نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشکده پزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد قم، قم، ایران.

2 پژوهشکده مواد و سوخت هسته ای، پژوهشگاه علوم و فنون هسته ای، تهران ،ایران.

3 گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد گرمسار، گرمسار، ایران

4 گروه فیزیولوژی، دانشکده پزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد قم، قم، ایران

5 باشگاه پژوهشگران و نخبه جوان، دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرج، کرج، ایران

چکیده

بررسی توان محافظت کبدی اسانس زیره سیاه در برابر آسیب کبدی القا شده توسط نانوذرات اکسید آهن در رت های نژاد ویستار طراحی شده است. در این مطالعه تجربی از 20 سر رت نژاد ویستار استفاده شد که به طور تصادفی به چهار گروه تقسیم شدند. گروه شاهد؛ محلول DMSO، گروه تیمار نشده؛ نانو ذرات اکسید آهن (Fe2O3)، گروه پیش درمانی؛ نانوذرات اکسید آهن به همراه اسانس زیره سیاه در دو دز متفاوت 100 و 200 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن (E.O100 و E.O200) دریافت کردند. 72 ساعت پس از تزریق، بافت کبد و خون رت ها جدا گردید. آسیب های کبدی توسط شاخص های بیوشیمیایی همچون گلوتاتیون (GSH)، پراکسیداسیون لیپیدها (LP) و میزان آنتی اکسیدان کل پلاسما توسط تست FRAP و همچنین فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدان سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز (SOD و CAT اندازه گیری شدند. بررسی های آسیب شناسی نیز جهت ارزیابی درجات مختلف آسیب کبد انجام شد. تزریق نانوذرات اکسید آهن، سطوح FRAP و GSH را به صورت معنی داری کاهش داده ولی میزان LP را به طور قابل توجهی افزایش داده است. در مقابل، پیش درمانی رت ها با اسانس زیره سیاه، سطوح تغییر یافته GSH و LP را به صورت معنی داری تا حد طبیعی بهبود داده است. همچنین نتایج پاتولوژی، کاهش میزان نکروز سلول های کبدی را نشان داده است. اسانس زیره سیاه، کبد را در برابر آسیب اکسیداتیو القاء شده توسط نانوذرات اکسید آهن محافظت می نماید و این تاثیر محافظتی با خواص آنتی اکسیدانی اسانس ارتباط دارد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

The hepatoprotective activity of caraway essential oil (Carum carvi L.) against iron oxide nanoparticles induced toxicity in Wistar rats

نویسندگان [English]

  • Abolfazl Dadkhah 1
  • Faezeh Fatemi 2
  • Mohammad Reza Mohammadi Malayeri 3
  • Fatemeh Torabi 4
  • Mostafa Sarbazi 3
  • Salome Dini 5

1 Department of Medicine, Faculty of Medicine, Qom Branch, Islamic Azad University, Qom, Iran

2 Material and Nuclear Fuel Research School, Nuclear Science and Technology Research Institute, Tehran, Iran

3 Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, Garmsar Branch, Islamic Azad University, Garmsar-Iran

4 Department of Physiology, Faculty of Science, Qom Branch, Islamic Azad University, Qom, I.R. Iran

5 Young Researchers and Elite Club, Karaj Branch, Islamic Azad University, Karaj, Iran

چکیده [English]

The current study was designed to evaluate the potential of chemopreventive activity of Carum carvi L. essential oil against the liver injuries induced by iron oxide nanoparticles in Wistar rats. In this study, twenty Wistar rats were randomly divided into four groups. Control group was received only DMSO soluble; non-treated group was received iron nanoparticles (Fe2O3), pretreatment group was received iron nanoparticles (Fe2O3) plus caraway essential oil in two different doses 100 and 200 mg/kg b.w (E.O100 and E.O200). 72 hours after injection, the liver and blood tissues of rats were separated. Liver injuries were determined by biochemical parameters such as glutation (GSH), lipid peroxidation (LP), total antioxidant capacity (FRAP) and also antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT). Histopathology analysis also assessed the different degrees of liver damage. The injection of iron oxide nanoparticles significantly reduced FRAP and GSH levels, but considerably increased LP level. In contrast, pretreatment rats with caraway essential oil improved the levels of GSH and LP significantly to normal levels. Pathological consequences also represented a decrease in the liver necrosis. The caraway essential oil protected the liver against oxidative damages induced by iron nanoparticles, and the liverprotection effect associated with the antioxidant activities of the essential oil.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Carum carvi
  • Iron oxide nanoparticles
  • Hepatotoxicity
  • Hepatoprotective activity

فعالیتحفاظت کبدی اسانس زیره سیاه (L.Carum carvi) بر مسمومیت القایی نانو ذرات اکسید آهن در رت­های نژاد ویستار

ابوالفضل دادخواه1*، فائزه فاطمی2، محمدرضا محمدی ملایری3، فاطمه ترابی4، مصطفی سربازی3 وسالومه دینی5،6

1 ایران،قم، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد قم،دانشکده پزشکی، گروه پزشکی

2 ایران، تهران، پژوهشگاه علوم و فنون هسته‌ای، پژوهشکده مواد و سوخت هسته‌ای

3ایران، گرمسار، دانشگاه آزاد اسلامی واحد گرمسار، دانشکده دامپزشکی، گروه پاتوبیولوژی

4 ایران، قم، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد قم، دانشکده پزشکی، گروه فیزیولوژی

