نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دپارتمان علوم جانوری و بیوتکنولوژی، دانشکده علوم و فناوری زیستی، دانشگاه شهید بهشتی، تهران ، ایران

2 دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، گروه بیوتکنولوژی، کرمان، ایران

چکیده

بیماری‌‌های قلبی-عروقی شایعترین عامل مرگ و میر در دنیا هستند. سلول درمانی به عنوان یکی از رویکردهای امیدوارکننده برای درمان این بیماری‌ها پیشنهاد شده‌است. تاکنون سلول‌های بنیادی مختلفی از قبیل سلول‌های بنیادی پرتوان (سلول‌های بنیادی جنینی و سلول‌های بنیادی پرتوان القائی) و سلول‌های بنیادی چندتوان (سلول‌های بنیادی مزانشیمی و پروژنیتورهای قلبی) برای تولید سلول‌های قلبی (سلول‌های پیش ساز و کاردیومایوسیت) استفاده شده‌اند. جدیدترین روش برای تولید سلول‌های قلبی، بازبرنامه ریزی مستقیمِ سلول‌های فیبروبلاست به این سلول‌ها می باشد. این رویکرد، روشی سریع، آسان و مطمئن برای تولید سلول‌های قلبی در شرایط آزمایشگاهی و نیز درون موجود زنده است. در این مطالعه، سلول‌های فیبروبلاست جنینی موش (MEFs) با استفاده از بازبرنامه ریزی مستقیم، به سلول‌های بیان کننده مارکرهای سلول‌های پیش ساز قلبی تبدیل شدند. به این منظور دو عامل رونویسی کلیدی Oct4 (فاکتور رونویسی ویژه پرتوانی) و Mef2C (فاکتور رونویسی ویژه قلبی) در سلول‌های فیبروبلاست‌ بیان شدند. 3 هفته بعد از کشت این سلول‌ها، ساختارهایی شبیه کلونی های پیش سازهای قلبی ایجاد شد. بررسی‌های بیان ژنی و رنگ آمیزی ایمونوفلورسنت برای مارکرهای پرتوانی و دودمان قلبی نشان دادند که کلونی‌های شکل گرفته به سلول‌های پیش ساز قلبی شباهت دارند. نتایج این مطالعه نشان می دهد باز برنامه ریزی مستقیم می‌تواند مسیر جدیدی را برای تولید سلول‌های قلبی مورد نیاز برای سلول‌درمانی قلب باز کند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Direct reprogramming of mouse fibroblasts to cardiac progenitor-like cells

نویسندگان [English]

  • Mahmood Talkhabi 1
  • Firooz Jannat Alipoor 2
  • Elmira Rezaei Zonooz 1

1 Department of Animal Sciences and Biotechnology, Faculty of Life Sciences and Biotechnology, Shahid Beheshti University, Tehran, Iran

2 Department of Biotechnology, Institute of Science and High Technology and Environmental Sciences, Graduate University of Advanced Technology, Kerman, Iran

چکیده [English]

Heart diseases are the most significant cause of morbidity and mortality in the world. Cell therapy has been proposed as a promising approach to treat heart diseases. To this end, different types of stem cells such as pluripotent stem cells (embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells) and multipotent stem cells (mesenchymal stem cells and cardiac progenitor cells) have been used for producing cardiac cells (cardiac progenitor cells/cardiomyocytes) in vitro. Direct reprogramming of fibroblasts to cardiac cells is the newest strategy for de novo generation of cardiac lineage cells. This approach is a shortcut for easy and safe production of cardiac lineage cells in vitro and in vivo. In the current study, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were directly reprogrammed to the cells expressing cardiac progenitor markers. To reprogram fibroblasts to cardiac lineage cells, pluripotency key transcription factor Oct4 and cardiac specific transcription factor Mef2C were overexpressed in MEFs. After three weeks, the transduced cell formed some cardiac progenitor like colonies. Gene expression analysis and immunostaining for cardiac lineage and pluripotency markers demonstrated that the emerged colonies were cardiac progenitor colonies derived through the direct reprogramming process. The results of this study indicate that direct reprogramming can open a new avenue for producing cardiac cells required in cell therapy including cardiomyocytes and cardiac progenitor cells.

