مجله پژوهشهای جانوری (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)

بررسی مورفولوژی و فراوانی سلول های خونی عقرب Mesobuthus eupeus (Scorpiones: Buthidae)

نوع مقاله : مقاله کوتاه

نویسندگان

1 1- موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی شعبه جنوب غرب- اهواز، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی, ایران

2 موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی شعبه جنوب غرب- اهواز، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، ایران.

چکیده

سلول‌های خونی شاخص مهم ایمنی بندپایان در برابر بیمارگرها و پارازیتوئیدها می‌باشند. با شناخت دقیق سلولهای خونی و واکنش آنها در برابر عوامل بیگانه ای که به همولنف وارد می‌شوند، بهتر می‌توان جنبه های دفاع سلولی حشره را بررسی کرد. با توجه به تحقیقات بسیار اندک در بیولوژی عقر‌ب‌ها در این تحقیق، سلول‌های خونی مزوبوتوس اپئوس با استفاده از میکروسکوپ نوری مورد مطالعه قرار گرفت. پنج نوع هموسیت در عقرب مزوبوتوس اپئوس شناسایی شد که شامل پروهموسیت‌ها، گرانولوسیت‌ها، پلاسموتوسیت‌ها، ائونوسیت‌ها و اسفرولوسیت‌ها بودند. شمارش تفرقی سلول‌های خونی نشان داد که پلاسموسیت‌ها 2/70% - 2/81% و گرانولوسیت‌ها 6/18% -7/29% بیشترین و ائونوسیت‌ها 2٪ و اسفرولوسیت‌ها 3٪ کمترین فراوانی را نسبت به سایر سلول ها داشتند. سلول‌های پروهموسیت با 5/5-7 میکرومتر کوچکترین و پلاسموسیت‌ها (75/22-5/12میکرومتر) بزرگترین سلول‌های همولنف عقرب مزبوتوس اپئوس گزارش شدند. شناخت سلولهای خونی این عقرب برای اولین بار انجام شده است و فراوانی بالای سلول‌های پلاسموسیت‌ها و گرانولوسیت‌ها می‌تواند زمینه مطالعه ایمنی این عقرب را در برابر عوامل پاتوژن و مقاومت آن در برابر شرایط محیطی آن فراهم کند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Study on morphology and abundance of hemocytes in Mesobuthus eupeus (Scorpiones: Buthidae)

نویسندگان [English]

  • Hedieh Jafari 1
  • Behzad Masihipour 2
  • Alireza Forouzan 2

1 استادیار انگل شناسی, بخش جانوران سمی, موسسه تحقیقت واکسن و سرم سازی رازی شعبه جنوب غرب

2 Razi Vaccine & Serum Research Institute, Ahvaz, Agriculture Research, Education and Extension Organization (AREEO).

چکیده [English]

Arthropoda hemocytes are an important indicator of the safety of arthropoda against pathogens and parasitoids. Morphological characterization of hemocytes, is the first step to investigate the involvement of hemocytes in scorpion immunity and specific functions of cells. Due to limited researches on the biology of scorpion in this research the hemocytes of Mesobuthus eupeus were examined using light microscopy. Giemsa staining was used to identify these cells. Five identified types of hemocytes in this scorpion were; Prohemocyte, plasmatocyte granulocytes, spherulocytes, and oenocytoids. Two cell types are very common, plasmatocytes and granulocytes, Plasmatocytes constitute 70.2–81.2%, followed by granulocytes with 18.6–29.7% of the total cell population. Prohomocyte with 5-7 μm was the smallest and plasmocytes (12.25- 75.2 μm) were reported to be the largest hemolymph of Mesobuthus eupeus. Identification of blood cells of this scorpion for the first time and can provide a study of the immunity of scorpion against pathogens and its resistance to environmental conditions

کلیدواژه‌ها [English]

  • scorpion
  • Mesobuthus eupeus
  • hemocyte

بررسی ریخت‌شناسی و فراوانی سلول­های خونی عقربMesobuthus eupeus (Scorpiones, Buthidae)

هدیه جعفری*، بهزاد مسیحی پور و علیرضا فروزان

ایران، اهواز، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، موسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی شعبه جنوب غرب اهواز

