نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانش آموخته کارشناسی ارشد شیلات، واحد لاهیجان، دانشگاه آزاد اسلامی، لاهیجان
2 استادیار گروه شیلات، دانشکده منابع طبیعی، واحد لاهیجان، دانشگاه آزاد اسلامی، لاهیجان
3 دانشیار گروه شیلات، دانشکده منابع طبیعی، واحد لاهیجان، دانشگاه آزاد اسلامی، لاهیجان
4 دکتری دامپزشک بخش بهداشت و بیماریهای آبزیان، موسسه تحقیقات بینالمللی تاسماهیان دریای خزر،رشت
چکیده
هدف از تحقیق حاضر بررسی تاثیرات عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس بر فراسنجههای خونی در ماهیان مبتلا شده به (Aeromonas hydrophila) بوده است. ایجاد آلودگی تجربی ماهیان آمور با باکتری آئروموناسهیدروفیلا با تراکمهای 106× 5/1 ، 107× 5/1 ، 108× 5/1 و 109× 2/1 (cfu/ml) به محوطه صفاقی ماهیان انجام شد که نتایج نشان دهنده ایجاد بیماری در تراکم 108× 5/1 و 109× 2/1(cfu/ml) باکتری بوده است. تأثیر عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس در غلظتهای تیماری 250، 410، 580 و 750 (ppm) به صورت حمام کوتاه مدت (به مدت 60دقیقه) بر بچهماهیان آمور (با میانگین وزنی 25 گرم) طی مدت 10روز با 3 تکرار مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج حاصل از بررسی فراسنجههای خونی ماهیان مورد آزمایش که بر اساس آزمون تجزیه واریانس یکطرفه و آزمون دانکن انجام گرفت نشان داد که اختلاف معنیدار آماری در میزان گلبولهایسفید، گلبولهایقرمز، حجم متوسط گلبولی، غلظت متوسط هموگوبین در گلبولقرمز، غلظت متوسط هموگلوبین گلبولهایقرمز، نوتروفیل، لینفوسیت خون ماهیان با تیمار شاهد حکایت دارد(P<0/05)، بررسی نتایج حاصل از این مطالعه نشان میدهد عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس خصوصا در غلظتهای پایین به دلیل عدم ایجاد تغییرات قابل توجه در فراسنجههای خونی میتوانند به عنوان ترکیبات ضدمیکروبی در کنترل عوامل بیماریزا و درمان ماهی آمور مورد توجه قرار گیرند.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Effects of different amounts of hydroalcoholic extract of eucalyptus on the blood parameters of Gras Carp (Ctenopharyngodon idella) infected with Aeromonas hydrophila
نویسندگان [English]
1 M.Sc. in Fisheries, Lahijan Branch, Islamic Azad University, Lahijan, I.R. of Iran
2 Assistant Professor in Department of Fisheries, Lahijan Branch, Islamic Azad University, Lahijan, I.R. of Iran
3 Assistant Professor in Department of Fisheries, Lahijan Branch, Islamic Azad University, Lahijan, I.R. of Iran
4 Dr. In veterinary International Sturgeon Research Institute, Agricultural Research Education and Extension Organization(AREEO), Rasht, Iran
چکیده [English]
The purpose of this study the effect of eucalyptus extract on blood and immune parameters in fish infected with Aeromonas hydrophila after treatment with eucalyptus extract was Created grass carp experimentally infected with Aeromonas hydrophila density 1.5×106 ,1.5×107 ,1.5×108 ,1.2 ×109 (cfu/ml ) The peritoneal cavity of fish was the results indicate that disease in dense 1.5×108 ,1.2 ×109 (cfu/ml ) bacteria have been. Effect of eucalyptus extract concentrations 250 , 410 ,580 ,750 (ppm) baths for a short time (60 minutes) on the grass carp (average weight 25 g) were evaluated over a period of 10 days with 3 replicates. The results of the analysis of blood parameters of the fish that were tested on the basis of one way ANOVA and Duncan test showed that there was a significant difference in the amount of white blood cells, red blood cells, mean corpuscular volume, mean concentration of hemoglobin in the red blood cell, medium concentration Hemoglobin, RBC, neutrophil, Lymphocyte, Fetal blood, with control treatment (p < 0.05), The serological results showed that the extract increases the amount of lysozyme and immunoglobulin and albumin blood Eucalyptus species in different treatments were compared to the negative control and significant differences between the treatments in question existed (p < 0.05).
