نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

بخش تشخیص بیماری های ویروسی دام، موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزی، کرج، ایران

چکیده

با توجه به کاربردهای متعدد آنتی ­بادی پلی ­کلونال در زمینه ­های تحقیقاتی و بالینی، ابداع روش­های تهیه ­ی سرم هایپرایمن علیه عوامل بیماری­زا از اهمیت بسیار برخوردار است. در تحقیق انجام شده با سعی بر تولید آنتی ­بادی علیه ویروس تب سه­ روزه ­ی گاو، روشی برای تولید سرم هایپرایمن ابداع گردید. بدین منظور ویروس کامل با عیار 50TCID 106.7 در سه دوز و با در نظر گرفتن فواصل زمانی صفر، یک و چهار هفته،  به روش وریدی و بدون استفاده از یاور(Adjuvant)  به خرگوش تزریق شد. دست­یابی به سرم هایپرایمن با عیار بالا نتیجه ­ی مطلوب این تحقیق است، بطوریکه میانگین آنتی بادیهای خنثی ­کننده علیه ویروس1625 برآورد گردید. که در مقایسه با مطالعات گذشته، کارایی بالای خود را در تولید آنتی ­بادی علیه عامل ویروسی نشان می­ دهد. سرم هایپرایمن  بدست آمده از این مطالعه  قطعاً بعنوان یک ماده بیولوژیک  در زمینه ­های تحقیقاتی و در صورت لزوم تجاری، مفید و راهبردی خواهد بود. همچنین به عنوان یک روش در تولید سرم­های هایپرایمن علیه ویروس­های دیگر می­تواند مورد توجه محققین و صاحب نظران قرار گیرد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Laboratory production of hyperimmune serum against Bovine ephemeral fever virus isolated in Iran

نویسندگان [English]

  • Shokoofeh Almasi
  • Mehran Bakhshesh

Animal Virology Department, Research and Diagnosis, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Karaj, I.R. of Iran

چکیده [English]

Considering the numerous applications of polyclonal antibodies in research and clinical fields, the development of methods for the preparation of hyperimmune serum against pathogens is very important. In this research, a method for producing hyperimmune serum against bovine ephemeral fever virus was introduced. The hyperimmune serum was raised in rabbit using at least 106.7 TCID50 of the whole viral particle which was administered intravenously without adjuvant. Antigen presentation was carried out at 0, 1 and 4 weeks intervals. In comparison to the previous studies, this schedule resulted in a high titer of hyperimmune serum against the virus as the mean of neutralizing antibodies was determined at 1625. The hyperimmune serum as a biological product of this research will definitely be exploited in the experiments required for this research as well as possible commercial applications in the future. This method is also introduced for producing hyperimmune serum against other viruses, especially rhabdoviruses.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Rhabdovirus
  • "Polyclonal Antibody"
  • Rabbit

تهیه آزمایشگاهی سرم هایپرایمن علیه ویروس تب سه‌روزه گاو جداشده در ایران

شکوفه الماسی و مهران بخشش*

ایران، کرج،سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی کرج، موسسه تحقیقات واکسن و سرم­سازی رازی، بخش تحقیق و تشخیص بیماری­های ویروسی دام

تاریخ دریافت: 13/10/96              تاریخ پذیرش: 23/2/97

چکیده

باتوجه به کاربردهای متعدد آنتی­بادی پلی­کلونال در زمینه­های تحقیقاتی و بالینی، ابداع روش­های تهیه­ی سرم هایپرایمن علیه عوامل بیماری­زا از اهمیت بسیار برخوردار است. در تحقیق انجام‌شده سعی بر تولید آنتی­بادی علیه ویروس تب سه‌روزه‌ی گاو، روشی برای تولید سرم هایپرایمن ابداع گردید. بدین منظور ویروس کامل با عیار 50TCID 106.7 در سه دوز و با در نظر گرفتن فواصل زمانی صفر، یک و چهار هفته، به روش وریدی و بدون استفاده از یاور(Adjuvant) به خرگوش تزریق شد. دست­یابی به سرم هایپرایمن با عیار بالا نتیجه­ی مطلوب این تحقیق است، بطوریکه میانگین آنتی‌بادی‌های خنثی­کننده علیه ویروس1625 برآورد گردید. که در مقایسه با مطالعات گذشته، کارایی بالای خود را در تولید آنتی­بادی علیه عامل ویروسی نشان می­دهد. سرم هایپرایمن بدست آمده از این مطالعه قطعاً بعنوان یک ماده بیولوژیک در زمینه­های تحقیقاتی و در صورت لزوم تجاری، مفید و راهبردی خواهد بود. همچنین به عنوان یک روش در تولید سرم­های هایپرایمن علیه ویروس­های دیگر می­تواند موردتوجه محققین و صاحب‌نظران قرار گیرد.

