نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشجوی دکتری بیوشیمی ، دانشگاه پیام نور واحد تهران شرق ، تهران ، ایران
2 پژوهشکده مواد و سوخت هسته ای، پژوهشگاه علوم و فنون هسته ای، تهران، ایران
3 استادیار گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد گرمسار، گرمسار، ایران
4 استاد دانشگاه پیام نور، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، تهران، ایران
5 استادیار دانشگاه پیام نور، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، تهران، ایران
6 کارشناس ارشد فیزیولوژی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد قم، قم، ایران
7 دانشجوی ارشد بیوشیمی، دانشگاه پیام نور واحد تهران شرق، تهران، ایران
چکیده
سپسیس علت عمده مرگ و میر بیماران در بخش مراقبت های ویژه است. با وجود درمان های حمایتی جدید و بکارگیری آنتی بیوتیک های قوی، سپسیس همچنان از جمله عوامل خطرزا در زندگی مبتلایان می باشد. لذا هدف از این مطالعه، بررسی تأثیر آب تهی شده از دوتریوم (DDW) و اسانس نعنا روی رت های سپتیکی القا شده با مدل CLP :Cecal Ligation and) Puncture) میباشد. ازاینرو، رت ها به 7 گروه :کنترل منفی (Laparotomy)، CLP ، گروههای تیمار با DDW (15 و 30 ppm) و همراه با اسانس نعنا mg/kg b.w)100) و کنترل مثبت (ایندومتاسین) تقسیم شدند. 24 ساعت پس از جراحی پارامترهای دخیل در آسیب اکسیداتیو و بیان ژن COX-2 در بافت ریه اندازهگیری شد. نتایج این تحقیق نشان میدهد سپسیس موجب کاهش FRAP و GSH و افزایش میزان LP ، MPO، PGE2 و بیان ژن COX-2 میگردد، ولی بر روی آنزیم GST اثری ندارد. تیمار حیوانات با DDW به تنهایی و همزمان با اسانس نعنا به اندازه ایندومتاسین، در تعدیل سطح این پارامترها مؤثر بوده است، بطوریکه سبب افزایش میزان FRAP و GSH و کاهش میزانLP ، MPO، PGE2 و بیان ژن COX- 2شده است. همچنین مطالعات پاتولوژی نشان میدهد که سپسیس منجر به ایجاد آسیبهایی در بافت ریه شده که این آسیبها در اثر تیمار با DDW و اسانس نعنا کاهش یافتهاند.
بنابراین سپسیس موجب آسیب اکسیداتیو بافت ریه شده و استفاده از این ترکیبات با تأثیر بر روی پارامترهای استرس اکسیداتیو و آنتیاکسیدانی میتواند در جلوگیری و بهبود این آسیبها مؤثر باشد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Considering the anti-inflammatory and antioxidant activities of DDW and Mentha longifolia E.O on pulmonary damage induced by CLP
نویسندگان [English]
1 Department of Biochemistry, Faculty of Sciences, Payame-e-Noor University, Tehran, Iran
2 Materials and Nuclear Fuel Research School, Nuclear Science and Technology Research Institute, Tehran, I.R. of Iran
3 Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, Garmsar Branch, Islamic Azad University, Garmsar, Iran
4 Professor of Biochemistry Department, Faculty of Science, Payame Noor University, Tehran, Iran
5 Professor assistant, Faculty of Science, Department of Biochemistry, Faculty of Sciences, Payame Noor University, Tehran, Iran
6 Department of Physiology, Faculty of Science, Qom Branch, Islamic Azad University, Qom, I.R. Iran
7 M.Sc. Student, Department of Biochemistry, Faculty of Sciences, Payame Noor University, Tehran, Iran
چکیده [English]
Sepsis is a major cause of morbidity and mortality in patients in the intensive care unit. Despite new supportive treatments and administration of high potent antibiotics, sepsis is overwhelmingly one of the risky factors in patient’s life. So, the purpose of this study is to investigate the effects of Deuterium Depleted Water (DDW) and M. longifolia essential oils (E.Os) on septic rats induced by CLP (Cecal Ligation and Puncture). Therefore, rats were divided into 7 groups: negative control (Laparotomy), CLP, treatment groups with DDW (15and 30 ppm), adjuvant with M. longifolia E.O (100 mg/kg b.w) and positive control group (indomethacin). Then, 24h after CLP induction, oxidative injury parameters and the expression of COX-2 gene in lung tissue were measured. The data indicated that sepsis induction reduced GSH, FRAP and increased LP, MPO, PGE2 and COX-2 gene but didn`t affected GST. Treatments of rats with DDW and E.Os alone and together as well as indomethacin have been effective in increasing the GSH, FRAP and decreasing the LP, MPO, PGE2 and COX-2. Histopathological examinations indicated that sepsis caused lung tissue damage and this damage decreased by DDW and E.O treatment. So sepsis causes oxidative lung tissue damage and the using of deuterium depleted water and Mentha longifolia can prevent injuries through modulation the oxidative stress/antioxidant parameters.
