نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد بیوشیمی، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه لرستان

2 زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه لرستان، خرم آباد،ایران

چکیده

دیابت شیرین در بسیاری از کشورها در سنین 70-20 سالگی علت اصلی کوری، قطع عضو و نارسایی مزمن کلیه محسوب می شود. افزایش سطح گلوکز خون و ورود آن به مسیر پلی‌ال یکی از عوامل دخیل در پاتوژنز عوارض مزمن دیابت است. از آنجایی که آنزیم کلیدی در این مسیر آلدوز ردوکتاز می باشد استفاده از ترکیبات گیاهی یا شیمیایی که فعالیت این آنزیم را کاهش دهند، میتواند به عنوان یک راه درمانی برای جلوگیری از بروز این عوارض مورد استفاده قرار گیرد. در این مطالعه اثر عصاره تام و فراکسیون موثر گیاه کنگر (Gundelai tourneforti) و هم چنین تعدادی از داروهای ضد دیابتی بر روی فعالیت آنزیم آلدوز ردوکتاز مورد بررسی قرار گرفت. برای این منظور، ابتدا محتوای فنول و فلاوونویید و فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره تام و فراکسیون های مختلف گیاه تعیین شد. در ادامه لنز چشم گاو استخراج و آنزیم آلدوز ردوکتاز از طریق روش Hayman-Kinoshita جداسازی شد و اثر مهاری ترکیبات مورد نظر روی فعالیت آنزیم مورد بررسی قرار گرفت. دنتایج به دست آمده نشان داد که فراکسیون اتیل‌استاتی دارای بیشترین مقدار ترکیبات فنول و فلاونوئیدی و بالاترین قدرت جمع کنندگی رادیکال های آزاد می باشد. هم چنین، این فراکسیون دارای بالاترین اثرات مهاری روی فعالیت آنزیم آلدوز ردوکتاز با IC50= 0.019 mg/ml می باشد. این فراکسیون با گلیسرآلدهید مهار غیررقابتی و با NADPH مهار رقابتی داشت. مطالعه حاضر روی داروهای ضددیابتی نشان داد که این داروها تاثیر زیادی بر مهار آنزیم ندارند و احتمالا روی مکانیسم‌های دیگر درگیر در بیماری دیابت موثر هستند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Inhibitory effect of the effective fraction of Gundelia tournefortii L and several anti-diabetic drugs on the aldose reductase activity isolated from cow lens eye: a comparative study

نویسندگان [English]

  • Zeynab Asareh 1
  • Seifollah Bahramikia 2

1 Department of Biology, Lorestan University, Khorramabad, Iran

2 Biology Department, Science Faculty, Lorestan University, Khorramabad, Iran

چکیده [English]

Diabetes mellitus in many countries among adults aged 20–70 is the main cause of blindness, amputation and chronic renal failure. Increasing blood glucose and entering glucose into the polyol pathway, is one of the factors involved in the pathogenesis of chronic diabetes complications. Since the key enzyme in this pathway is aldose reductase, the use of plant or chemical compounds that reduce the activity of this enzyme can be used as a therapeutic strategy to prevent the onset of chronic complications of diabetes. In this study, the effect of Gundela tournefortii crude extract and its different fractions in Lorestan province and also several anti-diabetes drugs on inhibition of Aldose reductase enzyme were investigated. For this purpose, firstly, the phenolic and flavonoid content and antioxidant activity of crude extract and various fractions were determined. In the next step, the cow lenses were extracted, the aldose reductase enzyme was isolated by Hayman-Kinoshita method and the inhibitory effect of the compounds on the activity of the enzyme was determined. The results showed that the ethyl acetate fraction has the highest amount of phenol and flavonoid compounds and the highest capacity for the DPPH radical scavenging. Also, this fraction has the highest inhibitory effect on aldose reductase enzyme activity with IC50 = 0.019 mg/ml. This fraction had uncompetitive inhibition with D-glyceraldehyde, but it showed competitive inhibition to NADPH. Anti-diabetic drugs have been shown do not significantly affect the inhibition of the enzyme and are likely to affect other mechanisms of diabetes.

کلیدواژه‌ها [English]

  • polyol pathway
  • aldose reductase
  • chronic diabetes complications
  • Gundela tournefortii
  • ethyl acetate fraction

اثر مهاری فراکسیون مؤثر گیاه کنگر (Gundelia tournefortii L.) و تعدادی از داروهای ضد دیابتی بر فعالیت آنزیم آلدوز ردوکتاز لنز چشم

زینب عصارهوسیف‌الله بهرامی کیا*

خرم آباد، دانشگاه لرستان، دانشکده علوم پایه، گروه زیست‌شناسی

تاریخ دریافت: 27/05/1398،         تاریخ پذیرش: 22/10/1398

چکیده

دیابت شیرین در بسیاری از کشورها در سنین 70-20 سالگی علت اصلی کوری، قطع عضو و نارسایی مزمن کلیه محسوب می‌شود. افزایش سطح گلوکز خون و ورود آن به مسیر پلی‌ال یکی از عوامل دخیل در پاتوژنز عوارض مزمن دیابت است. از آنجایی که آنزیم کلیدی در این مسیر آلدوز ردوکتاز است استفاده از ترکیبات گیاهی یا شیمیایی که فعالیت این آنزیم را کاهش دهد، می‌تواند به‌عنوان یک ‌راه درمانی برای جلوگیری از بروز این عوارض مورد استفاده قرار گیرد. در این مطالعه اثر عصاره تام و فراکسیون مؤثر گیاه کنگر (Gundelai tourneforti) و هم‌چنین تعدادی از داروهای ضد دیابتی بر روی فعالیت آنزیم آلدوز ردوکتاز مورد بررسی قرارگرفت. برای این منظور، ابتدا محتوای فنول و فلاوونویید و فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره تام و فراکسیون‌های مختلف گیاه تعیین شد. در ادامه لنز چشم گاو استخراج و آنزیم آلدوز ردوکتاز از طریق روش
Hayman-Kinoshita جداسازی شد و اثر مهاری ترکیبات مورد نظر روی فعالیت آنزیم مورد بررسی قرار گرفت. در آخر، با استفاده از بررسی کینتیک آنزیم، نوع مهار فراکسیون اتیل استاتی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج به‌دست ‌آمده نشان داد که فراکسیون اتیل‌استاتی دارای بیشترین مقدار ترکیبات فنول و فلاونوئیدی و بالاترین قدرت جمع کنندگی رادیکال‌های آزاد می‌باشد. هم چنین، این فراکسیون دارای بالاترین اثرات مهاری روی فعالیت آنزیم آلدوز ردوکتاز با IC50= 0.019 mg/ml است. این فراکسیون با گلیسرآلدهید که سوبسترای آنزیم می‌باشد مهار غیررقابتی و با NADPH مهار رقابتی داشت. مطالعه حاضر روی داروهای ضد دیابتی نشان داد که این داروها تأثیر زیادی بر مهار آنزیم ندارند و احتمالاً روی مکانیسم‌های دیگر درگیر در بیماری دیابت مؤثر هستند.