واژه­های کلیدی: آنتی­بادی پلی­کلونال، خرگوش، رابدوویروس

* نویسنده مسئول، تلفن: 02634570038، پست الکترونیکی: m.bakhshesh@rvsri.ac.ir

مقدمه

 

در سال­های اخیر تولید آنتی­بادی در آزمایشگاههای تحقیقاتی گسترش‌یافته و کاربردهای مختلفی در زمینه­های پژوهشی پیداکرده­ است. بعنوان نمونه می­توان به درمان و انجام آزمایش­های تشخیصی نظیر خنثی­سازی و الایزا، وسترن­ بلات، روش­های ایمنوهیستوشیمیایی، میکروسکوپ ایمنوفلورسانس، ایمنوالکترون و کنترل کیفی واکسن اشاره نمود (10). محققان بمنظور تولید آنتی­بادی با روش­های متعددی روبرو هستند که انتخاب بهترین و کاربردی­ترین روش از اهمیت بالایی برخوردار است (5). آنتی‌بادی‌ها بواسطه­ی سیستم ایمنی در پاسخ اختصاصی به یک ایمنوژن تولیدشده و از پلاسماسل­هایی ترشح می­شوند که در پی انگیزش مناسب با ایمنوژن خارجی، از لنفوسیت­های B تمایزیافته‌اند. بدین­صورت که پس از عرضه­ی اولیه­ی آنتی­ژن بیگانه پاسخ اولیه شکل می­گیرد. این پاسخ به دنبال واکنش­های خارج فولیکولی بوده و آنتی­بادی تولیدشده غالباً از کلاس IgM است. اما در ادامه با واکنش­هایی که در مراکز زایا صورت می­گیرد، دو رخداد عمده به وقوع می­پیوندد: اول، تغییر کلاس آنتی­بادی از IgM به IgG یا IgA، و دوم بلوغ (افزایش) افینیتی در لنفوسیت­های B برای آنتی­ژن اختصاصی­شان. نتیجه­ی این تغییرات تولید بیشتر آنتی­بادی با ظرفیت بالاتر برای اتصال به آنتی­ژن است. طی واکنش­های صورت گرفته در مراکز زایا شمار بسیاری از پلاسماسل­های اختصاصی ساخته می­شوند. مقدار IgG تولیدشده در مقابل آنتی­ژن طی 4 تا 6 هفته پس از ایمن­سازی اولیه به بیشترین مقدار خود می­رسد (14). پاسخ هومورال می­تواند به‌صورت تولید آنتی­بادی­های پلی­کلونال باشد که توسط کلون­های مختلف لنفوسیت B ساخته می­شوند (10). تولید آنتی­بادی پلی­کلونال نسبت به آنتی­بادی منوکلونال زمان، هزینه و زحمت کمتری صرف می­کند و مواد و وسایل موردنیاز آن نیز در دسترس­تر است (3). این نوع آنتی­بادی در زمینه­های تحقیقاتی ازجمله مقایسه­ی شباهت آنتی­ژنی، کنترل مثبت در تست­های خنثی­سازی، مطالعات بالینی و سرولوژی (تعیین هویت ویروسهای جدا شده و تهیه­ی کیت تشخیصی از جمله الایزا)، پیشگیری از بیماری و... کاربردهای فراوان دارد. در آزمایش‌های تشخیصی و تحقیقاتی استفاده ازسرمی که در حیوانی بافاصله‌ی تکاملی بیشتر از میزبان اصلی تهیه‌شده باشد، واکنش ناخواسته با پروتئین­های مشابه و غیراختصاصی را کاهش می­دهد (3).