کلیدواژهها [English]
بررسی فعالیت ضدالتهابی و آنتیاکسیدانی آب تهی شده از دوتریوم و اسانس نعنا بر روی آسیب ریوی ناشی از CLP
آزاده رسولی1، فائزه فاطمی2*، محمدرضا محمدی ملایری3،رضا حاجی حسینی1، آتوسا وزیری1، زهرا موسوی4، ماریا فروتن راد1 و سمانه اوتادی1
1 ایران، تهران، دانشگاه پیام نور، واحد تهران شرق، دانشکدهعلومپایه، گروه زیست شناسی
2 ایران، پژوهشگاه علوم و فنون هستهای، پژوهشکده مواد و سوخت هستهای
3ایران،گرمسار، دانشگاهآزاداسلامی،واحدگرمسار، دانشکدهدامپزشکی،گروهپاتوبیولوژی
4 ایران، قم، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد قم، دانشکده علوم پایه، گروه فیزیولوژی
تاریخ دریافت: 17/9/96 تاریخ پذیرش: 21/3/97
چکیده
سپسیس علت عمده مرگومیر بیماران در بخش مراقبتهای ویژه است. با وجود درمانهای حمایتی جدید و بکارگیری آنتیبیوتیکهای قوی، سپسیس همچنان ازجمله عوامل خطرزا در زندگی مبتلایان میباشد. لذا هدف از این مطالعه، بررسی تأثیر آب تهی شده از دوتریوم (DDW) و اسانس نعنا روی رتهای سپتیکی القا شده با مدلCLP :Cecal Ligation and) Puncture) میباشد. ازاینرو، رتها به 7 گروه :کنترل منفی (Laparotomy)، CLP ، گروههای تیمار با DDW (15 و 30 ppm) و همراه با اسانس نعنا mg/kg b.w)100) و کنترل مثبت (ایندومتاسین) تقسیم شدند. 24 ساعت پس از جراحی پارامترهای دخیل در آسیب اکسیداتیو و بیان ژن COX-2 در بافت ریه اندازهگیری شد. نتایج این تحقیق نشان میدهد سپسیس موجب کاهش FRAP و GSH و افزایش میزان LP ، MPO، PGE2 و بیان ژن COX-2 میگردد، ولی بر روی آنزیم GST اثری ندارد. تیمار حیوانات با DDW بهتنهایی و همزمان با اسانس نعنا بهاندازه ایندومتاسین، در تعدیل سطح این پارامترها مؤثر بوده است، بطوریکه سبب افزایش میزان FRAP و GSH و کاهش میزانLP ، MPO، PGE2 و بیان ژن COX- 2شده است. همچنین مطالعات پاتولوژی نشان میدهد که سپسیس منجر به ایجاد آسیبهایی در بافت ریه شده که این آسیبها در اثر تیمار با DDW و اسانس نعنا کاهشیافتهاند. بنابراین سپسیس موجب آسیب اکسیداتیو بافت ریه شده و استفاده از این ترکیبات با تأثیر بر روی پارامترهای استرس اکسیداتیو و آنتیاکسیدانی میتواند در جلوگیری و بهبود این آسیبها مؤثر باشد.
واژههای کلیدی: سپسیس، اسانس نعنا، آب تهی شده از دوتریوم، فعالیت ضدالتهابی، استرس اکسیداتیو
* نویسنده مسئول، تلفن: 09124186349 ، پست الکترونیکی: ffatemi@aeoi.org.ir
مقدمه
سپسیس واکنش سیستمیک بدن به میکروارگانیسمهای مهاجم ازجمله باکتریها و قارچها میباشد (39) و یکی از بیماریهایی است که بیماران بستری در بخش مراقبتهای ویژه ممکن است به آن مبتلا شوند (18). سپسیس بهعنوان یکی از علل ایجاد التهاب حاد، دومین علت شایع مرگومیر مبتلایان به بیماریهایی غیراز قلب و عروق بستری شده در بخش مراقبتهای ویژه و جزء ده دلیل اصلی مرگ در میان کل بیماران بستری در بیمارستان است (25). التهاب فرایندی است که توسط عوامل مختلف بیولوژیکی شروع گردیده و نهتنها مستقیماً با فعالسازی سیستم ایمنی بلکه باواسطه سیکلواکسیژناز ـ2(COX-2) نیز در ایجاد بیماری دخالت میکند (20و 37). یکی از روشهای تجربی ایجاد التهاب حاد، مدلCLP (cecal ligation and puncture) میباشد که از سال 1978 تاکنون، برای بررسی جنبههای مختلف سپسیس ازجمله وضعیت متابولیسم بدن، چگونگی درمان با آنتیبیوتیکها، عوامل میکروبی دخیل، پاسخهای قلبی-عروقی، عملکرد سیستم ایمنی، واسطههای ترشحشده در التهاب و الگوی بیان سایتوکینها مورد استفاده قرارگرفته است (16). COX-2 مسئول بیشتر آثار مضر و خطرناک سپسیس بوده (20) و مهار اختصاصی آن منجر به کاهش سایتوکینهای پیش التهابی و کاهش مرگومیر میشود (40). همچنین پارامترهای دخیل در تعادل سیستم استرس اکسیداتیو / آنتیاکسیدانی از جمله
(LP, GSH, MPO) نیز در سپسیس دستخوش تغییر شده و در عوارض آن نقش قابلتوجهی دارند (8).
امروزه داروهای ضدالتهابی غیراستروئیدی (NSAIDs) نقش بسیار مهمی را در درمان سپسیس ایفا میکنند. ولی باتوجه به عوارض جانبی ناشی از مصرف داروهای ضدالتهابی، امروزه استفاده از ترکیبات طبیعی در درمان سپسیس و التهاب اهمیت ویژهای پیداکردهاند (19).
جنس Mentha متعلق به تیره نعنا، دارای 29 تا 31 گونه گیاهی، اغلب در مناطق معتدل اروپا و آسیا، استرالیا و جنوب آفریقا یافت میشود (12). Mentha longifolia L گیاهی چندساله و معطر است (38) که در طب سنتی غالباً از دمکرده برگهای آن استفاده میشود (12). تسریعکننده عمل هضم، رفع آسم، اسپاسم، درد معده، سردرد، سرماخوردگی و سرفه و همچنین در استعمال خارجی برای درمان زخمها و غدد متورم (42) و نیز برای درمان برونشیت، نفخ شکم، بیاشتهایی، کولیت و اختلالات رودهایی مانند تهوع و سوءهاضمه و اسهال استفاده میشود (16و 47). این گیاه همچنین دارای اثراتی نظیر خواص آنتیاکسیدانی (1و26)، ضد قارچ (42)، ضد باکتری (33) و ضد انقباض و تشنج (12و 34) میباشد.