5ایران، کرج، دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرج، باشگاه پژوهشگران و نخبگان جوان

6 چین، هوانگجو، دانشگاه ژجیانگ، مرکز تحقیق و طراحی تکنولوژی غذایی ژجیانگ

تاریخ دریافت: 25/4/97                تاریخ پذیرش: 20/9/97

چکیده

بررسی توان محافظت کبدی اسانس زیره سیاه در برابر آسیب کبدی القاشده توسط نانو ذرات اکسید آهن در رت­های نژاد ویستار طراحی‌شده است. دراین مطالعه تجربی از 20 سر رت نژاد ویستار استفاده شد که به‌طور تصادفی به چهار گروه تقسیم شدند. گروه شاهد، محلول DMSO، گروه تیمار نشده، نانو ذرات اکسید آهن (Fe2O3)، گروه پیش درمانی، نانو ذرات اکسید آهن به همراه اسانس زیره سیاه در دو دُز متفاوت 100 و 200 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن (E.O100 و E.O200) دریافت کردند. 72 ساعت پس از تزریق، بافت کبد و خون رت­ها جدا گردید. آسیب‌های کبدی توسط شاخص‌های بیوشیمیایی همچون گلوتاتیون (GSH)، پراکسیداسیون لیپیدها (LP) و میزان آنتی‌اکسیدان کل پلاسما توسط تست FRAP و همچنین فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز (SOD و CAT اندازه‌گیری شدند. بررسی‌های آسیب‌شناسی نیز جهت ارزیابی درجات مختلف آسیب کبد انجام شد. تزریق نانو ذرات اکسید آهن، سطوح FRAP و GSH را به‌صورت معنی‌داری کاهش داده ولی میزان LP را به‌طور قابل‌توجهی افزایش داده است. در مقابل، پیش درمانی رت­ها با اسانس زیره سیاه، سطوح تغییریافته GSH و LP را به‌صورت معنی‌داری تا حد طبیعی بهبود داده است. همچنین نتایج پاتولوژی، کاهش میزان نکروز سلول‌های کبدی را نشان داده است. اسانس زیره سیاه، کبد را در برابر آسیب اکسیداتیو القاء شده توسط نانو ذرات اکسید آهن محافظت می‌نماید و این تأثیر محافظتی با خواص آنتی‌اکسیدانی اسانس ارتباط دارد.

واژه­های کلیدی: زیره سیاه، نانو ذرات اکسید آهن، مسمومیت کبدی محافظت کبدی، رت

* نویسنده مسئول، تلفن: 09122490620، پست الکترونیکی: Dadkhah_bio@yahoo.com

مقدمه

 

کبد بزرگترین اندام در بدن، وظیفه بسیاری از عملکردهای متابولیکی بدن که شامل تجزیه مواد سمی و زائد و دفع مواد مضر از بدن می‌باشد، را بر عهده دارد (3 و 28). این عضو، در ایجاد تعادل در بدن نقش حیاتی ایفا می‌کند، به‌طوری که تنظیم مواد لازم در تأمین انرژی و تغذیه بافت­ها همچون لیپیدها، پروتئین‌ها و کربوهیدرات‌ها را بر عهده دارد و هنگام ایجاد اختلال در بدن، آنزیم‌های بیوشیمیایی موجود در سلول‌های کبدی تغییر می‌کنند (12).

آهن یکی از فراوان‌ترین فلزات موجود در بدن است. این عنصر به‌عنوان جزئی از میوگلوبین، هموگلوبین، کاتالاز، سیتوکروم، پراکسیداز، گزانتین اکسیداز و آلفا گلیسرو فسفو هیدروژناز شناخته شده است. فعال شدن آهن فرو با پراکسید هیدروژن یا پراکسیدهای لیپیدی منجر به تولید آهن فریک،OH  و رادیکال بسیار فعال هیدروکسیل یا رادیکال‌های لیپیدی می‌گردد. این رادیکال‌ها منجر به صدمه به غشای لیپیدی اسیدنوکلئیک و پروتئین‌ها می‌شود (19). از طرف دیگر، آهن آزاد به دلیل توانایی اکسیدکنندگی بالا و همچنین توانایی تولید رادیکال‌های آزاد با غشای پروتئین‌ها، پیوند محکمی تشکیل داده که در طولانی‌مدت، تجمع یافته و به سلول‌ها آسیب می‌رساند. هنگامی‌که ذخایر آهن بیش‌ازحد باشد منجر به آسیب اکسیداتیو کبدی می‌شود. مصرف بیش‌ازحد آهن به‌عنوان یک عنصر سمی می‌تواند باعث اختلالات مختلفی در ارتباط با استرس اکسیداتیو و ضعف سیستم ایمنی بدن شود (14و 27). نانو ذرات آهن در حوزه پزشکی، برای درمان سرطان، تحویل دارو، عکس‌برداری پزشکی و تشخیص بیماری‌ها کاربرد فراوانی دارد (2). هرچقدر ذرات کوچک‌تر باشند نسبت سطح به حجم آن بیشتر شده و درنتیجه واکنش‌های بیوشیمیایی و بیولوژیکی آن بیشتر می‌شود (15). واکنش‌های بیوشیمیایی بیشتر نانو مواد منجر به افزایش تولید رادیکال‌های آزاد ازجمله رادیکال‌های واکنش‌گر اکسیژن (ROS) می‌شود. این رادیکال‌های آزاد به غشای سلول آسیب رسانده و با افزایش اکسیداسیون لیپیدها و شاخص‌های استرس اکسیداتیو منجر به التهاب بافت و مرگ سلول‌ها می‌شوند (9، 20). همچنین نانو ذرات اکسید آهن می‌توانند فعالیت آنزیم‌های کبدی را افزایش داده و منجر به ایجاد التهاب و تغییرات بافتی در کبد شوند (23).