کلیدواژه‌ها [English]

  • "direct reprogramming
  • cardiac progenitor cells
  • fibroblasts
  • cardiomyocytes"

بازبرنامه ریزیِ مستقیمِ سلولهای فیبروبلاست موشی بهسلولهای شبهپیشساز قلبی

محمود تلخابی1*، فیروز جنت علیپور2 و المیرا رضائی زنوز1

1 تهران، دانشگاه شهید بهشتی، دانشکده علوم و فناوری زیستی،  دپارتمان علوم جانوری و بیوتکنولوژی

2 کرمان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، گروه بیوتکنولوژی 

تاریخ دریافت: 28/9/95                تاریخ پذیرش: 13/9/96 

چکیده 

بیماری‌‌های قلبی-عروقی شایع‌ترین عامل مرگ و میر در دنیا هستند. سلول درمانی به عنوان یکی از رویکردهای امیدوارکننده برای درمان این بیماری‌ها پیشنهاد شده‌‌است. تاکنون سلولهای بنیادی محتلفی از قبیل سلولهای بنیادی پرتوان (سلوهای بنیادی جنینی و سلولهای بنیادی پرتوان القائی) و سلولهای بنیادی چند توان (سلولهای بنیادی مزانشیمی، پروژنیتورهای قلبی) برای تولید سلولهای قلبی (سلولهای پیشساز وکاردیومایوسیت بالغ) استفاده شده‌اند. جدیدترین روش برای تولید کاردیومایوسیتها، بازبرنامه ریزی مستقیمِ سلول‌های فیبروبلاست به این سلولها می باشد. این رویکرد، روشی سریع، آسان و مطمئن برای تولید سلولهای قلبی در شرایط آزمایشگاهی و نیز درون موجود زنده است. در این مطالعه، سلول‌های فیبروبلاست جنینی موش (MEFs) با استفاده از بازبرنامه ریزی مستقیم، به سلول‌های بیان کننده مارکرهای سلولهای پیشساز قلبی تبدیل شدند. به این منظور دو عامل رونویسی کلیدی Oct4 (فاکتور رونویسی ویژه پرتوانی) و Mef2C (فاکتور رونویسی قلبی) در سلول‌های فیبروبلاست‌ بیان شدند. کشت سلولهای ترانسدیوس شده با دو عامل فوق، بعد از 3 هفته ساختارهایی شبیه کلونی پیشسازهای قلبی را ایجاد کردند. بررسی‌های بیان ژنی و رنگ آمیزی ایمونوفلورسنت برای مارکرهای پرتوانی و دودمان قلبی نشان داد که کلونی‌های شکل گرفته به سلولهای پیشساز قلبی شباهت داشته که در اثر باز برنامه ریزی مستقیم سلولهای فیبروبلاست ایجاد شده اند و هرگز از مرحله پرتوانی عبور نکرده‌اند. نتایج این مطالعه نشان می دهد باز برنامه ریزی مستقیم می‌تواند مسیر جدیدی را برای تولید سلول‌های قلبی (سلولهای پیشساز/سلوهای کاردیومایوسیت بالغ) مورد نیاز برای سلول‌درمانی قلب باز کند.

واژه های کلیدی: دگرتمایزی، بازبرنامه ریزی مستقیم، پیش ساز قلبی، فیبروبلاست، فاکتور نسخه برداری 

* نویسنده مسئول، تلفن: 09195571785 ، پست الکترونیکی: m_talkhabi@sbu.ac.ir

مقدمه

 

