نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 عضو هیات علمی دانشگاه صنعتی شاهرود

2 دانشگاه صنعتی شاهرود

چکیده

نقش سلول‌های خونی و سیستم فنل اکسیداز در دفاع سلولی حشرات ثابت شده است. تعداد سلول‌های خونی تحت تاثیر هر نوع تنش یا ورود عامل بیگانه به همولنف تغییر می‌کند. حشرات با سامانه ایمنی قوی می‌توانند گاه روند بیماری‌زایی یک عامل بیماری‌زا را تغییر داده و یا متوقف کنند. در این تحقیق، اثر تنش‌های گرسنگی، تنش‌های دمایی و باکتری Bacillus thuringiensis بر دفاع سلولی لارو‌های سن پنجم لیسه سیب بررسی شد. نتایج آزمایش دوره‌های گرسنگی نشان داد که در همولنف لاروهای گرسنه با گذشت زمان به مدت 48 ساعت تفاوت معنی‌داری در تعداد کل سلول‌های خونی، پروهموسیت‌ها، گرانولوسیت‌ها، پلاسموتوسیت‌ها و اونوسیتوئیدها وجود داشت. همچنین میزان فعالیت آنزیم فنل اکسیداز تحت تاثیر تنش گرسنگی 24 ساعت به طور معنی‌داری کاهش یافت و بعد از 48 ساعت گرسنگی روند افزایشی نشان داد. اثر تنش‌های دمایی مختلف بر تعداد سلول‌ها کاملا معنی‌دار بود. به طوریکه تعداد کل و تفرقی سلولها در دمای 35 افزایش و در دمای 4 درجه سانتیگراد کاهش قابل توجهی نشان داد. تغذیه از برگ‌های آلوده به باکتری B. thuringiensis سبب افزایش معنی‌دار تعداد همه‌ سلول‌های خونی و فعالیت فنل اکسیداز شد. این فاکتورها با گذشت زمان تا 24 ساعت به طور معنی-داری کاهش یافتند که نشانگر واکنش مثبت سلول‌های خونی در برابر عامل بیگانه بود. این نتایج می‌تواند به عنوان مقدمه‌ای بر شناخت ویژگی‌های دفاع فیزیولوژیک لیسه سیب تلقی شود و در برنامه‌های کنترل میکروبی مد نظر قرار گیرد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Cellullar defense responses of 5th instar larvae of the apple ermine moth, Yponomeuta malinellus (Lepidoptera: Yponomeutidae) against starvation and termal stresses and Bacillus thuringiensis

نویسنده [English]

  • Maryam Mahmoodzadeh 2

2 shahrood university of technology

چکیده [English]

The role of hemocytes and the phenoloxidase system in insect cell defense has been proven. The number of hemocytes is affected by any type tension or entry foreign agent to the hemolymph. Insects with a strong immune system can sometimes change the pathogenicity of a pathogenic agent or stop it. In this research, the effect of Starvation stresses, the effect of thermal stresses and Bacillus thuringiensis on cell defense of fifth instar larvae of the apple ermine moth, Yponomeuta malinellus Zeller were investigated. The results of the starvation period test showed that there was a significant difference in total hemocyte count, prohemocytes, granulocytes, plasmatocytes, and oenocytoids In the hemolymph of hungry larvae for 48 hours. Also The phenoxoxidase activity was significantly reduced Under the starvation stress 24 hours and after 48 hours starvation showed an increasing trend. the effect of different thermal stresses on The total number of cells was quite significant.. Feeding the infected leaves to bacterium B. thuringiensis significantly increased the total number of hemocytes and the activity of phenoloxidase. These factors decreased significantly over time for up to 24 hours indicating a positive reaction of the blood cells against the foreign agent during the initial hours of entering the hemolymph. These results can be considered as introduction to recognition physiological defense characteristics of the apple ermine moth and to be considered in microbial control programs.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Yponomeuta malinellus
  • Response of Hemocytes
  • Feeding and Temprature
  • Bacillus thuringiensis

واکنش­های دفاع سلولی لارو لیسه سیب در برابر تنش­های گرسنگی، دمایی و باکتری بیماری­زای  Bacillus thuringiensis

مریم عجم حسنی* ومریم محمودزاده

ایران، شاهرود، دانشگاه صنعتی شاهرود

تاریخ دریافت: 15/8/1397            تاریخ پذیرش: 25/10/97

چکیده

نقش سلول­های خونی و سامانه فنل اکسیداز در دفاع سلولی حشرات ثابت شده است. تعداد سلول­های خونی تحت تأثیر هر نوع تنش یا ورود عامل بیگانه به همولنف تغییر می­کند. حشرات با سامانه ایمنی قوی می­توانند گاه روند بیماری­زایی یک عامل بیماری­زا را تغییر داده و یا متوقف کنند. دراین تحقیق، اثر تنش­های گرسنگی، تنش­های دمایی و باکتری Bacillus thuringiensis بر دفاع سلولی لارو­های سن پنجم لیسه سیب بررسی شد. نتایج آزمایش دوره­های گرسنگی نشان داد که در همولنف لاروهای گرسنه باگذشت زمان به مدت 48 ساعت تفاوت معنی­داری در تعداد کل سلول­های خونی، پروهموسیت­ها، گرانولوسیت­ها، پلاسموتوسیت­ها و اونوسیتوئیدها ایجاد شد. همچنین میزان فعالیت آنزیم فنل اکسیداز تحت تأثیر تنش گرسنگی 24 ساعت بطور معنی­داری کاهش یافت و بعد از 48 ساعت گرسنگی روند افزایشی نشان داد. اثر تنش­های دمایی مختلف بر تعداد سلول­ها کاملاً معنی­دار بود. بطوریکه تعداد کل و تفرقی سلول­ها (به‌جز پروهموسیت­ها) در دمای 35 افزایش و در دمای 4 درجه سلسیوس کاهش قابل‌توجهی نشان داد. فعالیت سامانه فنل اکسیداز بطور بارزی تحت تنش­های گرما و سرما کاهش یافت. تغذیه از برگ­های آلوده به باکتری B. thuringiensis سبب افزایش معنی­دار تعداد همه­ سلول­های خونی و فعالیت آنزیم فنل اکسیداز شد. این عوامل باگذشت زمان تا 24 ساعت بطور معنی­داری کاهش یافتند که نشانگر واکنش مثبت سلول­های خونی در برابر عامل بیگانه بود. این نتایج می­تواند به‌عنوان مقدمه­ای برای شناخت ویژگی­های دفاع فیزیولوژیک لیسه سیب استفاده شود و در برنامه­های کنترل میکروبی مدنظر قرارگیرد.

واژه‌های کلیدی: لیسه سیب، واکنش سلول­های خونی، تغذیه و دما، باکتری Bacillus thuringiensis

* نویسنده مسئول، تلفن: 0915502227، پست الکترونیکی: shahroodm@gmail.com

مقدمه

 

لیسه سیب (Lepidoptera: Yponomeutidae) Zeller Yponomeuta malinellus، آفتی مونوفاژ، تک نسلی و برگ‌خوار درختان سیب می­باشد که در سراسر مناطق معتدله پالئارکتیک پراکنده است (34). لیسه سیب مخصوص مناطق سردسیر کوهستانی بوده (9) و رایج­ترین میزبان­های آن گونه­های سیب و گلابی گزارش شده است (34و 40). لاروهای آفت بسیار پرخوار بوده و بطور دسته‌جمعی از بافت­های بین رگبرگ­های، برگ­های میزبان تغذیه می­کنند. لارو­ها ضمن تغذیه اقدام به تنیدن تار­های ابریشمی کرده و بدین وسیله برگ­ها و سرشاخه­ها را به هم می­چسبانند (9). در تحقیقی پارازیتیسم لیسه سیب توسط چند زنبور از خانواده Braconidae و Ichneumonidae در ترکیه مورد مطالعه قرارگرفت. براساس نتایج، زنبور (Gravenhorst) (Hymenoptera: Ichneumonidae) Diadegma armillatum بیشترین تأثیر را در انگلی کردن لارو­های لیسه سیب نشان داد (36). در مطالعه­ای که توسط اسلامی در سال 1379 جهت ارزیابی کاربرد سموم میکروبی بر پایهBacillus thuringiensis به‌منظور مبارزه با آفت لیسه درختان سیب انجام گرفت، نتایج آزمایش نشان داد که مرگ‌ومیر ناشی از سم‌پاشی در مورد تمام دوز­های مصرفی B.t صد در صد بوده است (1). جواد زاده و همکاران نیز تأثیر فرآورده داخلی B.t در کنترل لیسه سیب را در سال 1391 موردبررسی قراردادند (3). در مناطق باسابقه آلودگی بالا می­توان با استفاده از ترکیبات فسفره متداول آفت را کنترل کرد. همچنین استفاده از ترکیبات ساخته شده براساس هورمون­های تنظیم‌کننده رشد حشرات (IGR) نیز از دیگر موارد کنترل آفت است (9).