امروزه علاقه‌مندی محققین در پیدا کردن گیاهان حاوی ترکیبات آنتی‌اکسیدانی مؤثر در برابر آسیب کبدی ناشی از سموم و داروها رو به فزونی است. مهمترین مزیت این ترکیبات طبیعی، حداقل عوارض جانبی آن در مقایسه با داروهای شیمیایی رایج در بازار می‌باشد. زیره سیاه بانام علمیL.)  Carum carvi) گیاهی چندساله از خانواده چتریان (Apiaceae)، بومی آسیای غربی، اروپا و شمال آفریقا می‌باشد (30). زیره سیاه علاوه بر اینکه یکی از قدیمی‌ترین ادویه‌جات جهان به شمار می‌آید، به‌طور گسترده در طب سنتی به‌عنوان بادشکن، قاعده­آور، ازدیاد کننده شیرمادر و نیرودهنده استفاده می‌شود (10و 17). خواص فارماکولوژیکی همچون ضد میکروبی، آنتی‌اکسیدانی، ضد اسپاسمی و ضد سرطانی این گیاه ثابت‌شده است (1). مطالعه پیشین ما نشان داده است که اسانس این گیاه حاوی ترکیبات اصلیγ-terpinene, γ-terpinene-7-al  وp-cymene  است و دارای خواص ضدمیکروبی و آنتی‌اکسیدانی چشمگیری بوده که قابل‌مقایسه با آنتی‌اکسیدان و آنتی‌بیوتیک‌های استاندارد می باشد (11). همچنین، خاصیت محافظت کبدی اسانس و عصاره این گیاه در شرایط سپسیس و in vivo، ثابت شده است (7). مطالعه‌ای نشان داد که اسانس زیره سیاه دارای خواص آنتی‌اکسیدانی قابل‌توجهی می­باشد و می‌توان به‌عنوان آنتی‌اکسیدان طبیعی در کاهش سطح استرس اکسیداتیو و افزایش سطح فاکتورهای آنتی‌اکسیدانی به کار گرفته شود (29).

با صنعتی شدن نانوتکنولوژی، در معرض قرارگیری عموم با نانو ذرات در آینده نزدیک غیرقابل اجتناب می باشد، لذا بررسی اثرات دزهای مختلف این نانو ذرات و اثرات آن‌ها بر سلامتی حائز اهمیت است. بافت کبد نقش مهمی در سوخت‌وساز، متابولیسم و دفع مواد زائد دارد. اما کبد در معرض قرارگیری دزهای بالای نانو ذرات آهن، آسیب‌پذیر شناخته‌شده است. بنابراین، می‌توان از آن به کمک آنتی‌اکسیدان‌های طبیعی موجود در گیاهان دارویی مانند زیره سیاه تا حدود زیادی محافظت کرد. دراین راستا، این مطالعه تا جایی که ما بررسی کردیم برای اولین بار، تأثیر محافظتی اسانس حاصل از دانه‌های زیره سیاه در جلوگیری از آسیب کبدی ناشی از نانو ذرات اکسید آهن را به کمک شاخص­های بیوشیمیایی استاندارد نظیر گلوتاتیون (GSH)، لیپید پر اکسیداسیون (LP)، آنتی‌اکسیدان کل (FRAP) و همچنین آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی سوپر اکسید دیسموتاز (SOD) و کاتالاز (CAT) و نیز یافته‌های آسیب‌شناسی، موردمطالعه قرارداده است.

مواد و روشها

تهیهاسانسزیره سیاه: اسانس زیره سیاه به‌وسیله دستگاه کلونجر استخراج شد. در این روش، 50 گرم از دانه‌های پودر شده با افزودن 700 میلی‌لیتر آب مقطر به مدت 90 دقیقه در یک بالن یک لیتری جوشانده شد. حیوانات آزمایشگاهی دراین مطالعه 20 سر رت نر نژاد ویستار (3 تا 4 ماهه) با میانگین وزن 150 گرم با رعایت کلیه ملاحظات اخلاقی استفاده شد.

این کمیته اخلاق مبتنی بر اعلامیه انجمن پزشکی جهانی هلسینکی (تصویب‌شده توسط هیجدمین مجمع پزشکی جهانی، هلسینک، فنلاند، ژوئن 1964) بود. حیوانات از موسسه پاستور ایران خریداری شده و در اتاق حیوانات در قفسه‌های مخصوص نگهداری شده و دسترسی آزاد به غذا و آب آشامیدنی از طریق بطری داشتند، که تحت تأثیر 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی قرار گرفتند.