این مطالعه باهدف تولید آنتی­بادی پلی­کلونال علیه ویروس تب سه ‌روزه‌ی گاو (Bovine ephemeral fever) انجام شد. بیماری تب سه‌ روزه ازجمله بیماریهای منتقل‌شونده از طریق بندپایان است که در گاو و گاومیش نوعی بیماری ناتوان­کننده را منجر می­شود و بدنبال آن کاهش میزان شیردهی در گاوها، سقط‌جنین، ناباروری موقت و کاهش کیفیت محصول گوشت دیده می­شود. درنتیجه خسارات اقتصادی فراوان به صنعت گاوداری وارد شده که با ایجاد محدودیت صادرات دام و فراورده­های آن همراه است. عامل ویروسی این بیماری در جنس Ephemerovirus و خانواده­ی Rhabdoviridae قرارگرفته است. گلیکوپروتئین G این ویروس که تنها پروتئین سطحی آن است، عمده­ترین پروتئین ایمنی­زای آن بوده و علیه اپیتوپ­های مختلف آن آنتی­بادی خنثی­کننده تولید می­شود. این ویروس طی سال­های اخیر در ایران جداشده (2) و مطالعات ویروس­شناسی، اپیدمیولوژی و ساخت واکسن آن در جریان است. در همین راستا این تحقیق برحسب نیاز به آنتی­بادی پلی­کلونال به‌منظور انجام مطالعات روی این ویروس طراحی گردید.

مواد و روشها

1- آماده‌سازی ویروس جهت تزریق: تکثیر ویروس در کشت سلول Vero و محیط کشت
 DMEM= Dulbecco's Modified Eagle Medium  (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, California, USA) حاوی 2٪ FBS (سرم جنین گوساله/ Gibco, Invitrogen) و محلول ذخیره­ی آنتی­بیوتیک (شامل U100 پنی­سیلین G و μg50 استرپتومایسین به ازای هر میلی­لیتر از محیط کشت) انجام شد و پس از شش پاساژ متوالی، عیار آن با روش 50  TCID= Tissue culture infectious dose 50% اندازه­گیری گردید. به ‌این ‌ترتیب که رقتهای 1-10 تا 8-10 از سوسپانسیون ویروس در میکروپلیت 96 خانه و در تکرارهای هشت­تایی با بستر سلولی (سلول Vero) مواجه شده، سپس بمدت چهار روز در دمای C °37 و 2CO5٪ نگهداری شد. با خوانش تعداد چاهک­های حاوی اثرات سایتوپاتیک مثبت و منفی در هر رقت، تیتر ویروس به روش رید و مانچ (12) محاسبه گردید. برای انجام این کار ابتدا با ثبت موارد مثبت و منفی، فراوانی تجمعی و سپس درصد موارد مثبت بدست آمد.

 (تیتر نهایی ویروس)End point = 10-X

 

پس از این­که ویروس به عیار مناسب ) 50TCID 6.7 10( رسانده شد، سلول­ها و محیط کشت حاوی ویروس برداشت گردید. سپس با انجام سانتریفیوژ (International Equipment, Co-Needham HTC Massachusetts ) در RPM3000 و دمای C°4 به مدت 15-10 دقیقه، اجزاء سلولی رسوب داده شده و مایع رویی برای تزریق برداشت گردید.

2- تزریق به خرگوش و تهیه­ی سرم هایپرایمن:بدین منظور پنج خرگوش سفید ماده از نژاد Ducth برای تزریق نمونه انتخاب‌شده و چهار خرگوش دیگر بعنوان شاهد در نظر گرفته شدند. برای تولید آنتی­بادی باید از خرگوش­های جوان (16-10 هفته، به وزن 2 تا 2.5 کیلوگرم) استفاده کرد. دراین سن سطح آنتی­بادی مادری تقریباً از بین رفته و سیستم ایمنی خود خرگوش به حد بزرگسال رسیده است (11). خرگوش­های سفید یا قرمز نیوزیلندی بهترین منبع برای بدست آوردن آنتی­سرم اختصاصی­اند، زیرا هر بار می­توان30 تا 50 سی­سی از آن­ها خون گرفت (3).

قبل از آغاز تزریق ابتدا از خرگوش­های مورد آزمایش خونگیری شد تا از عدم وجود آنتی­بادی علیه ویروس­های تزریق‌شده اطمینان حاصل شود (سرم پیش ایمن). نوبت اول با تزریق 2 سی­سی از مایع حاوی ویروس با عیار 50TCID 6.7 10 بدون استفاده از یاور، به داخل ورید حاشیه­ای گوش (Marginal ear vein) صورت پذیرفت. به سه خرگوش شاهد، دو سی­سی مایع رویی کشت سلول پس از سانتریفیوژ (Supernatant)، بدون ویروس تزریق‌شده و خرگوش شاهد دیگر بدون تزریق باقی ماند. بمنظور یادآوری و افزایش عیار آنتی­بادی، تزریقات بعدی به همان مقدار و با برنامه زیر تکرار شد:

روز 0 : اولین تزریق و عرضه­ی آنتی­ژن

روز 7 : تزریق اولین یادآور

روز 28 : تزریق دومین یادآور

روز 42 : خونگیری و تهیه­ی سرم به شرح زیر

پس از نیم ساعت انکوباسیون نمونه­های خون در لوله­ی حاوی ماده فعال کننده لخته در دمای C °37، به مدت 10 دقیقه درRPM3000 سانتریفیوژ شدند. سرم­های بدست آمده به مدت 30 دقیقه در بن ماری C °56 قرار گرفت تا اجزای کمپلمان غیرفعال شوند.