براساس ویژگی‌های ریخت‌شناسی، عملکرد و شیمی بافت، پنج نوع سلول خونی در بالپولک­داران شناسایی شده‌ است که شامل پروهموسیت­ها، پلاسموتوسیت­ها، گرانولوسیت­ها، اونوسیتوئید­ها و اسفرولوسیت­ها می­باشند (48). جلالی و صالحی در سال 2008، بامطالعه‌ی سلول‌های خونی پروانه‌ی برگ‌خوار مرکبات Papillio demoleus L. (Lepidoptera: Papilionidae) بوسیله‌‌ی میکروسکوپ الکترونی، پنج نوع سلول خونی شناسایی کردند (28). نتایج مشابهی برای دیگر لارو‌های بالپولک‌داران مانند بید کلم Plutella xylostella (Linnaeus) (Lepidoptera: Plutellidae) (27)، شب‌پره خرنوب Ectomoyelois ceratoniae (Zeller) (Lepidoptera: Pyralidae)(4)، پروانه کرم ابریشم Bombyx mori (Linnaeus) (Lepidoptera: Bombycidae) (49)، پروانه برگخوار سفید اشجار Hyphantria cunea (Drury) (12) و لارو بید سیب‌زمینی Phthorimaea  operculella (42) گزارش شده است. دفاع سلولی با مشارکت انواع سلول­های خونی و فعالیت آنزیم فنل اکسیداز همراه است که تابع عوامل مختلفی مانند تغییرات دما، نوع تغذیه، ورود انواع آلودگی­ها و ... می­باشد (47). درواقع پاسخ ایمنی حشرات شاخص مهم حساسیت آن­ها به انواع آلودگی‌های ناشی از هجوم عوامل بیگانه مانند اسپور قارچ­ها و باکتری­ها، سموم، دیاپوز، پوست‌اندازی، تنش­های گرسنگی، محیطی، تغییر رژیم غذایی و حتی جنسیت است (52). این موضوع علاوه بر حشرات در مورد اکثر گروه­های جانوران مانند ماهی­ها نیز گزارش شده است (5و 10). نقش دما در زندگی حشرات به خوبی شناخته شده است (19، 44و 46). دما ممکن است تأثیرات زیادی بر همولنف داشته باشد که شامل تأثیر بر مورفولوژی و فراوانی سلول­های خونی و عملکرد آن­ها می­باشد (43). همانطور که حرارت­های پایین و بالا یکی از منابع استرس برای حشرات هستند، ممکن است که تعداد هموسیت­ها بطور مستقیم توسط تغییر در درجه حرارت تغییر کند. بعلاوه تغذیه به‌عنوان یک عامل حیاتی در دفاع سلولی و مقاومت در برابر عوامل بیماری‌زا شناخته شده است (31، 41و 50). مطالعات نشان داده است که محرومیت مواد غذایی بر پاسخ سلول­های خونی حشره تأثیر می­گذارد (14، 30، 45و 53). در مطالعه اثر محرومیت مواد غذایی روی حساسیت لارو (L.) Galleria mellonella به عفونت توسط بانویل و همکاران در سال 2012 نتایج نشان داد که محرومیت از مواد غذایی منجر به کاهش پاسخ سلولی و ایمنی و افزایش حساسیت به عفونت می­شود و در تراکم هموسیت­ها کاهش معنی‌داری رخ می­دهد (15). ووگل ویث و همکاران در سال 2016 فراوانی نسبی انواع سلول­های خونی وابسته به رژیم غذایی را در شب‌پره حبه انگور (Lepidoptera:Tortricidae) Eupoecilia ambiguella (Hubner) بررسی کردند. مشاهدات آن­ها نشان داد که غلظت کل سلول­های خونی و غلظت هر نوع سلول در رژیم­های غذایی مختلف متفاوت است (51). گزارش­های متعددی نیز مبنی بر واکنش‌های ایمنی حشرات مختلف در برابر ورود عوامل بیگانه مانند قارچ‌ها، باکتری‌ها و یا ترکیبات سنتزی به همولنف وجود دارد. بعنوان مثال عجم حسنی (b1393)، واکنش‌های ایمنی سلولی لارو‌های سن چهارم Spodoptera litura را علیه دو جدایه از قارچ  Beauveria bassianaو ذرات سنتزی لاتکس بید بررسی کرد (7). عجم حسنی (a1393)، همچنین واکنش ایمنی سلولی لارو‌های سن چهارم پروانه Utethesia pulchella L. (Lepidoptera: Arctiidae)، را در برابر دو جدایه از قارچ B. bassiana (Bals.-Criy) و یک جدایه از قارچ Isaria farinosae  را بررسی کرد (6). عجم حسنی و همکاران (2013)، پاسخ ایمنی پروانه برگخوار سفید آمریکایی Hyphantria cunea (Drury) (Lepidoptera: Arctiidae) را در برابر چهار ایزوله از قارچ بیماری‌زای حشرات به نام B. bassiana، و یک ایزوله ازI. farinosae (Holmsk.) ، بررسی کردند (12). پورعلی و عجم حسنی در سال 2018 نشان دادند که قارچ بیمارگر B. bassiana در زمان­های 3 و 6 ساعت پس از ورود به همولنف لارو سن چهار بید سیب‌زمینی سبب تغییر معنی­دار سلول­های مشارکت کننده در ایمنی می­شوند (2). در بررسی که توسط دانفی و همکاران در سال 1992 انجام گرفت، سلول­های خونی پروانه ابریشم باف ناجور Lymantria dispar (L.) در برابر باکتری­های Xenorhabdus luminescens و X. nematophilus بترتیب 5/1 و 5 ساعت پس از تزریق حفره­دار می­شوند و باگذشت زمان، لیپو پلی ساکارید­های دیواره­ی سلولی باکتری بر ساختار سلول­های خونی و اجسام چربی تأثیر گذاشته و موجب متلاشی شدن آن­ها می­شود (20). بورگز و همکاران (2008)، به این نتیجه رسیدند که واکنش دفاع سلولی سن خون­خوار  prolixus  Rhodniusدر مقابل باکتری Escherichia coli با افزایش تعداد سلول­های خونی و تغییرات مرفولوژیکی شدید این سلول­ها همراه بود که درنهایت منجر به غالب شدن سیستم ایمنی حشره بر این باکتری شد (18). اریکسون و همکاران (2009)، کاهش در تعداد سلول­های خونی را پس از تیمار پروانه کلم Trichoplusia ni با غلظت­های کم B. thuringiensis (Btk) و E. coli مورد مطالعه قراردادند. (21).

لیسه سیب از آفات برگخوار مهم درختان سیب می‌باشد که بویژه در ارتفاعات، گاه خسارت بالای آفت منجر به از بین رفتن تمام سطح پارانشیم برگ شده و متعاقباً میوه‌ها دچار ریزش می­شوند. تا­کنون گزارش مستندی مبنی بر شناسایی جنبه­های ایمنی‌شناسی لیسه سیب ارائه نشده است و حتی سایر ویژگی­های فیزیولوژیک این آفت ناشناخته است، بنظر می­رسد تحقیق حاضر با معرفی انواع سلول­های خونی لارو سن پنج آفت و برهمکنش هموسیت­ها با تنش­های دمایی، گرسنگی و باکتری B. t بتواند گام مؤثری در راستای شناخت ویژگی­های دفاع سلولی آن بردارد. قطعاً مطالعات فیزیولوژی این آفت کلیدی می‌تواند در اتخاذ روش­های کنترل میکروبی آن بر پایه B. t مثمر ثمر باشد.

مواد و روشها

جمع‌آوری حشرات: دستجات لارو­های نئونات لیسه سیب از باغ­های سیب شهرستان اسفراین در تاریخ 20/2/1397 جمع‌آوری شدند و تا زمان انجام آزمایشات مربوطه درون ظروف پرورش به ابعاد 15×15×15 سانتیمتر درون اتاقک رشد با دمای 1±20 و رطوبت نسبی 50% و دوره نوری 14:10 ساعت قرار داده شدند. برگ­های سیب درون ظروف روزانه مورد بازبینی قرار گرفتند و زمانیکه برگ­ها بطور کامل توسط لاروها خورده شده بودند، برگ­های تازه جایگزین آن­ها شد. لارو­های سن پنج لیسه سیب جهت آزمایشات ایمنی‌شناسی مورد استفاده قرار گرفتند. طول بدن لارو سن پنج آفت 20 میلیمتر و عرض کپسول سر 2/1 میلیمتر است.