واژه‌های کلیدی: مسیر پلی ال، آلدوز ردوکتاز، عوارض مزمن دیابت، کنگر، فراکسیون اتیل استاتی

* نویسنده مسئول، تلفن: 09166614082 ، پست الکترونیکی: Bahramikia.s@lu.ac.ir

مقدمه

 

دیابت شیرین یکی از بیماری‌های پرهزینه و پرخطر در جهان بوده و در بسیاری از کشورها علت اصلی کوری و سردسته‌ی علل قطع عضو و نارسایی مزمن کلیه محسوب می‌شود (4 و 25). مکانیسم یا مکانیسم‌های اصلی این بیماری هنوز به‌طور کامل و دقیق مشخص نشده است ولی هیپرگلیسمی یا افزایش قندخون به‌عنوان عامل اصلی شروع کننده این بیماری شناخته شده است. از طرفی، ارتباط بین هیپرگلیسمی و استرس اکسیداتیو که از آن به‌عنوان عدم تعادل بین تولید گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) و یا نیتروژن و سیستم آنتی اکسیدانی مقابله کننده با آن نام برده می‌شود به اثبات رسیده است (4). هایپرگلیسمی یا از طریق تولید مستقیم ROS و یا از طریق تغییر در تعادل احیا در استرس اکسیداتیو نقش دارد که مکانیسم این امر شامل: افزایش شار مسیر پلی ال، افزایش تشکیل درون سلولی محصولات انتهایی گلیکوزیلاسیون پیشرفته، فعال‌سازی پروتئین کیناز C و تولید بیش‌ازحد سوپراکسید توسط زنجیره انتقال الکترون میتوکندریایی می‌باشد (5و 22). کاتاراکت به‌عنوان یکی از ضایعات ایجادشده در دیابت است و اساساً در اثر تجمع Polyol و گلیکوزیلاسیون پروتئین‌ها در اپی­تلیوم و فیبرهای عدسی ایجاد می‌شود (19). مسیر پلی­ال یکی از مهم‌ترین علل هیپرگلیسمی دیابتی فرض می‌شود زیرا: 1) این مسیر وقتی فعال می‌شود که غلظت داخل سلولی گلوکز بالا برود 2) هر دو آنزیم این مسیر در بافت­ها و اندامهای انسانی که محل بروز عوارض دیابت می‌باشند وجود دارند 3) محصولات این مسیر و تغییر تعادل کوفاکتورهای آن نوعی استرس سلولی ایجاد می‌کند که این امر می‌تواند زمینه‌ساز و توضیح‌دهنده‌ی عوارض مزمن دیابت باشند (15و 25). در طی مسیر پلی­ال، که یک فرایند دومرحله‌ای است گلوکز پلاسما به‌راحتی و بدون نیاز به انسولین وارد بافت عدسی شده و در آنجا طی مسیر Polyol و توسط آنزیم آلدوز ردوکتاز و با استفاده از NADP+ به فروکتوز و سوربیتول تبدیل می‌شود. این پلی‌ال‌ها قادر به انتشار از غشا نبوده و در داخل عدسی تجمع پیدا می‌کنند. این تجمع باعث ایجاد فشار اسمزی و درنهایت باعث صدمه به این سلول‌ها می‌شود. به‌علاوه، استرس اکسیداتیو به دلیل این‌که پارامترهای اکسیداتیو ازجمله میزان اکسیداسیون پروتئین‌ها در بافت عدسی قابل‌ملاحظه است سهم عمده‌ای در ایجاد کاتاراکت دارد (7و 9). آلدوز ردوکتاز, AR2) E.C.1.1.1.21) اولین آنزیم و آنزیم محدود کننده‌ی سرعت در مسیر پلی­ال است. این آنزیم سیتوزولی احیای گلوکز به سوربیتول را کاتالیز می‌کند (15). در مطالعات مختلفی مشاهده‌شده که تعدادی از مهارکننده‌های آلدوز ردوکتاز، مصنوعی یا طبیعی، برخی از عوارض دیابت را در مدل‌های حیوانی به تأخیر می‌اندازند یا از بروز آن جلوگیری می‌کنند که برخی از آن‌ها در کارآزمایی‌های بالینی هم موردتوجه قرارگرفته‌اند، اما تا به امروز بیشتر مهارکننده‌ای آلدوز ردوکتاز با موفقیت محدودی همراه بوده‌اند برخی از مهارکننده‌های مصنوعی رایج در کارآزمایی­های بالینی از یک طرف همراه با عوارض جانبی می‌باشند و از طرف دیگر نفوذپذیری کمی در بافتهای هدف مثل شبکیه و نورون دارند (21، 25، 29و30). دو کلاس رایج مهارکننده‌ای آلدوز ردوکتاز که مطالعات زیادی هم روی آن انجام‌شده است عبارتند از: مهارکننده‌های کربوکسیلیک اسیدی مانند ponalrestat، zopolrestat و tolerestat که نفوذپذیری کمی در بافت هدف دارند و مهارکننده‌ای اسپیروایمیدی که نفوذپذیری بیشتری در بافت هدف دارند اما همراه با ازدیاد حساسیت پوستی و سمیت کبدی می‌باشند (21، 25، 29و 30). باتوجه به مطالب ذکرشده، مهارکننده­های زیادی برای آنزیم آلدوز ردوکتاز سنتز شده و در مراحل تحقیقاتی‌اند، اما باتوجه به اینکه مهارکننده­ها در بسیاری از مطالعات کینتیکی دارای کارایی پایین، عملکرد مهاری غیرانتخابی در بافتهای مختلف حاوی آنزیم، اثرات نامطلوب فارماکوکینتیکی و عوارض جانبی می‌باشند هنوز نیاز به توسعه مهارکننده­های جدید مخصوصاً مهارکننده‌هایی با منشأ گیاهی وجود دارد.