3- اندازه­گیری تیتر آنتی­بادی: اندازه­گیری میزان آنتی­بادی پلی­کلونال تولیدشده علیه ویروس، با آزمایش خنثی­سازی ویروس (Virus Neutralization Test) انجام شد. این کار در میکروپلیت 96 خانه صورت گرفت و برای هر رقت سرمی چهار چاهک در یک ردیف اختصاص یافت. در هر چاهک 50 میکرولیتر سوسپانسیون حاوی 50TCID100 ویروس با حجم مساوی سرم (50 میکرولیتر از رقت­های سریالی 2/1 تا 8192/1) مواجه شد. در کنار چاهک­های نمونه، کنترل سلول، کنترل ویروس و کنترل مثبت و منفی سرم قرارداده شده و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شدند. سپس سوسپانسیون سلولی Vero با تراکم cell/ml 106 به چاهک­ها اضافه‌شده و در گرم­خانه­ی
C°37 حاوی 2CO5% قرارگرفت. خوانش میکروپلیت پس از 4 تا 5 روز براساس مشاهده­ی اثرات سایتوپاتیک (cytopathic effect) بدنبال تکثیر ویروس انجام پذیرفت و مقدار عیار آنتی­بادی بدست آمده به روش رید و مانچ (12) محاسبه شد. 

نتایج

به منظور اطمینان از نتایج بدست آمده، عیار آنتی­بادی با روش VNT انجام‌شده و برای هر سرم سه بار تکرار گردید. سپس میانگین هندسی عیار آنتی بادی و انحراف معیار عیار آنتی بادی برای هرکدام از خرگوش­ها و نهایتاً بین هر پنج خرگوش تعیین شد (جدول 1).

(میانگین هندسی)

 

به دنبال ایمن­سازی خرگوش­ها در فواصل زمانی گفته‌شده با دوز بالای ویروس، سیستم ایمنی هومورال هریک از خرگوش­ها برانگیخته شد و درنتیجه میزان قابل‌ملاحظه‌ای از آنتی­بادی­های خنثی­کننده علیه ویروس تب سه‌روزه بدست آمد. میانگین عیار آنتی­بادی در خرگوش‌ها بین 812 تا 4096 و به‌طور میانگین 1625 در کنار انحراف معیار برآورد گردید. تمام خرگوش­های شاهد فاقد عیار آنتی­بادی علیه این ویروس بودند.

 

جدول 1 - عیار آنتی­بادی پلی­کلونال تولیدشده علیه ویروس تب سه‌روزه در هریک از خرگوش­ها و میزان آنتی‌بادی تولیدشده در هر یک از تکرارها

 

تکرار اول

تکرار دوم

تکرار سوم

میانگین هندسی

انحراف معیار

خرگوش 1

1024

1024

512

812

244

خرگوش 2

1024

2048

2048

1625

239

خرگوش 3

4096

4096

4096

4096

0

خرگوش 4

1024

1024

1024

1024

0

خرگوش 5

2048

2048

2048

2048

0

میانگین

1552

1782

1552

1625

6/96

خرگوش­های شاهد

0/0

0/0

0/0

0/0

0/0

 

 

بحث

در راستای دست­یابی به سرم هایپرایمن با عیار بالا علیه ویروس­های مختلف مطالعات متنوعی صورت گرفته است که در آن­ها از روش­ها، فواصل زمانی و یاورهای مختلف (ازجمله یاور کامل فروند و هیدروکسید آلومینیوم) استفاده‌شده است. در هرکدام از مطالعات باتوجه به هدف تولید سرم، عیار متفاوتی بدست آمده است. بااین‌حال تولید آنتی­بادی فرایندی پیچیده ­است و همیشه امکان کسب نتایج مشابه وجود ندارد (13). گاهی برای دست­یابی به اهدافی خاص تزریق یک دوز کافی­ست، اما اصولاً تیتر بالاتر آنتی­بادی با چند تزریق به‌صورت یادآور بدست می­آید. در مطالعه­ی حاضر باتوجه به نیاز به سرم هایپرایمن علیه ویروس تب­ سه‌روزه در کشور روشی بر مبنای تزریق دوزهای یادآور با عیار بالای ویروس ابداع گردید و به شکلی مؤثر کارایی خود را در تولید آنتی­بادی نشان داد. از مزیت­های این روش و تولید آنتی­بادی در خرگوش این است که احتمال واکنش ناخواسته با پروتئین­های گاوی به حداقل می­رسد.