کلیدواژهها [English]
تاثیر مقادیر مختلف عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس بر فراسنجههای خونی ماهیان آمور (Ctenopharyngodon idella)آلوده شده به باکتری آئروموناسهیدروفیلا
(Aeromonas hydrophila)
سید محمد صادق رودبارکی1*، هادی ارشاد1، حسین خارا1 و مهدی معصومزاده2
1 لاهیجان، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد لاهیجان، دانشکده منابع طبیعی، گروه شیلات
2 رشت، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، موسسه تحقیقات بینالمللی تاسماهیان دریایخزر، بخش بهداشت و بیماریهای آبزیان
تاریخ دریافت: 23/3/96 تاریخ پذیرش: 16/11/96
چکیده
هدف از تحقیق حاضر بررسی تاثیرات عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس بر فراسنجههای خونی در ماهیان مبتلا شده به (Aeromonas hydrophila) بوده است. ایجاد آلودگی تجربی ماهیان آمور با باکتری آئروموناسهیدروفیلا با تراکمهای 106× 5/1 ، 107× 5/1 ، 108× 5/1 و 109× 2/1 (cfu/ml) به محوطه صفاقی ماهیان انجام شد که نتایج نشان دهنده ایجاد بیماری در تراکم 108× 5/1 و 109× 2/1(cfu/ml) باکتری بوده است. تأثیر عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس در غلظتهای تیماری 250، 410، 580 و 750 (ppm) به صورت حمام کوتاه مدت (به مدت 60دقیقه) بر بچهماهیان آمور (با میانگین وزنی 25 گرم) طی مدت 10روز با 3 تکرار مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج حاصل از بررسی فراسنجههای خونی ماهیان مورد آزمایش که بر اساس آزمون تجزیه واریانس یکطرفه و آزمون دانکن انجام گرفت نشان داد که اختلاف معنیدار آماری در میزان گلبولهایسفید، گلبولهایقرمز، حجم متوسط گلبولی، غلظت متوسط هموگوبین در گلبولقرمز، غلظت متوسط هموگلوبین گلبولهایقرمز، نوتروفیل، لینفوسیت خون ماهیان با تیمار شاهد حکایت دارد (P<0/05)، بررسی نتایج حاصل از این مطالعه نشان میدهد عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس خصوصا در غلظتهای پایین به دلیل عدم ایجاد تغییرات قابل توجه در فراسنجههای خونی میتوانند به عنوان ترکیبات ضدمیکروبی در کنترل عوامل بیماریزا و درمان ماهی آمور مورد توجه قرار گیرند.
واژه های کلیدی: ماهی آمور، اکالیپتوس، آئروموناسهیدروفیلا ، فراسنجههای خونی
* نویسنده مسئول، تلفن: 01412229081 ، پست الکترونیکی: sadegh.roudbaraki@gmail.com
مقدمه
کپورماهیان از جمله مهمترین ماهیان پرورشی در ایران بوده و در بیشتر مناطق کشور مزارع پرورشی ماهیان مذکور وجود دارد و بیش از 60 درصد از تولیدات آبزیپروری کشور را به خود اختصاص دادهاند. در بین ماهیان گرمابی نیز ماهی آمور یا کپور علفخوار(Ctenopharyngodon idella) با ارزشترین و پرطرفدارترین گونه نزد مصرفکنندگان و تولیدکنندگان میباشد.ولی متاسفانه طی سالهای اخیر، تلفات این ماهی با ارزش، پرورش این گونه را با چالش جدی مواجه ساخته است. بطوری که بسیاری از پرورشدهندگان نسبت این گونه را در استخر به حداقل رسانده و یا آن را حذف نمودهاند (10). از مهمترین عوامل تهدیدکننده پرورش متراکم ماهیان از جمله ماهی آمور آلودگی به عوامل بیماریزا و در نتیجه بروز تلفات در آنها میباشد. اولین بار رضویلر و همکاران با جدا سازی آئروموناسهیدروفیلا از ماهی آمور در استان گیلان احتمال بیماریزایی و ایجاد علائم بیماری توسط این باکتری را در گونه آمور گزارش نمودند (4). پیغان و اسماعیلی در بررسی علل این تلفات موفق به جداسازی آئروموناسهای متحرک از آبشش، کلیه و کبد ماهی آمور گردیدند (1). سلطانی و موسوی دو گونه آئروموناسهیدروفیلاو آﺋﺮوﻣﻮﻧﺎسوروﻧﯽ را از تلفات ماهی آمور در دو کارگاه در استانهای گیلان و تهران گزارش نمودند (5). باکتریهای خانواده آئروموناس، باسیلهای گرم منفی آب شیرین بوده که اشکال متحرک آنها میتوانند میکروفلور جانوران آبزی باشند و در جانوران خونسرد، خونگرم و حتی انسان نیز بیماریزا باشند. آئروموناسهای متحرک عامل سپتیسمیهموراژیک در ماهیان آب شیرین عبارتند از: آئروموناسهیدروفیلا، آﺋﺮوﻣﻮﻧﺎسﮐﺎوﯾﻪ و آئروموناسسوبریا که همگی گرم منفی، بیهوازی اختیاری، غیرهاگزا و متحرک بوده که در مورد نقش آنها به عنوان پاتوژن اولیه شک و تردید وجود دارد اما نقش مهمی را در روند بیماری در ماهیان مبتلا ایفا میکنند (12). داروهای گیاهی طی قرنهای متمادی تنها منبع قابل دسترس جهت درمان دردها و آلام بودهاند و امروزه نیز با وجود پیشرفت علم و توسعه کاربرد داروهای سنتزی، هنوز گیاهان دارویی در مقیاس وسیع مورد استفاده قرار میگیرند. در مورد بیماریهای عفونی باکتریایی با توجه به محدودیتهای استفاده از آنتیبیوتیکها از جمله ایجاد مقاومتهای دارویی در ماهی و انسان (در مورد آنتیبیوتیکهایی که هم در ماهی و هم در انسان مصرف میشوند) مشکلات زیستمحیطی و قیمت بالای برخی آنتیبیوتیکها، گرایش به جایگزینی آنها با مواد کم ضررتر و ارزانتر را تقویت نموده است . از بین مواد مختلف جایگزینی آنتیبیوتیکها، اخیر اً فرآوردههایی با منشاء گیاهی جایگاه ویژهای یافتهاند (11).
