ریخت­سنجی هندسی بال برای تعیین تنوع درجمعیت­های زنبورعسل

 (Apismellifera meda) در شمال‌غرب ایران

سمیرا بوالحسنی¹، حسن رجبی­مهام^2* و مرتضی نادری³

¹ ایران، تهران، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات گروه محیط­زیست

² ایران، تهران، دانشگاه شهید بهشتی، دانشکده علوم و فناوری زیستی، گروه علوم و زیست‌فناوری جانوری

³ ایران، اراک، دانشگاه اراک، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، گروه محیط‌زیست

تاریخ دریافت: 28/7/95                تاریخ پذیرش: 16/11/96

چکیده

شناسایی و مطالعه تنوع موجود در جمعیت­های زنبورعسل یکی از اهداف مهم در اصلاح نژاد زنبورعسل محسوب می­شود. این پژوهش به‌منظور مقایسه­ی ویژگی ریخت­شناسی جمعیت­های زنبورعسل ایرانی در مناطقی از شمال­غرب و غرب کشور با استفاده از روش ریخت­سنجی هندسی به اجرا درآمد. برای این منظور زنبورهای کارگر از 111 کلنی متعلق­به چهار استان آذربایجان شرقی، آذربایجان غربی، اردبیل و همدان نمونه­برداری شد. از بال جلویی زنبورهای عسل به شیوۀ استاندارد عکس­برداری شد و روی تصاویر دوبعدی حاصل به‌منظور استخراج داده­های شکل بال، با روش ریخت­سنجی تعداد 19 لندمارک تعریف و رقومی شد. داده­های لندمارک پس از آنالیز پروکراست بااستفاده از روش­های آماری چندمتغیره­ی PCA، CVA و CDA و آنالیز خوشه­ای تحلیل گردیدند. نتایج به­دست آمده نشان داد که جمعیت­های زنبورعسل  در امتداد آذربایجان شرقی به سمت آذربایجان غربی تفاوت­های معنی­داری را با توجه به تغییرات ایجاد شده در اقلیم و توپوگرافی نشان می­دهند. هم­چنین آنالیز تحلیل خوشه‌ای نشان داد که جمعیت استان اردبیل و همدان کم‌ترین تفاوت و جمعیت استان‌های آذربایجان شرقی و غربی بیشترین تفاوت را ازنظر شکل ظاهری باهم دارند.

