آماری: آنالیز دادهها با استفاده از نرمافزار SPSS-19 و آنالیز واریانس یکطرفه (ANOVA) انجام شد (48). اختلاف بین گروهها با استفاده از روش Tukey’s بررسی شد. سطح معنیداری (05/0P <) در نظر گرفته شد. نمودارها با استفاده از نرمافزار Excel ترسیمشدهاند.
نتایج
بررسی آنالیز اسانس آویشن به روش (Gas Chromatography-Mass Spectroscopy: GC-MS): براساس آنالیز انجامشده با روش GC-MS، 12 نوع ترکیب در اسانس استخراج شده از آویشن شیرازی شناسایی گردید (جدول 1). چهار مورد از این ترکیبات بیشترین درصد اسانس را تشکیل دادند که به ترتیب شامل: Thymol (80/61%)، Carvacrol (54/10%)،
γ -Terpinene (40/4%) و p-Cymene (57/7 ) بود.
میزانآنزیم CYP 450 72 ساعت پس از تیمار حیوانات: تزریق نانوذرات آهن پس از 72 ساعت باعث کاهش میزان فعالیت پروتئین CYP 450 گردید (05/0P <)، اما مصرف اسانس آویشن شیرازی در دوزهای mg/kg b.w 100 و200 تغییری در میزان فعالیت سطح پروتئین CYP 450 ایجاد نکرد (نمودار1) (05/0P >).
میزان فعالیت آنزیم GST 72 ساعت پس از تیمار حیوانات: تزریق نانوذرات آهن پس از 72 باعث کاهش میزان فعالیت آنزیم GST گردید، مصرف اسانس آویشن شیرازی در دوزهای mg/kg b.w 100 و 2100 باعث بازگشت فعالت به حالت نرمال گردید (نمودار 2) (05/0P<).
جدول 1- ترکیبات شیمیایی اسانس آویشن
شماره |
ترکیب |
RI |
% |
1 |
α-Thujene |
8698/931 |
3937/0 |
2 |
pinene-α |
7259/940 |
3912/2 |
3 |
-pineneβ |
7905/976 |
0692/1 |
4 |
Terpinene –α |
1512/1031 |
7535/0 |
5 |
Cymene-ρ |
3974/1039 |
5785/7 |
6 |
Terpinene-γ |
1316/1073 |
4083/4 |
7 |
Thymol |
5475/1306 |
8047/61 |
8 |
Carvacrol |
6158/1315 |
5496/10 |
9 |
Thymyl acetate |
113/1358 |
8072/2 |
10 |
Geramyl acetate |
7243/1373 |
4918/0 |
11 |
E-caryophyllene |
1412/1458 |
581/2 |
12 |
Aromadendrene |
2953/1476 |
9996/0 |
مواردی که با سایهنشان دادهشدهاند، ترکیبات اصلی اسانس و میزان درصد نسبی آنها را نشان میدهد
بررسی میزان فعالیت آنزیمهای کبدی 72 ساعت پس از تیمار حیوانات: تزریق نانوذرات آهن پس از 72 ساعت باعث افزایش فعالیت آنزیم AST گردید (05/0P <)، ولی تأثیری بر فعالیت آنزیم ALT و ALP نداشت (05/0P>). مصرف اسانس آویشن شیرازی در دوزهای mg/kg b.w 100 و200 باعث بازگشت میزان آنزیم AST به حالت نرمال گردید (نمودار 3) (05/0P <) در حالیکه بر روی آنزیمهای دیگر کبدی بدون تأثیر بود (نمودار 4 و 5).