گیاه کنگر یک گیاه مقاوم و شیرابه‌دار پوشیده از کرک و با تیغ‌های فراوان است. این گیاه دارای برگهای پهن، ضخیم و متناوب، واجد تقسیمات شانه‌ای عمیق، دارای دندانه‌های منتهی به خاراست. ساقه دراین گیاه ضخیم، ساده و یا منشعب با شاخه‌های کم است. موسم گل‌دهی این گیاه اردیبهشت و خردادماه است و انتشار جغرافیایی وسیعی دارد که شامل مناطق غرب، شمال غرب، جنوب و جنوب شرق ایران می‌شود (6). در طب سنتی برای ساقه این گیاه خواص محافظتی برای کبد و تصفیه خون ذکر شده است. همچنین خواص کنگر را شبیه کنگر فرنگی(Synara scolymus)  ذکر نموده و معتقدند که برای کاهش چربی‌های خون به‌ویژه کلسترول مفید است (11). در طب سنتی ترکیه از دانه‌ی خشک‌شده این گیاه برای درمان بیماری پیسی استفاده می‌شود، حال‌آنکه برگهای تازه آن ادرارآور است. همچنین در کشور ترکیه به‌صورت سنتی، از ساقه آن برای درمان اسهال، درد معده، برونشیت، سنگ کلیه، آماس گردن و التهاب استفاده می‌شود (23). در اردن نیز مردم محلی از گیاه کنگر برای درمان دیابت استفاده می‌کنند (9). نتایج حاصل از یک پژوهش در ایران نظریه طب سنتی درباره اثرات محافظتی هپاتوسیت و اثرات مفید کنگر در درمان بیماری‌های کبدی را تأیید می‌نماید (11). در پژوهش دیگری در ترکیه نشان داده‌شده است که عصاره متانولی قسمت‌های هوایی و دانه این گیاه خاصیت آنتی اکسیدانی قابل‌توجهی نسبت به آلفا توکوفرول دارد، علاوه براین عصاره دارای اثر مهاری بر فعالیت آنزیم گلوتاتیون S ترانسفراز می‌باشد (6). آنها نشان دادند محتوی پلی فنلیک دانه گیاه بیشتر از قسمت‌های هوایی آن است و درنتیجه خاصیت آنتی اکسیدانی دانه از سایر قسمت‌ها بیشتر است. تأثیر گیاه کنگر در کاهش خطر بیماری‌های قلبی عروقی به‌واسطه فاکتورهای بیوشیمیایی مؤثر در آترواسکلروزیس نظیر کلسترول و آپولیپوپروتئین‌ها به اثبات رسیده است پژوهشی دیگر اثرات ضد درد و ضدالتهابی گیاه کنگر اثبات‌شده است (11). دراین تحقیق جهت بررسی بیشتر در ارتباط با مکانیسم یا مکانیسم‌های ضد دیابتی گیاه کنگر، تأثیر فراکسیون مؤثر این گیاه بر فعالیت آنزیم آلدوز ردوکتاز تخلیص شده جزئی از عدسی گاو و تعیین مکانیسم مهاری مورد مطالعه قرارگرفت. درکنار این مطالعه تأثیر احتمالی چند داروی ضد دیابتی مورداستفاده در بیماران دیابتی نوع 2 روی فعالیت آنزیم نیز موردبررسی قرارگرفت.

مواد و روشها

جمع‌آوری گیاه کنگر(Gundelia tournefortii): قسمت مورداستفاده گیاه دراین تحقیق ساقه زیرزمینی آن است که از زمینهای شهرستان نورآباد واقع در استان لرستان در اردیبهشت‌ماه و خردادماه سال 1394 جمع‌آوری گردید و توسط دکتر خدایاری(دانشگاه لرستان، ایران) شناسایی و با کد Lu120 در هرباریوم دانشگاه لرستان ثبت شد. ساقه‌های جمع‌آوری شده به منظور رفع آلودگی و گل‌ولای چسبیده به آنها شسته شده و در سایه به دور از نور آفتاب خشک گردید پس از خشک شدن گیاه را آسیاب نموده و تا زمان استفاده در یخچال نگهداری شد.

عصاره گیری گیاه و تهیه عصاره تام و فراکسیون‌های آلی: جهت عصاره­گیری این گیاه از روش خیساندن (maceration) استفاده شد.250 گرم از گیاه خشک‌شده در 500 میلی‌لیتر اتانول 80 درصد خیسانده شد و به مدت 24 ساعت در دمای محیط نگهداری گردید سپس عصاره صاف شده و در یک ارلن نگهداری شد (1). این عمل سه مرتبه دیگر تکرار شد. در پایان عصاره جمع‌آوری شده یک‌بار دیگر از صافی عبور داده شد و با دستگاه روتاری (IKA، آلمان) حلال آلی آن تبخیر شد. عصاره آبی باقیمانده توسط دستگاه فریز درایر (Christ، آلمان)، خشک گردید. عصاره خشک شده تا زمان استفاده در یخچال با دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد (عصاره تام). برای تهیه فراکسیونهای آلی از دو حلال دی اتیل اتر و اتیل استات استفاده گردید. عصاره تام بااستفاده ازاین دو حلال و به وسیله دکانتور فراکسیونه شد. هربار فراکسیون، سه مرتبه تکرار شد. در پایان فراکسیون‌های دی اتیل اتری، اتیل استاتی و باقیماندهی آبی به دست آمد که با حذف حلال آلی توسط دستگاه روتاری و قراردادن در انکوباتور کاملاً خشک شدند. فراکسیون‌های حاصله تا زمان استفاده در یخچال با دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.

تعیین مقدار کل فنول‌ها: محتوای کل ترکیبات فنولی در عصاره تام و فراکسیونهای گیاه Gundelia tournefortii با معرف فولین (FCR) مطابق روش‌های منتشر شده تعیین شد. 5/0 میلی‌لیتر از هر نمونه گیاهی و گالیک اسید به‌عنوان استاندارد با 5/2 میلی‌لیتر معرف فولین سیوکالتیو (رقیق شده به نسبت 1 به 10) و بعد با 2 میلی‌لیتر محلول سدیم کربنات 5/7 درصد مخلوط کردیم. پس از 90 دقیقه انکوبه کردن در دمای 30 درجه سانتی گراد جذب نمونه‌ها در طول‌موج 765 نانومتر با اسپکتروفتومتر خوانده شد. نتایج بر اساس میزان میلی‌گرم گالیک اسید معادل هر گرم از عصاره یا فراکسیون خشک شده بیان شد (3 و 24).

تعیین محتوای کل فلاونوییدها: محتوای کل فلاونوییدهای عصاره تام و فراکسیونهای گیاه کنگر توسط روش کالریمتری توصیف شده در مقالات علمی سنجیده شد. 5/0 میلی‌لیتر از هر نمونه گیاهی و کاتچین به‌عنوان استاندارد با 2 میلی‌لیتر آب مقطر و به دنبال آن با 15/0میلی‌لیتر محلول سدیم نیتریت 15 درصد مخلوط گردید. پس از 6 دقیقه، 15/0 محلول آلومینیوم کلراید 10 درصد اضافه شد. بعد از 6 دقیقه 2 میلی‌لیتر محلول سدیم هیدروکسید 4 درصد و پس‌ازآن بلافاصله 200 میلی‌لیتر آب مقطر اضافه و حجم نهایی به 5 لیتر رسید. پس از 15 دقیقه انکوبه کردن در دمای اتاق، جذب نمونه در طول‌موج 510 نانومتر در مقابل بلانک (آب مقطر) خوانده شد. نتایج براساس میلی‌گرم کاتچین معادل هر گرم از عصاره یا فراکسیون خشک شده بیان شد (31).