واژه­های کلیدی: صفات ریخت­شناسی، تنوع زیستی، بال، زنبور­عسل

* نویسنده مسئول، تلفن:  02129902725 ،  پست الکترونیکی: h_rajabi@sbu.ac.ir

مقدمه

زنبورعسل اروپایی، Apis mellifera Linnaeus 1758 در آفریقا، خاورمیانه، خاور نزدیک و اروپا پراکنده شده است. علاوه­بر پراکنش وسیع، این‌گونه نیچ­های اکولوژیکی متنوعی از قبیل مناطق بیابانی، جنگل­های بارانی گرمسیری، مناطق کوهستانی و باتلاق­ها را اشغال کرده است (17). به­دلیل تنوع زیاد و اهمیت، زیرگونه­های Apis mellifera L. به‌طور وسیعی مورد مطالعه قرارگرفته است (10). تفاوت­های مربوط به شرایط زیستی موجودات زنده اساس به وجود آمدن نژادها یا زیرگونه­های متفاوت می­باشد. زیرگونه­ها در مناطق مختلف اقلیمی به دلیل وجود شرایط مختلف اکولوژیک، خصوصیات متفاوتی را کسب می­کنند و درواقع شرایط محیطی مختلف باعث تفاوت­های بیولوژیک و مورفولوژیک در موجودات زنده و ازجمله نژادهای زنبورعسل می­شود (3). حداقل 29 زیرگونه براساس خصوصیات ریخت‌شناسی ازاین زنبور‌عسل شناخته‌شده است. این زیرگونه‌ها را به چهار گروه تقسیم‌بندی می‌کنند که درستی آن­ها با مطالعات ریخت‌شناسی، ژنتیک، همچنین آنالیزهای اکولوژیک، رفتاری و فیزیولوژیک نیز ثابت شده است: گروه A، که شامل زیرگونه‌هایی در سراسر آفریقا است؛ گروه M، که شامل زیرگونه‌هایی از اروپایی غربی و شمالی است؛ گروه C، که شامل زیرگونه‌هایی از اروپای شرقی است؛ و گروه O، که شامل گونه‌هایی در ترکیه و خاورمیانه است (16 و 18). خاورمیانه و آسیا منطقه‌ای با تنوع بالای ریخت‌شناسی و تکامل برای زنبورهای عسل است و بسیاری از نژادها از این منطقه انشقاق یافته‌اند، که شامل تنوع بالایی از زیست‌گاه‌ها می‌باشد، به نظر می‌رسد که آسیای صغیر، شامل آناتولی، مرکز ژنتیکی این زیرگونه‌های زنبور باشد. نژادهای زنبور‌عسل دراین منطقه شامل زیرگونه‌های
A. m. anatoliaca، A. m. caucasica، A. m. medaو
A. m. syriaca می‌باشد که توسط روتنر موردتوجه قرارگرفتند و تشکیل یک شاخه‌ی مرکزی از گونه را دادند (10). نام "Meda" اولین بار توسط A.S Skorikov به یک زنبور‌عسل در اتحاد جماهیر شوروی (USSR) نزدیک مرز ایران که متفاوت از زنبور‌عسل زرد قفقازی (Yellow transcaucasian bee) بود داده شد که تنها "tongue length" و "abdominal sternites" به‌عنوان توصیف این نژاد ثبت گردید که پراکندگی آن شمال ایران، Lencoran واقع در دریای خزر بود (16).

اولین طبقه­بندی جامع و تعیین نحوه­ی توزیع زنبورعسل نژاد ایرانی توسط روتنر و همکاران انجام شد؛ آنالیزهای چند متغیره بر روی داده­های مورفومتریک به­ دست­ آمده از 63 نمونه از سرتاسر ایران و 142 نمونه از کشورهای همسایه شامل ترکیه، عراق، سوریه، لبنان، اسرائیل، اردن و قبرس نشان داد که تا حدودی در گروه­های مختلف تداخل و همپوشانی وجود دارد، شش جمعیت محلی به‌منظور تفکیک  A. m. medaدرنظر گرفته شد: غرب و مرکز ایران (ارتفاعات آذربایجان - ایران) ، سواحل نیمه گرمسیری دریای خزر (مازندران)، شمال شرق ایران (مشهد) که به‌صورت  یک گروه کاملاً مجزا درنظر گرفته شد، جنوب­شرقی ایران (کرمان)، عراق، جنوب شرقی آناتولی (از دریاچه Van تا Antakya) (16). محققان با استفاده از روش تجزیه به مؤلفه‌های اصلی (PCA) نشان دادند که توده‌ی زنبور‌عسل موجود در ایران همان زنبور‌عسل نژاد ایرانی (A. m. meda) است و از نژادهای اروپایی واردشده به ایران فاصله‌ی زیادی دارد، واردات نژادهای بیگانه درگذشته به دلیل پایداری نژاد ایرانی و عدم واردات ملکه تأثیر قابل‌ملاحظه‌ای روی آن نگذاشته و این نژاد هویت خود را از دست نداده است و حتی در سال‌های اخیر نژاد ایرانی در مقایسه با نژادهای اروپایی فاصله بیشتری گرفته و در جهت تثبیت نژادی، به خصوصیات واقعی خود نزدیک‌تر شده است (4). برخی از محققین کلنی­های نمونه­برداری­شده از استان اردبیل را مورد بررسی قرار دادند که گرو­ه­بندی جمعیت­های استان اردبیل بر­اساس صفات مورفولوژیک با روش تجزیه خوشه­ای به روش حداقل واریانس وارد (WARD) چهار گروه مجزا را نشان داد؛ که براساس یافته-های این پژوهش جدایی مورفولوژیک زنبورعسل ایرانی و نژاد­های خارجی آن به­اثبات رسید؛ همچنین نژاد­های وارد­شده به این منطقه شامل نژاد ایتالیایی و هیبرید استارلاین درگرو­های کاملاً مجزا قرارگرفتند ولی نژاد میدنایت کاملاً از نژاد استارلاین مجزا نشد (2). در پژوهشی دیگر کلنی­های مربوط به استان­های خراسان شمالی، گلستان، تهران، زنجان و آذربایجان غربی مورد بررسی قرارگرفت و در بررسی­های آماری تک­متغیره با انجام آزمون دانکن، تک­تک خصوصیات ظاهری (16 صفت) به­طور مستقل بررسی شدند که نتایج نشان داد که طول خرطوم و طول پای عقبی از مؤثرترین خصوصیت متمایزکننده بین گرو­ها است، همچنین نتایج آنالیزهایی تک‌متغیره و چندمتغیره نشان داد که بیش‌ترین میزان یک­دستی در زنبورهای منطقه خراسان­شمالی و کم‌ترین آن مربوط به زنبورهای مناطق آذربایجان غربی بود (1).