تیمار حیوانات و نمونه‌گیری: حیوانات به‌طور تصادفی به چهار گروه تقسیم شدند. گروه شاهد، حیوانات روزانه به مدت سه روز، نرمال سالین (حلال نانو ذرات اکسید آهن) به همراه DMSO (حلال اسانس) را به‌صورت تزریق درون صفاقی (i.p) دریافت کردند. گروه تیمار نشده، 200 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن نانو ذرات اکسید آهن (Fe2O3) به همراه سالین (حلال نانو ذرات اکسید آهن) را روزانه به مدت 3 روز به‌صورت تزریق درون صفاقی دریافت کردند. گروه پیش درمانی، نانو ذرات اکسید آهن به همراه اسانس زیره سیاه در دو دُز متفاوت 100 (E.O100) و 200 (E.O200) میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن حل‌شده در DMSO را روزانه به مدت 3 روز به‌صورت تزریق درون صفاقی دریافت کردند. در روز سوم پس از تزریق (72 ساعت بعد از تزریق)، حیوانات توسط دی اتیل اتر بیهوش شده و از قلب آنها توسط سرنگ هپارینه، خونگیری انجام شد و به مدت 10 دقیقه با دور 3000 سانتریفوژ گردیده و پلاسما بدست آمد. همچنین، مقداری بافت کبد رت­ها نیز به‌منظور بررسی‌های پاتولوژیکی و تست‌های بیوشیمیایی برداشته شد.

آزمایشات بیوشیمیایی: ابتدا از بافت کبد هموژن 20 درصد وزنی/حجمی در بافر فسفات سرد (100 mM, pH=7.0) تهیه شد.

تعیین میزانLP : بخشی از بافت کبد برای اندازه‌گیری سطح مواد واکنش‌دهنده تیوباربیتوریک اسید (TBARS) به‌عنوان شاخص پر اکسیداسیون لیپید در بافر فسفات (100 mM, pH=7.0) هموژنیزه شد. غلظت TBARS با استفاده از اسپکتروفتومتری با استفاده از واکنش TBA بر اساس روش گزارش‌شده توسط بوج و آست در سال 1987انجام شد (5).

تعیین غلظت GSH: گلوتاتیون بااستفاده از معرف Ellman’s  و بر اساس روش لیندزی و سلداک (1986) در هموژن بافت کبد اندازه‌گیری شد. دراین روش، گلوتاتیون با ترکیبی به نام دی تیو نیترو بنزوئیک اسید (DTNB) کمپلکسی را تشکیل می‌دهد که طول‌موج آن توسط دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد. درنهایت، میزان گلوتاتیون به کمک منحنی استاندارد محاسبه شد (25).

تعیین ظرفیت آنتی‌اکسیدانی کل پلاسما )آزمون(FRAP: اندازه‌گیری ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام پلاسما با استفاده از روش FRAP که توسط بنزی و استرین در سال 1996 معرفی گردیده است، انجام شد. اساس این روش، توانایی سرم در احیای یون‌های فریک +3Fe به فرو +2Fe در حضور معرفTPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine) می­باشد. میزان قدرت احیاکنندگی سرم، با کمک منحنی استاندارد جذب در مقابل غلظت محلول +2Fe، توسط دستگاه اسپکتروفتومتری محاسبه می‌شود.

تعیین فعالیت آنزیم‌هایSODو CAT: فعالیت‌های آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان SOD و CAT در کبد با استفاده از کیت‌های تجاری  (Abcam, Inc., USA)براساس دستورالعمل‌های شرکت، برآورد شد.

مطالعات هیستوپاتولوژی: پس از سه روز رت­ها­کشته‌شده و بافت کبد برای بررسی هیستوپاتولوژیک برداشته شد و در بافر فرمالین 10 درصد فیکس شدند. برش‌های نازکی به ضخامت 6-5 میکرون از بافت بلوک شده در پارافین تهیه و به روش هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) رنگ‌آمیزی می‌شوند، سپس لام­ها به‌منظور مقایسه تغییرات بافتی توسط میکروسکوپ نوری با مشخصات Olympus cx21 و دوربین Olympus e510 موردبررسی قرارگرفته و عکس‌برداری می‌شوند (18). در رنگ‌آمیزی آهن به روشLillie’s، نانوذره ما در تحقیق Fe2O3 بود. بنابراین آهن 3 ظرفیتی داشته که با با سه ظرف گزیلول پارافین زدایی کرده و با درجات الکل نزولی و آب مقطر آبدهی کردیم و برای رنگ‌آمیزی آهن فریک (Fe3+) برش‌ها را یک ساعت در محلول پتاسیم فروسیانید قرارداده و بعد برش‌ها را بخوبی در محلول آبی 1 درصد اسید استیک گلاسیال شستشو  دادیم و بعد برش‌ها را برای ده دقیقه در محلول  Basic Fuchsin  قرارداده و بعد در آب مقطر شستشو دادیم و با الکل‌های66 درصد و الکل مطلق آبگیری کرده و در گزیلول شفاف‌سازی کرده و بعد لامل روی آن قراردادیم، آهن به‌صورت آبی پروس تیره دیده شد.

تجزیه‌وتحلیل آماری: برای تجزیه‌وتحلیل داده‌ها از نرم‌افزار SPSS ویرایش 15 استفاده گردید. نتایج به‌دست‌آمده از این تحقیق توسط آزمون واریانس یک‌طرفه (One way-ANOVA) و به دنبال آن با استفاده از آزمون تعقیبی توکی مقایسه شدند. نتایج به‌صورت میانگین ± انحراف معیار گزارش‌شده و مقایسه میانگین داده‌ها (برای هر آزمون 3 تکرار در نظر گرفته شد) در سطح آماری 05/0P< معنی‌دار در نظر گرفته شد. 05/0 *P<بیانگر تفاوت معنی‌دار گروه کنترل شاهد نسبت به گروه تیمار نشده و05/0**P< بیانگر تفاوت معنی‌دار گروه تیمار نشده نسبت به گروه‌های پیش درمانی (اسانس زیره سیاه) می باشد.