قلب پستانداران به عنوان اندامی با قدرت ترمیم بسیار پایین شناخته می‌شود (21). هرگونه آسیب به بافت قلب از طریق انفارکتوس مایوکاردی (Myocardial infarction)، ایسکمی، آلودگی با ویرووس و دیگر عوامل پاتولوژیک، باعث می‌شود سلول‌های اصلی قلب که کاردیومایوسیت (Cardiomyocytes) گفته می‌شوند، از بین رفته و تعداد آنها بطور قابل ملاحظه‌ایی کاهش پیدا کند (7). گزارشاتی وجود دارد که نشان می‌دهند در حدود یک میلیون کاردیومایوسیت بعد از یک انفارکتوس مایوکاردی از بین رفته (5) و  مرگ آنها، یک سری از رویدادهای سلولی و مولکولی را به راه می اندازد که منجر به پاسخ التهابی، تجمع فیبروبلاست‌ها، تولید ماتریکس خارج سلولی و در نهایت ایجاد  بافت غیر عملکردی "اسکار" می‌شود (23). شکل گیری بافت اسکار خود باعث از بین رفتنِ بیشتر کاردیومایوسیت ها شده و از آنجایی‌که کاردیومایوسیت های پستانداران بعد از تولد فاقد ظرفیت تکثیری هستند، سلول‌های از دست رفته، جایگزین نشده و قلب به تدریج عملکرد انقباضی خود را از دست داده و در نهایت نارسایی قلبی (Heart failure) ایجاد می‌شود (12). از این رو بیماری های قلبی، یکی از عوامل شایع مرگ و میر کودکان و افراد بالغ در سراسر جهان هستند. این بیماری‌ها تقریبا عامل %33 کل مرگ و میر در دنیا بوده و %55 کل مرگ و میر اتفاق افتاده در آمریکا در سال 2008 (6) و بیش از 4 میلیون فوت بطور سالانه در اروپا (9)، به علت بیماری‌های قلبی گزارش شده است. همچنین بیماری‌های قلبی هزینه گزافی را برای سیستم‌های سلامت ملی گذاشته و هزینه‌های مربوط به مدیریت و کنترل آنها از 300 میلیارد دلار فراتر می‌رود (16). از این رو روش‌های درمانی متفاوتی برای درمان بیماری‌های قلبی ابداع شده و توسعه یافته‌اند. البته با اینکه نرخ بقاء بیماران افزایش پیدا کرده ولی در حال حاضر هیچ تکنیک درمانی ثابت شده‌ایی برای برگرداندن کاردیومایوسیت های از دست رفته وجود ندارد. از این رو پیوند قلب تنها روش درمانی موجود است که برای بیماران با نارسایی‌های بسیار شدید انجام می‌شود (22)، اما این گزینه هم به علت مشکلاتی مانند رد پیوند و پایین بودن تعداد افراد دهنده، با محدودیت همراه است. استراتژی دیگر "سلول درمانی" است که بر استفاده از سلول برای درمان نقایص قلبی استوار بوده و در این استراتژی سلول‌های بنیادی با توانایی تمایزی محدود شامل سلول‌های بنیادی چندتوان (Multipotent stem cells) و نیز کاردیومایوسیت های جدید برای جایگزینی  کاردیومایوسیت های از بین رفته در طی آسیبهای قلبی، بکار گرفته می‌شوند (10 و 20). سلول‌های مشتق از مغز استخوان و میوبلاست‌های عضله اسکلتی اولین سلول‌هایی بودند که برای برگرداندن فعالیت قلبی بعد از انفارکتوس مایوکاردی مورد مطالعه قرار گرفتند (4). جدیدترین روش برای تولید سلولهای قلبی بازبرنامه ریزی مستقیم (Direct reprogramming) است که بوسیله آن از سلول‌های سوماتیک مانند فیبروبلاست که فاقد هر گونه پتانسیل تمایزی هستند، به سلول‌های تمایز یافته دیگر از قبیل سلول‌های قلبی تولید می‌شود (18). در این فرایند که تحت عنوان "تبدیل مستقیم (Direct conversion)" و " دگرتمایزی (Transdifferentiation)" نیز شناخته می‌شود، هیچگاه سلول‌های پرتوان (induced pluripotent stem cells or iPSC) ایجاد نمی‌شوند (15). تاکنون گزارشات متعددی در مورد بازبرنامه ریزی مستقیم سلول‌های فیبروبلاست به کاردیومایوسیت، منتشر شده اند (8). در اولین مطالعه Ieda و همکارانش گزارش کردند که Gata4، Mef2C و Tbx5 می توانند سلولهای فیبروبلاست موشی را به کاردیومایوسایت تبدیل کنند (15). مطالعات بعدی نشان دادند که اضافه کردن فاکتورهای دیگر قلبی مانند Hand2  (3) و یا جایگزین کردن GATA4 با Myocardin  (19) می‌تواند باعث بهبود بازده دگرتمایزی ‌شود. از طرف دیگر گزارش شده است که فاکتور پرتوانی Oct4 می تواند باعث بازبرنامه ریزی مستقیم سلولهای فیبروبلاست به سلولهای خونی شود. این فاکتور اخیرا به همراه سایر فاکتورهای ویژه سلولهای پرتوان القایی (Sox2، Klf4 وC-myc) (13) و نیز به همراه تعدادی کوچک مولکول اختصاصی(11)  برای تبدیل سلولهای فیبروبلاست به قلبی مورد استفاده قرار گرفته است. 

در مطالعه حاضر، سلولهای فیبروبلاست جنینی موش (MEF) با استفاده از وکتورهای ویروسی بیان کننده Oct4 و Mef2C ترانسدیوس شدند. این سلولهای به مدت 3 هفته در محیط اختصاصی سلولهای قلبی کشت شدند. طی این دوره تجمعات سلولی شبه کلونی ایجاد شدند که مارکرهای پیشساز قلبی را بیان کرده، در حالیکه مارکر پرتوانی را بیان نمی کردند. کلونی های شکل گرفته از لحاظ مورفولوژی به کلونی های سلولهای پیشساز قلبی شباهت بسیاری داشته و بصورت کلونال برای دو پاساژ قابلیت پاساژ پذیری داشتند.