شناسایی سلول­های خونی لیسه سیب: جهت شناسایی سلول‌های خونی، از ماده رنگ‌آمیزی گیمسا استفاده شد. سلول­ها با کلیدهای موجود در منابع معتبر (24) شناسایی شدند و جهت مشاهده و عکس­برداری از سلول­ها از بزرگنمایی 40 میکروسکوپ نوری Olympus BH2 استفاده شد. ده عدد لارو سنین مختلف لیسه سیب بعنوان ده تکرار انتخاب شدند. لاروها در بشر محتوی آب مقطر در دمای 55–50 درجه سلسیوس قرار داده شدند و پس از پنج ثانیه برداشته و روی کاغذ صافی قرار گرفتند . سپس بوسیله اسکالپل یک پای کاذب لارو برش داده شد و مقداری از همولنف لارو را روی یک لام گذاشته و با لام دیگر یک اسمیر تهیه شد. پس از خشک شدن همولنف، مقداری ماده رنگ‌آمیزی گیمسا (محلول 9:1 گیمسا و آب مقطر) روی اسمیر قرار گرفت، پس از گذشت 15 دقیقه، جهت شستن محلول رنگی لام در آب مقطر قرار گرفت و به آرامی خارج شد. سپس لام بمدت پنج ثانیه در کربنات لیتیم اشباع شده قرار داده شد (این امر بمنظور تثبیت رنگ سلول‌ها انجام گرفت). لام دوباره در آب مقطر شستشو داده شد و سلول­ها با توجه به منابع معتبر شناسایی شدند.

بررسی تأثیر دما‌های مختلف بر تعداد کل و تفرقی سلول‌های خونی لارو­های سن پنج لیسه سیب: برای این منظور ده عدد از لارو‌های سن پنجم لیسه سیب مورد استفاده قرار گرفتند. تیمارها بمدت 24 ساعت در دو دمای 4 و 35 درجه سلسیوس قرار گرفتند. (شرایط آزمایش برای دمای 4 درجه سلسیوس، یخچال و رطوبت نسبی 45 درصد و برای دمای 35 درجه سلسیوس اتاقک رشد با رطوبت نسبی 45 درصد در نظر گرفته شد) تیمار شاهد نیز شامل لاروهایی بود که در دمای 1±20 درجه سلسیوس و رطوبت نسبی 45 درصد در اتاقک رشد قرار داده شدند. تعداد کل هموسیت‌ها، پلاسموتوسیت‌ها، گرانولوسیت‌ها، پروهموسیت‌ها و اونوسیتوئیدهای لارو‌های تیمار شده شمارش شدند. شمارش سلول­ها با استفاده از لام نئوبار و بزرگنمایی 40 میکروسکوپ نوری انجام شد. به این منظور، همولنف لاروهای هر تیمار با استفاده از میکروپیپت جمع‌آوری و با بافر فیزیولوژیک رقیق شدند. ماده ضد انعقاد به کار رفته در آزمایش محلول تایسون بود (33). نسبت همولنف به تایسون 4:10 میکرولیتر و شمارش سلول­های خونی با محاسبه تعداد سلول­های خونی موجود در پنج‌خانه از لام نئوبار (هرکدام به ابعاد یک میلیمتر مربع) انجام شد و با فرمول زیر محاسبه گردید (29).

 

 

تجزیه داده‌ها با نرم‌افزار SAS انجام شد و مقایسه میانگین‌ها با آزمون توکی در سطح احتمال 1 درصد انجام گرفت.

بررسی تأثیر دوره­های گرسنگی بر تعداد کل و تفرقی سلول­های خونی در لارو­های سن پنج لیسه سیب: بمنظور انجام این آزمایش لارو­های سن پنجم لیسه سیب به مدت 24 و 48 ساعت در معرض گرسنگی قرار گرفتند. (آزمایش در اتاقک رشد با دمای 1±20 درجه سلسیوس و رطوبت نسبی 45 درصد انجام شد). تعداد کل هموسیت­ها و تعداد پلاسموتوسیت‌ها، گرانولوسیت‌ها، پروهموسیت‌ها و اونوسیتوئیدهای تکرارها شمارش شدند. تجزیه داده­ها در قالب طرح کامل تصادفی با نرم‌افزار SAS و مقایسه میانگین‌ها با آزمون توکی انجام شد. این آزمایش شامل سه تیمار شاهد، لاروهای گرسنه تحت تنش گرسنگی ظرف مدت 24 و 48 ساعت و هر تیمار شامل ده تکرار بود.

سمیت حشره‌کش بیولوژیک Bacillus thuringiensis روی لارو سن پنجم لیسه سیب: ترکیب بیولوژیک استفاده شده در تحقیق حاضر، Bacillus thuringiensis زیرگونه Kurstaki به شکل پودر و ساخت شرکت سی بی سی (اینتراکوم بیو) کشور ایتالیا می­باشد که از مرکز تحقیقات کشاورزی شاهرود تهیه شد. جهت انجام آزمایشات زیست‌سنجی، غلظتهای 5/0، 1 و 2 پی پی‌ام از ترکیب فوق که در آب مقطر تهیه می­شد و به برگ­های سیب تیمار شدند. برای هر غلظت، 60 عدد دیسک برگ سیب به شعاع 2 سانتیمتر و 60 عدد لارو سن پنج در نظر گرفته شد. ( تعداد تکرارها برای هر تیمار 4 عدد و هر تکرار شامل 15 عدد لارو بود). و با کمک میکروپیپت، ترکیب B.t به مقدار 200 میکرولیتر در مرکز هر برگ قرار داده شد. روی هر برگ یک عدد لارو سن پنج لیسه سیب قرار گرفت. هر لارو به همراه برگ مورد تغذیه آن به یک پتری به‌طور جداگانه منتقل شدند. تیمار شاهد شامل لاروهایی بود که روی برگ­های سیب تیمار شده با 200 میکرولیتر آب مقطر قرار گرفتند. پتری­ها به اتاقک رشد با دمای 1±20 درجه سلسیوس و رطوبت نسبی 45 درصد و نسبت روشنایی به تاریکی 14:10 ساعت انتقال‌یافته و به لاروها اجازه داده شد که مدت‌زمان 24 ساعت از برگ­های آلوده تغذیه کنند. پس از 24 ساعت، غلظتی از ترکیب که 25 درصد تلفات لارو­ها را به دنبال داشت بعنوان غلظت LC25 (پی پی‌ام) در نظر گرفته شد و از آن در آزمایشات ایمنی‌شناسی استفاده شد.

بررسی تأثیر باکتری B. t بر تعداد کل و تفرقی سلول­های خونی لارو سن پنج لیسه سیب: به این منظور ابتدا غلظتی از باکتری که حدود 25 درصد تلفات در لاروها ایجاد می­کرد یعنی LC25 با آزمون زیست‌سنجی تعیین شد. این غلظت 1 پی پی‌ام به دست آمد. سپس دیسک­های برگی به شعاع 2 سانتی­متر تهیه شد و در ظروف پتری­دیش بطور جداگانه یک عدد دیسک برگی آلوده شده به غلظت 1 پی پی‌ام باکتری به همراه یک عدد لارو سن پنج قرار داده شد و مدت12 و 24 ساعت به لاروها اجازه داده شد تا از برگ­ها تغذیه کنند. سپس آزمایش­های ایمنی‌شناسی روی لاروها انجام گرفت. این آزمایش شامل سه تیمار شاهد (لاروهایی که از برگ­های سیب تیمار شده با آب مقطر تغذیه کردند)، لاروهایی که 12 ساعت از برگ­های آلوده به باکتری تغذیه کردند و لاروهایی که 24 ساعت از برگ­های آلوده تغذیه کردند و سپس خون‌گیری شدند و برای هر تیمار 15 عدد لارو در نظر گرفته شد.

اندازه‌گیری فعالیت آنزیم فنل اکسیداز: برای تعیین اثر دوره­های گرسنگی و دمایی روی فعالیت فنل اکسیداز لارو­های مورد آزمایش از روش هموسیت لایزیت استفاده شد (32). در این روش همولنف لاروهای هر تیمار جداگانه جمع‌آوری شده و در 10000 دور در دقیقه برای 5 دقیقه سانتریفیوژ شدند. مایع رو نشین حذف‌شده و مقدار 100 میکرولیتر بافر فسفات )7(pH= به رسوبات اضافه‌شده و سپس هموژنیزه شد. محلول اخیر دوباره در 12000 دور در دقیقه برای 15 دقیقه سانتریفیوژ شده و مایع رونشین حاصل در برآوردهای آنزیمی استفاده شد. بدین منظور، 25 میکرولیتر از نمونه‌ها به 50 میکرولیتر از محلول 10 میلی‌مولار L-dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) و 50 میکرولیتر بافر فسفات اضافه شد. این مخلوط بمدت 5 دقیقه در دمای 30 درجه‌ی سلسیوس انکوبه شده و سپس توسط دستگاه الایزا ریدر در طول‌موج 490 نانومتر خوانده شد. آزمایش در 3 تکرار انجام شد. تجزیه داده‌ها با استفاده از برنامه نرم‌افزاری SAS و مقایسه‌ی میانگین‌ها با آزمون توکی در سطح احتمال 1 درصد انجام شد.