اکالیپتوس یکی از معروفترین گیاهان دارویی است که از دیرباز اثرات ضدمیکروبی و خواص دیگر آن مورد توجه بوده است . این گیاه منبع غنی از پلیفنلها و ترپنوئیدهاست و ترکیب اصلی برگ آن اکالیپتول(C10H18O) میباشد (8). عصاره برگ این گیاه دارای خواص ضدسرطانی، ضدالتهابی، ضددرد، آنتیاکسیدان ، ضدازدیاد قندخون ، ضدمالاریایی، ضدقارچی و ضدویروسی است (21). هدف تحقیق حاضر ارزیابی اثر عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس بر فراسنجههایی نظیر گلبولهای سفید، گلبولهای قرمز، هماتوکریت، هموگلوبین، ایمنوگلوبین، لیزوزیم در ماهیان مبتلا شده به آئروموناسهیدروفیلا بوده است.
مواد و روشها
این تحقیق در پاییز 1391 در موسسه تحقیقات بینالمللی تاسماهیان دریای خزر به انجام رسید. عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس مصرفی در این تحقیق، جهت اطمینان از درصد خلوص (اتانول 70درصد) ماده مؤثره، از یکی از شرکتهای معتبر تولیدکننده داروهای گیاهی با نام شرکت زردبند، تهیه گردید (جدول1).
جدول 1- مشخصات عصاره اکالیپتوس تهیه شده از شرکت زردبند
ویژگی |
Range |
Batch |
ظاهر |
Clear |
clear |
رنگ |
قهو ه ای |
قهو ه ای |
pH |
4- 5/5 |
5/21 |
چگالی |
1/022-1/045 |
1/037 |
Refractive Index |
1/388-1/395 |
1/388 |
Dry residue |
3-4/6 |
4/00 |
به منظور ایجاد آلودگی تجربی در بچهماهیان آمور به باکتری آئروموناسهیدروفیلا جدا شده از ماهیان خاویاری که جنس و گونه آن با استفاده از آزمایشات باکترولوژیک و روش ملکولی در موسسه تحقیقات بینالمللی تاسماهیان دریای خزر مشخص شده بود در محیط کشتتریپیکاز سوی براث(TSB)کشت داده شده و در مدت زمان 24 ساعت در 27 درجه سانتی گراد مورد انکوباسیون قرار گرفت با استفاده از دستگاه سانتریوفوژ جدا نموده تا باکتری خالص مورد آزمایش بدستآید. سپس باکتری آئروموناسهیدروفیلا که با غلظتهای cfu/ml106، cfu/ml107، cfu/ml108 با استاندارد نیم مکفارلند و cfu/ml 109 با استاندارد 4 مکفارلند برابر بود، تهیه شد. برای رسیدن به این غلظتها و مقایسه آن با استاندارد مکفارلند باکتری سانتریوفوژ شده را با استفاده از سمپلر به میزان 100 ماکرولیتر برداشته و به لوله آزمایش حاوی سرم فیزیولوژی اضافه و با دستگاه ورتکس آنها را میکس نموده و این کار تا زمانی که کدورت با استاندارد مکفارلند برابر شود ادامه پیدا کرد و سپس بصورت چشمی مورد مقایسه قرار گرفت، باکتری تهیه شده بدین روش به محوطه صفاقی ماهیان آمور با استفاده از سرنگ تزریق شد (13)، سپس ماهیان به آکواریومهای 20 لیتری با دمای 20 درجه سانتی گراد منتقل شدند. ماهیان تا 96 ساعت روزانه از نظر تلفات و علائم بیماری شامل بیحالی، اگزوفتالمی، تیرگی پوست و غیره مورد بررسی قرار گرفتند و تلفات روزانه ماهیان ثبت شد. بر اساس نتایج بدست آمده از انجام آزمایشات LC50 96 ساعته عصاره هیدروالکلی اکالییپتوس بر روی بچهماهیان آمور و نتایج حاصله از حداقل غلظت مهار کنندگی رشد (MIC) و حداقل غلظت کشندگی باکتری آئروموناسهیدروفیلا (MBC) اقدام به انتخاب 4 غلظت از عصاره هیدروالکلی اکالییپتوس شد. بر اساس غلظتهای مذکور گروههای تیمار و شاهد(مثبت و منفی) انتخاب و برای هر کدام از این گروه ها 3 تکرار در نظر گرفته شد. ماهیان مبتلا به آئروموناسهیدروفیلا با غلظتهای تیماری (ppm)250 مقدار(cc)5 عصاره هیدروالکلی اکالییپتوس دریافت کردند، (ppm)480 برابر(cc)8.2 از عصاره