سنجش میزان فعالیت جمع‌آوری رادیکال‌های DPPH: دی فنیل پیکریل هیدرازیل DPPH یک رادیکال آزاد پایدار است که در طول‌موج 517 نانومتر دارای حداکثر جذب نوری است. این ترکیب به رنگ بنفش بوده که در حضور ترکیبات آنتی‌اکسیدان احیاشده و به رنگ زرد درمی‌آید و درنتیجه جذب آن کاهش می‌یابد که این امر بیانگر قدرت احیاکنندگی ترکیبات آنتی‌اکسیدان است. آنتی‌اکسیدان‌ها از طریق دادن الکترون یا پروتون باعث احیای  DPPHمی‌گردند. سنجش فعالیت جمع‌آوری رادیکالهای آزاد توسط عصاره تام و فراکسیونها بر اساس روش Blios صورت گرفت (4). به این منظور یک میلی‌لیتر از غلظت‌های مختلف داروها (250-50) میکروگرم بر میکرولیتر تهیه شد و به هر کدام، یک میلی‌لیتر محلول DPPH 2/0 میلی مولار که دراتانول حل شده بود افزوده شد. پس از گذشت 30 دقیقه کاهش جذب نمونه‌ها به علت خاصیت پروتون دهندگی در 517 نانومتر قرائت شد.

تهیه نمونه‌های لنز و عصاره گیری: 20 عدد چشم گوساله از کشتارگاه خرم‌آباد تهیه شد، بلافاصله بعد از تهیه، لنزها از آن خارج شد. لنزها را با آب مقطر شستشو داده سپس وزن کرده و تا موقع استفاده در دمای 70- درجه سانتی‌گراد فریز شد. برای تخلیص آنزیم، لنزها را در هاون چینی روی یخ کاملاً کوبیده شدند، سپس پنج برابر حجم اولیه آب مقطر اضافه و با پوتر کاملاً یکنواخت و هموژن شد. سپس به منظور جداسازی پروتئین‌های نامحلول به مدت 20دقیقه با سرعت 10000 گرم در دقیقه سانتریفیوژ شد. بعد مایع رویی جدا و از کاغذ صافی عبور داده شد. سپس مایع رویی حاصل از سانتریفیوژ مجدداً سانتریفیوژ گردید (10).

رسوب‌دهی با آمونیوم سولفات و دیالیز: بیشتر پروتئین‌ها در غلظت بالای نمک حلالیت کمتری دارند. غلظتی از نمک که یک پروتئین در آن رسوب می‌کند معمولاً برای هر پروتئین متفاوت از سایر پروتئین‌هاست. ازاین‌رو، رسوب‌دهی بانمک می‌تواند سبب تفکیک پروتئین‌ها از یکدیگر گردد. برای رسوب‌دهی بیشتر از نمک‌هایی چون سولفات آمونیوم استفاده گردید. دراین مطالعه آمونیوم سولفات خشک تا غلظت اشباع 40 درصد بتدریج به نمونه مرحله قبل اضافه شد و به مدت یک شبانه‌روز در یخچال گذاشته، سپس به مدت 20دقیقه و سرعت 10000 گرم سانتریفیوژ شد. در این مرحله مایع رویی را برداشته و سپس آمونیوم سولفات خشک تا غلظت اشباع 50 درصد اضافه کرده و به مدت یک شبانه‌روز روی استیرر در یخچال گذاشته، سپس به مدت 20 دقیقه با سرعت 10000 گرم سانتریفیوژ شد. در این مرحله مایع رویی را برداشته و توسط آمونیوم سولفات خشک به غلظت اشباع 75 درصد رسانده شد. بعد مخلوط را به مدت 20 دقیقه با سرعت 10000 گرم سانتریفیوژ کرده، آنزیم مورد مطالعه در این مرحله رسوب کرد، رسوب در حجم کمی از همان بافر حل و برای دیالیز آماده شد (10). برای این کار ابتدا کیسه دیالیز با آب مقطر چندین مرتبه شسته شد. سپس پنج دقیقه در آب مقطر جوشانده شد و مجدداً چند مرتبه با آب مقطر شسته شدند. نمونه را در کیسه ریخته و در آن محکم بسته شد. سپس برای 72 ساعت در مقابل حجم بالایی از بافر پتاسیم دیالیز گردید. برای دیالیز بهتر چندین مرتبه بافر دیالیز تعویض شد. بعد از اتمام کار کیسه مجدداً شسته شده و درون اتانول 12 درصد در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگه‌داری شد. لازم به ذکر است که کیسه‌های دیالیز مورد استفاده در کل مراحل تخلیص، دارای قطر منافذ 10 کیلو دالتون بودند (7).

سنجش فعالیت آنزیم آلدوز ردوکتاز: اساس سنجش فعالیت ردوکتازی آنزیم بدین‌صورت است که NADPH توسط آنزیم به +NADP تبدیل می‌شود. لذا با توجه به کاهش جذب در 340 نانومتر فعالیت آنزیم سنجیده می‌شود (9). در سنجش آنزیمی از دستگاه اسپکتروفتومتری استفاده شد. جهت انجام سنجش فعالیت آنزیم از گلیسرآلدهید با غلظت 1/0 میلی مولار و NADPH با غلظت 6/0 میلی مولار و بافر فسفات 500 میلی مولار با 2/6=pH استفاده شد. و سپس محلول آنزیمی به سل حاوی مواد ذکرشده اضافه گردید و تغییرات در مقابل زمان در چند دقیقه اول مشاهده و ثبت شد. جهت بررسی درستی نتایج به‌دست‌آمده در سنجش فعالیت آنزیم در تستی دیگری آنزیم از مواد ذکر شده حذف شد که طبق انتظار این تغییر باعث شد هیچ‌گونه تغییری در جذب دیده نشود و در تستی دیگر سوبسترا یعنی گلیسرآلدهید حذف شد که در نتیجه‌ی این حذف نیز تغییر جذب به صفر رسید (16).

بررسی اثر مهاری عصاره، فراکسیون‌های مختلف و داروهای ضد دیابتی بر فعالیت آنزیم آلدوز ردوکتاز و تعیین IC50: جهت بررسی قدرت مهاری ترکیبات، در حضور غلظتهای اشباع از هر دو سوبسترای گلیسرآلدهید (100میکرولیتر) و NADPH  (100 میکرولیتر) و رقت‌های مختلف (1/0 – 005/0 میلی‌گرم/ میلی‌لیتر) از ترکیبات، عصاره و فراکسیون‌های مختلف گیاه با آنزیم (100میکرولیتر) مجاور شد و فعالیت آنزیم در مقایسه با کنترل که فاقد مهار‌کننده بود با سه بار تکرار اندازه‌گیری شد و به‌وسیله‌ی رسم نمودار غلظتی که 50 درصد فعالیت آنزیم را مهار می‌کرد مقدار IC50 مشخص شد.

