نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 هیئت علمی دانشگاه خوارزمی

2 هیئت علمی- دانشگاه خوارزمی

3 -

چکیده

مقدمه: بیماری آلزایمر در میان‌سالی شروع‌شده، به‌سرعت پیشرفت می‌کند و منجر به از دست دادن توان ذهنی فرد می‌شود. با توجه به اینکه اثر نوروپروتکتیو گیاه ختمیAlthea officinalis- Marshmallow)) گزارش‌شده است، در این مطالعه به بررسی اثر عصاره این گیاه در مدل تجربی بیماری آلزایمر در موش صحرایی و تأثیر آن بر بهبود حافظه اجتنابی غیر فعال پرداخته شد .روش کار: در ابتدا از طریق تزریق دوطرفه داخل بطنی پپتید آمیلوئید بتا(40-1)، مدل آلزایمری ایجاد شد.در این آزمایش از موش های نر نژاد ویستار با وزن (220-180)گرم استفاده شد. گروه های کنترل(بدون تزریق)، شم(نرمال سالین)، تجربی (بتاآمیلوئید (40-1) و چهار گروهی که عصاره گیاه ختمی را با مقادیر 10، 50، 100 و 250 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن، به‌صورت داخل صفاقی به مدت 7 روز قبل و سه هفته بعد از تزریق آمیلوئید بتا دریافت کردند. برای مطالعه رفتاری از دستگاه شاتل باکس استفاده شد و برای مطالعات بافت‌شناسی رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین و نیسل انجام شد.دادهها توسط آنالیز واریانس و تست توکی تجزیه و تحلیل شدند. نتایج: داده ها نشان داد که تیمار گروه دریافت کننده آمیلوئید بتا با دوز 100میلی‌گرم بر کیلوگرم با عصاره گیاه ختمی می‌تواند شاخص‌های رفتاری را در تست حافظه اجتنابی غیر فعال نسبت به گروه شم افزایش دهد (P<0.001) و باعثکاهش شدید میزان آسیب بافتی و افزایش تعداد نیسل بادی‌های رنگ‌آمیزی شده ناحیه CA1 هیپوکامپ شود.بحث و نتیجه‌گیری: در این تحقیق احتمالاً کاهش عوارض ایجاد شده با خاصیت آنتی‌اکسیدانی و خاصیت مهار کنندگی آنزیم استیل کولین استرازیترکیبات این گیاه مانندکوئرستین،کامپفرول،تانن،لسیتین،پکتین، استرولوکومارین در ارتیاط است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Effect of Marshmallow extract on improving passive avoidance memory disorders in male Wistar rats

نویسندگان [English]

  • Delaram Eslimi Esfahani 1
  • Shahrbanoo Oryan 2
  • Mitra Hatami 3

1 Animal biology Department, Biological sciences faculty, Kharazmi University , Tehran, Iran

2 Department of Animal Biology, Faculty of Biological Sciences, Kharazmi University, Tehran, Iran

3 -

چکیده [English]

Background and aim: Alzheimer's disease begins in the Middle Ages, it progresses rapidly and leads to loss of individual mental health. Considering that the neuroprotective effect of Marshmallow (Althea officinalis)has been reported, in this study, the effect of the plant on Alzheimer's rat model and its effect on the improvement of passive avoidance memory was investigated. Methods: Alzheimer's was initially induced by intra-ventricular injection of beta- amyloid peptide. In this experiment, male wistar rats (220-180 g) were used. The control group (no injection), sham group (saline injection), experimental group (injection of beta-amyloid (40-1)) and the groups which received marshmallow extract in 10, 50, 100 and 250 milligrams per kilogram of body weight by intraperitoneal injection for 7 days before and three weeks after beta-amyloid injection. Shuttle box was used to study the learning and memory behavior and H & E and Nissl staining were conducted for histological studies. The obtained data were analyzed by SPSS software (ANOVA and Tukey tests).Results: Data showed that treatment with beta-amyloid group at a dose of 100 mg/kg marshmallow extract increased behavioral indices in passive avoidance memory test, compared to sham group(P<0.001) and reduced the amount of tissue damage and increasesd the number of Nissl bodies in the CA1 hippocampus area. Discussion: In this study, likely reducing the complications, caused by the antioxidant properties and the effect of the inhibitory acetylcholinesterase enzyme of the compounds of this plant, such as quercetin, camphorol, tannin, lecithin, pectin, sterol and coumarin, are related.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Beta-amyloid
  • the passive avoidance memory
  • shuttle box
  • histological studies
  • Nissl bodies

بررسی اثر عصاره آبی-الکلی گیاه ختمی بر بهبود اختلالات یادگیری اجتنابی غیر فعال ناشی از تزریق دوطرفه پپتید آمیلوئید بتا در هیپوکامپموش صحرایی نر نژاد ویستار