هیدروالکلی اکالییپتوس، (ppm)510 برابر(cc)11 عصاره هیدروالکلی اکالییپتوس، (ppm)750 به مقدار (cc)15 از عصاره هیدروالکلی اکالییپتوس دریافت نمودند. شاهد مثبت (ماهیانی که به آنها باکتری آئروموناس هیدروفیلا تزریق شده بود ولی مرحله درمان روی آنها صورت نگرفت و هیچگونه عصاره ای دریافت نکردند) و شاهد منفی (ماهیانی که به آنها باکتری آئروموناسهیدروفیلا تزریق نشده بود و مرحله درمان روی آنها صورت نگرفت و هیچگونه عصاره ای دریافت نکردند) انتخاب گردید و برای هر کدام از این گروه ها 3 تکرار در نظر گرفته شد. پس از تعیین گروههای تیمار و شاهد نسبت به حمام بچهماهیان آمور آلوده شده به باکتری آئروموناسهیدروفیلا و دارای علائم ناشی از بیماری بعد از 96 ساعت از زمان آلودگی، روزانه بمدت یک ساعت در طی 10 روز اقدام گردید. جهت بررسی تاثیر مقادیر مختلف عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس بر فراسنجههای خونی ماهیان آمور تیمار شده با عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس مورد مطالعه نسبت به خونگیری از 30 درصد نمونه ها (3 قطعه ماهی از هر تکرار) به وسیله سرنگ 2 سیسی از ساقه دمی و در بعضی موارد با قطع ساقه دمی اقدام و خون بدست آمده بلافاصله وارد اپندورفهای حاوی ماده ضدانعقاد هپارین گردید. پس از تهیه نمونههای خون از ماهیان مورد بررسی اندازهگیری شاخصهای خونی(CBC) به روش استاندارد به شرح ذیل انجام گردید:
تعیین درصد هموگلوبین در نمونههایخون (Hb): اندازهگیری هموگلوبین با واحد گرم در دسیلیتر به دو روش دستگاهی با استفاده ازSysmexlys و یا با استفاده از محلول سیانومت هموگلوبین در طول موج 540 نانومتر با درابکین و منحنی استاندارد به روش دستی امکان پذیر است. این آزمایش از روش دستگاهی استفاده شد (18).
- تعیین غلظت هماتوکریت در نمونههای خون (HCT) : اندازهگیری هماتوکریت با لولههای میکروهماتوکریت و توسط میکروسانتریفوژ Hettich با دور 14000rpm اندازهگیری شده است (18).
گلبولقرمز به کمک محلول Lewis و با کمک پیپت ملانژور و لام نئوبار شمارش شده است.
گلبولسفید به کمک محلول Lewis در 1/0گرم (Brillant cresyl blue) به کمک پیپت ملانژور و لام نئوبار شمارش شده است (18).
شمارش افتراقی لکوسیتها در نمونههای خون (diff): در این بررسی جهت تعیین مقادیر لوکوسیتهای خون از روشهای توصیه شده توسط Svobodova و همکاران در سال 1991 و Feldman و همکاران در سال 2000 استفاده و شمارش جمعیت انواع گلبولهایسفید نمونههای خون ماهیان مورد بررسی با استفاده از لام نئوبار صورت پذیرفت (15 ،18 ،21).
محاسبه MCV (حجم متوسط سلول) با واحد (u3) میکرون مکعب:
=(mean cell volume) MCV
محاسبه MCH (هموگلوبین متوسط گویچه ای) با واحد پیکوگرم
=( mean corpuscular haemoglobin) MCH
محاسبه MCHC (متوسط غلظت هموگلوبین سلول) با واحد درصد
100 × = (mean cell Hb concentration) MCHC
نمونههای خون تهیه شده در دمای آزمایشگاه با سرعت 3000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ و سرم آنها جدا گردید.
اندازهگیری ایمنوگلوبین(IgM):
شکل6-2- ایجاد آلودگی تجربی در ماهی آمور
|
جهت اندازهگیری IgMنمونههای سرم تهیه شده از ماهیان تیمار و شاهد از روش Nephelometry استفاده گردید (25).
اندازهگیری غلظت آلبومین سرم: جهت اندازهگیری مقادیر آلبومین نمونههای سرم تهیه شده از ماهیان تیمار و شاهد از روش BCG/Colorinetric استفاده گردید (14).
