نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه گیلان

2 گروه شیلات، دانشکده منابع طبیعی، دانشگاه گیلان، صومعه سرا، گیلان، ایران

3 استادیار گروه شیلات، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان

4 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه نامور، بلژیک

چکیده

تعیین مراحل رسیدگی جنسی و آگاهی از شرایط فیزیولوژی تولید مثل در ماهی به منظور مدیریت صحیح مولدها انجام می شود. با این هدف، کارایی استفاده از موکوس پوست به عنوان منبع مهمی از ترکیبات بیوشیمیایی و همچنین روش کم تهاجمی در تعیین مراحل رسیدگی جنسی ماهی قرمز ماده مورد بررسی قرار گرفت. نمونه گیری از ماهیان قرمز طی پنج ماه صورت گرفت و با توجه به آنالیز بافت شناسی گناد، ماهیان به پنج مرحله تولیدمثلی شامل: رشد اولیه (I)، کورتیکال آلوئولی (II)، ویتلوژنزیز اولیه (III)، ویتلوژنزیز نهایی (IV) و تخمریزی (V) تقسیم بندی و سطوح پروتئین کل محلول، کلسیم، لیپیدها (کلسترول و تری گلیسرید) و آنزیم آلکالین فسفاتاز قلیایی (ALP) در موکوس و پلاسما اندازه گیری شدند. میزان پروتئین موکوس در ویتلوژنزیز نهایی به صورت معنی داری افزایش یافت. کلسیم موکوس در کل مراحل کم تر از پلاسما بود و سطوح کلسترول و تری گلیسرید موکوس در ویتلوژنزیز افزایش یافت. سطح ALP در پلاسما پس از مراحل ویتلوژنزیز همچنان ثابت باقی ماند اما در موکوس طی مرحله تخمریزی کاهش معنی داری نشان داد . تجزیه وتحلیل شاخص گنادوسوماتیک با پروتئین موکوس همبستگی مثبت داشت. در مطالعه حاضر، سطح ALP موکوس به عنوان شاخص متمایز کننده مناسب مرحله ویتلوژنزیز و تخمریزی معرفی می شود. همچنین، نتایج نشان داد تمام فاکتورهای بیوشیمیایی موکوس پوست، قابل اندازه گیری است و از موکوس می توان بعنوان یک ابزار کم تهاجمی و جایگزین خون برای مانیتورینگ پاسخ های اندوکرینی ماهی، شاخص های تولید مثلی و مراحل رسیدگی جنسی بخصوص در مراحل ویتلوژنزیز استفاده کرد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

A Comparative study on some biochemical and enzymatic parameters of plasma and mucus during reproductive stages in goldfish (Carassius auratus)

نویسندگان [English]

  • Bahram Falahatkar 1
  • MirMasoud Sajjadi 2
  • Hamed Kolangi Miandare 3
  • Patrick Kestemont 4
  • Zahra Roosta 2

1 University of Guilan

2 Fisheries Department, Faculty of Natural Resources, University of Guilan, Sowmeh Sara, Guilan, Iran

3 Fisheries Department, University of Agriculture and Natural Resources, Gorgan, Iran

4 Research Unit in Environmental and Evolutionary Biology, Institute of Life, Earth and Environment (ILEE), University of Namur, Namur, Belgium

چکیده [English]