بررسیهیستوپاتولوژیکبافتکبد: نتایج بررسیهای بافتشناسی نشان دادند که کبد حیوانات گروه کنترل طبیعی بوده، تخریب واکوئل، آسیب هپاتوسلولار و هیچ نکروزی به چشم نخورد و ساختار هسته، سیتوپلاسم، هپاتوسیتها و همچنین، بافت پارانشیم و لوبولها در بافت کبد نرمال است (شکل 1، A1وA2). درعینحال، دریافت mg/kg 200 نانو ذرات آهن موجب القای نکروز گستردهی هپاتوسلولار و تخریب واکوئل ها شد (شکل 1، B1 و B2). درحالیکه در گروه تیمار شده با اسانس آویشن در دو دوز mg/kg b.w 100 و 200 ناحیهی نکروز کوچکتر شده و نیز از آسیب هپاتوسلولار در این ناحیه تا حدی کاسته شد و تخریب واکوئل ها دیده نشد (شکل 1، C1 و C2 ، D1و D2).
نمودار1- میزان فعالیت پروتئینCYP 450. نتایج بهصورت میانگین ± انحراف معیار (mean±SEM) بیان شده است. علامت * نشاندهنده معنیدار بودن نتایج در گروه نانوذرات نسبت به گروه کنترل است(05/0P <).
نمودار2- میزان فعالیت آنزیم GST. نتایج بهصورت میانگین ± انحراف معیار (mean±SEM) بیان شده است. علامت * نشاندهنده معنیدار بودن نتایج در گروه نانوذرات نسبت به گروه کنترل است (05/0P <).
نمودار 3- میزان فعالیت آنزیم AST. نتایج بهصورت میانگین ± انحراف معیار (mean±SEM) بیان شده است. علامت * نشاندهنده معنیدار بودن نتایج در گروه نانوذرات نسبت به گروه کنترل است (05/0P <).
نمودار 4- میزان فعالیت آنزیم ALT. نتایج بهصورت میانگین ± انحراف معیار (mean±SEM) بیان شده است. علامت * نشاندهنده معنیدار بودن نتایج در گروه نانوذرات نسبت به گروه کنترل است (05/0P <).
نمودار 5- میزان فعالیت آنزیم ALP. نتایج بهصورت میانگین ± انحراف معیار (mean±SEM) بیان شده است. علامت * نشاندهنده معنیدار بودن نتایج در گروه نانوذرات نسبت به گروه کنترل است (05/0P <).
شکل 1- تأثیر E.O بر تغییرات بافتی کبد بعد از تیمار با نانو ذرات آهن. A2وA1 : بافت کبد طبیعی در گروه کنترل. B2 و B1: بافت کبد در گروه نانو ذرات تیمار نشده باE.O ، پارانشیم بافت کبد و لوبولها مخصوصاً در اطراف سیاهرگ مرکزی روشنتر هستند. نکروز حاد هپاتوسیتی و تخریب واکوئول ها مشهود است. C2و C1، D2 وD1 : بافت کبد حیوانات در گروه تحت تیمار با نانو ذرات و اسانس آویشن، پارانشیم بافت کبد و لوبولها بویژه نواحی periportal و midzonal روشنتر از نرمال است. تخریب واکوئولها دیده نشد، ولی نکروز سلولها نسبت به گروه نانو ذرات کاهشیافته است (رنگآمیزی H&E ، بزرگنمایی ×100 A, C و 400B, D × ).
بحث و نتیجهگیری
آلودگی محیطزیست، بهعنوان یکی از مباحث بسیار مهم در زندگی بشر میباشد (1 و 2)، با توجه به استفاده گسترده از نانوتکنولوژی و نانوذرات در زندگی امروزه و خطرات ناشی از استفاده گسترده بشر از این تکنولوژی، آلودگیهای ناشی از نانوذرات امروزه بهعنوان مسئلهای جدید و خطرناک مطرحشدهاند. درواقع این مورد به علت ماندگاری در محیط و زنجیره غذایی مسمومیتهایی را ایجاد می کند (18 و 35). رادیکالهای آزاد به غشای سلول آسیب میرسانند و با افزایش پراکسیداسیون لیپیدها و شاخصهای استرس اکسیداتیو منجر به التهاب بافت و مرگ سلولها میشوند (19 و 36). در این تحقیق بعد از تیمار حیوانات با نانوذرات آهن همراه با اسانس آویشن شیرازی توانایی محافظتی این ترکیب طبیعی در برابر آسیبهای ناشی از تزریق نانوذرات آهنبر روی متابولیسم گزنوبیوتیکها و اندازهگیری میزان سطح پروتئین CYP 450 و میزان فعالیت آنزیم GST و سطح مارکرهای آسیب کبدی، AST، ALT، ALP در پلاسما، مورد بررسی قرارگرفت.