تعیین نوع مهار توسط فراکسیون اتیل استاتی: IC50به‌دست‌آمده برای فراکسیون اتیل استاتی را به‌صورت ثابت در نظر گرفته و سپس یک‌بار غلظت افزایشی (1-1/0 میلی مولار) NADPH در حضور غلظت اشباع گلیسرآلدهید (1/0 میلی مولار) و یک‌بار از غلظت افزایشی گلیسرآلدهید (1- 1/0 میلی مولار) در حضور غلظت اشباع NADPH (6/0میلی مولار) فعالیت آنزیم محاسبه شد.

آنالیزهای آماری: آنالیزهای آماری با استفاده از آزمونt تست انجام شدند. تمامی داده‌ها به‌صورت میانگین±SD بیان شدند. داده‌ها زمانی معنی‌دار بودند که 05/0P <  به دست آمد.

نتایج

تعیینمحتوایکلفنولوفلاونوییدعصارهتامو فراکسیون‌ها: میزان محتوای کلی ترکیبات فنولی و فلاوونوییدی در عصاره و فراکسیون‌های مختلف گیاه Gundelia tournefortii معادل میزان میلی‌گرم گالیک اسید (به‌عنوان فنولیک استاندارد) و کاتچین (به‌عنوان فلاوونوئید استاندارد) در گرم ماده خشک عصاره و فراکسیون‌های گیاه بیان شده است. درمیان این فراکسیون‌ها و عصاره هیدروالکلی، فراکسیون اتیل استاتی بیشترین مقدار ترکیبات فنول و فلاونوئید را با 20/303 میلی‌گرم گالیک اسید به ازای هرگرم از فراکسیون خشک شده و 84/335 میلی‌گرم کاتچین معادل هر گرم از فراکسیون خشک شده را به ترتیب نشان می‌دهد (جدول 1).


 

جدول 1- تعیین محتوای فنولی و فلاونوئیدی عصاره تام و فراکسیون‌های مختلف گیاه کنگر

مقدار کل ترکیبات فلاوونوییدی b

(میلی‌گرم کاتچین معادل گرم وزن خشک گیاه)

مقدار کل ترکیبات فنولی

(میلی‌گرم گالیک اسید معادل گرم وزن خشک گیاه)

نمونه

06/1± 82/21

31/1 ± 2/107

عصاره تام

59/1± 0/22

83/0 ± 15/74

فراکسیون دی اتیل اتر

7/4±2/303

47/3± 84/335

فراکسیون اتیل استات

53/0±7/11

71/0± 08/95

فراکسیون آبی

نتایج میانگین سه آزمایش مستقل ± SD می‌باشد.


فعالیتجمع‌آوریکنندگیرادیکالهایDPPH:پایه و اساس این روش این است که رادیکال DPPH به‌عنوان پذیرنده الکترون از یک مولکول دهنده مانند آنتی‌اکسیدان عمل می‌کند که در نتیجه آن DPPH به DPPH2 تبدیل می‌شود در این حالت رنگ بنفش محیط به رنگ زرد تبدیل می‌شود بنابراین شدت جذب در 515 نانومتر کاهش می‌یابد. ازروی اندازه‌گیری کاهش شدت جذب به وسیله طیف‌سنجی می‌توان به خصوصیات آنتی‌اکسیدانی آن پی برد. همان‌طور که در جدول 2 مشاهده می‌شود فراکسیون اتیل استاتی در بین همه فراکسیون‌ها بیشترین میزان جمع‌آوری‌کنندگی رادیکال‌هایDPPH  را دارد. در بین داروهای ضد دیابتی گلی‌کلازید بیشترین درصد مهار DPPH را دارا می‌باشد که قابل‌مقایسه با فراکسیون اتیل استاتی و ویتامین ث می‌باشد. در زمان انجام این آزمایش به‌محض اضافه کردن گلی‌کلازید رنگ DPPH از بنفش به زرد تغییر کرد که نشانگر قدرت بالای آنتی اکسیدانی گلی‌کلازید می‌باشد.

محاسبه‌ی فعالیت آنزیم آلدوز ردوکتاز: جهت انجام این تست، ابتدا آنزیم تخلیص گردید، مراحل تخلیص جزئی آنزیم آلدوز ردوکتاز طبق روش ذکر شده انجام شد. سپس آنزیم به روش لوری در سال 1951 (15) تعیین غلظت گردید تا بتوان از این طریق فعالیت آنزیم را محاسبه نمود. فعالیت آنزیم با استفاده از نتایج به‌دست‌آمده با سه بار تکرار به شرح زیر بود: 

فعالیت آنزیم  = 2966/0 ± 020/0 mU

تعیین مقدار IC50 عصاره تام، فراکسیون‌های مختلف و داروهای ضد دیابتی برای مهار آنزیم آلدوز ردوکتاز: همانطور که در جدول 3 نشان داده شده است در بین عصاره تام و فراکسیون‌های مختلف گیاه کنگر، فراکسیون اتیل‌استاتی با IC50 mg/ml 019/0 بیشترین اثرات مهاری را روی فعالیت آلدوز ردوکتاز نشان داد. همه داروهای ضد دیابتی اثرات بسیار کمی را نسبت به گیاه‌نشان دادند. به همین علت آزمایشات در مورد داروها دراین مرحله متوقف شد. از شواهد به دست آمده می‌توان این نتیجه را گرفت که این داروها بر مکانیسم‌های دیگر دیابت مؤثر هستند و از آن طریق موجب جلوگیری از عوارض دیابت می‌شوند به دلیل اینکه فراکسیون اتیل استاتی دارای بیشترین محتوای فنولی و بیشترین قدرت جمع‌‌آوری کنندگیDPPH  و کم‌ترین IC50 می‌باشد، جهت بررسی مکانیسم مهاری در مابقی آزمایشات، فقط فراکسیون اتیل استاتی مورد بررسی قرارگرفت.

تعیین نوع مهار آلدوز ردوکتاز توسط فراکسیون اتیل‌استاتی: نوع مهار با سوبسترای گلیسرآلدهید: نتایج نشان داد که در حضور غلظت ثابت از مهارکننده، افزایش غلظت گلیسرآلدهید نتوانست بر مهار آنزیم فایق آید و فعالیت آنزیم افزایش مجدد نشان داد. بنابراین مهار آلدوز ردوکتاز توسط فراکسیون اتیل‌استاتی از نوع غیررقابتی می‌باشد (جدول 4).

 

جدول 2- فعالیت آنتی‌اکسیدانی غلظت‌های مختلف فراکسیون‌های مختلف گیاه کنگر (μg/ml 200-50)در جمع‌آوری و خنثی کردن رادیکال‌های DPPH.