Albumin+BCG pH 4.2 Albumin-BCG(complex)
آلبومین موجود در سرم با Bromocresol green در pH اسیدی یک کمپلکس رنگی سبز-آبی را ایجاد میکند. شدت رنگ ایجاد شده متناسب با میزان آلبومین نمونه میباشد.
اندازهگیری مقادیر لیزوزیم: برای تعیین میزان لیزوزیم از روش ارائه شده توسطKumari در سال 2006 استفاده شد. به این منظور از پلیتهای 96 خانهای شکل الیزا، مقدار 15 میکرولیتر سرم افزوده شد (17). سپس 150 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتری میکروکوکوس لیزودیکتیکوس تهیه شده در بافر سیتراتسدیم 02/0 مولار و pH 5/5 به میزان 2/0 میلیگرم در لیتر اضافه گردید و جذب نوری اولیه در 450 نانومتر اندازهگیری شد و پس از 1 ساعت در دمای اتاق، مجدداً جذب نوری اندازهگیری شد.
روشهای آماری: به منظور بررسی توزیع نرمال دادهها در گروهها و تکرارها جهت تشکیل تیمارها از آزمون Shapiro-Wilk استفاده شد. در صورت نرمال بودن دادهها به منظور مقایسه آماری بین گروهها در تیمارها از آزمون آنالیز واریانس یکطرفه(Oneway anova) و پس از انجام آزمون Test of Homogeneity of Variances جهت مقایسه گروهها با یکدیگر از آزمون دانکن استفاده شد. کلیه آنالیز های آماری با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 17 استفاده شد.
نتایج
با سپری شدن 96 ساعت از مدت زمان تزریق تعداد 140 عدد بچهماهیان آمور به باکتری آئروموناسهیدروفیلا ماهیان روزانه مورد بررسی قرار میگرفتند در نتیجه مشخص شد که ماهیان تزریق شده با غلطتcfu /ml106 ، cfu /ml107 ( با استاندارد نیم مکفارلند) فاقد علائم بیماری و همچنین تلفات ناشی از تزریق باکتری بودند. علائم بیماری در 12 عدد بچهماهی آمور در غلظت cfu /ml 108 (با استاندارد نیم مکفارلند) در مشاهده شد. اما علائم بیماری در غلظت cfu /ml 109 (با استاندارد چهار مکفارلند) با شدت بیشتر نمایان شد و تعداد 56 عدد از ماهیان در این غلظت تزریقی دچار تلفات گردیدند.
تیمار ماهیان آمور آلوده شده به باکتری آئروموناسهیدروفیلا با غلظت cfu /ml 108 (با استاندارد نیم مکفارلند) به تعداد 84 عدد ماهی انجام گردید که در طی مرحله درمان در 24 ساعت در تیمار چهارم با غلظت (ppm)750 که بر اساس آن (cc) 15 عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس به این تیمار و تکرار آن وارد شده بود دچار تلفات گردیدند (جدول2).
جدول2- تیمار ماهیان آلوده شده به Aeromonas hydrophila
شماره تیمار |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
|||||||||||
غلظت تیمار |
(ppm)250 |
(ppm)480 |
(ppm)510 |
(ppm)750 |
شاهد مثبت(+) |
شاهدمنفی (-) |
|||||||||||
(cc)5 |
(cc)8.2 |
(cc)11 |
(cc)15 |
||||||||||||||
تکرار |
1 |
2 |
3 |
1 |
2 |
3 |
1 |
2 |
3 |
1 |
2 |
3 |
0 |
0 |
|||
تلفات |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
2 |
0 |
|||||
بعد از طی دوره درمانی و تیمار ماهیان با غلظتهای مختلف عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس نتایج مربوط با توجه به عدم وجود علائم ظاهری بیماری در ماهیان بر اساس فراسنجههای خونی و سرمی مورد بررسی قرار گرفت که در ذیل به آنها پرداخت شده است:
نتایج حاصل از بررسی فراسنجههای خونی ماهیان مورد آزمایش که بر اساس آزمون تجزیه واریانس یکطرفه و آزمون دانکن انجام گرفت نشان داد که گلبولهایسفید در تیمارهای اول، دوم و سوم نسبت به تیمارهای شاهد با کاهش قابل ملاحظه ای مواجه شدهاند و در تیمار چهارم میزان گلبولهایسفید نسبت به تیمار شاهد منفی افزایش پیدا کرده است، همچنین میزان گلبولهایقرمز در تیمار دوم نسبت به سایر تیمارها از کمترین میزان برخوردار میباشد و تیمارهای اول و چهارم نسبت به تیمارهای شاهد کمتر میباشد. میزان هموگلوبین در تیمار دوم نسبت به تیمار شاهد منفی افت چشمگیری داشته و نسبت به سایر تیمارها نیز از مقدار کمتری برخوردار میباشد. هماتوکریت خون ماهیان در تیمار دوم به طور قابل ملاحضه ای نسبت به تیمار شاهد منفی کاهش یافته است ودر تیمارهای اول و چهارم این کاهش کمتر میباشد.حجم متوسط گلبولیخون ماهیان در تیمار اول نسبت به تیمار شاهد منفی پایینتر بوده و در سایر تیمارها بالاتر میباشد. غلظت متوسط هموگوبین گلبولهایقرمز خون در تیمار اول نسبت به تیمارهای شاهد کاهش یافته و در تیمار سوم از بالاترین میزان برخوردار میباشد. غلظت متوسط هموگلوبین گلبولهایقرمز خون در تیمار دوم نسبت به تیمارهای شاهد کاهش یافته و در سایر تیمارها افزایش داشته که این میزان در تیمار چهارم بیش از سایر تیمارها میباشد. میزان نوتروفیل در تیمارهای اول، دوم و سوم نسبت به تیمارهای شاهد کاهش یافته و در تیمار چهارم افزایش چشمگیری را میتوان دید. همچنین میزان لنفوسیت در تیمار چهارم نسبت به تیمارهای شاهد کاهش و در تیمارهای اول، دوم و سوم افزایش را نشان میدهد. نتایج از اختلاف معنیدار آماری در میزان گلبولهایسفید، گلبولهایقرمز، حجم متوسط گلبولی، غلظت متوسط هموگوبین در گلبولقرمز، غلظت متوسط هموگلوبین گلبولهایقرمز، نوتروفیل، لینفوسیت خون ماهیان حکایت دارد (P<0/05)، هچنین در نتایج حاصل از شمارش میزان مونوسیت و ائوزینوفیل خون ماهیان در بین تیمارهای مختلف هیچگونه اختلاف معنی دار آماری مشاهده نمیگردد (P>0/05) )جدول 3).
نتایج حاصل از بررسی فراسنجههای سرمی ماهیان مورد آزمایش که بر اساس آزمون تجزیه واریانس یکطرفه و آزمون دانکن انجام گرفت نشان داد که میزان لیزوزیم در تیمار چهارم نسبت به تیمارهای شاهد افزایش داشته اما به نسبت تیمارهای اول، دوم و سوم کمتر میباشد و در تیمار اول از بالاترین مقدار برخوردار است، شمارش حاصل از ایمنوگلوبین نشان داد که تیمار سوم در مقایسه با تیمار شاهد منفی از میزان بیشتری برخوردار بوده اما نسبت به شاهد مثبت این میزان کمتر میباشد اما در تیمارهای اول، دوم و چهارم بطور قابل ملاحظهای از هر دو شاهد مثبت و منفی بالاتر می باشد مقدار آلبومین موجود در خون ماهیان در تیمارهای اول تا چهارم نسبت به تیمارهای شاهد بالاتر بوده و در تیمارهای اول، دوم و چهارم تقریبا برابر بوده و در تیمار سوم بالاترین میزان را دارا میباشد، نتایج اختلاف معنیدار آماری را در میزان لیزوزیم، ایمنوگلوبین و آلبومین خون ماهیان در بین تیمارهای مختلف نشان میدهد (P<0/05) جدول (4).
جدول3 - میانگین فراسنجههای خونی در تیمارهای مختلف
تیمار
فراسنجه خونی |
تیمار 1
|
تیمار2 |
تیمار 3
|
تیمار 4
|
تیمار 5 (شاهد مثبت) |
تیمار 6 (شاهد منفی) |
گلبولسفید |
a 50 ± 4550 |
a25± 4425 |
a 25± 4725 |
c50± 8350 |
c25± 8375 |
b75± 7725 |
گلبولقرمز |
C 5000± 2165000 |
a 4500± 1585000 |
e 4000± 2485000 |
b 5000± 2015000 |
d 3500± 2405000 |
f 4507± 2925000 |
هموگلوبین |