مواد و روشها

تولید فیبروبلاست جنینی موش: جهت تولید فیبروبلاست جنینی موش (Mouse embryonic fibroblasts or MEFs) به عنوان سلول‌های مورد نظر برای دگرتمایزی قلبی، از موش نژاد NMRI استفاده گردید.  به طور خلاصه جنین‌های 5/12 روزه از داخل رحم جدا شده و به ظرف حاوی PBS منتقل شدند. کبد و سر جنین‌ها با استفاده از یک جفت پنست جدا شد و باقی مانده لاشه جنین (در صورت زیاد بودن تعداد جنین، فقط دست و پا جنین) به سرنگ 2 میلی‌لیتر منتقل و با استفاده از سوزن شماره 18، جنین‌ها به قطعات کوچک تبدیل گردید و به فلاسک حاوی محیط کشت سلول‌های فیبروبلاستی (DMEM/15%FBS, 1%Penicillin/Streptomycin, 1mM NaHCo3) انتقال داده شد. پس از گذشت 24 ساعت،‌ قطعات سلولی به کف فلاسک چسبیدند و مهاجرت سلولی از آن‌ها آغاز گشت. معمولا 72 ساعت بعد از کشت اولیه (primary culture) پوشش سلولی کف فلاسک 100% (confluent) می‌شود. پس از آن‌که سلول‌ها کف فلاسک را کاملا پوشاندند، با استفاده از آنزیم Trypsin/EDTA سلول‌ها منفرد شده و در فلاسکهای جدید کشت‌داده شدند. سلول‌های MEF در پاساژ سوم برای ترانسداکشن استفاده شدند.

تولید رتروویروس‌های حاوی ژن های Oct4 و Mef2C: برای تولید رتروویرس‌های بیان کننده ژن های Oct4  و Mef2C از رده سلولی Plat-E استفاده شدند (محیط کشت: DMEM/10FBS, , 1%Penicillin/Streptomycin, 1mM NaHCo3, 1 µg/mL Puromycin, 10 µg/mL Blasticidin .( یک روز قبل از آغاز فرایند انجام تراسفکشن و تولید ویروس، سلول‌های Plat-E توسط آنزیم Trypsin/EDTA کننده شده و در پلیت‌های کشت 10 سانتی‌متری کوت شده با ژلاتین و به تعداد 106×2 سلول به ازای هر پلیت کشت شدند ( °C37 و Co2 % 5). از این مرحله به بعد آنتی‌بیوتیک‌ها از محیط کشت حذف شدند. یک روز بعد و با مشاهده تراکم سلولی مناسب (%90-80) ترانسفکشن با استفاده از عامل ترانسفکشن FuGENE 6 و بصورت مستقل برای پلاسمیدهای ویروسی حاوی Oct4 و Mef2c (مقدار 9 میکروگرم از هر پلازمید) انجام شد. 24 ساعت بعد از انجام ترانسفکشن، محیط رویی سلول‌ها توسط سرنگ 10 میلی‌لیتری جمع‌آوری شده و بوسیله یک فیلتر ویژه با قطر منافذ µm 45/0 فیلتر شدند و برای ترانسداکشن سلول‌های MEF مورد استفاده قرار گرفتند.

ترانسداکشن سلول‌های MEF به وسیله رتروویس‌های حاوی Oct4 و Mef2c : سلول‌های MEF در پاساژ سوم برای ترانسداکشن مورد استفاده قرار گرفتند. بدین صورت که این سلول‌ها در ظرف‌های کشت 6 سانتی‌متری کشت شده، سپس یک میلی لیتر از محیط حاوی هر رتروویروس‌ (Oct4، Mef2C) و یک میلی‌لیتر محیط کشت تازۀ سلول‌های فیبروبلاستی به سلولها اضافه شد. برای افزایش بازده ترنسداکشن ماده Polybrene (غلظت نهایی µg/mL 6) به لوله حاوی مخلوط ویروسی اضافه شد. 24 ساعت بعد از ترانسداکشن با رتروویرس‌ها، سلول‌های MEF بوسیله آنزیم تریپسن کنده شده و بعد از شمارش به ظرف‌های کشت 6 چاهکی کوت شده با ماتریژل منتقل شده ( 104×5/4 سلول به ازای هر چاهک) و در محیط سلولهای قلبی (DMEM/M199/10%FBS, 1%Penicillin/Streptomycin, 1mM NaHCo3) کشت شدند. تغییرات سلولی با استفاده از میکروسکوپ و بصورت روزانه انجام شد و در تمام مراحل مطالعه، از سلول‌ها تصاویری میکروسکوپی گرفته شد.

رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس: برای انجام رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس ابتدا محیط کشت روی سلول‌ها حذف شد و سلول‌ها یک بار با محلول شستشو (5/0 درصد PBS/Tween) شستشو داده شده و با پارافرمالدهید 4 درصد به مدت 20 دقیقه، در دمای 4 درجه سانتی‌گراد فیکس شدند. سپس سلول ها دوبار (هر کدام به مدت 5 دقیقه) با محلول شستشو در دمای اتاق شستسو داده شدند و برای نفوذپذیر کردن سلول‌ها، انکوباسیون سلول‌ها با محلول 2/0درصد Triton X- 100 به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق انجام شد. بعد از دو بار شستشوی سلول‌ها (هر بار به مدت 5 دقیقه) در دمای اتاق، مسدود کردن جایگاه‌های غیراختصاصی اتصال آنتی‌بادی (بلوکه کردن) به وسیله تیمار سلول‌ها با سرم بز 10 درصد به مدت 60 دقیقه، در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انجام شد. بعد از یک بار شستشو، آنتی‌بادی‌های اولیه GATA4 (abcam, ab84593) و  ISL1 (abcam, ab20670) با رقت ۱:۱۰۰ به سلول ها اضافه شد و به مدت 60 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوباسیون صورت گرفت. سپس 3 بار شستشو (هر بار به مدت 15 دقیقه) در دمای اتاق انجام شد و آنتی‌بادی ثانویه  Goat Anti-Rabbit (Alexa Fluor® 488) (abcam, ab150077) با رقت ۱:۵۰۰ به سلول ها اضافه شد و انکوباسیون به مدت 60 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انجام شد. در ادامه سلول‌ها سه بار (هر بار به مدت 15 دقیقه) در دمای اتاق شستشو داده شدند و رنگ DAPI  به منظور رنگ‌آمیزی هسته اضافه شد. مشاهده و تصویر برداری از نمونه‌های رنگ‌آمیزی شده با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت (Carl Zeiss Axioplan-2) صورت گرفت.

بررسی بیان ژن‌ها به روش qRT-PCR : ابتدا سلول‌ها به وسیله آنزیم Trypsin/EDTA به صورت منفرد درآمدند و بعد از سانتریفیوژ، پلاک خشک سلولی در فریزر80- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. به منظور جداسازی کل RNA از سلول‌ها از محلول ترایزول استفاده شد. برای اجتناب از آلودگی RNase، در همه مراحل از میکروتیوب‌ها و سرسمپلرهای عاری از RNase و DNase و اتوکلاو شده استفاده شد. بررسی کیفی RNA با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (Nanodrop (ND-1000) spectrophotometer) انجام شد. پس از تعیین میزان جذب نمونه، معادل 5 میکروگرم RNA برداشته و با نصف میزان RNA یعنی 5/2 میکروگرم DNase تیمار شد. پس از انجام تیمار آنزیمی برای کسب اطمینان از عدم وجود آلودگی DNA 5/0 میکروگرم از نمونه را در ژل آگارز %1 بارگزاری کرده و باند‌های 18s و28s و عدم وجود باند DNA را در نمونه بررسی شد.  DNA مکمل (cDNA) با استفاده از oligo(dT)20 primer به عنوان پرایمر و کیت Super Script III First-Strand Synthesis System انجام شد. برای انجام واکنش‌های Real-Time PCR ازدستگاه Corbett Research Rotor-Gene 3000 استفاده شد. برای افزایش دقت، از هر گروه آزمایشی سه تکرار مستقل زیستی در نظر گرفته شد. ژن Gapdh به‌عنوان کنترل داخلی در نظر گرفته شد و از روش 152-∆∆ct">  برای مقایسه‌ تغییرات بیان ژن‌ها استفاده شد (توالی آغازگرهای مورد استفاده در شکل 2).