دلارام اسلیمی اصفهانی، شهربانو عریان و میترا حاتمی 

تهران، دانشگاه خوارزمی، دانشکدۀ علوم زیستی، گروه علوم جانوری

تاریخ دریافت: 5/5/96                 تاریخ پذیرش: 16/11/96

چکیده

بیماری آلزایمر در میان‌سالی شروع‌شده، به‌سرعت پیشرفت می­کند و منجر به از دست دادن توان ذهنی فرد می­شود. با توجه به اینکه اثر نوروپروتکتیو گیاه ختمیAlthea officinalis- Marshmallow)) گزارش‌شده است، در این مطالعه به بررسی اثر عصاره این گیاه در مدل تجربی بیماری آلزایمر در موش صحرایی و تأثیر آن بر بهبود حافظه اجتنابی غیر فعال پرداخته شد .در ابتدا از طریق تزریق دوطرفه داخل بطنی پپتید آمیلوئید بتا(40-1)، مدل آلزایمری ایجاد شد. در این آزمایش از موش های نر نژاد ویستار با وزن (220-180)گرم استفاده شد. گروه های کنترل(بدون تزریق)، شم(نرمال سالین)، تجربی (بتاآمیلوئید (40-1) و چهار گروهی که عصاره گیاه ختمی را با مقادیر 10، 50، 100 و 250 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن، به‌صورت داخل صفاقی به مدت 7 روز قبل و سه هفته بعد از تزریق آمیلوئید بتا دریافت کردند. برای مطالعه رفتاری از دستگاه شاتل باکس استفاده شد و برای مطالعات بافت‌شناسی رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین و نیسل انجام شد. داده‌ها توسط آنالیز واریانس و تست توکی تجزیه و تحلیل شدند. داده ها نشان داد که تیمار گروه دریافت کننده آمیلوئید بتا با دوز 100میلی‌گرم بر کیلوگرم با عصاره گیاه ختمی می‌تواند شاخص‌های رفتاری را در تست حافظه اجتنابی غیر فعال نسبت به گروه شم افزایش دهد (P<0.001) و باعث کاهش شدید میزان آسیب بافتی و افزایش تعداد نیسل بادی‌های رنگ‌آمیزی شده ناحیه CA1 هیپوکامپ شود. در این تحقیق احتمالاً کاهش عوارض ایجاد شده با خاصیت آنتی‌اکسیدانی و خاصیت مهار کنندگی آنزیم استیل کولین استرازیترکیبات این گیاه مانندکوئرستین،کامپفرول،تانن،لسیتین،پکتین، استرولوکومارین در ارتیاط است.

واژه های کلیدی: بتا آمیلوئید، حافظه اجتنابی غیر فعال، شاتل باکس، مطالعات بافتی، اجسام نیسل

* نویسنده مسئول، تلفن: 02188848940  ، پست الکترونیکی:  d.eslimi.i@gmail.com

مقدمه

 

بیماری آلزایمر (Alzheimer) که در میان ‌سالی شروع‌شده، به‌سرعت پیشرفت می­کند و منجر به از دست دادن توان ذهنی فرد می­گردد، به‌عنوان پیری زودرس مغز تعریف می‍شود (6و8). این بیماری در نتیجه از دست رفتن تدریجی و غیرقابل‌برگشت نورون­های قشری خصوصاً در نواحی نئوکورتکس و هیپوکامپ (مرکز اصلی حافظه و یادگیری) ایجاد می­شود، به همین دلیل اولین و مهم­ترین نشانه­ این بیماری فراموشی است (10و15). آلزایمر یک بیماری پیچیده یا چندعاملی نیز محسوب می­شود، چون هم عوامل ژنتیکی و هم فاکتور­های محیطی در ایجاد آن نقش دارند (12). بیماری آلزایمر شایع­ترین نوع دمانس است. اتیولوژی و ساز و کار زیستی دقیق آلزایمر ناشناخته است و احتمالاً مانند سایر بیماری­های مزمن،چند عاملی است (8)،بنابراین شناسایی عوامل ایجاد کننده  بیماری می­تواند نقش پیشگیرانه در بروز آن داشته باشد(27). عوامل مختلفی در ایجاد بیماری آلزایمر دخیل است که می توان به افزایش سن، زمینه ژنتیکی، مصرف دخانیات، چاقی و فشارخون، دیس لیپیدمی،دیابت و مقاومت به انسولین، بیماری­های مانند افسردگی و ترومای سر،رسوب فلزاتی مانند آلومینیوم و آهن، تغییر در ریتم ترشحی مواد میانجی، ترشح بیش‌ازحد آمینواسیدهای تحریکی، فعال شدن فرایند­های التهابی و بالاخره کاهش تعداد و عملکرد نورون­های کولینرژیکی و استرس اکسیداتیو اشاره کرد (12و22).

بیماری آلزایمر دارای دو مشخصه نوروپاتولوژیکی است که عبارت‌اند از: تجمع خارج سلولی پلاک­هایآمیلوئید بتا و کلاف­های رشته­ای داخل نورونی (23). الیگومرهای آمیلوئید بتا با هایپرفسفریلاسیون پروتئین Tau، ایجاد التهاب و استرس اکسیداتیو، تعامل با رسپتور­های نیکوتینی استیل کولین،مهار پلاستیسیتی سیناپسی، تغییرات سیناپسی مانند کاهش در چگالی انتهای پیش سیناپسی و از بین رفتن سیناپس­ها و درنهایت مرگ سلولی منجر به پیشرفت بیماری می­شوند (13و14و20). .به مرور در بیماران آلزایمری مغز دچار آتروفی می­شود که همراه با بزرگ شدن بطن­ها است(8).در این خصوص،هیپوکامپ یکی از اولین نواحی است که در بیماری آلزایمر کاهش نورون در آن رخ می­دهد و یکی از نواحی مغز می‌باشد که در شکل گیری حافظه نقش مهمی بر عهده دارد. مشاهده شده که تزریق پروتئین آمیلوئید بتا به داخل هیپوکامپ باعث دژنراسیون نورون‌ها،کاهش انتقال و پلاستیسیتی سیناپسی،نقصان یادگیری و کاهش میزان هماهنگی روانی-حرکتی می‌شود(16و19).