نتایج

شناسایی سلول­های خونی لارو سن پنج لیسه سیب: با استفاده از میکروسکوپ نوری، سلول­های خونی لارو­های سن پنج لیسه سیب Y. malinellus شناسایی شدند. این سلول‌ها شامل گرانولوسیت­ها، پلاسموتوسیت­ها، اونوسیتوئید­ها، پروهموسیت­ها و اسفرولوسیت­ها بودند. گرانولوسیت­ها سلول­هایی مدور یا بیضی شکل با هسته­ی مشخص مرکزی یا کناری بوده و در سطح سیتوپلاسم آن­ها گرانول­های فراوانی دیده شد. اندازه گرانولوسیت­ها متنوع و از کوچک تا سلول­هایی بزرگ در خون حشره مشاهده شد. این سلول­ها بیشترین فراوانی را در بین سلول­های خونی به خود اختصاص دادند (شکل 1 و 2). پلاسموتوسیت­ها، دوکی شکل با دو زائده سیتوپلاسمی کوچک در طرفین دیده شدند. این سلول­ها بعد از گرانولوسیت­ها بیشترین فراوانی را به خود اختصاص دادند (شکل 1 و 2). پلاسموتوسیت­ها و گرانولوسیت­ها در مجموع بیشترین فراوانی هموسیت­ها را تشکیل دادند. اونوسیتوئید­ها سلول­هایی کوچک، گرد یا تخم‌مرغی شکل با هسته جانبی مشخص مشاهده شدند که هسته مدور آن­ها بطور کامل به کناره­ی غشای سلول کشیده شده است. این سلول­ها بزرگتر از پروهموسیت­ها ولی کوچکتر از سایر سلول­های خونی می­باشند. فراوانی این سلول­ها نسبت به گرانولوسیت­ها و پلاسموتوسیت­ها کمتر بود (شکل 1 و 2). پروهموسیت­ها کوچکترین سلول­ها با هسته­ی مرکزی و مدور مشاهده شدند. هسته پروهموسیت­ها تقریباً تمام حجم سیتوپلاسم سلول را اشغال کرده است بطوریکه سیتوپلاسم به شکل لایه‌ای نازک به کناره­ی غشای سلول کشیده شده است (شکل 1 و 2).

 

شکل 1- تصاویر میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 40 از سلول­های خونی رنگ‌آمیزی شده با گیمسا در لارو سن پنج Yponomeuta malinellus

GR= گرانولوسیت، PL= پلاسموتوسیت، OE= اونوسیتوئید، PR= پروهموسیت، SP= اسفرولوسیت

 

 

شکل 2- میانگین درصد فراوانی سلول­های خونی لارو سن پنج لیسه سیب Yponomeuta malinellus

فراوانی این سلول­ها نسبتاً پایینتر از سلول­های قبلی بود. اسفرولوسیت­ها سلول­هایی نسبتاً بزرگ با یک هسته­ی فشرده مشاهده شدند که سطح سیتوپلاسم این سلول­ها دارای اسفرول­های متعددی بود و کم‌ترین میزان فراوانی سلول‌های خونی را به خود اختصاص دادند (شکل 1 و 2).

بررسی تأثیر دما‌های مختلف روی تعداد سلول‌های خونی لارو­های سن پنج لیسه سیب: واکنش­های دفاع سلولی لارو سن پنج لیسه سیب در برابر تنش­های دمایی (4 و 35 درجه سلسیوس) معنی­دار بود. نتایج حاصل از تأثیر دمایی مختلف روی هموسیت­های لارو سن پنج لیسه سیب نشان می­دهد که در لارو­هایی که بمدت 24 ساعت در دمای 35 درجه سلسیوس قرار گرفتند؛ تعداد کل هموسیت­ها، گرانولوسیت­ها، پلاسموتوسیت­ها و اونوسیتوئید­ها نسبت به شاهد (دمای 1±20 درجه سلسیوس) افزایش یافت اما تعداد پروهموسیت­ها نسبت به شاهد کاهش یافت بطوریکه تغییرات معنی­­داری در تعداد کل هموسیت­ها (F=4.23, df t,e=2, 12; P≤0.04)، گرانولوسیت­ها (F= 3.77, df t,e=2, 12; P≤ 0.05)، پلاسموتوسیت­ها (F=7.65, df t,e=2, 12; P≤0.007) و اونوسیتوئید­ها (F= 3.49, df t,e=2, 12; P≤ 0.05) نسبت به شاهد ایجاد شد (جدول 1). همچنین در اثر تنش سرما (دمای 4 درجه سلسیوس)، تعداد کل هموسیت­ها، گرانولوسیت­ها و پلاسموتوسیت­ها نسبت به شاهد کاهش یافت. در این دما تغییرات معنی­­داری در تعداد کل هموسیت­ها (F=4.23, df t,e=2, 12; P≤0.0408)، گرانولوسیت­ها (F= 3.77, df t,e=2, 12; P≤ 0.0538)، پلاسموتوسیت­ها (F=7.65, df t,e=2, 12; P≤0.0072) و اونوسیتوئید­ها (F= 3.49, df t,e=2, 12; P≤ 0.0539) نسبت به شاهد مشاهده شد (جدول 1).

بررسی تأثیر تنش­های دمایی مختلف بر فعالیت آنزیم فنل­اکسیداز در همولنف لارو سن پنج لیسه سیب: نتایج این آزمایش نشان داد که افزایش و کاهش دما بطور معنی­داری فعالیت آنزیم فنل­اکسیداز را کاهش می­دهد (F=30.15, df t,e=2, 6; P≤0.0007). فعالیت آنزیم فنل­اکسیداز در شاهد 003/0±23/0 میکرو­مول بر دقیقه بر میلی­گرم پروتئین بود که بطور قابل‌توجهی بالاتر از فعالیت آن در لارو­های تحت تنش دمای 4 درجه سلسیوس (015/0±14/0) میکرو­مول بر دقیقه بر میلی­گرم پروتئین و دمای 35 درجه سلسیوس (005/0±14/0) میکرو­مول بر دقیقه بر میلی­گرم پروتئین بود (جدول 2).

 

جدول1- بررسی تأثیر دما­های مختلف بر تعداد کل هموسیت­ها و انواع سلول­های خونی 20 عدد از لارو­های سن پنج Yponomeuta malinellus

OE

(in mm3 hemolymph)

PR

(in mm3 hemolymph)

PL

(in mm3 hemolymph)

GR

(in mm3 hemolymph)

THC

(in mm3 hemolymph)

Temperature

2±0.29b

1.8±0.24c

16.6±0.85ab

22±0.86c

41.8±1.37c

25±1°C

2±0.29b

3.2±0.38b

11±0.47b

11.2±0.64b

27.6±1.42b

4°C

3.4±0.33a

2.2±0.38a

24.4±2.62a

23.6±3.85a

55.4±6.72a

35°C

    حروف کوچک مشابه در هر ستون نشانگر عدم اختلاف معنی­دار بر مبنای گروه‌بندی توکی در سطح احتمال 1 %

جدول 2- بررسی تأثیر تنش­های دمایی مختلف بر فعالیت آنزیم فنل­اکسیداز (میکرو­مول بر دقیقه بر میلی­گرم پروتئین) در همولنف لارو سن پنج Yponomeuta malinellus

 

Temperature (°C)

   

35°C

4°C

20±1°C

 

0.14±0.005 b

0.14±0.015 b

0.23±0.003 a

Phenoloxidase activity

(µm/min/mg protein)

      حروف کوچک مشابه نشانگر عدم اختلاف معنی­دار بر مبنای گروه‌بندی توکی در سطح احتمال 1 درصد


بررسی تأثیر دوره­های گرسنگی روی تعداد کل و انواع سلول­های خونی لارو سن پنج لیسه سیب: تأثیر دوره­های گرسنگی بر تعداد گرانولوسیت­ها، پلاسموتوسیت­ها و اونوسیتوئید­ها معنی­دار بود. تعداد کل سلول­های خونی (F=34.56, df t,e=2, 12; P≤0.0001) در لارو­های تحت تیمار 24 ساعت گرسنگی تفاوت معنی­داری با شاهد نداشت ولی بعد از 48 ساعت گرسنگی تعداد کل سلول­های خونی با میانگین 57/0±2/45 عدد در میلی­متر مکعب همولنف بطور معنی‌داری نسبت به شاهد افزایش یافت و به 75/1±6/63 عدد در میلی­متر مکعب همولنف رسید. تعداد پروهموسیت­ها (F=14.59, df t,e=2, 12; P≤0.0006) نیز در لارو­هایی که 24 ساعت گرسنگی را تحمل کرده بودند اختلاف معنی­داری را با شاهد نشان نداد و میزان آن با میانگین 16/0±4/1 عدد در میلی­متر مکعب همولنف کاهش یافت ولی بعد از 48 ساعت گرسنگی بطور معنی‌داری نسبت به شاهد افزایش یافت و به 24/0±8/3 عدد در میلی­متر مکعب همولنف رسید. بر اساس مشاهدات افزایش معنی­داری در تعداد گرانولوسیت­های لارو­هایی که 24 ساعت گرسنگی را تحمل کرده بودند، نسبت به شاهد وجود داشت (F = 11.32, df t,e=2, 12; P≤ 0.0001). همچنین بعد از 48 ساعت تعداد کل گرانولوسیت­ها افزایش یافته و به  میانگین 92/0±2/30 عدد در میلی­متر مکعب همولنف رسید. تعداد پلاسموتوسیت­ها (F=7.95, df t,e=2, 12; P≤0.0063) تحت تنش گرسنگی 24 ساعت با میانگین 16/0±4/18 عدد در میلی­متر مکعب همولنف افزایش یافت و بعد از 48 ساعت گرسنگی روند افزایشی آن ادامه یافت تا به 92/0±8/22 عدد در میلی­متر مکعب همولنف رسید. تعداد اونوسیتوئید­ها (F=56.16, df t,e=2, 12; P≤0.0001) تحت تنش گرسنگی 24 ساعت با میانگین 13/0±2/1 عدد در میلی­متر مکعب همولنف بطور معنی­داری کاهش یافت سپس بعد از 48 ساعت گرسنگی بشدت افزایش پیدا کرد و به 26/0±6/6 عدد در میلی­متر مکعب همولنف رسید بطوریکه نسبت به شاهد تغییرات معنی­داری را نشان داد (جدول 3).