نتایج

شکل گیری سلولهای پیشساز قلبی: سلولهای فیبروبلاستی بعد از افزایش بیان Oct4 و Mef2C دچار تغییراتی مورفولوژیکی مشخصی شدند. یک هفته بعد از ترانسداکشن، یکسری ساختارهای شبه کلونی آشکار شدند که به مرور اندازه آنها بزرگتر شد (شکل 1). این کلونی ها، 3 هفته بعد از ترانسداکشن مورفولوژی مشخص تری پیدا کردند. در گروه کنترل که هیچ کدام از رتروریروسها را دریافت نکرده بود، هیچ گونه تغییر مورفولوژیک خاصی مشاهده نشد. و سلولها بطور کامل کف ظرف را اشغال کرده و مورفولوژی سلولهای پیر را نشان دادند. در گروهی که تنها با استفاده از Oct4  یا Mef2C ترانسدیوس شده بودند، تغییرات سلولی قابل رویت بود ولی هیچگونه ساختار شبه کلونی مشاهده نشد (شکل 1).  برای بررسی هویت سلول‌هایی که بواسطه افزایش بیان Oct4 و Mef2C ایجاد شده بودند، بیان یکسری از ژنهای قلبی مورد بررسی قرار گرفت. 3 هفته بعد از افزایش بیان دو فاکتور نسخه برداری فوق، بیان مارکرهای ویژه سلولهای پیشساز قلبی (Nkx2.5, Gata4, Isl1, Mef2C) و مارکر ویژه سلولهای کاردیومایوسایت بالغ (Mlc2v) با استفاده از Real-Time PCR مورد ارزیابی قرار گرفت. بطور مشخصی مارکرهای ویژه سلولهای پیشساز قلبی بیان بسیار بالایی در سلولهای بازبرنامه ریزی شده داشتند (شکل2، ب).

 

 

 

 

شکل 1. شکل گیری ساختارهای شبه کلونی در سلولهای ترانسدیوس شده با Oct4 و Mef2C. سلولهای گروه کنترل هیچگونه تغییرات سلولی خاصی از خود بروز نداده و سلولهای گروه Oct4 تنها  و نیز Mef2C تنها نیز اگرچه تغییرات مورفولوژیک بروز دادند که در گروه Oct4  بیشتر با تکثیر سلولی و در گروه Mef2C  با کنده شدن سلولی همرا بود. Oct4 و Mef2C باعث شگل گیری تجمعات سلولی ِ شبه کلونی شدند که تاحدی مشابه کلونی پیشسازها و سلولهای بنیادی قلبی بودند (دوایر نقطه چین)

 

شکل 2. سلولهای پیشساز قلبی بواسطه بازبرنامه ریزی مستقیم ایجاد شدند. الف) توالی پرایمرهای مورد استفاده در بررسی بیان ژنهای قلبی و پرتوانی. ب) سلولهای بازبرنامه ریزی شده مارکرهای پیشسازهای قلبی را بطور مشخصی بیان می کنند. بررسی 3 هفته بعد از ترانسداکشن (شروع فرایند دگرتمایزی) انجام شده است. Gapdh به عنوان کنترل داخلی استفاده شده است. مارکر پرتوانی Nanog هیچگونه بیان را نشان نمی دهد. پ) فیبروبلاستهای اولیه استفاده شده برای بازبرنامه ریزی فاقد هرگونه آلودگی سلولی به سلولهای قلبی بوده و مارکرهای ویژه دودمان قلبی در آنها بیان نمی شود (قلب جنین موش به عنوان کنترل سلولی و Gapdh به عنوان کنترل داخلی برای بررسی بیان ژن استفاده شد).

 

 

البته مارکر بلوغ (Mlc2v) نیز تا حدی بیان داشت که در مقایسه با مارکرهای سلولهای پیشساز بسیار پایین تر بود. سلولهای بازبرنامه ریزی شده، مارکرهای ویژه سلولهای پیشساز را در سطح پروتئین نیز بیان می کردند. رنگ آمیزی ایمونوفلورسنت نشان داد که سلولهای بخش های مرکزی کلونی‌های ایجاد شده فاکتورهای نسخه برداری Isl1 و GATA4 را بطور مشخصی بیان می‌کنند (شکل3). این نتایج بطورکلی نشان می دهد که افزایش بیان Oct4 و Mef2C می تواند باعث بازبرنامه ریزی سلولهای فیبربلاستی به سلولهای شبه پیشساز قلبی شود. اگرچه این سلول‌های تنها قابلیت تکثیر برای دو پاساژ در محیط مورد استفاده در مطالعه را داشتند و به سرعت مورفولوژی خود را از دست دادند.

 

 

شکل 3. کلونی های شبه پیشساز قلبی مارکرهای قلبی را بیان می کنند. تجمعات شبه کلونی ایجاد شده بعد از 21 روز از ترانسداکشن، مارکرهای هسته ایی Isl1 و GATA4 را بیان می کنند. بیان این مارکرها که فاکتورهای نسخه برداری ویژه سلولهای پیشساز قلبی (سلولهای بینادی قلبی) هستند به خوبی درون هسته قابل مشاهده است. هسته ها همچنین با DAPI نیز رنگ شده اند.­­­­­­­­­­