همان گونه که ذکر شد، در بیماری آلزایمر مقدار استیل کولین که یکی از میانجی های عصبی مؤثردر حافظه‌است کم می‌شود که دلیل آن آتروفی شدن وتحلیل نورونهای کولینرژیک می‌باشد. مشخص شده که مهار کننده‌هایآنزیم استیل کولین استراز (تجزیه کننده استیل کولین) برای بهبود بیماری آلزایمر مفید هستند (26و31). داروهای مختلفی برای افزایش مقدار استیل کولین پایانه‌های عصبی استفاده می‌شوند از جمله ریواستیگمین (Exelon)، دانپزیل (Aricept)، و گالانتامین (Razadyne) این داروها سبب بهبود حافظه، عملکرد شناختی و عملکرد اجتماعی بیمار می‌شوند. این داروها تا حدودی رفتارهای غیرطبیعی بیمار را نیز اصلاح می‌کنند. اما مشکل عمده این داروها عوارض گوارشی، تهوع، استفراغ، دل پیچه و اسهال می باشد (21).

امروزه گیاهان داروئی به دلیل عوارض جانبی کمتر نسبت به داروهای شیمیایی موردتوجه قرار گرفته‌اند (5و7). گیاه ختمی با نام محلی گل هیرو، نام عربی خطمی، نام انگلیسی Marshmallow، نام علمی (Althea officinalis) خود را از لغت یونانی آلتو به معنای ترمیم گرفته است (2و3). ختمی متعلق به خانوادهMalvaceae می‌باشد (18). یکی از ترکیبات ختمی موسیلاژ آن می‌باشد که در اثر هیدرولیز، قندهای رامنوز، گالاکتوز و اسید گالاکتورونیک ایجاد می شود (4و24). ترکیبات دیگر، شامل: فلاونوئید، پکتین، قندها، آسپاراژین و کمی استرول می باشند.فلاونوئیدها که آنتی اکسیدان های بر پایه گیاهی هستند به محافظت از سیستم عصبی مرکزی کمک می کنند.همچنین این گیاه دارای خاصیت مهار کنندگی آنزیم استیل کولین استرازاستکه باعث افزایش سطح استیل کولین در مغز می شود(4و24). بنابراین در این تحقیق به بررسی اثرعصاره گیاه ختمی بر بهبود اختلالات یادگیریاجتنابی غیر فعال ایجاد شده توسط آمیلوئید بتا پرداخته شد.

مواد و روشها

گروه های مورد آزمایش: در این مطالعه موش های صحرایی نر نژاد ویستار با وزن 220-180 گرم در دمای 22-24درجه سانتی گراد، رطوبت 45-50 درصد و چرخه ی 12 ساعت روشنایی/ تاریکی، با دسترسی آزادانه به آب و غذا نگهداری شدند.برای بررسی مدت زمان تاثیر بتا آمیلوئید (چهارمیکرولیترحاویدومیکروگرم)دو گروه به مدت دو و سه هفته مورد بررسی قرار گرفتند. برای بررسی تاثر عصاره، موش ها مقدار موش‌ها به صورت تصادفی به 7 گروه (هر گروه 8 عدد) شامل گروه کنترل، گروه شم (حلال)، گروه ‌آمیلوئید بتا(چهارمیکرولیترحاویدومیکروگرم)، گروه آزمون(دریافت عصاره در مقادیر10، 50، 100 و 250 میلی گرم/کیلوگرم)تقسیم شدند (11).گروه آزمون عصاره را به صورت داخل صفاقی هفت روز قبل از دریافت آمیلوئید بتا و 21 روز بعد از دریافت آمیلوئید بتا،یک روز درمیان دریافت کردند.

تهیه عصاره هیدروالکلی: دانه­های گیاه ختمیکه از مرکز ذخایر ژنتیکی ایران تهیه شده بود با استفاده از آسیاب برقی آسیاب و پودر شد. سپس پودر در اتانول 70% به روش ماسراسیون به مدت 48 ساعت خیسانده شد که در طی این مدت توسط دستگاه شیکر به طور مداوم در حال هم زدن و تکان دادن بود. در مرحله بعد توسط کاغذ صافی Watmanصاف شد و با استفاده از دستگاه روتاری (تقطیر در خلاء) حلال عصاره خارج گردید.

آزمون رفتاری یادگیری اجتنابی: ارزیابی حافظه احترازی غیر فعال توسط دستگاه شاتل باکس صورت گرفت.این آزمایش دردو روز پشت سرهم انجام شد (17). 

مرحله سازگاری (Adaptaion session): در روز 21 بعد از تزریق دارو پپتید آمیلوئید بتا(40-1) در حالی که بین اتاقک روشن وتاریک باز بود موش در اتاقک روشن قرار داده می­شد وبه مدت دو دقیقه به آن اجازه داده می­شد که با دستگاه آشنا شود واز طریق دریچه ارتباط بین اتاقک تاریک و روشن رابیابد، سپس موش از دستگاه خارج می­شد و به قفس انفرادی منتقل گردید.