 

جدول 3- بررسی تأثیر تنش­های گرسنگی بر تعداد کل هموسیت‌ها و انواع سلول­های خونی 20 عدد از لارو­های سن پنج Yponomeuta malinellus

OE

(in mm3 hemolymph)

PR

(in mm3 hemolymph)

PL

(in mm3 hemolymph)

GR

(in mm3 hemolymph)

THC

(in mm3 hemolymph)

Starvation(h)

2±0.29c

1.8±0.24b

16.6±0.85b

22±0.86c

41.8±1.37b

Control

1.2±0.13b

1.4±0.16b

18.4±0.16ab

23.8±0.38b

45.2±0.57b

24 h

6.6±0.26a

3.8±0.24a

22.8±0.92a

30.2±0.92a

63.6±1.75a

48 h

  حروف کوچک مشابه در هر ستون نشانگر عدم اختلاف معنی­دار بر مبنای گروه‌بندی توکی در سطح احتمال 1 درصد


بررسی تأثیر تنش­های گرسنگی بر فعالیت آنزیم فنل­اکسیداز در همولنف لارو سن پنج لیسه سیب: نتایج حاصل از این آزمایش نشان داد که افزایش مدت‌زمان گرسنگی پس از 24 ساعت با میانگین (012/0±16/0) میکرو­مول بر دقیقه بر میلی­گرم پروتئین موجب کاهش معنی­دار فعالیت آنزیم فنل­اکسیداز (F=44.72, df t,e=2, 6; P≤0.0002) و بعد از 48 ساعت با میانگین (008/0±16/0) میکرو­مول بر دقیقه بر میلی­گرم پروتئین موجب افزایش فعالیت آنزیم فنل­اکسیداز می­شود. میانگین فعالیت آنزیم فنل­اکسیداز در شاهد (003/0±23/0) میکرو­مول بر دقیقه بر میلی­گرم پروتئین تعیین شد (جدول 4).

 

جدول 4- بررسی تأثیر تنش­های گرسنگی بر فعالیت آنزیم فنل­اکسیداز (میکرو­مول بر دقیقه بر میلی­گرم پروتئین) در همولنف لارو سن پنج Yponomeuta malinellus

 

Starvation (h)

   

48 h

24 h

Control

 

0.28±0.008 a

0.16±0.012 b

0.23±0.003 a

Phenoloxidase activity

(µm/min/mg protein)

     حروف کوچک مشابه نشانگر عدم اختلاف معنی­دار بر مبنای گروه‌بندی توکی در سطح احتمال 1 درصد

جدول 5- سمیت حشره­کش بیولوژیک Bacillus thuringiensis بر لارو سن پنج لیسه سیب malinellus Yponomeuta

LC90 (90%FL)

LC50 (90%FL)

Slope±se

Chi-squre

Numbers

Pest

3.2-5.5ppm

1.7-2.8 ppm

5.2±0.53

1.4

240

Yponomeuta malinellus

 


بررسی تأثیرB. t روی تعداد کل و انواع سلول­های خونی لارو سن پنج لیسه سیب: نتایج نشان داد که واکنش ایمنی لارو­هایی که از برگ­های آلوده به باکتری B. t تغذیه کردند معنی­دار بوده است. بیشترین تغییرات معنی­دار روی سلول­های خونی بعد از 12 ساعت تغذیه لارو­ها از برگ­های آلوده به باکتری رخ داده است بطوریکه پس از 12 ساعت افزایش معنی­داری در تعداد کل سلول­های خونی (F=18.72, dft,e=2, 12; P≤0.0001)، گرانولوسیت­ها (F=23.13, dft,e=2, 12; P≤0.0002)، پلاسموتوسیت­ها (F=31.52, dft,e=2, 12; P≤0.03) و پروهموسیت­ها (F=14.5, dft,e=2, 12; P≤0.0001) نسبت به شاهد اتفاق افتاده است (جدول 6).

بررسی تأثیر B. t بر فعالیت آنزیم فنل­اکسیداز در همولنف لارو سن پنج لیسه سیب: نتایج این آزمایش نشان داد که تغذیه از برگ­های آلوده به باکتری B. t سبب افزایش معنی­دار فعالیت آنزیم فنل اکسیداز شد (F=40.72, dft,e=2, 12; P≤0.0001). میزان فعالیت آنزیم فنل اکسیداز در لارو­هایی که بمدت 12 ساعت از برگ­های آلوده به باکتری تغذیه کرده بودند با میانگین (006/0±27/0) میکرو­مول بر دقیقه بر میلی­گرم پروتئین بطور معنی­داری نسبت به شاهد افزایش یافت. (جدول 7).

 

جدول 6- بررسی تأثیر باکتری Bacillus thuringiensis  بر تعداد کل هموسیت­ها و انواع سلول­های خونی 20 عدد از لاروهای سن پنج Yponomeuta malinellus

OE

(in mm3 hemolymph)

PR

(in mm3 hemolymph)

PL

(in mm3 hemolymph)

GR

(in mm3 hemolymph)

THC

(in mm3 hemolymph)

B. t (1 ppm)

2.2±0.19c

1.7±0.21b

16.6±0.7c

23±0.86b

41.8±1.37b

Control

4.2±0.23a

3.7±0.5a

24.7±0.5a

30.2±1.5a

48.2±0.67a

12 h

3.6±0.26b

3.1±0.1a

21.5±0.45b

24.7±0.45b

40.6±2.52b

24 h

    حروف کوچک مشابه در هر ستون نشانگر عدم اختلاف معنی­دار بر مبنای گروه‌بندی توکی در سطح احتمال 1 درصد

جدول 7- بررسی تأثیر باکتری B.t بر فعالیت آنزیم فنل­اکسیداز (میکرو­مول بر دقیقه بر میلی­گرم پروتئین) در همولنف لارو سن پنج Yponomeuta malinellus

 

B. t (1 ppm)

   

24 h

12 h

Control

 

0.26±0.003 a

0.27±0.006 a

0.24±0.002 b

Phenoloxidase activity

(µm/min/mg protein)

        حروف کوچک مشابه نشانگر عدم اختلاف معنی­دار بر مبنای گروه‌بندی توکی در سطح احتمال 1 درصد