تاریخ دریافت: 19/1/97                تاریخ پذیرش: 25/10/97

چکیده

سلول­های خونی شاخص مهم ایمنی بندپایان در برابر بیمارگرها و پارازیتوئیدها می­باشند. با شناخت دقیق سلولهای خونی و واکنش آنها در برابر عوامل بیگانه‌ای که به همولنف وارد می­شوند، بهتر می­توان جنبه‌های دفاع سلولی حشره را بررسی کرد. باتوجه به تحقیقات بسیار اندک در بیولوژی عقرب­ها دراین تحقیق، سلول­های خونی مزوبوتوس اپئوس با استفاده از میکروسکوپ نوری موردمطالعه قرارگرفت. پنج نوع هموسیت در عقرب مزوبوتوس اپئوس شناسایی شد که شامل پروهموسیت­ها، گرانولوسیت­ها، پلاسموتوسیت­ها، ائونوسیت­ها و اسفرولوسیت­ها بودند. شمارش تفرقی سلول­های خونی نشان داد که پلاسموسیت­ها 2/70% - 2/81% و گرانولوسیت­ها 6/18% -7/29% بیشترین و ائونوسیت­ها 2 درصد و اسفرولوسیت­ها 3 درصد کمترین فراوانی را نسبت به سایر سلول‌ها داشتند. سلول­های پروهموسیت با 5/5-7 میکرومتر کوچکترین و پلاسموسیت­ها (75/22-5/12میکرومتر) بزرگترین سلول­های همولنف عقرب مزبوتوس اپئوس گزارش شدند. شناخت سلولهای خونی این عقرب برای اولین بار انجام‌شده است و فراوانی بالای سلول­های پلاسموسیت­ها و گرانولوسیت­ها می­تواند زمینه مطالعه ایمنی این عقرب را در برابر عوامل پاتوژن و مقاومت آن در برابر شرایط محیطی آن فراهم کند.

واژه‌های کلیدی: عقرب، مزوبوتوس اپئوس، سلولهای همولنف

* نویسنده مسئول، تلفن: 09168023711، پست الکترونیکی: hedieh­_jafari@yahoo.com

مقدمه

 

عقرب­ها ازجمله بندپایان سمی می­باشند که از اواخر دوره سیلورین بر روی کره زمین می­زیستند و به‌عنوان فسیل زنده یاد می­شوند. به دلیل بالا بودن طول عمر و مقاومت به شرایط متفاوت زیستی مانند تغییرات دمایی، گرسنگی و تغییرپذیری اندک ریخت‌شناسی نمونه­های مناسبی جهت بررسی در شاخه­های مختلف علوم زیستی، از فیزیولوژی تا اکولوژی تکاملی هستند. براساس ویژگی‌های ریخت‌شناسی، عملکرد و نوع فعالیت، چندین نوع سلول خونی در بندپایان شناسایی شده‌اند (1و 9). که به‌آسانی توسط میکروسکوپ نوری و فلورسنت قابل‌شناسایی می‌باشند (11و 12) سلول‌های خونی در بندپایان شامل پروهموسیت­ها، گرانولوسیت­ها، پلاسموتوسیت­ها و اوئنوسیت­ها اسفرولوسیت­ها و سیانوسیدها هستند. سیستم ایمنی بندپایان یک سیستم ایمنی ذاتی است که بیشتر با تکیه‌بر واکنش‌های سلولی (مانند فاگوسیتوز، انکپسولاسیون و ندولاسیون) همراه است (2و 3). عوامل بیماریزای در بندپایان مانند باکتری­ها، اسپور قارچ‌های بیماری‌زا و یا نماتدها به داخل همولنف بر شکل و تعداد سلول‌های خونی تأثیر دارد. این تغییرات ریختی سلول‌های خونی و همچنین تغییر در تعداد آنها در فواصل مختلف پس از ورود، در راستای ایمنی سلولی یعنی بیگانه‌خواری و گره زایی صورت می‌گیرد (15). همچنین ریخت‌شناسی و سلول‌ها در مراحل رشدی یک‌گونه نیز تفاوت‌هایی نشان می‌دهد که به عوامل مختلفی مانند سن، جنسیت، گرسنگی، پوست‌اندازی، دما و استرس‌های محیطی، وابسته است (17 و 18).