از سوی دیگر، DDW یا آب سبک دارای اثرات بیولوژیکی است (21) و یک مکمل درمانی سودمند محسوب میشود. DDW آبی است که محتوای دوتریوم در آن در مقایسه با استاندارد آب اقیانوسی پایینتر (ppm 120-30) بوده و ظاهر فیزیکی آن بیرنگ، طعمدار و با مقدار کمی یون است (6). DDW هم نقش درمانی و هم پیشگیریکننده از سرطان را دارد (24). سطوح پایین دوتریوم در سلول باعث عملکرد مناسب سلول میشود (29). آب فاقد دوتریوم رشد سلول سرطانی را مهار کرده و باعث بهبود کیفیت زندگی میشود و برخلاف داروهای ضد سرطان اثرات جانبی و تهاجمی ندارد (44و 45).
باتوجه به اثرات متعدد این گیاه و آب تهی شده از دوتریوم در درمان و کاهش آسیبها، بررسی عملکرد آنها حائز اهمیت خواهد بود. از این رو در این تحقیق، اثرات آنتیاکسیدانی و ضدالتهابی آب تهی شده از دوتریوم بهتنهایی و همزمان با اسانس نعنا بر روی آسیبهای اکسیداتیو بافت ریه ناشی از مدل التهابی CLP بررسی میگردد.
مواد و روشها
دراین مطالعه از آب تهی شده از دوتریوم (تهیهشده از مجتمع آبسنگین اراک، سازمان انرژی اتمی ایران) و اسانس نعنا (خریداری شده از شرکت باریج اسانس، (Batch No:3138-031-93/8 (707051); Sample Serial No:BE930347 استفاده گردید.
علاوه براین، از 70 سر رت نر بالغ با وزن متوسط 100 گرم خریداری شده از مرکز نگهداری حیوانات آزمایشگاهی انستیتوپاستور ایران استفاده گردید. خوراک حیوانات بهصورت Pellet با فرمول استاندارد از کارخانجات فرآوردههای غذایی تهران تهیه شد. حیوانات بالغ دسترسی آزاد به غذا و آب آشامیدنی از طریق بطری داشتند. حیوانات به 7 گروه تقسیم شدند:
1) گروه کنترل منفی: تیمار با حلال اسانس نعنا (DMSO) و آب معمولی به مدت 2 هفته بهصورت خوراکی و ایجاد laparotomy در روز پانزدهم. 2) گروه CLP: تیمار با حلال اسانس نعنا (DMSO) و آب معمولی به مدت 2 هفته بهصورت خوراکی و ایجاد مدل CLP در روز پانزدهم. گروههای تیمار: 3 و 4) گروههای تیمار حیوانات با غلظتهای ppm 15 و 30 ازDDW به مدت 2 هفته بهصورت خوراکی و ایجاد مدل CLP در روز پانزدهم. 5 و6) گروههای تیمار اسانس نعنا در دوز mg/kg bw 100 بهصورت خوراکی و همچنین تیمار همزمان حیوانات با غلظتهای ppm 15 و 30 از DDW روزانه به مدت دو هفته و ایجاد مدل CLP در روز پانزدهم. 7) گروه کنترل مثبت: تزریق داروی ضدالتهابی ایندومتاسین (mg/kg bw2)، به مدت دو هفته و ایجاد مدل CLP (روشCLP : در دیواره شکمی رتهای بیهوش شده برشی بهاندازه 2 سانتیمتر ایجاد شد، سکوم خارج و از بخش سکوم تا زیر دریچه ایلئوسکال بخیه و در سکوم آنها 2 سوراخ توسط نیدل G20 ایجاد گردید. سپس روده را به داخل محفظه شکمی برگردانده و پوست و صفاق بخیه زده شد). رتها 24 ساعت پس از جراحی CLP بیهوش شدند و از قلب آنها خونگیری و سرم بهوسیله سانتریفیوژ بهمنظور بررسی آنزیم FRAP و PGE2 جدا گردید. در مرحله بعدی، حیوانات کشتهشده و بافت ریه آنها بهمنظور بررسی پارامترهای مربوط به آسیب اکسیداتیو(LP, GSH, GST,MPO) و بیان ژن COX-2 جدا و هموژن گردید.
همچنین، بافت ریه برای بررسی هیستوپاتولوژیک برداشته شد و در بافر فرمالین10 درصد فیکس گردید. برشهای نازکی به ضخامت 6-5 میکرون از بافت بلوک شده در پارافین تهیه و به روش H&E رنگآمیزی شدند. سپس، بهمنظور مقایسه تغییرات بافتی، لامها توسط میکروسکوپ نوری بررسی و از آنها عکسبرداری به عمل آمد.
غلظت مالون دی آلدئید (MDA) با اندازهگیری میزان جذب توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در 535 نانومتر و از روی ضریب خاموشی آن (L/cm.mmol105×56/1) محاسبه گردید (46). سطح گلوتاتیون احیاء (GSH) به روشSeldak and Limdsay توسط اسپکتروفتومتر در طولموج nm412 (35) و فعالیت آنزیم گلوتاتیون S- ترانسفراز (GST) به روش Habig و با استفاده ازسوبسترای CDNB (1-Chloro-2,4-dinitrobenzene) توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طولموج nm 340 اندازهگیری شد (13). همچنین، فعالیت آنزیم میلوپراکسیداز (MPO) باکمی تغییر مطابق روش هایلگاس و همکاران (1990) انجام شد. در این روش تغییر جذب ناشی از مصرف H2O2 توسط آنزیم میلوپراکسیداز در طولموج 460 نانومتر اندازهگیری شد (15).