b 1/0± 1/6 |
a1/0± 5/4 |
e05/0± 75/7 |
b1/0± 6 |
c05/0± 05/7 |
d1/0± 4/8 |
هماتوکریت |
b 1± 24 |
a 5/0± 5/19 |
cd 5/0± 5/31 |
b1 ± 24 |
c 5/0± 5/29 |
d 5/0± 5/33 |
حجم متوسط گلبولیخون (MCV) |
a5/ 0 ± 5/114 |
b75/0± 5/125 |
b25/0 ± 5/125 |
a 1 ± 116 |
b5/1± 5/123 |
a5/0 ± 5/115 |
غلظت متوسط هموگوبین در گلبولقرمز(MCH) |
a 56/ 0 ± 5/27 |
a50/0 ± 5/28 |
b87/0 ± 5/31 |
ab 81/0 ± 5/29 |
a50/0 ± 5/28 |
a37/0 ± 5/28 |
غلظت متوسط هموگلوبین گلبول های قرمز(MCHC) |
b5/ 0 ± 5/24 |
a 5/1± 5/22 |
b 45/0 ± 5/25 |
b 50/0 ± 5/26 |
a49/0 ± 5/23 |
b37/0 ± 5/24 |
نوتروفیل |
a 50/ 0 ± 50/32 |
b45/ 0 ± 5/34 |
a0 5/1 ± 5/32 |
d50/0 ± 50/43 |
c 68/1 ± 5/38 |
c5/0 ± 50/38 |
لینفوسیت |
c5/ 1± 50/63 |
c5/0± 5/62 |
c50/2± 50/63 |
a50/1 ± 5/54 |
b50/0± 50/58 |
b 2 ± 50/58 |
مونوسیت |
b81/ 0 ± 3 |
b5/0± 3 |
c68/0± 3 |
a5/0 ± 2 |
c 81/0± 3 |
a85/0 ± 2 |
ائوزینوفیل |
ERR ± 1 |
0 |
ERR ± 1 |
0 |
0 |
ERR ± 1 |
شکل1- مقایسه میزان گلبولهای سفید در تیمارهای مختلف
شکل2- مقایسه میزان گلبولهای قرمز در تیمارهای مختلف
شکل3-مقایسه میانگین میزان هموگلوبین در تیمارهای مختلف
شکل4- مقایسه میانگین میزان هماتوکریت در تیمارهای مختلف
شکل5- مقایسه میانگین میزان حجم متوسط گلبولی در تیمارهای مختلف
شکل6- مقایسه میانگین میزان MCH در تیمارهای مختلف
شکل7- مقایسه میانگین میزان MCHC در تیمارهای مختلف
شکل8- مقایسه میانگین میزان نوتروفیل در تیمارهای مختلف
شکل9- مقایسه میانگین میزان لینفوسیت در تیمارهای مختلف
شکل10- مقایسه میانگین میزان مونوسیت در تیمارهای مختلف
شکل11- مقایسه میانگین میزان ائوزینوفیل در تیمارهای مختلف
جدول4 - میانگین فراسنجههای سرمی در تیمارهای مختلف
فراسنجه سرمی تیمار |
لیزوزیم |
IgM ایمنوگلوبین |
آلبومین |
تیمار1 |
f 5/ 0 ± 5/79 |
c 05/ 0 ± 65/10 |
c 005/ 0± 64/0 |
تیمار2 |
e56/0± 50/49 |
c05/0± 45/10 |
c01/0± 68/0 |
تیمار3 |
d 1± 45 |
a 32/0± 4/8 |
d 01/0± 84/0 |
تیمار4 |
c87/1 ± 39 |
c1/0± 8/10 |
c01/0 ± 66/0 |
تیمار5 (شاهد مثبت) |
b 88/0 ± 5/33 |
b 5/0± 05/9 |
b 005/0± 41/0 |
تیمار6 (شاهد منفی) |
a87/0± 5/18 |
a14/0± 2/8 |
a01/0 ± 36/0 |
شکل12- مقایسه میانگین میزان لیزوزیم با تیمارهای مختلف
شکل13- مقایسه میانگین میزان IGM در تیمارهای مختلف
شکل14- مقایسه میانگین میزان آلبومین در تیمارهای مختلف
بحث
با توجه به اینکه باکتری آئروموناسهیدروفیلا بطور طبیعی در اکثر منابع آبی حضور دارند ضروری است به منظور کنترل و حذف باکتری در مراکز تکثیر و پرورش ماهیان گرمابی اقدام نمود برای این منظور در حال حاضر از مواد ضدعفونیکننده شیمیایی و نیز از انواع آنتیبیوتیکها جهت درمان ماهیان بیمار استفاده میگردد که نتایج متفاوتی در ارتباط با هر کدام از آنها حاصل گردیده است که این امر میتواند ناشی از تغییر فراسنجههای فیزیکی و شیمیایی آب مانند دما، pH، اکسیژن محلول، مواد آلی و مواد معلق باشد (6). تاثیرات سوء زیستمحیطی مواد شیمیایی ضدعفونیکننده و آنتیبیوتیکها در کنار اثرات منفی آنها بر مصرفکنندگان ماهیان تحت درمان مانند ایجاد مقاومت داروئی در برابر عوامل باکتریایی موجب گردیده است امروزه استفاده از مواد طبیعی مانند گیاهان دارویی مورد توجه ویژه قرار گیرد.