بحث و نتیجه‌گیری

نتایج تحقیق حاضر وجود پنج نوع سلول خونی شامل گرانولوسیت­ها، پلاسموتوسیت­ها، اونوسیتوئید­ها، پروهموسیت­ها و اسفرولوسیت­ها را در همولنف لارو­های لیسه سیب اثبات کرد که با مطالعاتی که توسط دیگر محققین در زمینه شناسایی سلول­های خونی انجام شده شباهت نزدیکی دارد. برای مثال، در بررسی هموسیت­های شب پره‌ی مدیترانه‌ای آرد Ephestia kuehniella Zeller پنج نوع سلول خونی شامل پروهموسیت، پلاسموتوسیت، گرانولوسیت، اونوسیتوئید و اسفرولوسیت و دو مورفوتایپ دیگر ورمیسیت و پودوسیت گزارش شد (22). عجم‌حسنی در سال 1394 پنج نوع هموسیت در مراحل مختلف لاروی، شفیرگی و بالغ کرم شاخ‌دار فرفیون Hyles euphorbiae L. (Lepidoptera: Sphingidae) را شناسایی کرد (8). با توجه به نتایج حاصل از اندازه‌گیری‌های سلولی نشان داده شده است که هر یک از مورفوتیپ­های سلول دارای اندازه­های متنوعی هستند. در این تحقیق نیز اشکال متنوعی از برخی هموسیت­ها بویژه گرانولوسیت­ها مشاهده شد که اندازه آن­ها متنوع و از کوچک تا سلول‌هایی درشت در خون حشره پراکنده بودند. تعداد هموسیت­های در گردش خون همچنین می­تواند به‌سرعت در پاسخ به تنش از قبیل زخم، عفونت، گرسنگی، تغذیه و یا تغییرات دمایی تغییر کند (23و 35). تغییر در تعداد سلول­های خونی، سامانه ایمنی حشره را تحت تأثیر قرار می­دهد و واکنش حشرات را در برابر انواع روش­های کنترل، مانند کنترل میکروبیولوژیک یا شیمیایی تغییر می­دهد (12). مطالعاتی که در رابطه با اثر درجه حرارت بر تعداد هموسیت‌های حشرات مختلف، توسط محققین صورت گرفته، نشان‌دهنده نتایج متفاوتی است. در بررسی­های انجام‌گرفته روی Antheraea mylitta (Drury) تغییراتی در تعداد تفرقی سلول­های خونی تحت تنش­های دمایی مشاهده شد. کاهش در تعداد پلاسموتوسیت­ها و گرانولوسیت­ها در طی تنش­های دمایی در مقایسه با دمای معمولی مشاهده شد، اما دمای بالا و پایین روند مشابهی را نشان نداد. همچنین کاهش قابل‌توجهی در تعداد کل سلول­های خونی در دمای پایین مشاهده شد، اما در دمای بالا افزایش قابل‌توجهی دیده نشد (39). در یک مطالعه‌ی دیگر روی لاروDanaus chrysippus L. ، نشان داده شد که تنش سرما سبب کاهش تعداد سلول‌های خونی می‌شود بااین‌وجود، تنش گرمایی افزایش سلول‌های خونی را بدنبال داشت (38). طبق مشاهدات قاسمی و همکاران در سال 2013 در رابطه با واکنش­های ایمنی E.  kuehniella در برابر تنش­های دمایی، شکل سلول­های خونی و تعداد آن‌ها دچار تغییرات شدیدی شد. نتایج آن­ها نشان داد که درجه حرارت بالا (40 درجه سلسیوس) سبب افزایش قابل‌توجهی در تعداد کل سلول­های خونی بویژه اونوسیتوئید­ها و پلاسموتوسیت­ها و درجه حرارت پایین (4 درجه سلسیوس) منجر به کاهش قابل‌توجهی در تعداد کل سلول­های خونی شد. دیواره سلولی پلاسموتوسیت‌ها و گرانولوسیت‌ها بعنوان مهم‌ترین سلول‌های خونی شرکت‌کننده در ایمنی سلولی، در برابر دمای حدود 40 درجه سلسیوس پاره شدند و محتویات سلولی آن‌ها به داخل همولنف پخش شد. (22). پندی و همکاران در سال 2008 شمارش کل و تفرقی سلول­های خونی را در لارو­های سن پنجم D. chrysippus تحت تنش دمایی مورد بررسی قراردادند و به این نتیجه رسیدند که سرما موجب کاهش تعداد سلول­های خونی و گرما افزایش تعداد سلول­های خونی را بدنبال دارد. میانگین تعداد پروهموسیت­ها پس از گرم شدن و سرد شدن بترتیب افزایش و سپس کاهش می‌یابد، درصد پلاسموتوسیت­ها در تمام مراحل آزمایش کاهش یافت. علاوه بر این تنش­های دمایی سرما و گرما بر ساختار هموسیت­ها تأثیر گذاشته و موجب شکسته شدن غشای پلاسما و تکه‌تکه شدن هسته و اندام­های سلولی می­شود (37). در بررسی تأثیر تنش­های دمایی بر سامانه ایمنی بید سیب‌زمینی (Lepidoptera: Gelechiidae) P. operculella مشاهده شد که تعداد کل هموسیت­ها و پلاسموتوسیت­هایی که بمدت 24 ساعت تحت تنش دمایی 35 درجه سانتی­گراد قرار گرفتند، نسبت به شاهد (دمای 1±20 درجه سانتی­گراد) بطور معنی‌داری افزایش یافت. همچنین در اثر تنش سرما (دمای 4 درجه سلسیوس) تعداد کل هموسیت­ها، پلاسموتوسیت­ها و اونوسیتوئید­ها نسبت به شاهد کاهش معنی­داری نشان داد (2). در تحقیق حاضر نیز نتایج آزمایش­های مربوط به بررسی دفاع سلولی لیسه سیب در برابر تنش­های دمایی و گرسنگی نشان داد که این تنش­ها بر سامانه ایمنی این حشره بطور معنی‌داری تأثیرگذار هستند. نتایج حاصل از آزمایشات مربوطه نشان داد که تنش گرما سبب افزایش قابل‌توجهی در تعداد کل هموسیت‌ها (THC) و در مقابل تنش سرما کاهش قابل‌توجهی در THC را نشان داد. بنابراین بنظر می­رسد که در معرض قرار دادن حشره در دمای بالا، می­تواند سازگاری محیطی لارو را از طریق یک مکانیسم مشابه و رفتار تنظیم حرارت یعنی افزایش تعداد کل هموسیت­ها و بخصوص افزایش پلاسموتوسیت­ها بالا ببرد. نتایج تحقیق حاضر نشان داد که تغذیه یا عدم تغذیه بر واکنش­های دفاع سلولی لیسه سیب مؤثر است چراکه انرژی تولید شده با تغذیه برای حفظ پایداری بدن و فعالیت­های ایمنی ضروری است (15). مطالعات ایمنی‌شناسی لاروهای گرسنه زنبورعسل Apis mellifera نشان داد که در لاروهای گرسنه مانده بمدت هفت روز غلظت پپتیدهای ضدمیکروبی مانند آریل فورین کاهش یافت (13). در تحقیقی دیگر لاروهای شب‌پره موم‌خوار گرسنه از میزان کمتری پپتیدهای ضدمیکروبی مانند لیپوکالین و پروتئین­های ایمنی مانند آپولیپوفورین و آریل فورین  نسبت به لارو­های شاهد بهره‌مند بودند (15). اثر محرومیت­های غذایی بر عملکرد ایمنی L. Tenebrio molitor مورد مطالعه قرارگرفته است و مشخص شده است غلظت آنزیم فنل­اکسیداز در حشراتی که گرسنه مانده‌اند بطور معنی­داری کمتر از حشرات تغذیه کرده است (45). آدامو و همکاران (2016) با بررسی اثر محرومیت­های غذایی بر سیستم ایمنی کرم شاخدار تنباکو نشان دادند که محرومیت غذایی اثرات پیچیده و متناقضی بر سامانه­ی ایمنی این حشره دارد بطوریکه موجب تغییرات ذخایر انرژی کوتاه مدت مانند چربی­ها و بلند مدت مانند پروتئین­ها، کاهش آستانه­ی فعال­سازی برای برخی پاسخ­های ایمنی مانند سامانه­ی فنل­اکسیداز می­شود (11). در بخش دیگری از تحقیق حاضر دفاع لارو­های سن پنجم لیسه سیب در برابر باکتری B. t با افزایش معنی­دار همه­ی سلول­های خونی و فعالیت آنزیم فنل اکسیداز همراه بود. با توجه به نتایج به دست آمده می‌توان چنین استنباط نمود که در فاصله زمانی حدود 12 ساعت پس از ورود عامل بیگانه به بدن لارو، سامانه دفاع یاخته­های تحریک شده و شمار کل سلول­ها بی‌درنگ افزایش قابل‌توجهی یافته است. ضمن اینکه قسمت عمده این افزایش مربوط به گرانولوسیت­ها و پلاسموتوسیت­ها است. این سلول­ها نقش عمده در فعالیت­های بیگانه‌خواری، تشکیل گره و کپسول اطراف عامل بیگانه دارند و ثابت شده به همراه توکسین­های ترشح‌شده و فعالیت اجزای فنل اکسیداز سبب ملانیزاسیون و حذف عامل آلوده می­شوند (16). با گذشت زمان تا 24 ساعت، آلودگی ناشی از باکتری سبب کاهش تراکم سلول­های خونی و درنتیجه ضعیف شدن سامانه ایمنی حشره شد. واکنش­های دفاع سلولی حشرات در برابر عوامل بیگانه توسط دیگر محققین نیز به اثبات رسیده است. بعنوان مثال هروهوو و دان (1982)، جمعیت سلول­های خونی لارو کرم شاخدار توتون Manduca sexta را در اثر ورود باکتری Pseudomonas aeruginosa  و E. coli به همولنف حشره بررسی کردند. بر اساس مشاهدات، تعداد کل سلول­های خونی، بطور معنی­داری افزایش یافت و تعداد پروهموسیت­ها، پلاسموتوسیت­ها، گرانولوسیت­ها و اسفرولوسیت­ها نیز یک ساعت پس از ورود عامل بیگانه به همولنف به میزان 80% افزایش یافت (26). هنان در سال 2012، دفاع هیومرال لاروهای Agrotis ipsilon را در برابر باکتری B. thuringiensis مطالعه کرده و نتیجه گرفتند که 6 و 12 ساعت پس از تیمار لاروها با باکتری، فعالیت لیزوزیمی بطور معنی­داری افزایش یافت (25). فعالیت عجم حسنی (b1393)، در بررسی واکنش‌های ایمنی سلولی لارو‌های سن چهارم S. litura  علیه دو جدایه از قارچ B. bassiana و ذرات سنتزی لاتکس بید، نشان داد که در زمان‌های سه و شش ساعت پس از تزریق اسپورها، تعداد کل سلول‌ها، تعداد پلاسموتوسیت‌ها و گرانولوسیت‌ها نسبت به شاهد بطور معنی‌داری بالاتر بود. فعالیت آنزیم فنل­اکسیداز نیز اندازه‌گیری شد و نشان داد که بالا­ترین فعالیت این آنزیم در زمان­های سه و شش ساعت پس از تزریق تیمار­ها بود. در انتها سلول‌های خونی این حشره در مقابله با عامل بیگانه‌ای چون اسپور قارچ و ذرات سنتزی لاتکس بید، فعالیت مثبتی از خود نشان داده و با تشکیل گره اطراف اسپور‌ها، توانستند آن‌ها را از بین ببرند (7). در تحقیقی دیگر پاسخ ایمنی پروانه برگخوار سفید آمریکایی H. cunea در برابر چهار ایزوله از قارچ بیماری‌زای حشرات به نام B. bassiana، و یک ایزوله ازI. farinosae  ، بررسی شد. نتایج نشان داد که 6 ساعت پس از تزریق اسپورهای قارچ بیمارگر در همه جدایه‌ها، تعداد کل سلول‌های خونی و تعداد ایمنوسیت‌های در گردش خون بطور معنی­داری نسبت به شاهد افزایش یافت (12). در بررسی­های انجام شده توسط بلانکو و همکاران (2017)، پاسخ ایمنی لارو G. mellonellaدر برابر سه سویه باکتری گرم منفی  Actinobacillus pleuropneumoniae مثبت بود بطوریکه غلظت پپتیدهای آنتی باکتریال را در همولنف حشره بطور معنی­داری افزایش داد (17). پورعلی و عجم حسنی (2017)، ایمنی سلولی لارو سن چهار بید سیب‌زمینی P. operculella (Lepidoptera: Gelechiidae) را در برابر دو جدایه از قارچ بیمارگر B. bassiana شامل Fashand و 47 بررسی کردند. پس از گذشت 3، 6 و 10 ساعت فراوانی سلول­های خونی در لارو­های تیمار شده مورد بررسی قرار گرفت. نتایج آن­ها نشان داد که تعداد کل سلول­های خونی، پلاسموتوسیت­ها و گرانولوسیت­ها در لارو­های تیمار شده بعد از گذشت 3 ساعت بطور معنی­داری نسبت به شاهد افزایش یافت ولی فراوانی آن­ها با گذشت زمان تا 10 ساعت به‌تدریج کاهش یافت. پروهموسیت­ها نیز کاهش معنی­داری 6 ساعت پس از تزریق اسپور­ها نشان دادند (42).