مرحله آموزش (Training session) : نیم ساعت بعد از مرحله  سازگاری  هر موش در اتاقک روشن (در حالیکه در گیوتینی بسته بود) قرار داده شد، 10 ثانیه بعد درب گیوتینی باز می­شد پس از رفتن موش به اتاقک تاریک  بلافاصله درب بسته می­شد و یک شوک الکتریکی به مدت 2 ثانیه با شدت جریان 1 میلی آمپر وبا فرکانس 50 هرتز از میله­های فلزی به کف پای حیوان  اعمال می­شد و 20 ثانیه بعد حیوان از اتاقک تاریک خارج می­شد. برای اطمینان از اینکه حیوان یادگرفته که نباید به اتاقک تاریک وارد شود  دو دقیه بعد از خارج کردن حیوان از اتاقک تاریک دوباره حیوان را در اتاقک روشن قرار میدادیم و 2 دقیقه فرصت میدادیم تا ببینیم که آیا حیوان وارد خانه تاریک می­شود و یا اینکه در اثر شوک اولیه یادگرفته است که نباید وارد اتاقک تاریک شود. اگر حیوان در بار دوم بعد از شوک وارد اتاقک می­شد دوباره درب گیوتینی را می­بستیم و دوباره به آن شوک میدادیم این عمل را تا زمانی که حیوان دیگر وارد اتاقک تاریک نشود انجام میدادیم.

مرحله به یاد آوری (Memory retention session): 24 ساعت بعد از مرحله آموزش هر موش در اتاقک روشن ( درحالی که درب گیوتینی بسته بود) قرار داده شد و 10 ثانیه بعد درب گیوتینی باز می­شود و زمان تاخیر در ورود به اتاقک تاریک به عنوان Step- through latency time یاداشت گردید. حداکثر زمان برای تاخیر در ورود به جعبه تاریک تا 600 ثانیه ثبت گردید، بعد از آنکه موش به قسمت تاریک رفت مدت زمان سپری شده در جعبه تاریک یاداشت می­گردد که به عنوان زمان سپری شده در اتاق تاریک Total time in dark chamber در 24 ساعت بعد از آموزش و اعمال شوک در نظر گرفته می­شد.

مطالعات بافت شناسی: بافت هیپوکامپ توسط دو روش رنگ آمیزی هماتوکسیلین– ائوزین و نیسل مورد بررسی قرار گرفت. برای مطالعات بافتی پس از فیکس کردن نمونه با فرمالین 10%، مراحل آبگیری و شفاف سازی، نمونه‌ها در داخل پارافین مذاب قالب‎گیری شدند و با استفاده از میکروتوم (Cambrige Medical Instruments, United Kingdom) برش‌هایی با ضخامت 5 میکرون انجام شد. نمونه‌ها روی لام قرار گرفتند و سپس با هماتوکسیلین– ائوزین رنگ‎‌آمیزی شدند. همچنین دراین مطالعه از رنگ آمیزیکریزل ویوله برای رنگ آمیزی اجسام نیسل در سیتوپلاسم نورونها استفاده شد که در این روش اجسام نیسل به رنگ بنفش -آبی دیده می شوند .پس از فیکس کردن، غالب گیری و برش توسط دستگاه میکروتوم به ضخامت 7 میکرون، نمونه ها روی لام قرار داده شده وپس از شفاف سازی و آبدهی، نمونه ها با کریزل ویوله یک درصد رنگ آمیزی شدند. این رنگ آمیزی معمولابرای شناسایی نکروز در بافت مغز وطناب نخاعی استفاده می‌شود. سپس با استفاده از فتومیکروسکوپ نوری(Zeiss, Germany)و بزرگنمایی  40Xبافت هیپوکامپ مورد بررسی قرار گرفت .به منظور شمارش سلولی در یک میلیمتر مربع هیپوکامپ،از نرم­افزارOlysia bioreport (GmbH version: 5.1.2600.2180) استفاده شد.

روش های آماری: داده­های بدست آمده توسط نرم افزار19SPSS و با استفاده از آزمون آنالیز واریانس و توکی تجزیه تحلیل گردیدند. سطح معنی داری کمتر از 05/0 در نظر گرفته شد. نمودا­رها با استفاده از نرم افزار Sigma plat رسم شدند.

نتایج

نتایج آزمون رفتاری یادگیری اجتنابی غیر فعال: داده‌ها نشان دهنده تاخیر زمانی برای اولین ورود به اتاق تاریک در موش های دریافت کننده آمیلوئید بتادر مقایسه باگروه کنترل بودند و افزایش مدت زمان ماندن در خانه­ی تاریک در موش های دریافت کننده آمیلوئید بتادر مقایسه با گروه کنترلنیز مشاهده شد. کاهش معنی داری درتاخیر زمانی برای اولین ورود به اتاق تاریک در موش‌هاسه هفته پس ازدریافت آمیلوئید بتادر مقایسه با موش‌هادو هفته پس ازدریافت آمیلوئید بتامشاهده گردید و افزایش معنی داری نیز در مدت زمان ماندن در اتاق تاریک در موش‌هاسه هفته پس ازدریافت آمیلوئید بتادر مقایسه با موش‌هادو هفته پس ازدریافت آمیلوئیدبتادیده شد. به همین دلیل سه هفته پس از تزریق آمیلوئید بتابرای انجام تحقبقات انتخاب شدند.

مقایسه تاخیر زمانی ورود به اتاق تاریک نشان داد که گروه تیمار شده با دوز 100 میلی­گرم بر کیلوگرم وزن بدن عصاره آبی- الکلی گیاه ختمی نسبت به گروه کنترل تفاوت معنی داری تداشت. همچنین گروه‌های تیمار شده با عصاره هیدرو­الکلی گیاه ختمی با دوزهای 50، 100 و 250 میلی­گرم بر کیلوگرم وزن بدن موش، در مقایسه با گروه آمیلوئید بتا تفاوت معنی دار نشان می­دهند (نمودار2).