نتایج این پژوهش نشان داد نانوذرات آهنبر روی عملکرد CYP 450 و GST اثر کرده و باعث کاهش عملکرد آنها و آسیب کبدی میگردد (نمودار1 و2). آنزیم سیتوکروم P450 (CYP 450) در جانوران یکی از اولین سیستمهای دفاعی است که از سلول در برابر عوامل شیمیایی سمی طبیعی که از گیاهان و طی غذاهای روزانه وارد بدن میشوند، حفاظت میکند. این آنزیمها همینطور در برابر تأثیرات سمی مواد شیمیایی خارجی مقاومت ایجاد میکنند. هرکدام از این ترکیبات ممکن است مواد اکسیداتیو را بهعنوان محصولات جانبی تولید کند که بهDNA آسیب میرساند (31). بعد از اتصال گزنوبیوتیک، سیتوکروم P450 مولکول اکسیژن و الکترون موردنیاز برای عملکرد خود را از NADPH میگیرد. سیتوکروم با آهن در مرحله اکسیداسیون (Fe III) به گزنوبیوتیک متصل میشود. بدین ترتیب آهن به آهن دو ظرفیتی احیا میشود. الکترون توسط کمپلکس NADPH به سیتوکروم P450 متصل میگردد و به مولکول اکسیژن اجازه اتصال میدهد (23). همچنین گلوتاتیون_S_ترانسفراز (GST) باعث ساختهشدن آنزیمهایی با کارکردهای متعدد میشود که مسئول کاتالیز کردن ترکیبات کارسینوژنیک و سایتوتوکسیک از طریق کونژوگه کردن آنها به گلوتاتیون میباشد. به دلیل آنکه بسیاری از مواد سمی و مضر از طریق کونژوگه شدن با گلوتاتیون غیرفعال میشوند، گاهی با نقص در عملکرد GST میتواند باعث حساس شدن بافتهای بدن به مواد سمی و سرطانزای شیمیایی شود (24). همچنین در جریان مسمومیت ناشی از نانوذرات اکسید تیتانیوم پیشبینی میشود واکنشهای استرس اکسیداتیو و فعالیت گلوتاتیون در سلولهای افزایش یابد (16 و 39). با توجه به مطالعات انجامشده روی نانوذرات اکسید آهن بدون پوشش، مشخص شده است که بسیاری از این نانوذرات اثرات سمی زیادی در سیستمهای بیولوژیک اعمال میکنند (27). آهن یکی از عناصر کلیدی در سلولهای زنده میباشد که نقش مهمی در فرایندهای متابولیکی نظیر انتقال اکسیژن و الکترون، فسفریلاسیون اکسیداتیو، تولید انرژی، متابولیسم گزنوبیوتیک، سنتز DNA، رشد سلول، آپوپتوز، تنظیم بیان ژن و التهاب بازی میکند. همچنین، آهن بهعنوان واسط نکروز هپاتوسلولار و التهاب میتواند فرایندهای پراکسیداتیو را فعال و تولید رادیکالهای آزاد اکسیژن کند و از این طریق موجب آسیب رساندن به پروتئین و DNA گردد (43). حیدرنژاد و همکاران در سال 2013 گزارش کردند که تأثیر نانوذرات نقره 30 نانومتری بر موش BALB/c سبب ایجاد تغییراتی در کبد شامل اتساع در ورید مرکزی، پرخونی، تورم و افزایش سلولهای کوپفر و ارتشاح سلولهای التهابی در مسیر وابسته به زمان شد که با نتایج ما در القای نکروز کبدی و تخریب واکوئل ها همخوانی داشت (22). حسین و همکاران در سال 2005 سمیت نانوذرات نقره را بر کبد موش صحرایی مورد ارزیابی قراردادند و پس از 24 ساعت قرار گرفتن در معرض نانوذرات میتوکندری نشت قابل ملاحظه و وابسته به دوز لاکتات دهیدروژناز را مشاهده کردند (38).