سلولهای شبه پیشساز قلبی به‌ واسطه بازبرنامه ریزی مستقیم ایجاد شدند: برای اطمینان از اینکه سلولهای شبه پیشسازی شکل  گرفته از ابتدا در بین سلولهای فیبروبلاست نبوده اند، سلولهای فیبروبلاست جنینی موش تنها از دست و پا، دم و نیمه تحتانی جنینهای موش استخراج شد. درنتیجه کشت اولیه فاقد هرگونه سلولی قلبی بود. بیان ژنهای قلبی نشان داد که این ژنها در سلولهای فیبروبلاستی مورد استفاده برای بازبرنامه ریزی بیان نداشتند (شکل 2، پ). از طرفی در طی فرایند بازبرنامه ریزی مارکر پرتوانی Nanog نیز بیان نشد (شکل2، ب) که نشان می دهد هیچگونه سلول پرتوانی در طی فرایند باز برنامه ریزی شکل نگرفتند. بطورکلی این نتایج نشان می دهند که سلولهای شبه پیشساز قلبی بواسطه بازبرنامه ریزی مستقیم سلولهای فیبروبلاست شکل گرفته اند.

بحث و نتیجه گیری

در این مطالعه نشان دادیم که افزایش بیان Oct4 و Mef2C

می تواند سبب شکل‌گیری کلونی‌هایی شود که مارکرهای ویژه پیشساز قلبی را بیان می کنند. این کلونی های مارکر پرتوانی Nanog را بیان نمی کردند. سلولهای شبه پیشساز قلبی شکل گرفته در این مطالعه در محیط کشت سلولهای قلبی بالغ شکل گرفتند. احتمالا این علت اصلی عدم پاساژ پذیری این سلولها بود، بطوریکه این سلولها بسیار سریع و در عرض دو پاساژ ماهیت خود را تغییر دادند. البته در این مطالعه بررسی نشد که سلولها بعد از این ماهیت خود را تغییر می‌دهند به چه سلولهای قلبی و احیانا غیر قلبی تبدیل می شوند. حتی این سلولها در 3 هفته بعد از ترانشداکشن و همراه با مارکرهای ویژه سلولهای پیشساز قلبی، مارکر سلول قلبی بالغ (Mlc2v) را نیز بیان می کردند، که نشان دهنده مناسب نبودن محیط و شرایط کشت برای سلولهای پیشساز قلبی می باشد. از آنجاییکه تاکنون هیچ فاکتوری به تنهایی نتوانسته است سلولهای پرتوان القایی را در شرایط کشت سلولهای پرتوان ایجاد کند پس شکل گیری سلولهای پرتوان در محیط کشت سلولهای قلبی و در حضور یک فاکتور تمایزی قلبی (Mef2C) غیر منطقی و عجیب می باشد. همانطور که در گروهی که تنها با Oct4 تنها ترانسدیوس شده بود، هیچ گونه کلنی شبه iPSC ویا شبه پیشساز قلبی شکل نگرفت. در این مطالعه نشان دادیم که فاکتورهای پرتوانی به همراه فاکتورهای قلبی می توانند برای بازبرنامه‌ریزی مستقیم سلولهای فیبروبلاست به سلولهای دودمان قلبی استفاده شوند. این رویکرد برای تبدیل سلولهای فیبروبلاست به غضروف (17) و استخوان (14) گزارش شده است. مطالعات بعدی می توانند با بررسی شرایط کشت اختصاصی‌تر، تولید کارآمد سلولهای پیشساز قلبی را سبب شوند. همچنین این احتمال وجود دارد که کشت سه بعدی بازده دگرتمایزی را افزایش دهد (1). چنانچه این سلولها قابلیت پاساژ پذیری داشته باشند گزینه مناسبی را برای تولید سایر سلولهای قلبی (کاردیومایوسایت، اندوتلیال و عضله صاف دور‌رگی) فراهم می‌کنند. تاکنون مواد مختلفی برای القا تکثیر و یا مهار تکثیر سلولهای مختلف مورد استفاده قرار گرفته اند که این عوامل می توانند در افزایش تکثیر سلولهای پیشساز قلبی حاصل از دگرتمایزی موثر باشند (2). در این مطالعه، دگرتمایزی سلولهای فیبروبلاست به سلولهای پیشساز قلبی تنها با استفاده از دو فاکتور Oct4 و Mef2C صورت گرفته است و سایر ترکیبات فاکتورهای پرتوانی و فاکتورهای قلبی می توانند سلولهای پیشساز قلبی و یا سلولهای بالغ قلبی را با بازده  و کیفیت بالاتری تولید کنند. تمام این موارد نیاز به مطالعات بیشتر و دقیق تری دارد.