فعالیت جمع کنندگی رادیکال‌های DPPH (درصد مهار)

IC50 (µg/ml)

غلظت‌ها (µg/ml)

نوع

فراکسیون

 

200

100

50

204 ±1/3

49.3 ± 1/2

23.7 ± 1.7

1/12 ± 9/1

فراکسیون دی اتیل اتر

5<

8/94 ± 4/2

2/93 ± 2/4

91.7 ± 1/1

فراکسیون اتیل استات

367±5/3

4/26 ± 0/2

5/11 ± 5/0

6/4 ± 2/0

فراکسیون آبی

2/11±1/1

85/89 ± 1/1

-

62/86± 3/2

گلی کلازید

870±1/15

79/10 ± 0/1

-

09/0±  01/0

آکاربوز

-

2/1 ± 1/0

-

60/8± 1/1

گلی بنکلامید

-

02/2± 4/0

-

34/11± 1/2

پیوگلیتازون

5/3 ±8/1

-

-

-

ویتامین ث

نتایج میانگین 3 آزمایش مستقل ± SD می‌باشد

 

جدول 3- مقایسه‌ی IC50 های عصاره تام، فراکسیونهای مختلف گیاه کنگر و تعدادی از داروهای ضد دیابتی برای مهار فعالیت آنزیم آلدوز ردوکتاز

IC50  µg/ml

نمونه

19 ± 1/2

فراکسیون اتیل استاتی

950± 4/15

عصاره تام

1140± 2/21

فراکسیون دی‌تیل‌اتری

1250± 2/12

گلی کلازید

1450± 2/10

آکاربوز

1520±1/35

پیوگلیتازون

2120 ± 2/11

گلی‌بنکلامید

      نتایج میانگین 3 آزمایش مستقل ± SD  می‌باشد

در این نوع مهار، مهارکننده توانایی اتصال به آنزیم آزاد و کمپلکس آنزیم-سوبسترا را دارد. چون مهارکننده به جایگاهی غیر از جایگاه فعال آنزیم متصل می‌شود، بنابراین افزایش غلظت سوبسترا تأثیری در برگشت مهار ندارد و باوجود اینکه کمپلکس آنزیم – سوبسترا در غلظت بالا تشکیل شده است، افزایش تولید محصول را نخواهیم داشت، زیرا اتصال مهارکننده سبب تغییر ساختمان آنزیم می‌شود. در این نوع مهار Vmax کاهش می‌‌یابد و Kmثابت می‌ماند.

جدول 4- فعالیت آلدوز ردوکتاز[AR2] در حضور غلظت اشباع NADPH [0/6Mm] و غلظت‌های افزایشی گلیسرآلدهید در حضور غلظت mg/ml 019/0 (معادل IC50 ) فراکسیون اتیل استاتی

فراکسیون اتیل‌استاتی(mg/ml)

غلظت گلیسرآلدهید (mM)

فعالیت آلدوز ردوکتاز (mU)

019/0

2/0

89/0  ± 09/0

019/0

5/0

84/0± 02/0

019/0

1

68/0 ± 05/0

نتایج میانگین 3 آزمایش مستقل ± SD می‌باشد

نوع مهار با سوبسترای NADPH: همانطور که در جدول 5 مشاهده می‌شود، در حضور غلظت ثابت از مهارکننده، افزایش غلظت NADPH منجر به برگشت مهار شد. با افزایش غلظت NADPH فعالیت آنزیم افزایش نشان داد. بنابراین مهارکننده با NADPH در رقابت بوده و مهارکننده و NADPH برای اتصال به جایگاه فعال با یکدیگر رقابت می‌کنند. بنابراین با افزایش غلظت سوبسترا اثر مهارکننده کاهش می‌یابد. در این مهار رقابتی Vmax ثابت و Km افزایش می‌یابد.

 

جدول 5- فعالیت آلدوز ردوکتاز [AR2] در حضور غلظت اشباع گلیسرآلدهید[0/1 Mm] و غلظت‌های افزایشی NADPH در حضور غلظت 0/019mg/ml (معادل IC50 ) فراکسیون اتیل استاتی

فراکسیون اتیل‌استاتی(mg/ml)

غلظت NADPH (mM)

فعالیت آلدوز ردوکتاز (mU)

019/0

6/0

52/0± 6/0

019/0

1

10/1± 10/0

019/0

2

02/2± 12/0

نتایج میانگین 3 آزمایش مستقل ± SD می‌باشد

 

بحث و نتیجه‌گیری

کاتاراکت به‌عنوان یکی از ضایعات ایجادشده در دیابت بوده و اساساً بوسیله تجمع Polyol و گلایکه شدن پروتئین‌ها در اپی­تلیوم و فیبرهای عدسی ایجاد می‌شود (8و 20). مسیر پلی‌ال به‌عنوان یکی از مهم‌ترین کاندیدهای علل عوارض مزمن و تأخیری دیابت مطرح می‌شود و همانگونه که بیان شد آنزیم آلدوز ردوکتاز آنزیم کلیدی و محدودکننده‌ی سرعت دراین مسیر محسوب می‌شود و مهار این آنزیم می‌تواند در جلوگیری از شروع یا در کند کردن مسیر پیشرفت عوارض مزمن دیابت نقش زیادی داشته باشد. از طرفی دیگر بین فعالیت آنزیم آلدوز ردوکتاز و استرس اکسیداتیو که از آن به‌عنوان عدم تعادل بین تولید رادیکال‌های آزاد و گونه‌های فعال اکسیژن از یک سو و سیستم دفاع آنتی‌اکسیدانی مقابله کننده با آن یاد می‌شود ارتباط مستقیمی وجود دارد. افزایش فعالیت آلدوز ردوکتاز باعث استرس اکسیداتیو همراه با دیابت در لنز، عصب محیطی و قشر کلیه از طریق از بین بردن آنتی‌اکسیدان‌های غیرآنزیمی عمده، آسکوربات، تائورین و تغییرات مربوط به سطح ردوکس گلوتاتیون می‌شود (17و 18). یکی دیگر از اهداف رادیکال‌های آزاد در بدن تأثیر آنها بر فعالیت آنزیم گلیسرآلدهید3-فسفات دهیدروژناز می‌باشد، این آنزیم یکی از آنزیم‌های مهم مسیر گلیکولیز می‌باشد و تحت تأثیر رادیکال‌های آزاد غیرفعال می‌شود و تحت این شرایط مسیر گلیکولیز متوقف می‌شود. در نتیجه، در افراد دیابتی در شرایط هیپرگلیسمی، گلوکز و مشتقات آن به سمت مسیرهای دیگر اشاره‌شده در مقدمه خواهند رفت و باعث ایجاد مکانیسم‌های مختلف درگیر در عوارض مزمن دیابت خواهند شد (5 و 26). یکی از مهم‌ترین مسیرهای درگیر، مسیر پلی­ال می‌باشد دراین مسیر گلوکزی را که نتوانسته وارد مسیر گلیکولیز شود توسط آنزیم آلدوز ردوکتاز به سوریتول تبدیل مس شود. که تجمع سوربیتول باعث عوارضی مثل کاتاراکت می‌شود. باتوجه به این واقعیات، یکی از استراتژی‌های مهم برای کاهش عوارض مزمن دیابت، استفاده از مهارکننده‌های آنتی اکسیدانی که هم بتواند تولید رادیکال‌های آزاد را در داخل سلول کاهش دهد و متعاقب آن آنزیم گلیسرآلدهید3-فسفات دهیدروژناز و مسیر گلیگولیز مجدداً فعال شود و هم بتواند به‌طور مستقیم آنزیم آلدوزردکتاز را مهار نماید و ازاین طریق مکانیسم پلی‌ال را کاهش دهد می‌باشد. اولین مطالعات جهت مهار آنزیم آلدوز ردوکتاز در دهه‌ی 1960 با بررسیTMG آغاز شد. اما مطالعات و کارآزمایی­های بالینی با مهارکننده‌های سنتتیک تاکنون با موفقیت کمی همراه بوده است (18). لذا، مطالعات جدید در راستای نتایج مطالعه وارما و همکارانش در دهه 1980 با هدف دستیابی به سنتز مشتقاتی که با الگو گرفتن از مهارکننده‌های طبیعی آلدوز ردوکتاز به جهت عوارض کمتر استوار می‌باشند صورت می‌گیرد (12، 27و 28). مهارکننده‌‌های آلدوز ردوکتاز به دو دسته‌ی گیاهی و سنتتیک تقسیم می‌شوند. در این تحقیق به بررسی و مقایسه تعدادی از این ترکیبات سنتزی که در داروخانه‌ها برای درمان بیماری دیابت مورد استفاده قرار می‌گیرند و عصاره و فراکسیونهای مختلف گیاه کنگر به‌عنوان یک گروه از ترکیبات گیاهی پرداخته شد.