Determination of reproductive status and knowledge in physiological situations of fish is essential to manage brooders. So, in this study, the efficacy of skin mucosal layer was investigated as the important source of biochemical and also less-invasive method to know goldfish reproductive status. In our research, fish sampling was carried out during five months and according to the histological analysis of gonad, the fish were divided into 5 stages: primary growth (I), cortical alveoli (II), early-vitellogenesis (III), late-vitellogenesis (IV) and spawning (V). Total protein, calcium, lipids (cholesterol and triglyceride) and alkaline phosphatase (ALP) levels of mucus and plasma were measured and compared. Protein levels of mucus were significantly increased during late-vitellogenesis (P < 0.05). Mucosal calcium levels were lower than plasma. Cholesterol and Triglyceride of mucus showedsignificant enhancing during the late-vitellogenesis (P < 0.05). ALP activity was elevated in mucus more than plasma. In histological studies, the analysis of gonadosomatic index showed significant positive correlation between this factor and plasma protein as well as mucus (P < 0.01). ALP was the appropriate indicator to distinguishing vitellogenesis and spawning stages. In summary, the results of this study indicated that the biochemical factors in mucus is measurable and be considered as a less-invasive tool and alternative blood for monitoring the endocrine response, reproductive indices, and sexual stages, especially in the vitellogenesis stages.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Mucus
  • Calcium
  • Cholesterol
  • Reproductive stages
  • goldfish

مقایسه برخی پارامترهای بیوشیمیایی در پلاسمای خون و موکوس پوست جنس ماده ماهی قرمز (Carassius auratus) در مراحل مختلف رسیدگی جنسی

زهرا روستا1، بهرام فلاحتکار1،2*، میرمسعود سجادی1، حامد پاکنژاد3 و پاتریک کستمونت4

1 ایران، صومعه سرا، دانشگاه گیلان، دانشکده منابع طبیعی، گروه شیلات

2 ایران، رشت، دانشگاه گیلان، پژوهشکده حوضه آبی دریای خزر، گروه علوم دریایی

3 ایران، گرگان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، دانشکده شیلات و محیط زیست، گروه شیلات

4 بلژیک،دانشگاه نامور، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 26/9/97                تاریخ پذیرش: 11/2/98

چکیده

تعیین مراحل رسیدگی جنسی و آگاهی از شرایط فیزیولوژی تولید­مثل در ماهی به­منظور مدیریت صحیح مولد­ها انجام می­شود. با این هدف، کارایی استفاده از موکوس پوست به­عنوان منبع مهمی از ترکیبات بیوشیمیایی و همچنین روش کم­تهاجمی در تعیین مراحل رسیدگی جنسی ماهی قرمز ماده مورد بررسی قرار گرفت. نمونه­گیری از ماهیان قرمز طی پنج ماه صورت گرفت و با توجه به آنالیز بافت­شناسی گناد، ماهیان به پنج مرحله تولید­مثلی شامل: رشد اولیه (I)، کورتیکال آلوئولی (II)، زرده­سازی اولیه (III)، زرده­سازی نهایی (IV) و تخمریزی (V) تقسیم­بندی و سطوح پروتئین کل محلول، کلسیم، لیپیدها (کلسترول و تری­گلیسرید) و آنزیم آلکالین فسفاتاز قلیایی (ALP) در موکوس و پلاسما اندازه­گیری شدند. میزان پروتئین موکـوس در زرده­سازی نهایی به صورت معنی­داری نسبت به سایر مراحل تولید­مثلی افزایش یافت (05/0 > P). کلسیم موکوس در کل مراحل کم­تر از پلاسما بود و سطوح کلسترول و تری­گلیسرید موکوس در زرده­سازی افزایش یافت (05/0 > P). سطح ALP در پلاسما پس از مراحل زرده­سازی همچنان ثابت باقی ماند اما در موکوس طی مرحله تخمریزی کاهش معنی­داری نشان داد (05/0 > P). تجزیه وتحلیل شاخص گنادوسوماتیک با پروتئین موکوس همبستگی مثبت داشت (01/0 > P). در مطالعه حاضر، سطح ALP  موکوس به عنوان شاخص متمایز کننده مناسب مرحله زرده­سازی و تخمریزی معرفی می­شود. همچنین، نتایج این مطالعه نشان داد که تمام فاکتورهای بیوشیمیایی موکوس پوست، قابل اندازه­گیری است و از موکـوس می­تـوان بــه­عنوان ابزاری کم­تهاجمی و جایگزین خون جهت پایش پاسخ­های درون­ریز ماهی، شاخص­های تولید­مثلی و مراحل رسیدگی جنسی به­خصوص در مراحل زرده­سازی استفاده کرد.