ظرفیت آنتیاکسیدانی توتال پلاسما توسط تست FRAP (Ferric reducing ability of plasma) و با استفاده از سوبسترای TPTZ در طولموج 593 نانومتر اندازهگیری شد (7). علاوه براین، غلظت پروستاگلاندین E2 ((PGE2 براساس روش ELISA و بااستفاده از کیت ELISA (Assay Desighs Co, U.S.A) اندازهگیری شد.
بهمنظور بررسی بیان ژن COX-2 در بافت ریه، استخراج RNA با استفاده از کیت استخراج RNA (BioBasic Inc, Canada) انجام شد. سپس، بهمنظور حذف DNA از RNA استخراج شده، از آنزیم DNase شرکتThermo Scientific استفاده شد. بهمنظور یکسان بودن غلظت RNA مصرفی در ساخت cDNA، غلظت RNA موجود در نمونههای تیمار شده با DNase، توسط دستگاه نانودراپ NanoDrop 2000)) خوانده شد. درنهایت، میزان معینی از RNA برای ساخت تمامی cDNAها استفاده گردید. برای ساخت cDNA از RNA استخراج شده، از کیت شرکت تاکارا (Takara bio Inc, Japan) استفاده گردید. در ادامه بهمنظور تأیید انجام مراحل قبل، واکنش PCR برای ژن موردنظر انجام شد و سپس محصول حاصل بر روی ژل آگارز 5/2 درصد بارگذاری گردید.
بهمنظور انجام واکنش PCR و Real time PCR، از پرایمرهای اختصاصی ژنCox-2 (F: 5'ACCTCTGCGATGCTCTTC3', R: 5'AGGAATCTCGGCGTAGTAC3') و(F: 5'TGCCAGCCTCGTCTCATAG3', R: 5'ACTGTGCCGTTGAACTTGC3') GAPDH استفاده شد. درنهایت، واکنش Real time PCR با استفاده از پرایمر اختصاصی و کیت مخصوص QuantiNova SYBR Green PCR Kit انجام پذیرفت. این کیت حاوی تمام مواد لازم برای انجام واکنش PCR (آنزیم Taq، بافر همراه باMgCl2 و dNTPs) و رنگ سایبرگرین میباشد که بهعنوان مسترمیکس مورد استفاده قرار میگیرد. هر واکنش Real time PCR (حجم نهایی10 میکرولیتر) حاوی μl 5 مسترمیکس، μl 4/0 پرایمرهای Forward و Reverse، μl5/0 cDNA و μl 9/3 آب عاری از Nuclease میباشد. بهمنظور اطمینان از صحت انجام واکنش، نمونههای حاوی ژن مورد آزمایش (COX-2) و نمونه حاوی ژن کنترل داخلی ) (GAPDH در بلیتها بهصورت سهتایی ریخته شد. درنهایت، از چرخه حرارتی شامل 3 مرحله، دناتوراسیون اولیه با دمای Co 95 به مدت 2 دقیقه- 40 سیکل دمایی شامل Co 95 به مدت 15 ثانیه، Co 60 و Co 72 هرکدام به مدت 20 ثانیه- طویل سازی نهایی با دمای Co 95-57 به مدت 15 ثانیه، جهت انجام واکنش Real-Time PCR استفاده شد. بهمنظور محاسبه میزان تغییرات بیان ژن COX-2 از روشCT DD استفاده گردید.
تفاوتهای بین دادهها با استفاده از نرمافزار SPSS و تست ANOVA تعیین گردید. بااستفاده از این نرمافزار P- value دادهها، محاسبه گردید و 05/0P< بهعنوان تفاوت معنیدار در نظر گرفته شد.
نتایج
براساس جدول 1، سطح MDA بهعنوان محصول لیپید پراکسیداسیون و آنزیم میلوپراکسیداز در بافت ریه رتهای مبتلابه سپسیس (گروه CLP) افزایش مییابد (05/0P<). تیمار رتهای سپتیکی با آب تهی شده از دوتریوم در دوزهای ppm 15 و 30 به تنهایی وهمزمان با اسانس باعث کاهش معنیدار سطح پراکسیداسیون لیپیدها میگردد که این کاهش در گروه تیمار شده با داروی ضدالتهابی ایندومتاسین نیز دیده میشود (05/0P<). همچنین، سطح گلوتاتیون در گروه CLP نسبت به گروه کنترل کاهش مییابد ( 05/0P<). تیمار رتهای سپتیکی با DDW و اسانس نعنا بهصورت مجزا و باهم در هر دو دوز باعث افزایش معنیدار میزان گلوتاتیون میگردد که این افزایش در گروه تیمار شده با ایندومتاسین نیز دیده میشود (05/0P<).
نتایج نشان میدهد که نه تنها بیماری سپسیس بلکه تیمار رتها با اسانس نعنا و DDW در تمام دوزها تأثیری بر روی آنزیم GST ندارد (05/0P>). بهعلاوه، میزان FRAP در نمونهی پلاسمای موشهای سپتیکی، 24 ساعت پس از ایجاد CLP کاهش و در گروههای تیمار همزمان با اسانس نعنا و DDW افزایش مییابد (05/0P<) درحالیکه آب فاقد دوتریوم به تنهایی در دوزهای ppm 30 و 15 تأثیری بر میزان FRAP ندارد (05/0P>). همچنین ایندومتاسین نتایج مشابه با گروههای تیمار با DDW را در خصوص میزان FRAP نشان میدهد (05/0P>).