مقایسه مدت زمان ماندن در اتاق تاریک نشان داد که گروه تیمار شده با دوز 100 میلی­گرم بر کیلوگرم وزن بدن عصاره آبی- الکلی گیاه ختمی نسبت به گروه کنترل تفاوت معنی داری تداشت. همچنین گروه‌های تیمار شده با عصاره هیدرو­الکلی گیاه ختمی با دوزهای 50، 100 و 250 میلی­گرم بر کیلوگرم وزن بدن موش، در مقایسه با گروه آمیلوئید بتا تفاوت معنی دار نشان می­دهند (نمودار 3).

بررسی­های بافت شناسی: مشاهدات میکروسکوپی در رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین نشان داد که در گروه آمیلوئید بتا، انسجام بافتی که در گروه کنترل وجود دارد، دیده نمی­شود. همچنین آمورف شدن هسته سلول­ها و فاصله گرفتن سلول­ها به دلیل نکروز در ناحیه CA1 هیپوکامپ قابل رویت است (شکل 1- B). گروه تیمار شده با دوز (10 میلی‌گرم/ کیلوگرم) عصاره­ی هیدروالکلی گیاه ختمی، نکروز بافتی و تخریب نورونی و در نتیجه کاهش انسجام بافتی در ناحیه­ی CA1 هیپوکامپن سبت به گروه کنترل مشاهده می­شود که نشان دهنده­کم اثر بودن این دوز از عصاره در بهبود آسیب بافتی ناشی از Aβ (1-40) است(شکل 1- C).گروه تیمار شده با دوز (50 میلی‌گرم/ کیلوگرم) نسبت به گروه کنترل دارای انسجام بافتی بهتری در ناحیه­ی CA1 هیپوکامپ است که نشان­ ازموثر بودن این دوز از عصاره در بهبود آسیب بافتی ناشی از پلاک های آمیلوئید بتا است(شکل 1- D).گروه تیمار شده با دوز (100 میلی‌گرم/ کیلوگرم) مشابه با گروه کنترل دارای انسجام بافتی در ناحیه CA1 هیپوکامپ است که نشان­ ازموثر بودن این دوز از عصاره در بهبود آسیب بافتی ناشی از پلاک های آمیلوئیدبتااست(شکل 1- E). درگروه تیمار شده با دوز (250 میلی‌گرم/ کیلوگرم) در مقایسه با گروه کنترل، تا حدودی کاهش انسجام بافتی در ناحیه CA1 هیپوکامپ مشاهده شد که البته این کاهش نسبت به گروه تیمار شده با دوز (100 میلی‌گرم/ کیلوگرم) کمتر است ونشان دهنده تاثیر کمتر این دوز از عصاره در بهبود آسیب بافتی ناشی از Aβ (1-40) است (شکل 1- F).

در رنگ آمیزی نیسل گروه کنترل در ناحیه CA1 هیپوکامپ نورون­های هرمی با هسته­های گرد، هستک­های برجسته و سیتوپلاسم واضح قابل مشاهده­اند. در گروه آمیلوئید بتا اندازه­ی نورون­ها کوچکتر، هسته­ها چروکیده، هستک­ها غیر واضح و محدوده­ی سیتوپلاسمی سلول نیز در بیشتر موارد خوب مشخص نبود و در مجموع تراکم سلولی از گروه کنترل به طور معنی داری بسیار کمتر بود ولی در دوز 100 میلی‌گرم/ کیلوگرم عصاره، آسیب سلول‌ها کمتر شده بود (شکل 2).

 

 

نمودار 1- مقایسه تاخیر زمانی برای اولین ورود و مدت زمان ماندن در اتاق تاریکدر گروه کنترل ، دو هفته و سه هفته پس از دریافت پپتیدآمیلوئید بتا. P<0.001*** بین گروه کنترل و گروه های دریافت کننده آمیلوئید بتا، P<0.05+, P<0.001++ بین دو گروه دریافت کننده آمیلوئید بتا)

 

نمودار 2- مقایسه تاخیر زمانی ورود به اتاق تاریک در گروه­های مختلف. (P<0.001***)تفاوت نسبت به گروه کنترل، (P<0.001###) تفاوت نسبت به گروه القائی آلزایمر.

نمودار3- مقایسه مدت زمان ماندن در اتاق تاریک در گروه­های مختلف، (P<0.001***) تفاوت نسبت به گروه کنترل، (P<0.001###) تفاوت نسبت به گروه القائی آلزایمر.

شکل1)مقایسه فتومیکروگراف­های رنگامیزی H&Eناحیه­ی CA1 هیپوکامپ در گروه کنترل (A)، گروه دریافت کننده­ی Aβ (1-40)(B)، گروه تیمار شده با دوز(10 میلی‌گرم/کیبوگرم) عصاره (C)، گروه تیمار شده با دوز (50 میلی‌گرم/کیبوگرم) عصاره (D)، گروه تیمار شده با دوز (100 میلی‌گرم/کیبوگرم)  عصاره (E)، .گروه تیمار شده با دوز (250 میلی‌گرم/کیبوگرم)  عصاره (F) (بزرگنمایی × 400).

شکل2-  مقایسه  فتومیکروگراف­های رنگامیزی نیسل ناحیه CA1 هیپوکامپ در گروهه­های مختلف. گروه کنترل(A)، گروه دریافت کننده­ی Aβ (1-40) (B)، گروه تیمار شده با دوز(mg/kg10) عصاره (C)، گروه تیمار شده با دوز (mg/kg50) عصاره (D)، گروه تیمار شده با دوز (mg/kg 100) عصاره (E)، .گروه تیمار شده با دوز (mg/kg 250) عصاره (F) (بزرگنمایی × 400).