تهیه­ی سرم هایپرایمن با استفاده از روش تزریق وریدی ویروس­ قبلاً نیز تجربه‌شده است. در مطالعه­ای Webster (15) بر مبنای پاسخ آنتی­بادی در خرگوش­ها طی یک دوره­ی حدوداً سه‌ماهه نشان داد که تزریق مقادیر یکسان ویروس آنفلوانزا به روش درون وریدی نسبت به روش درون صفاقی یا زیرجلدی ارجحیت دارد. در روش درون وریدی، آنتی­ژن ابتدا وارد طحال (به عنوان بافت لنفاوی اولیه) و سپس گره­های لنفاوی شده و تمام اجزای سیستم ایمنی را فعال می­نماید. در این روش، هیچ‌گاه نباید از یاور استفاده کرد. البته باید توجه شود که در این روش، خطر آمبولی ریوی یا شوک آنافیلاکتیک کشنده در حیوان حساس به میزان پایین وجود دارد. همچنین از عدم آلودگی آنتی­ژن باید اطمینان حاصل شود. آلودگی بسیار ناچیز با سایر اجرام گاهی می­تواند ایمنی­ بیشتری نسبت به آنتی­ژن موردنظر ایجاد کند (11).

در غالب مطالعاتی که بمنظور تهیه­ی سرم هایپرایمن علیه سایر ویروس­ها صورت پذیرفته است، تزریق ویروس به شکل زیر جلدی و یا عضلانی انجام‌شده، بعلاوه اینکه در بیشتر موارد از یاور هم برای عرضه­ی آنتی­ژن استفاده‌شده است (1، 7، 8 و13). حاصل به‌کارگیری این­ روش­ها با افزایش دفعات تزریق یادآور حتی تا شش بار (7)، بدست آمدن مقدار آنتی­بادی تا عیار 1024/1 بوده است.

همین‌طور در مطالعاتی که روی ویروس تب سه‌روزه انجام‌شده (4، 6و 9) با استفاده از روش­های ذکرشده، حاصل کار مقادیر متفاوتی از آنتی­بادی خنثی­کننده بوده است. کاتو و همکاران (9) در راستای تحقیق خود روی این ویروس، با بهره‌گیری از روش تعریف‌شده توسط بنیاد ملی سلامت حیوانات در سال 2007، علیه تب سه­روزه سرم هایپرایمن تهیه کردند. این روش به‌صورت وریدی و بدون یاور، در دو دوز تزریق به فاصله­ی سه هفته و خونگیری پس از ده روز، طراحی‌شده­ و نتیجه­ی آن دست­یابی به عیار تقریبی 1400/1 بود.

اطلاعات بدست آمده از تحقیقات گذشته بسته به نوع ویروس، نوع حیوان مورد آزمایش، دوز تزریق، استفاده از انواع یاور­ها، فواصل تزریق و... نتایج متفاوتی بدنبال داشته است. اما بنیان­گذاری روش­هایی که با امکانات موجود بهترین نتیجه را بدست دهد نیاز به علم، تجربه و بررسی همه‌جانبه دارد. در مطالعه­ی پیش رو نیز که باهدف دست­یابی به سرم هایپرایمن جهت ادامه­ی مطالعات تحقیقاتی روی ویروس تب سه‌روزه انجام شد، با در نظر گرفتن همه­ی جوانب و در مقایسه با سایر تحقیقات، روش ابداع‌شده منجر به تولید محصول (سرم هایپرایمن) با عیار و کارایی بالا گردید که می­تواند نیازهای تحقیقاتی موردنظر را برآورده کند و راه­گشای تولید آنتی­بادی در تحقیقات ویروس­شناسی باشد.