نتایج

تأثیر اسانس زیره سیاه بر روی پارامترهای استرس اکسیداتیو / آنتی‌اکسیدانت (GSH،LP  و FRAP): نتایج اندازه‌گیری LP حاکی از آن است که تزریق نانو ذرات اکسید آهن با دُز 200 میلی‌گرم در کیلوگرم وزن بدن، 72 ساعت پس از تزریق، این شاخص از مقدار
n mol/mg protein 1.39±0.17 در گروه شاهد به 2.53±0.11 n mol/mg protein در گروه تیمار نشده افزایش یافت (05/0P<). اما، میزان آن به‌طور قابل‌توجهی (05/0P<) با مصرف اسانس زیره سیاه در دو گروه E.O100 (1.60±0.19 n mol/mg protein) و E.O200 (1.52±0.13 n mol/mg protein) کاهش معنی‌داری پیدا کرد (جدول 1). تزریق نانو ذرات اکسید آهن پس از سه روز، باعث کاهش قابل توجه میزان گلوتاتیون کبدی از (460.4±13.03 n mol/mg protein) در گروه شاهد به (342.4±19.2 n mol/mg protein) شده است. درحالی‌که در گروه‌های پیش درمانی با اسانس زیره سیاه در دو گروه E.O100 (423±23.16 n mol/mg protein) و E.O200 (428±25.28 n mol/mg protein) میزان GSH افزایش چشمگیری (05/0P<) پیداکرده است (جدول 1). تیمار رت ها با 200 میلی‌گرم در کیلوگرم وزن بدن نانو ذرات اکسید آهن منجر به کاهش معنی‌دار ظرفیت آنتی‌اکسیدانی کل پلاسما از 631.60±40.37μmol/L به
 μmol/L 436.40±17.45، پس از سه روز شد (05/0P<). اما این پارامتر پس از پیش درمانی با اسانس زیره سیاه در دو دُز 100 و 200 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن تأثیری در میزان فعالیت آنتی‌اکسیدانی پلاسما نداشته است (05/0P>) (جدول 1).

 

جدول 1- تأثیر اسانس زیره سیاه بر روی پارامترهای استرس اکسیداتیو/ آنتی‌اکسیدان (GSH،LP  و FRAP)

Groups

LP (n mol/mg protein)

GSH (n mol/mg protein)

FRAP (μmol/L)

NC

1.39±0.17

460.4±13.03

631.60±40.37

C

2.53±0.11*

342.4±19.2*

436.40±17.45*

E.O100

1.60±0.19**

423±23.16**

425.5±15.67

E.O200

1.52±0.13**

428±25.28**

386±20.87

 :NCگرو شاهد،  :Cگروه تیمار نشده، E.O100: گروه پیش‌درمان شده با اسانس زیره سیاه با دزmg/kg b.w  100 و E.O200: اسانس زیره سیاه با دُز mg/kg b.w 200. 05/0*P< تفاوت معنی‌دار گروه شاهد (C) نسبت به گروه تیمار نشده (NC) و 05/0P<** تفاوت معنی‌دار گروه تیمار نشده (NC) نسبت به گروه‌های پیش درمانی (E.O100 و E.O200) را نشان می‌دهد


تأثیر اسانس زیره سیاه بر روی آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان SOD و CAT: براساس داده‌های جدول  2، فعالیت آنزیم‌های SOD و CAT تحت تأثیر نانو ذرات اکسید آهن قرار نگرفت. همچنین تیمار پیش درمانی حیوانات با اسانس زیره سیاه در دو گروه E.O100 و E.O200 منجر به ایجاد تغییر در سطح این دو آنزیم نشده است (05/0P>) (جدول 2).

 

 

جدول 2- تأثیر اسانس زیره سیاه بر روی فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی SOD و CAT

Groups

SOD (mU/min/mg protein)

CAT (mU/min/mg protein)

NC

12.06±0.75

7.26±0.35

C

11.79±0.61

6.63±0.27

E.O100

11.94±0.70

6.94±0.32

E.O200

11.66±0.84

7±0.27

:NCگرو شاهد،  :Cگروه تیمار نشده، E.O100: گروه پیش‌درمان شده با اسانس زیره سیاه با دزmg/kg b.w  100 و * E.O200: اسانس زیره سیاه با دزmg/kg b.w  200. 05/0P<* تفاوت معنی‌دار گروه شاهد (C) نسبت به گروه تیمار نشده (NC) و 05/0P<** تفاوت معنی‌دار گروه تیمار نشده (NC) نسبت به گروه‌های پیش درمانی (E.O100 و E.O200) را نشان می‌دهد