 

نتایج نشان داد که در گروه دریافت کننده پپتید آمیلوئید بتا، تعداد سلول ها نسبت به گروه کنترل کاهش معنی داری داشت. تعداد سلول هادر گروه تیمار شده با دوز (10 میلی‌گرم/ کیلوگرم) عصاره گیاه ختمی در مقایسه با گروه کنترل نیز تفاوت معنی داری دارد. تعداد سلول هادر گروه تیمار شده با دوز (50 میلی‌گرم/ کیلوگرم) نسبت به گروه القائی آلزایمر تعداد سلول هادر حال افزایش است.تعداد سلول هادر گروه تیمار شده با دوز (100میلی‌گرم/ کیلوگرم) نسبت به گروه کنترل تفاوت معنی داری ندارد ولی نسبت به گروه القائی آلزایمر تعداد سلول هاآن به صورت معنی داری افزایش یافته است.گروه تیمار شده با دوز (250 میلی‌گرم/ کیلوگرم)  تفاوت معنی داری در تعداد سلول ها نسبت به گروه آمیلوئید بتا دارد (نمودار 4).

 

نمودار4- تعداد سلولها در ناحیه CA1 هیپوکامپ در رنگامیزی نیسل در گروه­های مختلف. ( P<0.001***، P<0.01**،) تفاوت با گروه کنترل.

 


بحث

در این مطالعه به بررسی اثرات گیاه ختمی بر بیماری آلزایمر القاء شده توسط پپتید(1-40) Aβ پرداخته شد. نتایج نشان داد این گیاه با مقدار100 میلی‌گرم/ کیلوگرمباعث کاهش عوارض ایجاد شده و بهبود حافظه اجتنابی غیر فعال گردید.دوز های 10 و 50 میلی‌گرم/ کیلوگرم تاثیر کمتری داشتند. اثر دوز 250 میلی‌گرم/ کیلوگرم نیز از 100 میلی‌گرم/ کیلوگرم کمتر یود که شاید به این دلیل است که دوز بالاتر این گیاه با کاهش قتد خون باعث ایجاد اختلال در حافظه تاثیر می‌شود (32). گیاه ختمی یکی از گیاهان بسیار پر کاربرد و پر استفاده می باشد (29). به دلیل داشتن ترکیبات ضد التهابی، آنتی اکسیدانی وخاصیت مهار کنندگی آنزیم استیل کولین استراز، گزینه مناسبی برای بهبود عوارض ایجاد شده توسط بتا آمیلوئید می باشد (4و24). مطالعات بیانگر افزایش پراکسیداسیون لیپیدی و کاهش سطح گلوتاتیون، افزایش استیل کولین استراز، کاهش فعالیت استیل کولین ترانسفراز و سطوح استیل کولین در موش­های تیمار شده باAβ بود (25). تزریق داخل مغزی پپتید Aβ (1-40)باعث کاهش فعالیت کولین­استیل­ترانسفراز در قشر مغز و هیپوکامپ می­گردد (26و31). همچنینمحققین کاهش قابل توجهی در میزان نیکوتین و KCLناشی ازکاهش آزادسازی استیل کولین را در هیپوکامپ و قشر مغز و همچنین کاهش ترشح دوپامین در اثر تزریق داخل­مغزی پپتید Aβ (1-40)را در زیر جسم مخطط مشاهده کردند. در این مطالعه گیاه ختمی نشان داد که با توجه به داشتم خاصیت مهار کنندگی آنزیم استیل کولین استراز، عوارض داروهای آنتی کولین استرازی را ندارددر این تحقیق عصاره هفت روز قبل و 21 روز بعد از کاربرد امیلوئید بتا به حیوانات داده شد. مطالعات نشان می دهند کاریرد عصاره قبل از تزریق امیلوئید بتا یاعث بقای سلولی و همچنین بهبود عوارض ایجاد شده می گردد (33).

مطالعات همچنین نشان می­دهندکه پپتید Aβباعث القاء استرس اکسیداتیو شامل پراکسیداسیون لیپید­ها و پراکسیداسیون هیدروژن در نورون­ها می­شود استرس اکسیداتیو نقش مهمی را در توسعه و پیشرفت بیماری آلزایمر بازی می­کند (28و30).  بنا به این دلیل آنتی­اکسیدانت­ها مانند یک α-توکوفرول اثر محافظتی در برابر کاهش یادگیری و حافظه القاء شده از طریقAβ را دارند (19). از جمله ترکیبات موجود در گیاه ختمی میتوان به فلاونوئیدهای کوئرستین، کامپفرول، تانن، لسیتین، پکتین، استریول وکومارین اشاره نمود (4). همانطور که در این تحقیق گفته شد، ختمی حافظه موش­های آلزایمری شده (AD) را در مطالعه حاضر در دوز(100 میلیگرم/ کیلوگرم) بهبود بخشیده است. با توجه به اثر نورودژنریتیو پپتید Aβ(1-40)، برخی از محققان نشانه­هایی از آسیب سلولی پس از تزریق پپتیدAβ (1-40) در مغز را پیدا کرده­اند (15). در مطالعه­ی حاضر در نمونه­های بافتی تهیه شده با رنگ آمیزی نیسل در گروه مدل به دلیل متلاشی شدن اجسام نیسل یا به عبارتی متلاشی شدن RNA های ریبوزومی و شبکه­ی آندوپلاسمی زبر،کاهش تراکم نورونی و همچنین کروماتولیز مشاهده شد که نشان­دهنده­ی تخریب ناحیه CA1 هیپوکامپ در گروه دریافت کننده پپتیدAβ (1-40)است (1) که این نتایج همسو با مطالعات بافتی قبلی از طریق رنگ آمیزی نیسل است. در بررسی بافتی رنگامیزی هماتوکسیلین- ائوزین در موش صحرایی­های آلزایمری تخریب بافتی و فاصله گرفتن سلول­ها به دلیل ایجاد نکروز دیده شد که نشان دهنده­ی اثر تخریبی پپتید Aβ (1-40)در ناحیه­ی CA1هیپوکامپ است. محققان نشان دادند که تزریق  Aβ (1-40)منجر­به از بین رفتن سلول­های عصبی و آسیب نواحی CA1 ، CA3 و DG می­شود، همچنین گسستگی سلول­های گرانولی و لایه­ی سلول­های هرمی­شکل از طریق رنگ امیزی نیسل به طور واضح مشاهده گردید (9و15). Nobakht و همکارانش در سال 2011 پس از تزریق پپتید Aβ (1-40) از طریق رنگ آمیزی نیسل میزان تراکم نورونی را در ناحیه­ی CA1هیپوکامپ و قشر نشان دادند که تراکم نورونی در موش‌های صحرایی آلزایمری به میزان زیادی کاهش یافته بود (15)که با نتایج بدست آمده از این تحقیق هم خوانی دارد و می توان نتیجه گرفتگیاه ختمیباعث کاهش نکروز و فیبروز بافتی شده و شرایط زیست سلول ها را بهبود بخشیده است.