در عقرب‌ها، سلول­های بنیادی تولیدکننده هموسیت­ها در غدد لنفاوی قدام و جانبی، نزدیک به شریان انسدادی شکمی متمرکز است (4). در بررسی انجام شده سلول­های همولنف عقرب Mesobathus tamulus phipsoni پنج نوع سلول خونی شناسایی شد که به­ترتیب فراوانی شامل سلول­های پلاسموسیت، گرانولوسیت، اسفروسیت، پروهموسیت و ائونوسیت­ها بودند (16). باتوجه به تحقیقات اندک بر فیزیولوژی این بندپا، دراین بررسی سلول­های همولنف عقرب مزوبوتوس اپئوس که دارای پراکندگی وسیعی در سراسر ایران می‌باشد موردبررسی قرارگرفت. به دلیل مقاومت عقرب به شرایط محیطی و زنده­مانی در زیستگاه­های مختلف و تغییرات تکاملی کم، شناخت سلولهای خونی و فراوانی آن­ها در همولنف عقرب می‌تواند تا حدود زیادی روشن‌کننده مقاومت و سازگاری این بندپا به شرایط محیطی و یا عوامل بیگانه مانند باکتری­ها و انگل­ها باشد.

مواد و روشها

به‌منظور شناسـایی سلول‌های خـونی، بااستفاده از سرنگ انسولین از سطح پشتی مزوزومای 10 عقرب مزوبوتوس اپیوس همولنف هر عقرب به‌صورت جداگانه جمع‌آوری شد. مقدار 10 میکرولیتـر از همولنـف را روی یک لام گذاشته و با لام دیگر یک اسمیر تهیه شـد. پـس از خشـک شــدن، رنگ‌آمیزی گیمســا (محلـول 1:9 گیمسـا و آب مقطـر) انجام شد، پـس از گذشـت 20 دقیقـه، لام در آب مقطـر قـرارگرفت تا محلول رنگی شسته شود. انـواع سلول‌های خونی بـاتوجـه بـه منـابع موجـود شناسایی شد (20) .جهت مشاهده و شناسایی سلول‌های خونی از بزرگنمایی 40 میکروسکوپ نوری Olympus BH2 استفاده شد. قطر سلول‌ها بااستفاده از عدسی مجهز به میکرومتری چشمی محاسبه شد.

جهت شمارش کل سلول‌های خـونی، پس از جمع‌آوری همولنف از عقرب مزوبوتوس اپئوس مقـدار 4 میکرولیتر از همولنف در 200 میکرولیتر مـاده ضـد انعقـاد اسیدسیتریک 6/2 مولار، سیترات سدیم 3/0 مولار، کلرید سدیم 45/0 مولار، گلوکز 1/0 مولار و EDTA 1/0 مولار با 6/4pH=  رقیق شد (20). شمارش سلولهای خونی با استفاده از لام نئوبار و بزرگنمــایی 40 میکروســکوپ نــوری انجــام گرفــت. شمارش کل با محاسبه میانگین تعـداد سلول‌های خـونی با استفاده از فرمول جونز 1959 محاسبه شد (6).

تجزیه‌وتحلیل داده‌ها با نرم‌افزار SAS (9.3) انجام شد و مقایسه میانگین­ها با آزمون توکی در سطح احتمال 5 درصد انجام شد.

نتایج

در تحقیق حاضر سلولهای همولنف عقرب مزوبوتوس اپیوس با تمرکز بر ویژگی‌های مورفولوژیکی مورد بررسی قرارگرفت. با استفاده از میکروسکوپ نوری سلولهای همولنف در حال گردش دراین عقرب توصیف شدند (جدول1). دراین مطالعه 5 نوع هموسیت مشاهده شد که عبارت بودند از: پروهموسیت، پلاسماتوسیت، گرانولوسیت، اسفرولوسیت و ائونوسیت. اشکال تقسیم میتوزی نیز در بین پلاسماتوسیت‌ها مشاهده شد. شمارش کل سلول‌ها مشخص شد که پلاسماتوسیت‌ها (2/81%-2/70%) و گرانولوسیت‌ها ( 7/29%- 6/18%) بیشترین فراوانی را به خود اختصاص می­دهند.