مطالعه هیستوپاتولوژی: تصاویری از مقاطع بافتی رنگ‌آمیزی شده به روش H&E در شکل‌های زیر ارائه‌شده است. نتایج بررسی‌های بافت‌شناسی نشان دادند که کبد حیوانات گروه شاهد طبیعی بوده و تخریب واکوئل، آسیب هپاتوسلولار و هیچ نکروزی به چشم نخورد و ساختار هسته، سیتوپلاسم، هپاتوسیت­ها و همچنین، بافت پارانشیم و لوبول­ها در بافت کبد نرمال است (شکل 1، A1 وA2). درعین‌حال، چنانچه تصاویر نشان می‌دهند، دریافت 200 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن نانو ذرات اکسید آهن، القای نکروز گسترده هپاتوسلولار و تخریب واکوئل­ها را موجب شده است (شکل 1،B1  وB2). درحالی‌که تصاویر گروه‌های پیش درمانی با اسانس زیره سیاه E.O100 و E.O200، ناحیه نکروز کوچک‌تر شده را نشان داده و نیز از آسیب هپاتوسلولار در این ناحیه تا حدی کاسته شده است، ولی تخریب واکوئل ها همچنان مشهود است (شکل 1، C1 وC2) (شکل 1،  D1وD2)

بحث

در مطالعه حاضر اثر سمیت نانو ذرات اکسید آهن به علت کاربرد زیاد آن در صنایع مختلف بررسی‌شده است. سم‌زدایی مواد سمی یکی از اعمال مهم کبد است و آسیب این عضو منجر به ضررهای جبران‌ناپذیری در بدن می‌شود.

 

 

 

 

 

شکل1- اثر اسانس زیره سیاه در دو دُز 100 و 200 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن بر روی تغییرات پاتولوژی بافت کبد بعد از 72 ساعت از تزریق نانو ذرات اکسید آهن. A: گروه شاهد،. B: گروه تیمار نشده،(B B2 C: گروه پیش درمانی با اسانس زیره با دُز 100 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن (E.O100   D: گروه پیش درمانی با اسانس زیره با دُز 200 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن (E.O200)


بنابراین، گیاهان دارویی همچون زیره سیاه، گیاه پرکاربرد در طب سنتی ایران حاوی آنتی‌اکسیدان­های طبیعی با حداقل عوارض جانبی می‌تواند از بافت کبد در برابر استرس اکسیداتیو محافظت کند. بنابراین، بررسی اثر اسانس زیره سیاه برای اولین بار در کاهش آسیب­های کبدی ناشی از نانو ذرات اکسید آهن بوده است. در این راستا، در این تحقیق بعد از تیمار حیوانات با دُز سمی نانو ذرات اکسید آهن و پیش درمانی آن‌ها با اسانس زیره سیاه، توانایی محافظتی این ترکیب طبیعی در برابر آسیب­های رادیکال‌های آزاد ناشی از تزریق نانو ذرات اکسید آهن، با اندازه‌گیری پارامترهای استرس اکسیداتیو، سطح آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان و مطالعه هیستوپاتولوژی مورد آزمایش قرارگرفت.

به‌طور کلی، واکنش شیمیایی بیشتر نانو مواد منجر به افزایش تولید رادیکال‌های آزاد ازجمله رادیکال‌های واکنش‌گر اکسیژن (ROS) می‌شود. تولید ROS در محدوده متنوعی از نانو مواد شامل فولرن، نانو لوله‌های کربنی و نانو ذرات اکسید فلزی مشاهده‌شده است (21و 22). رادیکال‌های آزاد به غشای سلول آسیب رسانده و با افزایش پر اکسیداسیون لیپیدها و شاخص‌های استرس اکسیداتیو منجر به التهاب بافت و مرگ سلول‌ها می‌شوند (9و 20). نتایج حاصل از این تحقیق نیز نشان می‌دهد که تزریق نانو ذرات اکسید آهن با دُز 200 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن باعث افزایش میزان MDA به‌عنوان شاخص پر اکسیداسیون لیپیدها و کاهش میزان گلوتاتیون کبدی می‌گردد (جدول 1). کبد جایگاه اصلی سنتز، ذخیره و صادرکننده پلاسمایی گلوتاتیون به‌حساب می‌آید. غلظت و پتانسیل اکسیداسیون / احیای بالای گلوتاتیون باعث شده است که به‌عنوان یک آنتی‌اکسیدان قوی و اولین خط دفاعی علیه رادیکال‌های آزاد در سلول‌ها محسوب گردد. در واکنش‌های شیمیایی گلوتاتیون با ترکیبات زنوبیوتیک، گلوتاتیون به‌طور مستقیم بااین ترکیبات وارد واکنش شده و با افزایش حلالیت، آنها را به خارج سلول انتقال می‌دهد. وجود مقادیر زیاد ترکیبات سمی با تهی ساختن منابع گلوتاتیون، سلول‌ها را در مقابل صدمات استرس اکسیداتیو ثانویه بسیار آسیب‌پذیر می‌گرداند (13).