نتایج این تحقیق نشان دهنده­ی دفاع سلولی مناسب لیسه سیب می­باشد. چرا که سلول­های خونی حشره در دما­های بالا مانند 35 درجه سلسیوس افزایش معنی­داری نشان دادند که احتمالاً نشان از توان دفاعی خوب حشره در شرایط آب و هوایی مختلف است. از طرف دیگر بر اساس مشاهدات، لارو­های گرسنه با افزایش معنی­دار تراکم سلول­های خونی و فعالیت آنزیم فنل اکسیداز سازگاری مناسبی در برابر تنش گرسنگی نشان دادند. این موضوع می­تواند به‌نوعی در مطالعات بیولوژی آفت و گذر لارو­های نئونات از شرایط بدون غذا در زمستان مؤثر باشد. باکتری Bacillus thuringiensis به‌عنوان عامل میکروبی مناسبی برای لیسه سیب و بسیاری از بالپولک­داران گزارش شده است. فعالیت دفاعی لیسه سیب در برابر باکتری بیماری­زای B. t با مشارکت سلول­های خونی و سیستم فنل اکسیداز همراه بود. بنظر می­رسد مطالعات وسیع­تر در زمینه اثر متقابل ایمنی حشره- عامل میکروبی می­تواند جنبه­های جدید­تری از استفاده از روش­های کنترل میکروبی علیه این آفت برگ­خوار سیب ارائه دهد.

سپاسگزاری

نگارندگان از معاونت پژوهشی دانشگاه صنعتی شاهرود بخاطر حمایت­های مالی و از خانم مهندس معصومه حیدرنیا بدلیل همکاری در نمونه برداری­های صحرایی صمیمانه سپاسگزاری می­نمایند.

1- اسلامی، ع.، 1379. ارزیابی کاربرد سموم میکروبی بر پایه Bacillus thuringiensisبه‌منظور مبارزه با آفت لیسه درختان سیب (Hyponomeuta spp.)، اولین کنگره بیولوژی کاربردی ایران.

2- پورعلی، ز.، و عجم حسنی، م.، 1397. تأثیر دو جدایه قارچ بیمارگر Beauveria bassiana بر ایمنی لارو سن چهارم بید سیب‌زمینی Phthorimaea operculella (Lepidoptera: Gelechiidae)، گیاه‌پزشکی (مجله علمی کشاورزی)، جلد 41، شماره 3، صفحه 40-31.

3- جوادزاده، م.، مرزبان، ر.، و کلیایی، ر.، 1391. بررسی تأثیر فرآورده­ داخلی Bacillus thuringiensis در کنترل لیسه سیب، بیستمین کنگره گیاه‌پزشکی ایران.

4- خسروی، ر.، جلالی سندی، ج.، و قاسمی، و.، 1391. ﺷﻨﺎﺳﺎﻳﻲ ﺳﻠﻮلﻫﺎی ﺧﻮﻧﻲ ﻻرو ﺷﺐ ﭘﺮه ﺧﺮﻧﻮب Zeller (Lepidoptera: Pyralidae) Ectomoyelois ceratoniae، تحقیقات آفات گیاهی، شماره2 (3)، صفحات 39-30.

5- ربیعی، م.، 1395. اثر درمانی تجویز عصاره برگ و سرشاخه­های گیاه مو بر سیستم ایمنی ماهی قزل‌آلای رنگین‌کمان (Oncorhynchus mykiss) در مسمومیت تجربی با سم دیازینون، مجله پژوهش­های جانوری (مجله زیست‌شناسی ایران)، جلد 30، شماره 3، صفحه 317-308 .

6- عجم حسنی، م.، 1393a. بررسی دفاع سلولی لارو‌هایUtethesia pulchella (Lepidoptera: Arctiidae) در مقابل قارچ‌های Isaria farinosae و Beauveria bassiana، مهار زیستی در گیاه‌پزشکی، جلد 2، شماره 1، صفحات 67-57.

7- عجم حسنی، م.، 1393b. واکنش‌های ایمنی سلولی لارو Spodoptera littura (Fabricus) (Lepidoptera.: Noctuidae) علیه قارچ بیمارگر Beauveria bassiana، تحقیقات آفات گیاهی، جلد 4، شماره 2، صفحات 68-59.

8- عجم حسنی، م.، 1394. بررسی یاخته‌شناسی سلول‌های خونی کرم شاخدار فرفیون Hyles euphorbiae L. (Lepidoptera: Sphingidae)، مجله علمی کشاورزی، جلد 38، شماره 3، صفحات: 62-50.

9- کلیایی، ر.، خباز جلفائی، ح.، و میرکمالی، ح.، 1394. راهنمای آفات، بیماری­ها و علف­های هرز سیب، نشر آموزش کشاورزی، صفحه 272-1.

10- مشکینی، س.، دلیرژ، ن.، و طافی، ع. ا.، 1394. بررسی تاثیر لوامیزول بر سیستم ایمنی و مقاومت در برابر تنش تراکم در قزل آلای رنگین‌کمان (Oncorhynchus mykiss)، مجله پژوهش­های جانوری (مجله زیست‌شناسی ایران)، جلد 29، شماره 1، صفحه 105-99.

 

11- Adamo, S. A., Davies, G., Easy, R., Kovalko, I., and Turnbull, K. F., 2016. Reconfiguration of the immune system network during food limitation in the caterpillar Manduca sexta. Journal of Experimental Biology, PP: jeb-132936.

12- Ajamhassani, M., Sendi, J. J., Zibaee, A., Askary, H., and Farsi, M. J., 2013. Immunoliogical Responses of Hyphantria cunea (Drury)(Lepidoptera: Arctiidae) to Entomopathogenic Fungi, Beauveria bassiana (Bals.-Criy) and Isaria farinosae (Holmsk.) Fr. Journal of Plant Protection Research. 53(2), PP: 110-118.

13- Alaux, C., Ducloz, F., Crauser, D., and Le Conte, Y., 2010. Diet effects on honeybee immunocompetence. Biology letters. rsbl20090986 p.

14- Ayres, J. S., and Schneider, D. S., 2009. The role of anorexia in resistance and tolerance to infections in Drosophila, PLoS Biol, 7 p.

15- Banville, N., Browne, N., and Kavanagh, K., 2012. Effect of nutrient deprivation on the susceptibility of Galleria mellonella larvae to infection. Virulence. 3(6), PP: 497-503.