پروهموسیت­ها کوچکترین سلول­ موجود در همولنف با فراوانی تقریبی 5 درصد بودند این سلول­ها دارای سیتوپلاسم بازوفیلیک و هسته در موقعیت مرکزی قرارگرفته است (شکل 1-الف). پلاسموسیت­ها بزرگترین و فراوانترین سلول همولنف عقرب مزوبوتوس اپئوس بودند و سیتوپلاسم با چندین شکل مورفولوژیکی دیده شد. دراین سلول هسته تقریباً مرکزی و سیتوپلاسم بازوفیلیک مشاهده شد (شکل 1-ج). گرانولوسیت­ها بعد از پلاسموسیت­ها دارای فراوانی بالایی بودند این سلول­ها دارای سیتوپلاسم گرانوله و اسیدوفیلیک و هسته مرکزی و یا در حاشیه بودند (شکل 1- ب). اسفرولوسیت­ها با فراوانی تقریبی 3 درصد دارای هسته در حاشیه و سیتوپلاسم اسیدوفیلیک دیده شد (شکل 1- د). سلول‌های ائونوسیت­ها دارای کمترین میزلن فراوانی (2%) بودند این سلول­ها دارای سیتوپلاسم بازوفیلیک و موقعیت هسته غالباً در حاشیه گزارش شد (شکل 1- ه).

 

جدول 1- اندازه‌گیری‌های مورفومتریک سلول‌های همولنف عقرب

ماهیت سیتوپلاسم

موقعیت هسته

عرض(میکرومتر)

طول(میکرومتر)

نوع سلول

بازوفیلیک

مرکزی

9-5

7-4

پروهموسیت

بازوفیلیک

غالباً در مرکز

16-9

27-5/18

پلاسموسیت

اسیدوفیلیک

مرکزی یا در حاشیه

12-8

18-12

گرانولوسیت

بازوفیلیک

غالباً در حاشیه

10-8

13-11

ائونوسیت­ها

اسیدوفیلیک

حاشیه

10-8

13-11

اسفروسیت

 

 

شکل 1- سلول‌های همولنف مزوبوتوس اپیوس رنگ‌آمیزی شده با گیمسا. الف- پروهموسیت، ب- گرانولوسیت، ج- پلاسموسیت، د- اسفرلوسیت، ه- ائونوسیت­ها

 

بحث و نتیجه‌گیری

در مطالعه حاضر، سلول‌های خونی مزوبوتوس اپئوس با استفاده از میکروسکوپ نوری بررسی شد. پنج نوع سلول شناسایی شده شامل پروهموسیت­ها، پلاسموتوسیت­ها، گرانولوسیت­ها، اوئنوسیت­ها و اسفرولوسیت­ها بودند. بیشترین و کمترین فراوانی سلول­های همولنف به ترتیب شامل پلاسموسیت، گرانولوسیت، پروهموسیت، اسفرولوسیت و ائونوسیت­ها بود. مطالعات نشان داده است که طبقه‌بندی سلول‌های خونی، در حشرات مختلف و حتی در مراحل زیستی مختلف، متفاوت بود (1).

پروهموسیت­ها کوچک‌ترین سلول‌ها (5/5-7 میکرومتر) با هسته مرکزی و مدور مشاهده شدند که سیتوپلاسم به شکل لایه‌ای نازک به کناره غشای سلول کشیده شده است تقریباً در تمام مطالعات ریخت‌شناسی سلول­های همولنف، پروهموسیت­ها چنین مشخصاتی داشته‌اند و در همولنف همه بندپایان گزارش‌شده‌اند. پلاسموسیت­ها در همولنف اخذ شده عقرب مزوبوتوس اپئوس دارای بزرگترین اندازه (75/22-5/12میکرومتر) و بیشترین فراوانی بودند. این سلول در بندپایان به اشکال متفاوت و نامنظم دیده شده است (13). زوائد سیتوپلاسمی و اشکال نامنظم به دلیل مشارکت این سلول در سیستم دفاعی بندپایان و بیگانه‌خواری عوامل پاتوژن می‌باشد (14).