در ابتدا، برای بررسی توانایی آنتی اکسیدانی ترکیبات مختلف و عصاره و فراکسیون‌های مختلف گیاه کنگراز تستDPPH  استفاده شد. در تستDPPH، توانایی آنتی‌اکسیدان‌ها در جمع‌آوری رادیکال‌های DPPH طور مستقیمی در ارتباط باقدرت هیدروژن دهندگی(Hydrogen-donating ability) آنهاست (4). همانطور که در نتایج نشان داده شده است در بین فراکسیون‌های مختلف گیاهG. tournefortii ، فراکسیون اتیل استاتی دارای بالاترین پتانسیل جمع‌کنندگی رادیکالهای DPPH است. از طرفی این فراکسیون دارای بیشترین میزان ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی است. باتوجه به توانایی ترکیبات فنولی در انتقال هیدروژن منطقی است که فراکسیون اتیل استاتی بیشترین پتانسیل را در جمع‌آوری این رادیکال‌های آزاد داشته باشد (2). در بین داروهای سنتزی، گلی‌کلازید بیشترین درصد مهار DPPH را دارا می‌باشد که قابل‌مقایسه با فراکسیون اتیل استاتی و ویتامین ث می‌باشد. همان‌طور که بیان شد ویژگی اول مهارکننده­های آنزیمی یعنی خاصیت آنتی‌اکسیدانی به وسیله این ترکیبات و گیاه کنگر مورد تأیید قرارگرفت. در قسمت دوم مطالعه تأثیر فراکسیونهای مؤثر گیاه روی مهار آنزیم مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاکی از تأثیر همه فراکسیون‌های گیاه روی مهار آنزیم آلدوز ردوکتاز ولی با نسبت‌های مختلف داشت. فراکسیون اتیل استاتی با داشتن بیشترین ترکیبات فنولی و فلاوونوییدی و بالاترین خاصیت آنتی­اکسیدانی دارای بیشترین اثرات مهاری بود. به همین دلیل، ادامه مطالعات به بررسی مکانیسم اثرات مهاری این فراکسیون محدود شد. در بین داروها، هیچکدام اثر قابل‌توجه و معناداری را روی مهار آنزیم از خود نشان ندادند.

تحقیقات مختلف در ارتباط با آنزیم آلدوز ردوکتاز نشان داده است که مکانیسم عمل آنزیم در احیاء آلدهیدها به کمک اتصال به NADPH و سوبسترا انجام می‌شود، اتصال به NADPH باعث ایجاد یک تغییر ساختاری در جایگاه فعال آنزیم می‌شود. سپس با انتقال هیدروژن NADPH به کربن کربونیل سوبسترا الکل تولید می‌شود، بعد از الکل تغییر ساختمانی دیگری در آنزیم به منظور آزادسازی NADP+انجام می‌شود (13). همانطور که در بخش نتایج مشاهده شد فراکسیون اتیل‌استاتی دارای مهار رقابتی با NADPH می‌باشد و باتوجه به مطالعات انجام‌شده و آزمایشات به عمل آمده مشخص شد که این فراکسیون دارای بیشترین محتوای ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی می‌باشد. از طرفی دیگر، مطالعات مختلف نشان داده است که ترکیبات فلاوونوییدی اثرات مهاری شدیدی را در فعالیت آنزیم آلدوز ردوکتاز دارند. احتمال داده شده است که ترکیبات فنولی به‌جای NADPH در جایگاه فعال قرار می‌گیرند و مانع از انتقال هیدروژن از NADPH به سوبسترا می‌شوند و از این طریق آنزیم آلدوز ردوکتاز غیرفعال می‌شود و مسیر پلی‌ال پیشروی نمی‌کند (25). از طرفی دیگر، بررسی حاضر مشخص نمود که نوع مهار آنزیم آلدوزردوکتاز بوسیله‌ی فراکسیون اتیل استاتی کنگر در کنار مهار رقابتی با NADPH، مهار غیررقابتی با گلیسرآلدهید را نیز نشان می‌دهد. باتوجه به اینکه عوارض ناشی از فعالیت افزایش‌یافته مسیر پلی‌ال مربوط به شرایط هایپرگلیسمی می‌باشد و قندها به‌عنوان سوبسترای اصلی آلدوز ردوکتاز می‌باشند، این مهار غیررقابتی با گلیسرآلدهید یک مزیت برای این مهارکننده محسوب می‌شود زیرا حتی با افزایش شدیدتر قند خون این اثر مهاری برنمی‌گردد. در بین مهارکننده‌های آلدوز ردوکتاز نیز، مهارکننده‌های مؤثرتر مهارکننده‌های غیررقابتی بوده‌اند، روتین یک بیوفلاونویید طبیعی و مشتقاتی از تری آزولیدین دیون به‌عنوان مهارکننده‌های غیررقابتی مؤثر برای آلدوز ردوکتاز شناسایی شد (13و 14).

به‌طور کلی، تحلیل نتایج حاضر دو نتیجه‌گیری جالب را در پی داشت :1) عصاره و فراکسیونهای گیاهی با داشتن بیشترین ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی دارای خاصیت آنتی اکسیدانی قویتری هستند 2) ارتباط مستقیمی بین توانایی آنتی اکسیدانی و مهار مکانیسم‌های ایجاد دیابت وجود دارد ولی این مطلب بدان معنی نیست که همه ترکیبات آنتی اکسیدانی دارای اثرات مهاری روی آنزیم آلدوزردوکتار می‌باشند همانطور که داروهای ضد دیابتی مورد مطالعه قرارگرفته در این تحقیق باوجود ویژگی آنتی اکسیدانی قوی، فاقد اثرات مهاری قابل‌توجهی بودند.