از سوی دیگر، ایجاد سپسیس منجر به افزایش قابلملاحظه سطح PGE2 در پلاسما نسبت به گروه لاپاراتومی میشود (05/0P<) و سطح این فاکتور در گروههای تیمار با آب تهی شده از دوتریوم در دوزهای ppm 15 و 30، اسانس نعنا همراه با آب در هر دو دوز بهصورت معنیداری کمتر از گروه CLP میباشد (05/0P<). همچنین در گروه کنترل مثبت (ایندومتاسین) نیز مقدار PGE2 کاهش مییابد (05/0P<) (جدول 2). علاوه براین، نتایج نشاندهنده افزایش میزان بیان ژن COX-2 در بافت ریه پس از القا سپسیس میباشد. گروههای مختلف تیمار نتایج مشابهی را در تعدیل بیان ژن COX-2 نشان میدهند و میزان بیان این ژن را بهصورت معنیداری کاهش و به سطح بیان آن در گروه کنترل منفی میرسانند (05/0P<).
جدول 1- سطح فاکتورهای دخیل در سیستم استرس اکسیداتیو/آنتیاکسیدان در بافت ریه
گروهها |
MDA (n mol/ mg protein) |
GSH (n mol/ |
FRAP (µmol/L) |
GST (n mol/min/ mg protein) |
MPO (U/mg protein) |
لاپاراتومی |
52/8 ± 65/0 |
63/3 ± 36/0 |
407 ± 76/21 |
92 ± 65/4 |
66/24 ± 41/0 |
CLP |
41/14 ± 93/0a |
2 ± 18/0a |
257 ± 98/10a |
33/95 ± 41/4 |
33/51 ± 4/0a |
DDW15 |
21/9 ± 78/0b |
06/3 ± 13/0b |
265 ± 54/15 |
115 ± 22/7 |
6/24 ± 67/0b |
DDW30 |
58/9 ± 83/0b |
88/3 ± 2/0b |
246 ± 7/9 |
33/97 ± 43/2 |
25/25 ± 69/0b |
+اسانس DDW15 |
91/8 ± 61/0b |
88/3 ± 29/0b |
420 ± 56/16b |
151 ± 33/3 |
16/23 ± 19/1b |
+اسانس DDW30 |
9 ± 6/0b |
47/3 ± 33/0b |
374 ± 7/6b |
132 ± 8/3 |
8/22 ± 59/1b |
ایندومتاسین |
68/9 ± 35/0b |
5/3 ± 24/0b |
280 ± 2/18 |
92 ± 04/5 |
83/19 ± 53/1b |
علامت a نشاندهنده نتیجه حاصل از آنالیز آماری گروه CLP بوده که با گروه لاپاراتومی معنیدار است (05/0P<)
علامت bنشاندهنده نتیجه حاصل از آنالیز آماری گروههای مختلف تیمار بوده که با گروه CLP معنیدار هستند (05/0P<). نتایج بهصورت میانگین ± انحراف معیار (mean ± SEM) بیانشده است
جدول 2- نتایج حاصل از بیان ژن COX-2 و محصول آن (PGE2)
گروهها |
PGE2 (ng/ml) |
COX-2 expression |
لاپاراتومی |
508 ± 7/26 |
0 ± 04/0 |
CLP |
796 ± 7/20a |
19/0 ± 04/0a |
DDW15 |
584 ± 4/18b |
09/0 ± 02/0b |
DDW30 |
709 ± 18b |
10/0 ± 02/0b |
+اسانس DDW15 |
510 ± 8/25b |
06/0 ± 02/0b |
+اسانس DDW30 |
543 ± 3/40b |
04/0 ± 01/0b |
ایندومتاسین |
536 ± 8/32b |
05/0 ± 02/0b |
علامت a نشاندهنده نتیجه حاصل از آنالیز آماری گروه CLP بوده که با گروه لاپاراتومی معنیدار است (05/0P<)
علامت bنشاندهنده نتیجه حاصل از آنالیز آماری گروههای مختلف تیمار بوده که با گروه CLP معنیدار هستند (05/0P<). نتایج بهصورت میانگین ± انحراف معیار (mean ± SEM) بیانشده است
مطالعات هیستوپاتولوژیک بافت ریه نشان میدهد که در گروه کنترل (لاپاراتومی) خفیفترین ضایعات بصورت پرخونی، ارتشاح نوتروفیلها در بافت بینابینی و ادم التهابی بافت بینابینی رخ میدهد (شکل1- A). بیشترین آسیب بافت ریه در گروه رتهای مبتلا به سپسیس (گروه (CLP مشاهده میگردد. در این گروه، بافت ریه در بازرسی ظاهری (ماکروسکوپیک) دچار پرخونی است. در بررسی هیستوپاتولوژیک نیز پرخونی شدید دیده میشود. ادم شدید بافت بینابینی باعث گسترش دیواره همبند بین لوبولی میگردد. همچنین ادم بینابینی و پیرامون عروقی و خونریزیهای کانونی در این گروه دیده میشود. دیواره آلوئولهای ریوی ضخیم شده و به دلیل هایپرتروفی ماکروفاژهای درون عروقی و بینابینی ریوی و نیز بدلیل نفوذ و حاشیهنشینی نوتروفیلها در دیواره سیاهرگها (margination)، بافت ریه هیپرسلولار به نظر میرسد. تمام این تغییرات نشاندهنده وقوع ذات الریه بینابینی حاد در بافت های ریه میباشد (شکل1- B). همانطور که در جدول 3 مشاهده میشود، در گروه CLP، ادم التهابی، ارتشاح نوتروفیل، پرخونی و ذات الریه در بافتهای بینابینی بطور معنادار نسبت به گروه کنترل ایجاد میشود.