پارک و همکاران تجویز خوراکی نانوذره نقره بـه مـوش وICR در طـی 28 روز باعـث افـزایش آنزیمهای ALP، ALT وAST شد بهطوری که در غلظت بالای نـانوذره نقره این تغییرات معنیدار بـود کـه بـا نتـایج مطالعـه مـا همخـــوانی دارد (34). آدیمی و همکـــاران در سال 2014 گزارش کردند که مصرف خوراکی نانوذره نقـره در موش نژاد ویستار باعث کاهش معنیدار آنزیم ALT و AST در غلظت mg/kg 100 شد که با نتایج مطالعه ما مطابقت ندارد (4). علاوه براین، نتایج حاصل از این تحقیق نشاندهنده افزایش میزان AST در 72 ساعت پس از تیمار با نانوذرات آهن بود (نمودار 3) ولی هیچ تغییری در میزان آنزیمهای ALT و ALP مشاهده نشد (نمودار 4 و 5). نقش و همکاران گزارش کردند که تزریق درون صفاقی نانوذره 4 نانومتری در موش نژاد ویستار باعث بیشترین آسیب بـه سـلول کبـدی در دوز ppm 50 شــد، درصورتیکه در غلظــتppm 100 و 200، 400 تغییــر معنیداری در آنــزیم ALT حاصــل نشــد که با نتایج ما همخوانی نداشت (32). آواشتی و همکــاران در ســال 2015 گــزارش کردنــد کــه تجــویز دوزهای 50 و 100 میلیگرم بر کیلوگرم نانوذره نقره به روش خوراکی (گاواژ) به موش آلبینو باعـث افـزایش آنزیمهایALT ،ALP و AST و همچنــین تغییــرات هیستوپاتولوژی خفیفی مانند پر خونی در کبد شد (8).
اگرچه مکانیسمهای محافظتی درونسلولی به میزان زیادی آسیبهای ناشی از ROS را کاهش میدهند، اما به علت فراوانی تولید این رادیکالهای آزاد، وجود راههای محافظتی دیگری بهویژه آنتیاکسیدانهای مواد غذایی برای سلامت انسان بسیار مهم میباشد. وجود ترکیبات طبیعی بهویژه نمونههای گیاهی که خاصیت آنتیاکسیدانی دارند دارای این ویژگیها میباشد (7 و42). تعدادی از گیاهان موجود در طب سنتی کشورهای مختلف به علت داشتن آنتیاکسیدانها خاصیت محافظت کبدی را دارند (9 و 46). برای جلوگیری و کاهش و بهبود آسیبهای حاصله ایجادشده ناشی از این نانوذرات امروزه استفاده از گیاهان دارویی باهدف دستیابی به داروهای کمخطر و با حداقل عوارض جانبی روزبهروز در حال افزایش است و این به دلیل اثربخش و عوارض کم بسیاری از این ترکیبات میباشد.