باتوجه به نتایج جدول  1، پس از 72 ساعت از تزریق 200 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن نانو ذرات اکسید آهن به‌صورت درون صفاقی به رت­ها، کاهش قابل‌توجهی (05/0P<) در ظرفیت آنتی‌اکسیدانی توتال پلاسما (FRAP) مشاهده شد. آزمون FRAP مجموعه عوامل الکترون دهنده را به‌عنوان ظرفیت کل آنتی‌اکسیدانی اندازه‌گیری کرده و بنابراین این احتمال وجود دارد که نانو ذرات اکسید آهن با ایجاد رادیکال‌های آزاد منجر به کاهش سطح عوامل الکترون دهنده در پلاسما و درنتیجه کاهش FRAP شوند (24). همچنین در نتایج هیستوپاتولوژی کبد، در گروه‌های مسموم شده با نانو ذرات اکسید آهن، آسیب و التهاب کبدی پدید آمده نتایج بیوشیمیایی را تأیید می‌کند (شکل 1).اما هیچ‌گونه تغییر قابل‌ملاحظه ای (05/0P<) در میزان فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی بافت کبدی در اثر تزریق دُز سمی نانو ذرات اکسید آهن مشاهده نشد (جدول  2). در مطالعه‌ای بررسی سمیت نانو ذرات اکسید روی آنزیم‌های کبدی در موش صحرایی نر نشان داد که با افزایش غلظت نانو ذرات اکسید روی، بافت کبد آسیب‌دیده باعث افزایش سطح آنزیم‌ها کبدی در پلاسما می‌شود (16). همچنین در جریان مسمومیت ناشی از نانو ذرات اکسید تیتانیوم پیش‌بینی می‌شود واکنش‌های استرس اکسیداتیو و فعالیت گلوتاتیون در سلول‌های افزایش یابد (6و 26). اگرچه مکانیسم‌های محافظتی درون‌سلولی به میزان زیادی آسیب‌های ناشی از ROS را کاهش می‌دهند اما به علت فراوانی تولید این رادیکال‌های آزاد وجود راه‌های محافظتی دیگری به‌ویژه آنتی‌اکسیدان­های مواد غذایی برای سلامت انسان بسیار مهم می باشد. وجود ترکیبات طبیعی به‌ویژه نمونه‌های گیاهی که خاصیت آنتی‌اکسیدانی دارند دارای این ویژگی می‌باشند (27). ترکیبات فنلی که به دلیل خاصیت احیاء کنندگی دارای خاصیت آنتی‌اکسیدانی می‌باشند به‌عنوان مواد احیاء کننده، دهنده هیدروژن و غیرفعال کننده اکسیژن عمل می‌کنند (22). فعالیت آنتی‌اکسیدانی اسانس حاصل از زیره سیاه در مطالعات پیشین ثابت شده است و این خاصیت را به ترکیباتی چون کومین آلدئید، گاما ترپینن و بتاپینن نسبت داده‌اند (23). در مطالعه حاضر، میزان سطوح فاکتورهای GSH و LP به صورت معنی داری در رت هایی که اسانس زیره سیاه را با دو دُز مختلف 100 و 200 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن به صورت صفاقی دریافت کرده اند،  تعدیل پیدا کرده است (جدول 1). در مطالعه پیشین ما، اثر محافظت کبدی اسانس زیره سیاه در شرایط القای مسمومیت به‌صورت سپسیس، با اندازه‌گیری پارامترهای بیوشیمیایی چون پر اکسیداسیون لیپید و گلوتاتیون ثابت شده است (7). علاوه براین در یافته‌های پاتولوژی، التهاب موجود در بافت کبد بعد از پیش درمانی رت­ها با اسانس زیره سیاه با دُز 200 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن به‌طور قابل‌توجهی کاهش‌یافته است (شکل 1). در مطالعه دیگری نیز، سیلی مارین با قابلیت آنتی‌اکسیدانی بالا اثر محافظتی کبدی قابل‌توجهی، با کاهش معنی‌داری در آنزیم‌های کبدی، در مقابل آسیب کبدی ناشی از دُز بالای آهن از خود نشان داده است (19). مطالعات پیشین نیز ثابت کرد که اسانس گلپر و آویشن شیرازی می‌تواند بر روند آسیب کبدی ناشی از غلظت سمی استامینوفن با مهار کردن پارامترهای استرس اکسیداتیو و تعدیل فعالیت آنزیم‌های کبدی مؤثر واقع شود (8و 21).

نتیجه‌گیری

نتایج این تحقیق نشان می‌دهد که تیمار حیوانات با اسانس زیره سیاه، از طریق تعدیل پارامترهای دخیل در استرس اکسیداتیو و آنتی‌اکسیدان نظیر پراکسداسیون لیپیدها و گلوتاتیون احیاء منجر به کاهش آسیب‌های بافتی کبد ناشی از مسمویت نانو ذرات اکسید آهن شده است و میزان نکروز سلول‌های کبدی را کاهش داده است. این اثرات احتمالاً با قابلیت آنتی‌اکسیدانی ترکیبات مؤثر موجود در اسانس زیره سیاه ارتباط دارد.

1-       Agrahari, P., and Singh, D .K., 2014. A review on the pharmacological aspects of Carum carv, J Biol Earth Sci, Vol. 4, PP: M1-M1 3.

2- Babadi, V. Y., Najafi, L., Najafi, A., Gholami, H., Beigi Zarji, M. E., and Golzadeh, J., 2013. Evaluation of iron oxide nanoparticles effects on tissue and enzymes of liver in rats, Elixir Appl Chem. Vol. 55, PP: 13226-29.

3- Bell, A. W., 1979. Lipid metabolism in liver and selected tissues and in the whole body of ruminant animals, Prog Lipid Res, Vol. 18, PP: 117-164.

4-       Benzie, I. F. F., and Strain, J. J., 1996. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of antioxidant power: the FRAP assay. Anal Biochem, Vol.239, PP: 70–76.

5-       Buege, J. A., and Aust, S. D., 1978. Microsomal lipid peroxidation, Methods Enzymol, Vol. 52, PP: 302–10.

6-       Chen, Z., Meng, H., Xing, G., Chen, C., Zhao, Y., Jia, G., and et al., 2006. Acute toxicological effects of copper nanoparticles in vivo, Toxicology Letters,Vol. 163, PP: 109-20.