16- Beckage, N. E., 2008. Insect Immunology, Academic Press. California.

17- Blanco, L. A. A., Crispim, J. S., Fernandes, K. M., de Oliveira, L. L., Pereira, M. F., Bazzolli, D. M. S., and Martins, G. F., 2017. Differential cellular immune response of Galleria mellonella to Actinobacillus pleuropneumoniae. Cell and tissue research. 370(1), PP: 153-168.

18- Borges, A. R., Santos, P. N., Furtado, A. F., and Figueiredo, R. C. B. Q., 2008. Phagocytosis of latex beads and bacteria by hemocytes of the triatomine bug Rhodnius prolixus (Hemiptera: Reduvidae). Micron. 39(4), PP: 486-494.

19- Chapman, R. F., and Chapman, R. F., 1998. The insects: structure and function. Cambridge university press.

20- Dunphy, G., and Bourchier, R., 1992. Responses of Nonimmune Larvae of the Gypsy Moth, Lymantria dispar, to Bacteria and the Influence of Tannic Acid. Journal of Invertebrate Patholology. 60, PP: 26-32.

21- Ericsson, J. D., Janmaat, A. F., Lowenberger, C., and Myers, J. H., 2009. Is decreased generalized immunity a cost of B.t resistance in cabbage loopers Trichoplusia ni. Journal of invertebrate pathology. 100(2), PP: 61-67.

22- Ghasemi, V., Moharramipour, S., and Jalali Sendi, J., 2013. Circulating hemocytes of Mediterranean flour moth, Ephestia kuehniella Zell (Lep: Pyralidae) and their response to thermal stress. Invertebrate Survival Journal 10, PP: 128-140.

23- Gillespie, J. P., Burnett, C., and Charnley, A. K., 2000. The immune response of the desert locust Schistocerca gregaria during mycosis of the entomopathogenic fungus, Metarhizium anisopliae var acridum. Journal of Insect Physiology. 46(4), PP: 429-437.

24- Gupta, 1985. Cellular elements in the haemolymph. In kerkut, G. A, Gilbert, L. I, (Eds.), Comperhensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology. Cambridge University Press, PP: 87-127.

25- Hanan, A., 2012.Effect of Bacillus thuringiensis and Farnesol on Haemocytes Response and Lysozymal Activity of the Black Cut Worm Agrotis ipsilon Larvae. Asian Journal of Biological Sciences, 5(3), PP: 157-170.

26- Horohov, D. W., and Dunn, P. E., 1982. Changes in the circulating hemocyte population of Manduca sexta larvae following injection of bacteria. Journal of Invertebrate Pathology. 40(3), PP: 327-339.

27- Huang, F., Yang, Y. Y., Shi, M., Li, J. Y., Chen, Z. Q., Chen, F. S., and Chen, X. X., 2010. Ultrastructural and functional characterization of circulating hemocytes from Plutella xylostella larva: cell types and their role in phagocytosis. Tissue and Cell. 42(6), PP: 360-364.

28- Jalali, J., and Salehi, R., 2008. The hemocyte types, differential and total count in Papilio demoleus L, (Lepidoptera: Papilionidae) during post-embryonic development. Mun. Ent, Zool. 1, PP: 199-216.

29- Jones, J. C., and Liu, D. P., 1969. The effects of ligaturing Galleria mellonella larvae on total haemocyt counts and onmitotic indices among haemocytes. Journal of Insect Physiology, 15, PP: 1703-1708.

30- Kapari, L., Haukioja, E., Rantala, M. J., and Ruuhola, T., 2006. Defoliating insect immune defense interacts with induced plant defense during a population outbreak, Ecology 87, PP: 291–296.

31- Lazzaro, B. P., and Little, T. J., 2009. Immunity in a variable world. Philos. Trans. R. Soc. B Biol. Sci, 364, PP: 15–26.

32- Leonard, C., Söderhäll, K., and Ratcliffe, N. A., 1985. Studies on prophenoloxidase and protease activity of Blaberus craniifer haemocytes. Insect Biochemistry, 15(6), PP: 803-810.

33- Mahmood, A., and Yousaf, M., 1985. Effect of some insecticides on the hemocytes of Gryllus bimaculatus de Geer. Pakistan Journal of Zoology, 17, PP: 71-84.

34- Menken, S. B., Herrebout, W. M., and Wiebes, J. T., 1992. Small ermine moths (Yponomeuta): their host relations and evolution. Annual Review of Entomology. 37(1), PP: 41-66.

35- Mowlds, P., and Kavanagh, K., 2008. Effect of pre-incubation temperature on susceptibility of Galleria mellonella larvae to infection by Candida albicans, Mycopathologia, 165(1), PP: 5-12.

36- Narmanlioglu, H. K., 2017. Parasitoids of the apple ermine moth, Yponomeuta malinellus Zeller, 1838 (Lepidoptera: Yponomeutidae), in the Çoruh Valley, Erzurum Province, Turkey. Turkiye Entomology Dergisi-Turkish Journal of Entomology, 41(4), PP: 357-365.

37- Pandey, J. P., Tiwari, R. K., and Kumar, D., 2008 a. Temperature and ganglionectomy stresses affect haemocyte counts in plain tiger butterfly, Danais chrysippus L.(Lepidoptera: Nymphalidae),  Journal of Entomology, 5(2), PP: 113-121.

38- Pandey, J. P., Tiwari, R. K., and Kumar, D., 2008 b. Reduction in haemocyte mediated immune response in Danaus chrysippus following treatment with neem based insecticides. J. Entomol, 5, PP: 200-206.

39- Pandey, J. P., Mishra, P. K., Kumar, D., Singh, B. M. K., and Prasad, B. C., 2010. Effect of temperature on hemocytic immune responses of tropical tasar silkworm, Antheraea mylitta D. Research Journal of Immunology, 3(2), PP: 169-177.

40- Philip, H. G., and Edwards, L., 1991. Field Guide to Harmful and Beneficial Insects and Mites of Tree Fruits. Ministry of Agriculture and Fisheries, Victoria, British Columbia, Canada, 62 p.

41- Ponton, F., Wilson, K., Cotter, S. C., Raubenheimer, D., Simpson, S. J., 2011. Nutritional immunology: a multi-dimensional approach, PLoS Pathog, 7 p.

42- Pourali, Z., and Ajamhasani, M., 2018. The effect of thermal stresses on the immune system of the potato tuber moth, Phthorimaea operculella (Lepidoptera: Gelechiidae), 2nd Iranian International Congress of Entomology,PP: 515-525 .

43- Ribeiro, C., and Brehélin, M., 2006. Insect haemocytes: what type of cell is that, Journal of insect physiology, 52(5), PP: 417- 429.

44- Sehnal, F., Nedved, O., and Kostal, V., 2003. Temperature, Effects on Development and Growth. In: Encyclopedia of Insects, Resh, V. H., and R. T., Carde (Eds.), Academic Press, New York, PP: 1116-1119.

45- Siva‐Jothy, M. T., and Thompson, J. J., 2002. Short‐term nutrient deprivation affects immune function. Physiological Entomology. 27(3), PP: 206-212.

46- Solensky, M. J., and Larkin, E., 2003. Temperature induced variation in larval coloration in Danaus plexippus (Lepidoptera: Nymphalidae). Ann. Entomol. Soc. Am, 96, PP: 211-216.

47- Stanley, D. W., and Miller, J. S., 2006. Eicosanoid actions in insect cellular immune functions. Entomologia Experimentalis et Applicata. 119(1), PP: 1-13.

48- Strand, M. R., 2008. Insect hemocytes and their role in immunity. Insect immunology, PP: 25-47.

49- Tan, J., Xu, M., Zhang, K., Wang, X., Chen, S., Li, T., Xiang, Z., and Cui, H., 2013. Characterization of hemocytes proliferation in larval silkworm, Bombyx mori. Journal of insect physiology, 59(6), PP: 595-603.

50- Vogelweith, F., Dourneau, M., Thiery, D., Moret, Y., and Moreau, J., 2013. Geographical variation in parasitism shapes larval immune function in a phytophagous insect. Naturwissenschaften, 100, PP: 1149–1161.

51- Vogelweith, F., Moret, Y., Monceau, K., Thiéry, D., and Moreau, J., 2016. The relative abundance of hemocyte types in a polyphagous moth larva depends on diet. Journal of insect physiology, 88, PP: 33-39.

52- Washburn, J. O., Haas-Stapleton, E. J., Tan, F. F., Beckage, N. E., and Volkman, L. E., 2000. Co-infection of Manduca sexta larvae with polydnavirus from Cotesia congregata increases susceptibility to fatal infection by Autographa californica M nucleopolyhedrovirus. Journal of Insect Physiology. 46(2), PP: 179-190.

53- Yang, S. Y., Ruuhola, T., Haviola, S., and Rantala, M. J., 2008. Effects of host-plant shift on immune and other key life-history traits of an eruptive Geometrid, Epirrita autumnata (Borkhausen), Ecol, Entomol, 33, PP: 510–516.