در این تحقیق، تیمار حیوانات با اسانس آویشن از کاهش GST و افزایش AST جلوگیری کرده، درنتیجه آسیبهای کبدی ناشی از نانوذرات آهن را تا حدودی بهبود میبخشد. نتایج تحقیقات در مورد آنالیز ترکیبهای اسانس آویشن و بررسی خواص آنتیاکسیدانی آن درin vitro نشان میدهد که تیمول و کارواکرول بیشترین میزان را در اسانس آویشن تشکیل میدهند (جدول 1) و این دو ترکیب باعث خواص آنتیاکسیدانی بسیار زیادی در اسانس میشوند (39). یکی از ترکیبات اسانس آویشن به نام کارواکرول دارای خاصیت آنتیاکسیدانی است و پراکسیداسیون لیپیدی را کاهش میدهد و ممکن است بافت کبد را از آسیبهای ناشی از سمیت مصون بدارد (5 و 29). سیاهدانه در اثر ترکیـب بـا آهـن مانع اکسیداسیون آن میشود. در بـسیاری از بیماریها ماننـد سیروز کبدی یا آسیبهای کبـدی ناشـی از عفونـت و مـواد شیمیایی که رادیکال آزاد تولید میشود، عمـل آنتیاکسیدانی سیاهدانه میتواند بــسیار مفیــد واقــع شــود (10، 13 و 33). دالــی در ســال 1999 جهــت بررســی اثــرات آنتیاکسیدانی پوسـت درخـت دارچـین و دانههای هـل در موشهای تغذیهشده بـا غـذای پرچـرب، غـذای حـاوی آنزیمهای آنتیاکسیدانی، گلوتاتیون و رژیم پرچرب همـراه با هل یا دارچین به موشها خوراندند و گـزارش کردنـد کـه فعالیتهای آنزیماتیـک آنتیاکسیدانی بهطور معنیدار افزایش مییابد (18). باتا چـارجی و همکاران در سـال 2007 در مطالعهای تحـت عنـوان مهـار پراکسیداسیون لیپیدی و افـزایش فعالیـت گلوتـاتیون – S – ترانسفراز (Glutathion-s-transferase) بهوسیله هـل و دارچــین در طــی کارســینوژنزیس کولــون کــه بهصورت شیمیایی در موشهای آلبینـو ایجادشده نـشان دادنـد کـه سوسپانسیون آبی هل و دارچین سـبب افـزایش سـطح آنزیم دتوکــسی فینــگ (فعالیــت گلوتــاتیون - S - ترانــسفراز) میشود و بهطور هــمزمــان ســبب کــاهش ســطوح پراکسیداسیون لیپیدی در گروههای تیمار شده با محلولهای آبی هل و دارچین نـسبت بـه گـروه کنتـرل کـه کارسـینوژن هستند، میشوند (11). تزریق همزمان عصاره پلیفنل بذر خارمریم و ریشه شیرینبیان همراه با تیواستامید موجب کاهش در مقایسه ALP و SGPT ، ,SGOT میزان بیلی روبین کل و فعالیت با گروه دریافتکننده تیواستامید گردید. این بدان معنی است که این عصارهها دارای اثر حفاظتی مؤثری در سلولهای کبدی در برابر آسیب ایجادشده توسط تیواستامید میباشند. علاوه براین، در مطالعهای نشان داده شد که کورکومین موجود در زردچوبه از طریق خواص ضدالتهابی و آنتیاکسیدانی خود دارای اثرات مفیدی بر روی آسیب کبدی رت های نژاد ویستار داشته است (3). بررسی های بافتشناسی انجامشده نیز این نتایج را تأیید می کند. ترکیبات پلیفنلی از مهمترین آنتیاکسیدانها میباشند (14،37 و41). این ترکیبات و بهخصوص فلاونوییدها دارای اثر حفاظتی بر روی کبد در برابر آسیبهای ناشی از سموم کبدی و رادیکالهای آزاد هستند (6، 15 و 45).
نتیجهگیری و پیشنهادات
نتایج این تحقیق نشان میدهد که تیمار حیوانات با اسانس آویشن شیرازی، از طریق تعدیل پارامترهای دخیل در متابولیسم گزنوبیوتیکهاCYP 450) ، (GST منجر به کاهش آسیبهای بافتی کبد ناشی از مسمویت نانوذرات آهن شده است و میزان نکروز سلول های کبدی را کاهش میدهد. همچنین اسانس آویشن شیرازی منجر به مهار افزایش سطح ASTسرم بهعنوان مارکر آسیب کبدی شده است. این اثرات احتمالاً به قابلیت آنتیاکسیدانی ترکیبات مؤثره اسانس آویشن نسبت داده میشود.