برای آشکارسازی تفاوت­های ریختی، مطالعات ریخت­سنجی هندسی به دلیل انعکاس تعامل محیط و گونه اهمیت بسزایی دارد (5). روش ریخت­سنجی هندسی یک روش مدرن نسبت به روش­های سنتی است که در آن داده­های لندمارک و خط سیر پیرامونی اطلاعات شکل ساختارهای زیستی را در قالب شکل استخراج می­کند و به‌صورت  گرافیکی به نمایش در می­آورد (21). علاوه بر این امکان تفسیر داده­های این اشکال و آنالیز آماری آن­ها به‌راحتی امکان­پذیر است (5). در مطالعه‌ی زنبورهای عسل آنالیز ریخت­سنجی هندسی شکل بال دید وسیعی از صفات و شناسایی جمعیت­ها و دودمان­ها را فراهم می­کند (8، 9، 10 و 20). از این­رو با توجه به قابلیت بالای ریخت­سنجی هندسی در جداسازی اشکال زیستی، این تحقیق باهدف مقایسه­ی تغییرات رگبال­های بال جلویی جمعیت­های زنبورعسل ایرانی در مناطق مختلف بااستفاده از روش ریخت­سنجی هندسی انجام شد. در این پژوهش تلاش شده تا مشخص شود که آیا وضعیت جغرافیایی مناطق مورد مطالعه باعث تغییر خصوصیات مورفولوژیک شده است یا خیر؟

مواد و روشها

روش نمونه­برداری و آماده­سازی نمونه: در این بررسی تعداد 157 نمونه زنبور کارگر از 38 ایستگاه مختلف متعلق به استانهای آذربایجان غربی، آذربایجان شرقی، اردبیل و همدان در سال 1389 و 1391 جمع­آوری شد (شکل 1، جدول 1).

شکل 1- موقعیت ایستگاه­ها در استان­های مورد مطالعه

برای نمونه‌برداری از ظروف پلاستیکی دهان‌گشاد استفاده شد و زنبورهای کارگر جوان بااحتیاط از داخل هر کندو و از روی شانهای زنبورعسل در داخل بطری­های پلاستیکی قرار داده و جهت مطالعه به آزمایشگاه منتقل شدند. سپس بال جلویی 157 نمونه به‌دقت جدا شد و مدتی آن را در محلول الکل 70 درصد قرار داده و سپس بال­ها به ترتیب روی اسلایدهای دوجداره چیده شدند تا پس از تبخیر الکل به اسلایدها بچسبند. عکس­برداری با استفاده از یک دوربین دیجیتال Casio14MP و استریومیکروسکوپ در شرایط استاندارد انجام شد.