|
|
|
|
|
|
نمودار 1- نتایج حاصل از بیان ژن COX-2 در بافت ریه
علامت a نشاندهنده نتیجه حاصل از آنالیز آماری گروه CLP بوده که با گروه لاپاراتومی معنیدار است (05/0P<)
علامت bنشاندهنده نتیجه حاصل از آنالیز آماری گروههای مختلف تیمار بوده که با گروه CLP معنیدار هستند (05/0P<)
|
|
|
|
|
|
نمودار 2- غلظت پروستاگلاندین E2 در پلاسما
علامت a نشاندهنده نتیجه حاصل از آنالیز آماری گروه CLP بوده که با گروه لاپاراتومی معنیدار است (05/0P<)
علامت bنشاندهنده نتیجه حاصل از آنالیز آماری گروههای مختلف تیمار بوده که با گروه CLP معنیدار هستند (05/0P<)
گروههای تیمار با اسانس نعنا همراه با آب تهی شده از دوتریوم در هر دو دوز (شکل 1- E, F) میتوانند بطور معنادار باعث کاهش ادم، شدت ذات الریه بینابینی، ارتشاح نوتروفیلها و پرخونی گردند (شکل 1 E, C) (جدول 3). در گروه تیمار شده با ایندومتاسین، هیچ گونه پرخونی و ادم با بزرگنمایی 100 مشاهده نشد (شکل 1G).
جدول3- میانگین و خطای استاندارد مقادیر عددی شاخصهای آسیبشناسی در گروههای مختلف مطالعه
شدت ذات الریه بینابینی |
پرخونی |
ارتشاح نوتروفیل |
ادم التهابی |
گروهها |
2/0 ± 1/1 |
0 ± 1 |
3/0 ± 8/0 |
4/0± 6/1 |
لاپاراتومی |
a1/0± 2/3 |
a2/0± 5/3 |
a2/0±5/3 |
a1/0± 1/3 |
CLP |
2/2 ± 3/0 |
4/1 ± 2/0b |
1 ±0b |
5/1 ±1/0b |
DDW15 |
4/3 ± 2/0 |
3 ± 0 |
3 ±0 |
1/3 ±0 |
DDW30 |
6/1 ±2/0b |
2 ± 0b |
8/1 ± 3/0b |
7/1 ±1/0b |
+اسانس DDW15 |
6/1 ± 2/0b |
8/2 ± 2/0 |
4/2 ± 2/0b |
2/2 ±1/0 |
+اسانس DDW30 |
4/0 ± 6/2 |
4/0± 8/2 |
3/0± 5/2 |
4/0 ± 3/2 |
ایندومتاسین |
a: دارای اختلاف معنادار با گروه لاپاراتومی، b: دارای اختلاف معنادار با گروه CLP
نتایج بهصورت میانگین ± انحراف معیار (mean ± SEM) بیانشده است.
|
|
|
|
|
|
|
شکل 1-(A گروه لاپاراتومی LAP: پرخونی و ادم ملایم بافت بینابینی و عدم مشاهده نوتروفیل در بافت ریه با بزرگنمایی 400* (B گروه CLP : پرخونی شدید، ادم و التهاب وسیع بافت بینابینی ریه (تجمع آستیندار نوتروفیل ها در اطراف سیاهرگ (سر پیکان)، مرزنشینی نوتروفیلها در مجاور آندوتلیوم سیاهرگ (پیکانها)) با بزرگنمایی 400*، (C, D گروه DDW در دوزهای ppm 15 و 30: عدم مشاهده پرخونی و ادم در دوز 15 و تجمع آستین وار نوتروفیل ها در اطراف رگ خونی (پیکانها) با بزرگنمایی 400* (E, F گروه اسانس نعنا در دوز mg/kg b.w 100 همزمان با آب تهی شده از دوتریوم در دوز ppm 30و 15: عدم مشاهده پرخونی، ادم و ارتشاح نوتروفیل در بافت بینابینی و اطراف عروق خونی با بزرگنماییE 100*, F 400* (Gگروه ایندومتاسین: عدم مشاهده پرخونی و ادم با بزرگنمایی 100*
بحث و نتیجهگیری
التهاب حاد ریوی یکی از عوارض مزمن سپسیس است که درنهایت منجر به مرگ بیماران مبتلا به سپسیس میشود (11). به همین دلیل جلوگیری از سپسیس و عوارض ناشی از آن بهخصوص آسیب ریوی حاصل از سپسیس از اهمیت زیادی برخوردار است.
دراین مطالعه بهمنظور بررسی اثرات حفاظتی، آنتیاکسیدانی و ضدالتهابی آب تهی شده از دوتریوم و اسانس نعنا بهصورت تنها و ترکیبی بر روی بیماری سپسیس در سیستم in vitro، از یک مدل تجربی التهابی در رت (CLP) که نسبت به سایر مدلهای التهابی برتری دارد، استفاده گردید. این مدل در حیوانات مختلف قابل انجام است، اما در جوندگان ازجمله رت و موش بسیار ساده بوده و به فراوانی نیز مورد استفاده قرار میگیرد. ایجاد مدل سپسیس توسط جراحی CLP بسیار کمهزینه و سریع میباشد و استاندارد کردن آن نیز آسان است (16). از طرف دیگر در مدل CLP، سپسیس از طریق شیفت میکروارگانیسمها و باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی از لومن رودهای به جریان خون ایجاد میشود. افزایش بار میکروبی از طریق فعالسازی مسیرهای دخیل در استرس اکسیداتیو در سپسیس منجر به القاء استرس اکسیداتیو گردیده که درنهایت منجر به آسیب ارگانهای بدن میگردد (16).