سرم تهیه‌شده برای اهداف مختلف تحقیقاتی ازجمله مطالعه­ی اپیتوپ­های آنتی­ژنیک استفاده می شود (16)، همچنین بعلت احتمال پائین ایجاد واکنشهای متقاطع با پروتئین‌ها و اجرام بیماری­زای گاوی برای آزمایشاتی نظیر میزان خنثی­کنندگی جدایه­های مختلف، جداسازی ویروس­های جدید یا مطالعات سرواپیدمیولوژی و...کاربرد دارد. بعلاوه در مقیاس وسیع­تر ممکن است بتوان با بهینه نمودن روش کار از سرم هایپرایمن باهدف ایجاد ایمنی غیرفعال برای مقابله با این بیماری استفاده کرد.

1- Attyat, M. K., and Wafaa, R., 2015."Efficacy of canine parvovirus hyperimmune serum prepared in horses for treatment of canine parvo and feline panleucopenia infections." Behna veterinary medical journal, 28(2), PP: 34‐39

2- Bakhshesh, M, and Abdollahi, D., 2015. "Bovine Ephemeral fever in Iran: Diagnosis, isolation and molecular characterization." Journal of arthropod-borne diseases 9(2), 195 p.

3- Cooper, H. M., and Paterson, Y., 2009. "Production of polyclonal antisera." Current protocols in neuroscience, 5.5. 1-5.5. 10.

4- Cybinski, D., and H., Zakrzewski, 1983. "The isolation and preliminary characterization of a rhabdovirus in Australia related to bovine ephemeral fever virus." Veterinary Microbiology 8(3), PP: 221-235.

5- Hanly, W. C., Artwohl, J. E., and Bennett, B. T., 1995. "Review of polyclonal antibody production procedures in mammals and poultry." ILAR journal 37(3), PP: 93-118.

6- Hsieh, Y. C., Wang, S. Y., Lee, Y., Chen, S. H., Mak, P. O., and Chu, C. Y., 2006. "DNA sequence analysis of glycoprotein G gene of bovine ephemeral fever virus and development of a double oil emulsion vaccine against bovine ephemeral fever." Journal of veterinary medical science 68(6), PP: 543-548.

7- Hussain, I., Rasool, M., and Mahmood, M., 2004. "Production of hyperimmune serum against infectious bursal disease virus in rabbits." Pak. Vet. J 24, PP: 179-183.

8- Islam, M., Parvin, M., Akhter, J., Islam, M., Siddique, M., and M.Rashid 2014. "Clinical Evaluation of Hyperimmune Serum for the Treatment of Newcastle Disease in Indigenous Layer Birds." Progressive Agriculture 24(1-2), PP: 79-84.

9- Kato, T., Aizawa, M., Takayoshi, K., Kokuba, T., Yanase, T., Shirafuji, H., Tsuda T., and Yamakawa M., 2009. "Phylogenetic relationships of the G gene sequence of bovine ephemeral fever virus isolated in Japan, Taiwan and Australia." Veterinary microbiology 137(3), PP: 217-223.

10- Leenaars, M., and Hendriksen C. F., 2005. "Critical steps in the production of polyclonal and monoclonal antibodies: evaluation and recommendations." Ilar Journal 46(3), PP: 269-279.

11- Protocol-Rabbits, P.A.P. 2007. Polyclonal Antibody production Protocol-Rabbit Florida State University. www.research.fsu.edu/media/ 1851/antibody-production_polyclonal.pdf.

12- Reed, L. J., and Muench, H., 1938. "A SIMPLE METHOD OF ESTIMATING FIFTY PER CENT ENDPOINTS." American journal of epidemiology 27(3), PP: 493-497.

13- Samiullah, M., Rizvi, F., Anjum A., and Shah M., 2006. "Raising hyperimmune serum against Avian Paramyxovirus (APMV-1) and Pigeon Paramyxovirus (PPMV-1) in rabbits and their cross reactivity." Pakistan Journal of Biological Sciences 9(11), PP: 2184-2186.

14- Siegrist, C. A., 2012. Vaccine immunology, section1, Chapter 2 in Vaccines, 6th edition; Edited by Plotkin,S., W,Orenstein., P, Offit. Saunders Elsevier, Philadelphia, USA, PP: 17-37.

15- Webster, R., 1965. "The immune response to influenza virus: I. Effect of the route and schedule of vaccination on the time course of the immune response, as measured by three serological methods." Immunology 9(6), 501 p.

16- Yazdani, F., Bakhshesh, M., Esmaelizad, M., Sadigh, Z.A.,  2017. "Expression of G1-epitope of bovine ephemeral fever virus in E. coli: A novel candidate to develop ELISA kit". Veterinary Research Forum 8 (3): 209-213