7-       Dadkhah, A., and Fatemi, F., 2011. Heart and kidney oxidative stress status in septic rats treated with caraway extracts, Pharm Biol, Vol. 49, PP: 679-686.

8-       Dadkhah, A., Khalaj, G. H., Fatemi, F., Dini, S., Naeege, S., and Fadaee Monfared, M., 2016. Considering the effect of Golpar (Heracleum Persicum) essential oils on the acute hepatotoxcity induced by acetaminophen in Wistar rats, Journal of Animal Researches, Vol. 29, PP: 292-306.

9- Droge, W., 2002. Free radicals in physiological control of cell function, Physiol Rev, Vol.82, PP: 47-95.

10- Eddouks, M., Lemhadri, A., and Michel, J. B., 2004. Caraway and caper: potential anti-hyperglycaemic plants in diabetic rats. J Ethnopharmacol, Vol. 94, PP: 143–148.

11-    Fatemi, F., Allameh, A., Khalafi, H., Rajaee, R., and Rezaei, M. B., 2011. Biochemical properties of γ-irradiated caraway essential oils, J Food Bio chem. Vol. 35, PP: 650-62.

12- Guyton, C., and Hall John, E., 2000. Medical Physiology, Farokh Shadan, Tehran Chehr, No. 2, PP: 866-867.

13-    Handy, R. D., and Shaw, B. J., 2007. Toxic effects of nanoparticles and nanomaterials: Implications for public health, risk assessment and the public perception of nanotechnology, Health Risk & Society. Vol.9, PP: 125-144.

14- Hanini, A., Schmitt, A., Kacem, K., Chau, F., Ammar, S., and Gavard, J., 2011. Evaluation of iron oxide nanoparticle biocompatibility, Inter J Nanomed, Vol.6, PP: 787– 94.

15- Jain, T. K., Reddy, M. K., Morales, M. A., Leslie-Pelecky, D. L., and Labhasetwar, V., 2008. Biodistribution, clearance, and biocompatibility of iron oxide magnetic nanoparticles in rats, Molecular Pharmaceutics, Vol. 5, PP: 316-327.

16-    Jani, P., and Halbert, G. W., Langridge, J., and Florence, A. T., 1990. Nanoparticle uptake by the rat gastrointestinal mucosa: quantitation and particle size dependency, J Pharm Pharmacol, Vol.42, PP: 821- 826.

17-    Lemhadri, A., Hajji, L., Michel, J. B., and Eddouks, M., 2006. Cholesterol and triglycerides lowering activities of caraway fruits in normal and streptozotocin diabetic rats, J Ethnopharmacol, Vol.106, PP: 321–326.

18-    Lillie, R. D., 1965. Histopathologic technic and practical histochemistry, 3rd ed, New York, McGraw-Hill Book Co.

19- Najafzadeh, H., Razijalali, M., Morovvati, H., and Taravati, F., 2010. Comparison prophylactic effect of silymarin and deferoxamine on iron overloadinduced hepatotoxicity in rat, J Med Toxicol, Vol.6, PP: 22–6.

20- Puntarulo, S., 2005. Iron, Oxidative stress and Human Health, Mole Aspe Med,Vol.26, PP: 299-312.

21-    Rasooli, A., and Hajihosseini, R., 2018. Considering the Zataria multiflora essential oil effect on the xenobiotic metabolism in acute toxicity induced by iron nanoparticle, Journal of Animal Researches, Vol. 31, PP: 172-182.

22-    Rice-Evans, C. A., Miller, N. J., and Paganga, G., 1996. Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids, Free Radical Biology and Medicine, Vol. 20, PP: 933-956.

23- Sadeghi, L., Yousefi Babadi, V., and Espanani, H. R., 2015. Toxic effects of the Fe2O3 nanoparticles on the liver and lung tissue, Bratisl Lek Listy, Vol.116, PP: 373-8.

24- Scott, E., 2011. Characterization of nanoparticles intended for drug delivery, Methods Mole Biol, Vol. 697, PP: 3-5.

25-    Seldak, J., and Lindsay, R. H., 1968. Estimation of total protein bound and non-protein sulfidryl groups in tissue with Elman’s reagent, Anal Biochem, Vol. 25, PP: 192-205.

26-    Shi, J. W., Zhang, F., Zhao, Y. L., and Chai, Z. F., 2006. Acute toxicity of nano- and micro-scale zinc powder in healthy adult mice,Toxicology Lett, Vol. 161, PP: 115-23.

27-    Ulicna, O., Greksak, M., Vancova, O., Zlatos, L., Galbavy, S., Bozek, P., and Nakano, M., 2003. Hepatoprotective Effect of Rooibos Tea (Aspalathus linearis) on CCl4-Induced Liver Damage in Rats, Physiol Res, Vol. 52, PP: 461-466.

28- Wolf, P. L., 1999. Biochemical diagnosis of liver disease, Ind J ClinBiochem. Vol. 14, PP: 59-64.

29-    Yu, L. L., Zhou, K. K., and Parry, J., 2005. Antioxidant properties of cold-pressed black caraway, carrot, cranberry, and hemp seed oils. Food Chem. Vol. 91, PP: 723–29.

30- Zargari, A., 1996. Medicinal plants. Tehran: Tehran University Publications, Vol. 3, P. 513- 514. 1996.