واژه های کلیدی: موکوس، کلسیم، کلسترول، رسیدگی جنسی، ماهی قرمز

* نویسنده مسئول، تلفن: 09122037428  پست الکترونیکی: falahatkar@guilan.ac.ir

مقدمه

 

لایه موکوس پوست به­عنوان رابط مستقیم بین ماهی و محیط آبی عمل می­کند و دارای ترشحات و نقش­های بسیاری است. موکوس در سیستم ایمنی، تنفس، تنظیم یونی، اسمزی و تولید­مثل دخیل است (38 و 40). این لایه از پوست به­علت دسترسی سریع و آسان، به­عنوان یک ابزار تشخیصی موثر و مفید برای محققان به شمار می­رود. همچنین با نمـونه­گیری از لایه موکوسی مـی­توان از قربانی­کردن ماهی­ها، به­خصوص در گونه­های کوچک جلوگیری کرد. روش جمع­آوری موکوس، مولد­ها را از پاسخ فیزیولوژیک به عوامل استرس­زا محافظت می­کند و در مطالعات تولید­­مثلی نیز مناسب­تر از روش­های مخرب بافت شناسی گنادها و استفاده از خون، ارزیابی شده است (6، 13 و 38) نقش موکوس در تشخیص کارایی سیستم درون­ریز و تولید­مثل ماهیان با ترشح ویتلوژنین (27 و 29) و 11-کتوتستوسترون (6 و 38) و همچنین در ایمنی با ترشح لایزوزیم، کمپلمان، پروتئاز، ایمونوگلوبولین و غیره  (16 و 44) به اثبات رسیده است. بنابراین نمونه­برداری از موکوس به عنـوان روش کـم­تهاجمی/غـیر­تهاجمی در سال­های اخیر موضوع بسیاری از مطالعات را به خود اختصاص داده است و با توجه به داشتن بسیاری از ترکیبات مشابه (6، 36 و 44) جایگزین مناسبی برای خون در مطالعات گسترده مربوط به گونه­های مختلف ماهیان، به خصوص ماهیان با­ارزش خواهد بود (6، 13، 29، 38 و 44).