1. دیزجی، ع.، هدایی، ل.، سهیلی، ز-س.، (1393)، زیست پلیمرآلژینات بعنوان بستر سه بعدی جهت کشت و تمایز سلولهای بنیادین مزانشیمی بافت چربی انسان به سلولهای کندروسیت غضروف, مجله پژوهشهای جانوری. دوره 27، شماره 4، 521-534

2. منصوری، ف.، سپهری، ح.، دلفی، ل.، (1395) اثر مواد پکتینی بر القا رها سازی نیتریک اکساید و مهار تکثیر سلولی در دودمان سلولی سرطان پروستات انسانی LNCaP,  مجله پژوهشهای جانوری. دوره 29، شماره 4، 480-492.

 

3.  Acharya A., Huang G.N., Luo X., Nam Y.-J., Song K., (2012) Heart repair by reprogramming non- myocytes with cardiac transcription factors, Nature, 485, 599-604.

4. Ardehali, R., Chen, C.H., Sereti, K.I., Wu, B.M., (2015) Translational aspects of cardiac cell therapy,  Journal of cellular and molecular medicine, 19, 1757-1772.

5. Bassel-Duby, R., Olson, E.N., Xin, M., (2013) Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair, Nature reviews Molecular cell biology, 14, 529-541.

6. Benjamin, E.J., Berry, J.D., Borden, W.B., Bravata, D.M., Go, A.S., Mozaffarian, D., (2013) Heart  disease              and stroke statistics--2013 update: a report from the American Heart Association,  Circulation, 127e6.

7. Boudoulas, K.D., Hatzopoulos, A.K., (2009) Cardiac repair and regeneration: the Rubik’s cube of cell   therapy for heart disease, Disease models & mechanisms, 2, 344-358.

8. Budniatzky I., Gepstein L., (2014) Concise review: reprogramming strategies for cardiovascular  regenerative medicine: from induced pluripotent stem cells to direct reprogramming, Stem cells  translational medicine, 3, 448-254.

 9. Burkhoff, D., Edwards, N., Homma, S., Kocher, A., (2001) Neovascularization of ischemic myocardium  by human bone-marrow–derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces  remodeling and improves cardiac function, Nature medicine, 7, 430-436.

 10. Burridge, P.W., Gold, J.D., Keller, G., Wu, J.C., (2012) Production of de novo cardiomyocytes: human   pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming, Cell stem cell, 10, 16-28.

11. Cao N., Ma T., Nie B., Spencer C.I ,  Srivastava D., (2014) Small molecules enable cardiac reprogramming of mouse fibroblasts with a single factor, Oct4, Cell reports, 6, 951-960.

12. Davis, R.P., Krieger, J.E., Mummery, C.L, (2010) Challenges in using stem cells for cardiac repair,  Science translational medicine,  27ps17-27ps17.

13. Efe J.A., Chen J., Hilcove S., Kim J. ,  Ouyang K., (2011) Conversion of mouse fibroblasts into  cardiomyocytes using a direct reprogramming strategy, Nature cell biology, 13, 215-222.

14. Ejima A., Kishida T., K. Fujiwara H., Nishioka K., Kubo T., (2015) Direct conversion of human  fibroblasts into functional osteoblasts by defined factors, Proceedings of the National Academy of Sciences, 112, 6152-6157.

15. Fu J.-D., Ieda M., (2010) Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by  defined factors, Cell, 142, 375-386.

16. Gaskin, D.J., Richard, P., (2012) The economic costs of pain in the United States, The Journal of Pain,  13, 715-724.

17. Hiramatsu K., Nakagawa K., Outani H., Sasagawa S., Yoshikawa H., Tsumaki N., (2011) Generation of  hyaline cartilaginous tissue from mouse adult dermal fibroblast culture by defined factors, The  Journal of clinical investigation, 121, 640-657.

18. Khaloughi, K., Pournasr, B., Salekdeh, G.H., Totonchi, M., (2011) Concise review: alchemy of biology:  generating desired cell types from abundant and accessible cells, Stem cells, 29, 1933-1941.

19. Khattak S., Lindemann D., Poulet C., Protze S., (2012)  A new approach to transcription factor  screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells, Journal of molecular and  cellular cardiology, 53, 323-332.

20. Lee, R.T., Segers, V.F., (2008) Stem-cell therapy for cardiac disease, Nature, 451, 937-942.

21. Lee, R.T, Steinhauser, M.L., (2011) Regeneration of the heart, EMBO molecular medicine, 3, 701-712.

22. Lietz, K., Miller, L.W., (2007) Improved survival of patients with end-stage heart failure listed for  heart transplantation: analysis of organ procurement and transplantation network/US United  Network of Organ Sharing data, 1990 to 2005, Journal of the American College of Cardiology,  50.1282-1290.

23. Nichols, M., Rayner, M., Scarborough, P.,Townsend, N., (2013) European cardiovascular disease  statistics,2, 12-20.