سپاسگزاری

نویسندگان از معاونت پژوهشی دانشگاه لرستان که با حمایت مالی امکان انجام این تحقیق را فراهم آورده‌اند تقدیر و تشکر به عمل می‌آورند.

1-      کاروی، ع.، شاهانی پور، ک.، و منجمی، ر.، 1396. مقایسه اثر آنتی اکسیدانی و سیتوتوکسیک عصاره‌های آبی و هیدروالکلی گیاه سداب  (Ruta graveolens)بر رده سلولی سرطان پروستات (DU145)، مجله پژوهشهای جانوری، جلد 30، شماره 3، صفحات 335-345.

2-      خسروی، م.، خاکپور، ش.، جعفری مرندی، س.، و احدی عالی، م.، 1394. اثر ضدالتهابی اسانس مریم‌گلی
(Salvia officinalis L) درموش کوچک آزمایشگاهی نر، مجله پژوهشهای جانوری، جلد 28، شماره 2، صفحات 154-160.

 

3-      Bahramikia, S., Yazdanparast, R., and Ardestani, A., 2009. Protective effects of some Iranian medicinal plants against free radical-mediated protein oxidation. Food. Chem, 115, PP: 37-42.

4-      Blois, M. S., 1958. Antioxidant determination by the use of a stable free radical. Nature 181, PP: 1199-1200.

5-      Brownlee, M., 2001. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications. Nature, 414, PP: 813–820.

6-      Coruh, N., Sag hdicog lu Celep, A. G., Ozgpkce, F., and Iscan, M., 2007. Antioxidant capacities of G. Tournefortii L. extracts and inhibition on glutathione-s-transferase activity. Food. Chem, 100, PP: 1249-1253.

7-      Dunn, M. J., 1992. Protein determination of total protein concentration, in protein purification methods. S. Angel , Editor, Oxford.

8-      Egerman, R. L., and Kern, T. S., 1993. Aldose reductase inhibition fails to prevent retinopathy in diabetic gogoctosemic dogs. Diabetes, 42(6), PP: 820-825

9-      Hamdan, I. I., and Afifi, F. U., 2004. Studies on the in vitro and in vivo hypoglycemic activities of some medicinal plants used in treatment of diabetes in Jordanian traditional medicine. J. Ethnopharmacol, 93, PP: 117-121.

10-   Hayman, S., and Kinoshita, J. H., 1946. Isolation and properties of Lens Aldose Reductase, J Biol chem, 204, PP: 877-882.

11-   Jamshidzadeh, A., Fereidooni, F., and Salehi Niknahad, H., 2005. Hepatoprotective activity of Gundelia tourenfortii. J. Ethnopharmacol, 101, PP: 233-237.

12-   Kato, A., 2008. Protective effects of dietary chamomile tea on diabetic complications.  Food. Chem, 56 (17), PP: 8206- 8211.

13-   Kim, J. K., 2011. Inhibition of aldose reductase by phenylethanoid glycoside isolated from the seeds of Paulownia coreana. Biol Pharm Bull, 34(1), PP: 160-163.

14-   Lee, Y. S., 2005. Inhibitory effects of isorhamnetin-3-O-beta-D-glucoside from Salicornia herbacea on rat lens aldose reductase and sorbitol accumulation in streptozotocin-induced diabetic rat tissues. Biol Pharm Bull, 28(5), PP: 916-918.

15-   Lee, Y. S., Kim, S. H., Jung, S. H., Kim, J. K., Pan, C. H., and Lim, S. S., 2010. Aldose reductase inhibitory compounds from Glycyrrhiza uralensis. Biol Pharm Bull, 33(5), PP: 917-921.

16-   Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., and Far, A. L., 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem, 193, PP: 265-275.

17-   Obrosova, I. G., 2002. How does glucose generate oxidative stress in peripheral nerve, Int Rev Neurobiol, 50, PP: 33-35.

18-   Obrosova, I. G., 2005. Increased sorbitol pathway activity generates oxidative stress in tissue sites for diabetic complications. Antioxid Redox Signal, 7(11-12), PP: 1543-1552.

19-   Obrosova, I. G., Chung, S. S., and Kador, P. F., 2010. Diabetic cataracts: mechanisms and management. Diabetes Metab Res Rev, 26(3), PP: 172-180.

20-   Pfeifer, M. A., and Schumer, M. P., 1997. Aldose reductase inhibitors: the end of an era or the need for different trial designs, Diabetes, 46 Suppl 2, PP: S82-9.

21-   Raskin, P., Rosenstock, J., 1987. Aldose reductase inhibitors and diabetic complications. Am J Med 83(2)PP: 298-306.

22-   Rosen, P., Nawroth, P. P., King, G., Moller, W., Tritschlev, H. J., and Packer, L., 2001. The role of oxidative stress in the onset and progression of diabetes and its complication. Diabetes, Metab, Res, Rev, 17, PP: 189-212.

23-   Sarper, F., Akadin, G., Simsek, I., and Yesildad, E., 2009. An ethnobotanical field survey in the haymana district of Ankara Province in Turkey. Turk. J Biol, 33, PP: 79-88.

24-   Slinkard, J., and Singleton, V. L., 1977. Total phenol analysis: automation and comparison with manual methods. Am. J. Enol. Viticult, 28, PP: 49-55.

25-   Tang, W. H., Martin, K. A., and Hwa, J., 2012. Aldose reductase, oxidative stress, and diabetic mellitus. Front Pharmacol, 3, PP: 1-8.

26-   Tripath, B. K., and Srivastava, A. K., 2006. Diabetes mellitus: complications and therapeutics. Med Sci Monit, PP: 130-147.

27-   Varma, S. D., and Kinoshita, J. H., 1976. Inhibition of lens aldose reductase by flavonoids - their possible role in the prevention of diabetic cataracts. Biochem Pharmacol, 25(22), PP: 2505-2513.

28-   Varma, S. D., and Mizuno, A., 1977. Diabetic cataracts and flavonoids. Science, 195(4274), PP: 205-206.

29-   Yabe-Nishimura, C., 1998. Aldose reductase in glucose toxicity: a potential target for the prevention of diabetic complications. Pharmacol Rev, 50(1), PP: 21-33.

30-   Yoon, H. N., Lee, M. Y., Kim, J. K., Suh, H. W., and Lim, S. S., 2013. Aldose reductase inhibitory compounds from Xanthium strumarium. Arch Pharm Res, 36(9), PP: 1090-1095.

31-   Zhishen, J., Mengcheng, T., and Jianming, W., 1999. The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals. Food. Chem, 64, PP: 555-559.