روش­های آماری و تجزیه‌وتحلیل داده­ها: برای استخراج داده­های شکل درروش ریخت­سنجی هندسی تعداد 19 لندمارک تعیین گردید (شکل 2). لندمارک­ها با استفاده از نرم­افزار TPS Dig v2.16 (20) بر روی تصاویر دو­بعدی قرار داده شدند و مختصات نقاط آن­ها به­صورت طول (x) و عرض (y) در قالب یک فایل متنی تهیه شد. ابتدا بر روی  نمونه­ها به بررسی اثر آلومتری در نرم­افزار PAST v2.17 (11) پرداخته شد. سپس برای استخراج داده­های شکل و حذف داده­های غیر­شکل شامل اندازه، موقعیت و جهت، جایگاه لندمارک­ها با استفاده از تحلیل پروکراست (Generalized Procrustes Analysis) روی هم­گذاری شدند. داده­های حاصل از شکل بال جلویی نمونه­ها ابتدا به­منظور نشان دادن مهم­ترین فاکتور در تغییرات شکل بال، بااستفاده از تحلیل­های چندمتغیره تجزیه به مولفه­های اصلی (Principal Component Analysis)، که در آن با­ توجه به واریانس صفات، برای هریک از آن‌ها در هر مؤلفه ضریبی در نظر گرفته می­شود و از دخالت ضرایب در اندازه­ی صفات، نهایتاً وضعیت نژادها روی مؤلفه­ی اول مشخص می­شود. سپس مولفه­های بعدی بااستفاده از واریانس صفات به همان شکل و با اعمال ضرایب دیگری به­دست می­آید؛ ارزش نژادها در مولفه­های مختلف، درواقع مختصات نژادهای مذکور در نمودارهایی است که با استفاده از این مؤلفه‌ها ترسیم می­شود، با استفاده از نرم­افزار PAST v2.17 مورد آنالیز قرارگرفت.

جدول 1- اطلاعات ایستگاه­های نمونه­برداری­شده

شکل 2- نمایی از بال جلویی رقومی­شده با 19 لندمارک

سپس آزمون تجزیه همبستگی کانونی (Canonical Variate Analysis)، به­منظور تعیین اندازه رابطه­ی بین دو مجموعه از متغیرها بااستفاده از ضرایب افزونگی (درجه همپوشانی بین دو مجموعه متغیر) با استفاده از نرم­افزار PAST v2.17 انجام شد، و پس‌ازآن آزمون تابع تفکیک کانونی (Canonical Discriminant Analysis) که با آزمون Wilks’Lambda ارزیابی می‌شود که میانگین کلی از محاسبه‌ی درصد صحیح کسب‌شده در میان نمونه‌های منسوب شده به گروه پیش‌بینی‌شده خود و گروه‌های واقعی را فراهم می‌کند، نیز با استفاده از نرم­افزار SPSS v22 (14) مورد آنالیز قرارگرفت.

نتایج

تحلیل تجزیه به مؤلفه‌های اصلی (PCA)، سه مؤلفه‌ی اصلی (PC) را به‌منزله‌ی مؤلفه‌های مؤثر تشخیص داد که سهمهرکدام از این مؤلفه‌ها از مقدار کل واریانس از مؤلفه‌ی اول تا مؤلفه‌ی سوم به ترتیب 20/46، 01/31 و 70/22 درصد بود. دو مؤلفه‌ی اصلی اول با مجموع واریانس 30/77 درصد بیشترین بار عاملی را به خود اختصاص داد. مقایسه‌ی ضریب Jolliffe cut-off با مقدار 14/7 و مقادیر ویژه­ی مؤلفه‌های اصلی به ترتیب 13/14، 51/9 و 94/6 معنی‌داری دو مؤلفه‌ی اصلی اول و دوم را تائید و معنی‌داری مؤلفه‌ی اصلی سوم را رد کرد. مؤلفه‌ی اصلی اول (PC₁) مربوط به تغییر جایگاه لندمارک‌های شماره 19، 1 و مؤلفه اصلی دوم (PC₂) مربوط به تغییر جایگاه لندمارک‌های شماره‌ی 15 و 13 بود (شکل 3). در تحلیل تجزیه همبستگی کانونی (CVA)، براساس فواصل Mahalanobis، با در نظرگرفتن سطح معنی‌داری کمتر از 05/0 عدم وجود تفاوت معنی‌دار بین گروه‌های مختلف نشان داده ‌شده است (شکل 4). فواصل Mahalanobis در جدول 2 آورده شده است. که کمترین فاصله ازنظر شکل بال بین جمعیت‌های استان‌های اردبیل و همدان و بیشترین فاصله را جمعیت استان آذربایجان غربی از استان آذربایجان شرقی و پس‌ازآن جمعیت استان آذربایجان غربی از استان اردبیل داشت.