بنابراین، باتوجه به عوامل تأثیرگذار در ایجاد سپسیس میتوان راهکارهای درمانی را تعیین کرد که یکی از بهترین آنها کاهش سطح بار میکروبی و کاهش عوامل استرس اکسیداتیو و التهابی است. درمانهای رایج سپسیس شامل استفاده از آنتیبیوتیکها برای کاهش بار میکروبی، همچنین تقویت سیستم آنتیاکسیدانی توسط داروهای مختلف میباشد. بهعلاوه داروهای ضدالتهابی با کاهش واکنشهای التهابی ناشی از سپسیس میتواند باعث تعویق یا درمان بیماری گردد. گیاهان دارویی و محصولات طبیعی منبع ارزشمندی از عوامل درمانی بوده و امروزه هنوز هم یک موضوع مهم برای شناسایی داروهای جدید هستند (22و 27).
نتایج حاصل از بررسی پارامترهای دخیل در آسیب اکسیداتیو در بافت ریه رتهای مبتلا به سپسیس نشان داد که در گروه CLP، سطح پارامترهای مربوط به استرس اکسیداتیو 24 ساعت بعد از القاء سپسیس دچار اختلال میشوند. این پارامترها (آنزیم میلوپراکسیداز، مالون دی آلدئید و گلوتاتیون) از شاخصهای وضعیت سیستم استرس اکسیداتیو میباشند که در سپسیس به دلیل نقص در سیستم دفاع آنتیاکسیدانی دچار اختلال میشوند (8). اولین مشاهدات در آسیب اکسیداتیو بافتی حاصل از سپسیس افزایش سطح LP در بافت ریه همراه با افزایش فعالیت آنزیم MPO و کاهش سطح GSH در گروه CLP نسبت به گروه کنترل میباشد (05/0P<) (جدول 1). در سپسیس، آنزیم میلوپراکسیداز با استفاده از H2O2 باعث تولید واسطههای فعالی میگردد که این واسطهها پراکسیداسیون لیپیدها را افزایش میدهند (31). آنزیم MPO نقش بسیار مهمی را در شروع پراکسیداسیون لیپیدها در سیستم in vivo ایفاء میکند. علاوه بر آن، شروع پراکسیداسیون لیپیدها و تشکیل ایکوزانوئیدهای فعال فرایندهای مهمی در التهاب هستند (48). در مطالعهای، اندازهگیری فعالیت آنزیمی MPO بهعنوان بیومارکر در پاسخ التهابی در بیماران با SIRS و سپسیس گزارش شده است (23). همچنین، MDA بهعنوان مارکر استرس اکسیداتیو، آخرین محصول تجزیه لیپیدها است. حضور بالای رادیکالهای آزاد مخصوصاً پراکسیدها نقش کلیدی در بیماریزایی تعدادی از بیماریها مانند دیابت، بیماریهای قلبی عروقی، سرطان، پیری و انواع بیماریهای دیگر دارد (3). مطالعات متعددی ثابت کردهاند که میزان محصولات پراکسیداسیون لیپیدها در بیماران مبتلا به سپسیس افزایش مییابد (30). این گزارشات تأییدی بر نتایج بهدستآمده در تحقیق حاضر میباشند و همچنین نشاندهندهی نزدیک بودن شرایط بالینی بیماران به مدل بهکاررفته دراین تحقیق است. از طرفی، گلوتاتیون، یک آنتیاکسیدان آمینواسیدی است که عامل فعال آن گروه HS (تیول) میباشد. این ترکیب هم در خون و هم در بافت ها یافت میشود و یکی از نقشهای آن، جلوگیری از پراکسیداسیون لیپیدها در غشاءهای بیولوژیکی میباشد. گلوتاتیون میتواند به طور مستقیم یا بهعنوان سوبسترای آنزیمهای گلوتاتیون پراکسیداز و گلوتاتیون S – ترانسفراز در سمزدایی پراکسید هیدروژن، لیپید هیدروپر اکسیدها و ترکیبات الکتروفیلیک شرکت نماید (28).
این دادهها (MPO, GSH, LP) همراه با نتایج هیستوپاتولوژیکی (شکل 1) نشان میدهند که آسیب اکسیداتیو بافت ریه حاصل از سپسیس، تخریب بافتی شدیدی را در 24 ساعت پس از CLP موجب شده است. مطالعات دیگر نیز نشان دادند که در مدل التهابی CLP، تغییر پارامترهای دخیل در استرس اکسیداتیو منجر به آسیب بافتی میشود که با نتایج تحقیق حاضر مطابقت دارد (4، 1، 36).
علاوهبراین، نتایج حاصل از تیمار رتها در بررسی مارکرهای آسیب اکسیداتیو در بافت ریه نشان میدهد که آب تهی شده از دوتریوم در دو دوزppm 15 و 30 و ترکیب آن با اسانس نعنا در دوز mg/kg bw 100 باعث مهار تغییر پارامترهای فوق در رتهای مبتلا به سپسیس در 24 ساعت پس از CLP میگردد (جدول 1). بهعلاوه، نتایج حاصل از داروی شناخته شده ضدالتهابی ایندومتاسین -که در این تحقیق بهعنوان گروه کنترل مثبت استفادهشده است- همانند گروههای تیمار میباشد. نتایج بررسیهای هیستوپاتولوژیک نیز تأثیر تیمارهای مختلف در تعدیل آسیبهای بافتی را تائید میکنند (شکل 1). جبران کاهش گلوتاتیون که یک جزء مهم از سیستم حفاظتی داخل سلولی برعلیه استرس اکسیداتیو میباشد، منجر به بازیافت مکانیسم دفاع سلولی و توقف پر اکسیداسیون لیپیدها گردیده که درنتیجه سلول را در مقابل آسیب اکسیداتیو بافتی محافظت میکند. بنابراین کاهش معنیدار در میزان مالون دی آلدهید بافت ریه (05/0P<) در رتهای تیمار شده همزمان با کاهش قابلملاحظه در میزان فعالیت آنزیم میلوپراکسیداز نشاندهنده نقش محافظتی این ترکیبات در جلوگیری از پراکسیداسیون لیپیدها است. بهعبارتدیگر، جلوگیری از پراکسیداسیون لیپیدها در بافت ریه بهواسطه مهار فعالیت آنزیم MPO توسط اسانس نعنا و DDW میتواند یکی از مکانیسمهای دخیل در اثر محافظتی این ترکیبات در جلوگیری از آسیب بافتی باشد. این نتیجه با گزارش ارائهشده توسط ویلا مبنی بر نقش محافظتی گلوتاتیون در سپسیس مطابقت دارد (43). همچنین، فاطمی و همکاران (2010) نشان دادند که اسانس زیره دارای اثر محافظتی در مدل تجربی سپسیس بر روی MPO، GSH و LP میباشد (11). مطالعهی دیگری نشان داد اسانس گلپر میتواند کبد را در برابر استرس اکسیداتیو ناشی از سمیت داروها محافظت نماید (2). در مطالعات قبلی نیز رسولی و همکاران اثر آنتیاکسیدانی DDW را در محافظت از کبد در برابر سمیت مواد نشان دادند (32). همچنین بررسی دیگری حاکی از آن است که در رتهای مبتلا به سپسیس، 16 ساعت پس از CLP در دو بافت کبد و ریه محصول پر اکسیداسیون لیپیدها افزایش مییابد (36).