بررسی نتایج ایجاد آلودگی تجربی ماهی کپورعلفخوار به باکتری آئروموناسهیدروفیلا با غلظتهای106×5/1و
107× 5/1 و 108× 5/1و 109× 2/1 (cfu/ml ) از ایجاد بیماری در تزریق داخل صفاقی مقادیر 108× 5/1و 109× 2/1 حکایت مینماید هرچند علائم کلینیکی بیماری و نیز تلفات ماهیان در تزریق غلظت باکتریایی 109× 2/1 نسبت به 108× 5/1 بیشتر بوده است، بررسی نتایج مذکور با نتایج بدست آمده از مطالعه Aboud در سال 2010 با تزریق غلظت 109× 1(cfu/ml) از باکتری آئروموناسهیدروفیلا در ماهی تیلاپیا نشان داد ماهی آمور نسبت به ماهی تیلاپیا در مقادیر پایینتر از باکتری آئروموناسهیدروفیلا به بیماری آئرومونازیس مبتلا میشود (13). در بررسی دیگری نتایج بدست آمده از مطالعه توکلی و اخلاقی در سال 1388 با تزریق غلظتهای باکتریایی105× 2 ، 106× 4 ، 107× 3(cfu/ml) باکتری آئروموناسهیدروفیلا به ماهی قزلآلایرنگینکمان (2)، طافی و همکاران در سال 1392 با تزریق 107 (cfu/ml) باکتری آئروموناسهیدروفیلا به ماهی قزلآلایرنگینکمان (9) و همچنین نتیجه بدست آمده از مطالعه انجام شده توسط رحمتی اندانی و همکاران در سال 1390 با تزریق غلظت باکتریایی 106× 8/9 (cfu/ml) باکتری آئروموناسهیدروفیلا به ماهی قزلآلایرنگینکمان نشان داده شد که ماهی آمور نسبت به ماهی قزلآلایرنگینکمان در مقادیر بالاتر به بیماری آئرومونازیس مبتلا می شود و در نتیجه مقاومتر میباشد (3). در مطالعه انجام شده توسط علیشاهی و همکاران در سال 1388 میزان LD50 باکتری آئروموناسهیدروفیلا برای ماهی کپور علفخوار برابر 107× 1/1 (cfu/ml) مشخص گردید(10) ، همچنین در مطالعه دیگری از Weifeng و همکاران در سال 2004 مشخص شد که میزان LD50 آئروموناسهیدروفیلا برای ماهی کپور علفخوار در حدت 107 (cfu/ml) می باشد (23). Zheng و همکاران در سال 2012 میزان LD50باکتری آئروموناسهیدروفیلا را برای ماهی کپور علفخوار در حدت 108× 0/1 (cfu/ml) تعیین نمودند(24). میتوان علت تفاوت در نتایج بدست آمده از تحقیق حاضر با نتایج بدست آمده از مطالعه علیشاهی و همکاران و Weifeng و همکاران و Zheng و همکاران را در شرایط محیطی نظیر دمای آّب جستجو نمود. تعداد گلبولهایسفید و نسبت انواع آنها به عنوان یکی از شاخص های مهم سلامتی و وضعیت سیستم ایمنی به شمار می آید (20). بر این اساس می توان نتیجه گرفت حمام ماهیان آمور با مقادیر250 ppm،410ppm ،580 ppm و750 ppm عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس به مدت 10 روز، روزانه به مدت 1 ساعت میتواند در تعداد انواع گلبول های سفید خون تغییرات قابل توجهی ایجاد نماید. در میزان گلبولهایقرمز خون، هموگلوبین و هماتوکریت در بین تیمارهای مختلف اختلاف معنی دار آماری مشاهده شد. بیشترین میزان گلبولقرمز، هموگلوبین، هماتوکریت در شاهد منفی مشاهده شد و در غلظت ppm 410 از کمترین میانگین برخوردار بود.
مقدار شاخصهای سرمی از دیگر عوامل تعیین کننده وضعیت سلامتی جانوران مختلف از جمله ماهیان می باشند. نتایج حاصل از این بررسی نشان داد در بین گروههای تیمار با یکدیگر و نیز بین گروههای تیمار با شاهد مثبت و منفی در مقادیر آلبومین، لیزوزیم و IgM اختلاف معنی دار آماری وجود داشته بطوریکه لیزوزیم در مقدار ppm 250 بیشتر از سایر تیمارها و شاهد منفی کمتر از سایر تیمارها بوده است. بیشترین میزان آلبومین در غلظت ppm 580 و تیمار منفی از کمترین میزان برخوردار بود. بیشترین میزان IgM در غلظت های ppm250، ppm410 و ppm 750 بود درحالی که شاهد منفی از کمترین مقدار برخوردار بوده است. بر اساس نتایج شیخ زاده و همکاران در سال 1388 غلظت های پایین اسانس اکالیپتوس به دو روش حمام و خوراکی می تواند منجر به افزایش گلبول هایسفید خون در ماهی کپور معمولی (Cyprinus carpio) نسبت به گروه شاهد گردند (7). بررسی نتایج حاصل از این مطالعه و نیز نتایج حاصل از سایر مطالعات نشان می دهد عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس خصوصا در غلظتهای پایین به دلیل عدم ایجاد تغییرات قابل توجه در فراسنجههای خونی میتوانند به عنوان ترکیبات ضدمیکروبی در کنترل عوامل بیماریزا در ماهی آمور مورد توجه قرار گیرند. با توجه به اینکه در مدت زمان انجام آزمایش دمای آب پایین تر از حد اپتیموم برای ماهی آمور بوده است بنابراین دمای آب میتواند عاملی برای عدم تحریک ایمنی در ماهی عمل نماید.