گرانولوسیت­ها غالباً دایره‌ای شکل (15-10 میکرومتر) با هسته فشرده مشخص مرکزی یا کناری بوده و سطح سیتوپلاسم آنها از گرانول پرشده است. در تحقیق حاضر میزان فراوانی گرانولوسیت­ها بعد از پلاسموسیت­ها گزارش شد. در تحقیقات انجام شده بااستفاده از میکروسکوپ الکترونی بر روی گرانولوسیت­ها وجود دو نوع گرانول ترشحی در سیتوپلاسم این نوع سلول­ها گزارش‌شده است. گرانول­های بزرگ که در ترشح فاکتورهای انعقادی، پروتئین­های قابل انعقاد، کواگولاژن، مهارکننده‌های پروتئیناز، لکتین و پروتئین­های آنتی باکتریال نقش دارند. گرانول­های کوچک دارای پروتئین­های ضد­میکروبی با وزن کمتر از 30 کیلو دالتون می‌باشند (10). فراوانی گرانولوسیت­ها به دلیل شرکت در فرایند دفاعی بندپایان بالا می‌باشد. به دلیل قابلیت تبدیل این سلول­ها به اسفرولوسیت­ها در ذخیره و انتقال هم شرکت دارند (19).

ائونوسیت­ها سلول­های گرد بزرگتر از پروهموسیت­ها ولی کوچکتر از پلاسموسیت­ها و گرانولوسیت­ها (12-9 میکرومتر) با فراوانی 2درصد مشاهده شدند. ائونوسیت­ها یکی از منابع تولید آنزیم فنل اکسیداز، عامل ملانیزاسیون همولنف در بندپایان شناخته شده­اند و در فاگوسیتوز عوامل بیگانه نقش دارند (5و 8). در بررسی ساختار ائونوسیت­ها بااستفاده از میکروسکوپ الکترونی وجود پاهای کاذب بسیار کوچکی مشاهده شد (7).

اسفرولوسیت­ها سلول­هایی با اندازه تقریبی (12-9 میکرومتر) که 3درصد از سلول­های همولنف عقرب مزوبوتوس اپئوس را تشکیل می‌دادند. سطح سیتوپلاسم این سلول­ها دارای اسفرول­های متعددی است نقش این سلول­ها در بندپایان انتقالی است در واکنش­های ایمنی فعالیتی ندارند (13).

در بررسی سلول­های همولنف عقرب مزوبوتوس تامالوس تامالوس میزان فراوانی پلاسموسیت­ها 71-81%، گرانولوسیت 10-31%، اسفرلوسیت 2-4% و ائونوسیت 7-13% گزارش شد (16). ازنظر درصد فراوانی سلول‌های خونی و تنوع سلول­ها با تحقیق حاضر هم­خوانی دارد.

مطالعات بسیار اندکی در مورد سلول­های همولنف در عقرب­ها وجود دارد. با شناخت و بررسی سلول­ها همولنف می­توان جنبه­های ایمنی این بندپا را با توجه به مقاومت بالای آن به شرایط مختلف محیطی و عوامل بیگانه مورد مطالعه قرارداد. در مطالعه حاضر فراوانی بالای سلول‌های دفاعی نظیر پلاسموسیت­ها و گرانولوسیت در همولنف می­تواند نشانگر مقاومت عقرب به شرایط مختلف محیطی باشد.

سپاسگزاری

از حمایت مالی موسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی شعبه جنوب غرب کشور- اهواز تشکر به عمل می‍آید.