از سوی دیگر، نتایج بهدستآمده در این مطالعه نشان داد که میزان FRAP در نمونهی پلاسمای موشهای سپتیکی، 24 ساعت پس از ایجاد CLP کاهش مییابد و تیمار رتها با اسانس همزمان با DDW در هر دو دوز باعث افزایش و بازگشت سطح ظرفیت آنتیاکسیدانی کل پلاسما (FRAP) به حالت نرمال میشود (جدول 1) ولی تیمار با آب تهی شده از دوتریوم به تنهایی در هر دو دوز تغییری بر میزان این فاکتور ایجاد نکرد (جدول 1). همانطور که اشاره شد یکی از روشهای رایج اندازهگیری ظرفیت آنتیاکسیدانی نمونههای بیولوژیک، استفاده از روش FRAP است که در سال 1996 توسط بنزی و همکارانش معرفی شد (7). مطالعهای نشان داده است که در بیماران مبتلا به شوک سپتیک، میزان FRAP و فاکتورهای دخیل در آن مثل اسید اوریک و بیلیروبین متناسب با شدت سپسیس افزایش مییابد (5).
همچنین، نتایج حاصل از تحقیق نشان میدهد که ایجاد سپسیس تأثیری بر آنزیم GST ندارد (جدول 1). GST مسئول سمزدایی ترکیبات کارسینوژنیک و سایتوتوکسیک از طریق کونژوگه کردن آنها با گلوتاتیون میباشد. به دلیل آنکه بسیاری از مواد سمی و مضر از طریق کونژوگه شدن با گلوتاتیون غیرفعال میشوند، گاهی نقص در عملکرد GST میتواند باعث حساس شدن بافت های بدن به مواد سمی و کارسینوژنهای شیمیایی شود. در واقع نقش ایزوآنزیمهای مختلف GST، محافظت از سلول در مقابل صدمات اکسیداتیو از طریق ترکیب متابولیتهای فعال سموم و داروها با گلوتاتیون میباشد (17).
از طرفی مهار ژن COX-2 بهعنوان یک راهکار درمانی مؤثر برای پیشگیری از التهاب و آسیبهای بافتی حاصل از آن معرفیشده است (41). COX-2 نقش مهمی در پاتوژنز التهاب بازی میکند و بهطور قابلتوجهی توسط محرکهای التهابی که منجر به افزایش سنتز پروستانوئیدها (واسطههای التهابی قوی) در بافتهای التهابی میشود، تشدید میگردد. PGE2 فراوانترین پروستانوئید در بافتهای التهابی است که از آراشیدونیک اسید طی فعالیت COX-2 ایجاد میشود (14). بررسی این پارامتر دخیل در فرایند التهاب در گروه CLP نشان داد که افزایش بیان ژن COX-2 در رتهای سپتیکی، منجر به افزایش تولید PGE2 و درنتیجه افزایش سطح آن در پلاسما میشود که درنهایت منجر به آسیب بافتی در ریه میگردد (جدول 2، نمودار 1 و 2). در سپسیس و التهاب حاد، افزایش تولید رادیکالهای آزاد و واکنش بین انواع سایتوکینهای پیش التهابی و ضدالتهابی باعث ازکارافتادن بسیاری از ارگانها و درنهایت مرگ میگردد (10).دراین بیماری، اجزاء مهمی از فرایندهای پاتولوژیکی دستبهدست هم میدهند تا نوتروفیلها را برای آزادسازی یک سری از واسطههایی که در تخریب سلولهای نرمال نقش دارند، تحریک کنند. مطالعات نشان میدهند که القاء ژن COX-2 با تشدید استرس اکسیداتیو در گسترش آسیبهای بافتی ناشی از التهاب نقش مهمی دارند (10). همچنین نتایج حاصل از بررسی بیان ژن COX-2 و PGE2 در بافت ریه نشان میدهد که تیمار آب فاقد دوتریوم در دوز ppm 15 و 30 و ترکیب اسانس و DDW باعث تعدیل بیان این ژن و محصول آن (PGE2) در رتهای مبتلا به سپسیس در 24 ساعت پس از CLP میگردد. شایان ذکر است که بیان ژن COX-2 در سلولهای نرمال در سطح بسیار پایینی قرار دارد. این آنزیم در ماکروفاژها و سلولهای آندوتلیال در طول شرایط التهابی ازجمله سپسیس القاء گردیده و افزایش شدیدی مییابد (9).