نتیجه گیری 

نتایج این تحقیق نشان دهنده بهبود اختلالات حافظه فضایی ایجاد شده توسط آمیلوئید بتا توسط عصاره گیاه ختمی است. همچنین بهبود عوارض ایجاد شده بافتی نیز مشاهده می شود. از آنجا که گیاه ختمی دارای ترکیبات ضد التهابی، آنتی اکسیدانی وخاصیت مهار کنندگی آنزیم استیل کولین استراز می باشد، نیاز به بررسی و مطالعات بیشتر در خصوص تمامی این موارد دارد.

تقدیر و تشکر

از معاونت پژوهشی دانشگاه خوارزمی و دانشکده علوم زیستی که امکان انجام این تحقیق را فراهم نموده‌اند، قدردانی می‌گردد.

  1. Babri S, Amani M, Mohaddes G, Alihemmati A, Ebrahimi H, (2012).Effect of Aggregated β-Amyloid (1-42) on Synaptic Plasticity of Hippocampal Dentate Gyrus Granule Cells in Vivo.`Bioimpacts.2(4):189-94
  2. Barnes J, Anderson LA, Phillipson JD, (2002). Herbal Medicines: A Guide for Health Care Professionals. The Pharmaceutical Press. pp: 112 - 13.
  3. Bradley P, (2006). British herbal compendium: a handbook of scientific information on widely used plant drugs. British Herbal Medicine Association, pp: 239.
  4. Curnow A, Owen SJ,(2016).An Evaluation of Root Phytochemicals Derived from Althea officinalis (Marshmallow) and Astragalus membranaceus as Potential Natural Components of UV Protecting Dermatological Formulations.Oxid Med Cell Longev.2016:7053897
  5. Finch CE, Cohen DM (1997). Aging metabolism and Alzheimer disease: review and hypotheses. Experimental neurology; 143 (1): 82-102.
  6. Golshani G, Zarei M, Mohammadi S, (2015). Acute/Chronic Pain Relief: Is Althaea officinalis Essential Oil Effective? Avicenna J Neuro Psych Physio. 2(4): e36586.
  7. Kalaria RN, Maestre GE, Arizaga R, Friedland RP, Galasko D, Hall K, Luchsinger JA, Ogunniyi A, (2008). Alzheimer's disease and vascular dementia in developing countries: prevalence, management, and risk factors. Lancet Neurol. 7(10):867.
  8. Miguel-Hidalgo J.J, Cacabelos R, (1998). Beta-amyloid (1-40) induced neurodegeneration in the rat hippocampal neurons of the CA1 subfield. Acta Neuropathologica; 95(5): 455–465.
  9. Mooney P, Nicell PL, (1992). The importance of exterior environment for Alzheimer residents: effective care and risk management. Healthc Manage Forum. 5(2):23-9.
  10. Nabeshima T, Nitta A, (1994).Memory impairment and neuronal dysfunction induced by beta-amyloid protein in rats.Tohoku J Exp Med. 174(3):241-9.
  11. Nelson PT, Alafuzoff I, Bigio EH, Bouras C, Braak H, Cairns NJ, Castellani RJ, Crain BJ, Davies P, Del Tredici K, Duyckaerts C, Frosch MP, Haroutunian V, Hof PR, Hulette CM, Hyman BT, Iwatsubo T, Jellinger KA, Jicha GA, Kövari E, Kukull WA, Leverenz JB, Love S, Mackenzie IR, Mann DM, Masliah E, McKee AC, Montine TJ, Morris JC, Schneider JA, Sonnen JA, Thal DR, Trojanowski JQ, Troncoso JC, Wisniewski T, Woltjer RL, Beach TG, (2012). Correlation of Alzheimer disease neuropathologic changes with cognitive status: a review of the literature. J Neuropathol Exp Neurol. 71(5):362-81.
  12. Nitta A, Itoh A, Hasegawa T, Nabeshima T, (1994). Beta-amyloid proteininduced Alzheimer’s disease animal model. Neuroscience Letters; 170(1): 63–66.
  13. Nitta A, Fukuta T, Hasegawa T, Nabeshima T, (1997). Continuous infusion of beta-amyloid protein into the rat cerebral ventricle induces learning impairment and neuronal and morphological degeneration. Japanese Journal of Pharmacology. 73(1): 51–57.
  14. Nobakht M, Hoseini S. M, Mortazavi P, Sohrabi I, (2011). Neuropathological Changes in Brain Cortex and Hippocampus in a Rat Model of Alzheimer’s Disease. Iranian Biomedical Journal; 15 (2): 51-85.
  15. Ozdemir MB, Erdogan C, Iwasaki K, Watanabe T, Ishikane S, Fujiwara M, (2013).Injection of specific amyloid-beta oligomers (beta₁₋₄₀:beta₁₋₄₂ = 10:1) into rat medial septum impairs memory retention without inducing hippocampal apoptosis.Neurol Res. 35(8):798-803
  16. Quillfeldt J A (2006). Behavioral Methods to Study Learning and Memory in Rats. CNS Drugs 24(2):163-76.