1- Brehélin, M., Drif, L., Baud, L., and Boemare, N., 1989. Insect haemolymph: Cooperation between humoral and cellular factors in Locusta migratoria. Insect Biochemistry, 19, PP: 301-307.
2- Cerenius, L., and Söderhäll, K., 2011. Coagulation in invertebrates. Journal of Innate Immunity, 3, PP: 3–8.
3- Cerenius, L., Jiravanichpaisal, P., Liu, H., and Söderhäll, I., 2010. In: Crustacean immunity. In: Söderhäll, K. (Ed.), Invertebrate Immunity. Springer Science Business Media, LLC, New York, PP: 239–253.
4- Farley, R. D., 1984. The ultrastructure of hemocytopoietic organs in the desert scorpion Paruroctonus. Tissue and Cell Journal, 16, PP: 577–588.
5- Fukuzawa, A. H., Vellutini, B. C., Lorenzini, D. M., Silva, P. I.,  Mortara, R. A., da Silva J. M., and Daffre, S., 2008. The role of hemocytes in the immunity of the spider Acanthoscurria gomesiana. Developmental and Comparative Immunology, 32, PP: 716–725.
6- Jones, J. C., 1959. A phase contrast study of the blood cells in Prodenia larvae (Lepidoptera). Quart. Journal of Microbial Science 100, PP: 17–23.
7- Gadelahk, G., 2005. Ultrastructure of hemocytes of the last larval instar of the red palm weevil, Rhynchophorus Ferrugineusoliv. (coleoptera: curculionidae), Alexandria Journal of Agricultural Research, 50 (1), PP: 103 – 110.
8- Giulianini, P. G., Bertolo, F., Battistella, S., and Amirante, G. A., 2003. Ultrastructure of the hemocytes of Cetonischema aeruginosa larvae (Coleoptera: Scarabidae) involvement of both granulocytes and oenocytoids in vivo phagocytosis. Tissue Cell, 35, PP: 243-251.
9- Gupta, A. P., 1985. Cellular elements in the haemolymph. In: Kerkut, G. A., Gilbert, L. I., (Eds.), Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology. Cambridge University Press, PP: 85-127.
10- Iwanaga, S., Lee, B.L., 2005. Recent advances in the innate immunity of invertebrate animals. J Biochemistry Molecular Biology, 38(2), PP: 128–50.
11- Lavine, M. D., and Strand, M. R., 2002. Insect hemocytes and their role in immunity. Insect Biochemistry Molecular and Biology, 32, PP: 1295-1309.
12- Ling, E., and Yu, X., 2006. Hemocytes from the tobacco hornworm Manduca sexta have distinct functions in phagocytosis of foreign particles and self-deadcells. Immunology, 30, PP: 301-309.
13- Liu, F., Xu, Q., Zhang, Q., Lu, A., Beerntsen, B., and Ling, E., 2013. Hemocytes and hematopoiesis in the silkworm, Bombyx mori. Invertebrate Survival Journal, 10, PP: 102-109.
14- Lorenzini, D. M., Silva, J. R., Fogaca, A. C., Bulet, P., and Daffre, S., 2003. Acanthoscurrin: a novel glycine-rich antimicrobial peptide constitutively expressed in the hemocytes of the spider Acanthoscurria gomesiana. Developmental and Comparative Immunology, 27(9), PP: 781–91.
15- Nahla, M., Hanan, Abd El-Aziz, A., and Awad, H., 2010. Changes in the haemocytes of Agrotis ipsilon larvae (Lepidoptera: Noctuidae) in relation to dimilin and Bacillus huringiensis infections. Micron, 41, PP: 203–209.
16- Patil, A., Shah, U., 2011. Types of hemocytes in scorpion Mesobuthus tamulus tamulus. Bioscan, 6, PP: 597–599.
17- Sanjayan, K. P., Ravikumar, T., and Albert, S., 1996. Changes in the haemocyte profile of Spilostethus hospes (Fab.) (Heteroptera: Lygaeidae) in relation to eclosion, sex and mating. Journal of Biochemistry, 21, PP: 781-788.
18- Sharma, P. R., Sharma, O. P., and Saxena, B. P., 2008. Effect of sweet flag rhizome oil (Acorus calamus) on hemogram and ultrastructure of hemocytes of the tobacco armyworm, Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae). Micron, 39, PP: 544-551.
19- Yamashita, M., and Iwabuchi, K., 2001. Bombix mori prohemocytes division and differentiation in individual microcultures. Journal of Insect Physiology, 47, PP: 325-331.
20- Yeager, J., 1945. FThe blood picture of the southern armyworm (Prodenia eridania). Journal of Agricultural Research, 71, PP: 1-40.
مجله پژوهشهای جانوری (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)
دوره 32، شماره 4
دی 1398
صفحه 253-258
  • تاریخ دریافت: 19 فروردین 1397
  • تاریخ بازنگری: 20 آبان 1397
  • تاریخ پذیرش: 25 دی 1397