همچنین با استفاده از تابع تفکیک کانونی (CDA) درصد منتسب شدن نمونه‌های استان اردبیل به گروه‌بندی پیش‌بینی‌شده 1/65 درصد، انتساب نمونه‌های استان آذربایجان غربی به گروه پیش‌بینی‌شده مربوطه 9/88 درصد، انتساب نمونه‌های استان آذربایجان شرقی به گروه پیش‌بینی‌شده خود 2/88 درصد و نهایتاً درصد منتسب شدن نمونه‌های استان همدان به گروه پیش‌بینی‌شده 8/60 درصد نشان داده شد. درمجموع، درصد صحیح انتساب افراد به گروه خودشان 2/68 درصد را نشان داد. عملکرد آزمون تفکیک کانونی (CDA)، با آزمون Wilks’Lambda ارزیابی شد که میانگین کلی از محاسبه‌ی درصد صحیح کسب‌شده در میان نمونه‌های منسوب شده به گروه پیش‌بینی‌شده خود و گروه‌های واقعی را فراهم می­کرد. براساس نتایج به­دست آمده، تحلیل داده­ها با استفاده از معیار Sig (05/0P<) حاکی از جدایی جمعیت­های استانهای آذربایجان شرقی و آذربایجان غربی می­باشد (Sig=0.034) که این جدایی نسبت به جدایی جمعیت­های استان­های اردبیل و آذربایجان شرقی از معنی‌داری  بیشتری برخوردار است (Sig=0).

تحلیل خوشه‌ای براساس سنتروئید گروه به‌صورت واضح نشان داد که جمعیت استان اردبیل و همدان کم‌ترین تمایز و استان‌های آذربایجان شرقی و غربی بیشترین تمایز را باهم دارند.

شکل 3- نمودارتجزیه به مولفه­های اصلی PCA شکل بال چهار جمعیت زنبور‌عسل ایرانی موردمطالعه

شکل 4- نمودار CVA شکل بال چهار جمعیت زنبور‌عسل ایرانی موردمطالعه

جدول 2- فاصله­ی Mahalanobis بین چهار جمعیت متعلق به 4 استان مورد­مطالعه

همچنین دو کلاد مجزا مشاهده شد که کلاد اول شامل جمعیت‌های استان‌های آذربایجان شرقی، استان همدان و استان اردبیل و کلاد دوم شامل جمعیت استان آذربایجان غربی بود. باتوجه به شکل 5 در استان اردبیل بیشترین تغییرات حول لندمارک شماره 13، در استان آذربایجان غربی بیشترین تغییرات حول لندمارک شماره 5، در استان آذربایجان شرقی بیشترین تغییرات حول لندمارک‌های شماره 10، 11 و 13 و در استان همدان بیشترین تغییرات حول لندمارک شماره 7 اتفاق افتاده است.

شکل 5- نمودار تحلیل خوشه‌ای مربوط به تصاویر شکل بال مربوط به هر کلاد (رنگ‌های گرم: گسترش در حول نقاط لندمارک و رنگ‌های سرد: عدم گسترش)