  17. Razavi M, (2003). Medicinal plant. Talash Pub. pp: 104 - 5 (Persian).
  18. Reddy P. H, (2006). Amyloid precursor protein-mediated free radicals and oxidative damage: Implications for the development and progression of Alzheimer’s disease. Journal of Neurochemistry. 96(1): 1–13.
  19. Rojas-Gutierrez E, Muñoz-Arenas G, Treviño S, Espinosa B, Chavez R, Rojas K, Flores G, Díaz A, Guevara J, (2017). Alzheimer's disease and metabolic syndrome: A link from oxidative stress and inflammation to neurodegeneration.Synapse. 15:359-365.
  20. Salawu FK, Umar JT, Olokoba AB, (2011). Alzheimer's disease: a review of recent developments. Ann Afr Med. 10(2):73-9.
  21. Selkoe DJ, (2001). Alzheimer's disease results from the cerebral accumulation and cytotoxicity of amyloid beta-protein.J Alzheimers Dis. 3(1):75-80
  22. Stepanichev M, Lazareva N, Tukhbatova G, Salozhin S, Gulyaeva N, (1996). Trensient disturbances in cortextual fear memory induced by AB (25-35) in rats are accompanied by cholinergice dysfunction. Behavioural brain research; 259: 152-157.
  23. Thies W, (2011). Stopping a thief and killer: Alzheimer's disease crisis demands greater commitment to research. Alzheimers Dement. 7(2):175-6.
  24. Varadarajan S, Yatin S, Aksenova M, Butterfield D. A, (2000).Review: Alzheimer’s amyloid beta-peptide-associated free radical oxidative stress and neurotoxicity. Journal of Structural Biology; 130(2–3): 184–20.
  25. Wichtl M, Bisset NG, (2004). Herbal Drugs and Phytopharmaceuticals. CRC Press. pp: 234.
  26. Yamada K, Tanaka T, Han D, Senzaki K, Kameyama T, Nabeshima T, (1999). Protective effects of idebenone and alpha-tocopherol on beta-amyloid-(1-42)-induced learning and memory deficits in rats: Implication of oxidative stress in beta-amyloid-induced neurotoxicity in vivo. European Journal of Neuroscience; 11 (1): 83-90.
  27. Yamaguchi Y, Kawashima S, (2001). Effects of amyloid beta (25-35) on possive avoidance radial arm maze and choline acetyl transferase activity in the rat. European Journal of pharmacology; 412 (3): 265-272.
  28. Yarmohammady P, Hosseini N, Salehi I, Ramazani M, (2015). The Effect of Althaea officinalis.L Root Alcoholic Extract on Blood Sugar Level and Lipid Profiles of Streptozotocin Induced-Diabetic Rats. IJEM, 17(3): 238-250.
  29. Yazdian MR, Irani Z, (2015). Evaluation of the Effects of Hydro alcoholic Extract of Althea Root on Experimental Inflammation and Pain Due to Injection of Formalin in Male Rrats. J Shahid Sadoughi Univ Med Sci. 23(6): 528-38.

5.       EkorM (2014). The growing use of herbal medicines: issues relating to adverse reactions and challenges in monitoring safety. Front Pharmacol. 4: 177.

21.    Santoro A, Siviero P, Minicuci N, Bellavista E, Mishto M, Olivieri F, Marchegiani F, Chiamenti AM, Benussi L, Ghidoni R, Nacmias B, Bagnoli S, Ginestroni A, Scarpino O, Feraco E, Gianni W, Cruciani G, Paganelli R, Di Iorio A, Scognamiglio M, Grimaldi LM, Gabelli C, Sorbi S, Binetti G, Crepaldi G, Franceschi C (2010).Effects of donepezil, galantamine and rivastigmine in 938 Italian patients with Alzheimer's disease: a prospective, observational study.CNS Drugs. 24(2):163-76.

24.    Sendker J, Böker I, Lengers I, Brandt S, Jose J, Stark T, Hofmann T, Fink C, Abdel-Aziz H, Hensel A, (2017). Phytochemical Characterization of Low Molecular Weight Constituents from Marshmallow Roots (Althaea officinalis) and Inhibiting Effects of the Aqueous Extract on Human Hyaluronidase-J Nat Prod.24;80(2):290-297.

25.    Shanker G. M, Bloodgood B. L, Townsend M, Walsh D. M, Selkoe D. J, Sabatini B. L, (2007). Natural oligomers of the Alzheimer amyloid- beta protein induce reversible synapse loss by modulating an NMDA type glutamate receptor dependent signaling pathway. The Journal of Neuroscience; 27 (11): 2866-2875.