از ­آنجا که دانش صحیح در مورد وضعیت سیستم تولید­مثل در مطالعات آبزی پروری به­منظور مدیریت صحیـح مولـدها بسـیار ارزشـمند اسـت، تـلاش بـرای به­کارگیری روش های غیرتهاجمی برای تشخیص جنسیت و مراحل رسیدگی جنسی ادامه دارد (6 ، 14 و 48). سطوح در گردش استروئیدهای جنسی و ویتلوژنین در خون، به­عنوان تنظیم کننده­های حیاتی چرخه تولید­مثل، نشانگر مناسبی برای شناسایی جنس و / یا بلوغ جنسی به شمار می­روند (8، 14 و 25). مولکول ویتلوژنین یک گلیکوفسفولیپوپروتئین است که به­منظور رسیدگی تخمدان به خون تخلیه می­شود و حاوی مقدار زیادی کلسیم و فسفات می­باشد (26 و 33). از طرفی آلکالین فسفاتاز (ALP) یک آنزیم هیدرولاز مسئول حذف گروه های فسفات می­باشد و تحقیقات نشان داده است که این آنزیم تحت کنترل استروئیدهای جنسی بوده و محل اصلی فعالیت آن در سلول های تکای تخمدان است (10). هورمون های جنسی همچنین در بازسازی یون کلسیم در زمان رسیدگی تولید­­مثل نقش داشته که این یون در مهره داران، در طی چرخه تولیدمثلی افزایش می­یابد (3 و 4). اندازه­گیری ویتلوژنین با­توجه­به هزینه­بر بودن، لزوم دسترسی به تجهیزات آزمایشگاهی و دانش مناسب در رابطه با تعیین غلظت­های معتبر، در بسیاری از موارد امکان­پذیر نیست (4 و 29). کلسیم و فسـفر خون شاخص­های غیر­مستقیم تعیین غلظت ویتلوژنین جهت تعیین توسعه تخمدان و مرحله رسیدگی جنسی محسوب می­شوند (18، 24 و 45). در ماهی کاد (Gadus morhua) کلسیم پلاسما به­عنوان شاخص گردش استروژن در ماده­ها (10) و همچنین فاکتور تعیین کننده سطح ویتلوژنین در انواع مختلف ماهیان از جمله ماهی کپور معمولی (Cyprinus carpio) (46) و ماهیان خاویاری (4، 24 و 41) گزارش شده است. همچنین ارتباط مستقیم بین سطوح استروئیدهای جنسی با یون کلسیم و آنزیم آلکالین فسفاتاز  در ارتباط با تکامل گناد در ماهی کپور نقره ای نر و ماده گزارش شده است. از طرفی در برخی موارد اندازه­گیری آلکالین-لیبل فسفوپروتئین فسفروس، به دلیل دسترسی سریع و آسان به واکنشگرها و امکانات آزمایشگاهی، همچنین در برخی موارد نتایج دقیق تر نسبت به کلسیم ترجیح داده شده است (33). ویتلوژنین علاوه بر اتصال به پروتئین، کلسیم و فسفر پلاسما، در انتقال لیپیدها و مواد حلال در چربی ها نقش مهمی را ایفا می­­کند (4). اثر استروئیدهای جنسی در ماهی قرمز (Carassius auratus) بر تغییر غلظت فاکتورهای بیوشیمیایی خون، مانند نوسانات سطح تری­گلیسرید پلاسما (49) و در بررسی پلاسمای ازون برون (Acipenser stellatus)  نوسانات غلظت تری­گلیسرید، کلسترول، فسفر و گلوکز گزارش شده است (15). اسووبودا و همکاران  با اندازه­گیری پروتئین کل، لیپید، کلسترول، ترانس آمیناز، کراتین کیناز، آلکالین فسفاتاز و الکترولیت های موجود در پلاسمای جنس­های نر و ماده لای ماهی (Tinca tinca) اختلافاتی را در دوران قبل و بعد از تخمریزی گزارش کردند (45).

در مطالعه حاضر، از ماهی قرمز که در دنیا به­عنوان یک مدل مناسب در مطالعات تولید­مثلی و سیستم غدد درون­ریز شناخته شده است، استفاده شد. این ماهی علاوه بر نگهداری و دسترسی آسان به مولد­ها، توانایی بلوغ و تولید مثل در شرایط طبیعی و آزمایشگاهی، به دلیل پیچیدگی تشخیص دقیق مرحله رسیدگی جنسی وغیر­همزمانی تخمدان گونه هدف قرار گرفت (22 و 30).

مطالعه حاضر، به اندازه­گیری سطوح پروتئین، کلسیم، آلکالین فسفاتاز قلیایی، کلسترول و تری­گلیسرید در موکوس پوست ماهی و مقایسه سطوح ذکر شده در موکوس با غلظت­های موجود در پلاسما می­پردازد. هدف نهایی، بررسی تفکیک مراحل رسیدگی جنسی با استفاده از پارامترهای ذکر شده در موکوس پوست ماهی و مقایسه کارآمدی این روش با روش اندازه گیری پارامتر­های بیوشیمیایی پلاسمای خون و روش بافت­شناسی است.

مواد و روشها

شرایط آزمایش و نمونه­برداری: نمونه­گیری از ماهی قرمز طی فصول زمستان (وزن 65/5 ± 04/53 گرم و  طول کل 57/0 ± 57/14 سانتی­متر) و بهار (وزن 01/16 ± 60/87 گرم و  طول کل 13/1 ± 05/16 سانتی­متر) صورت گرفت. در مجموع هشتاد و دو قطعه ماهی قرمز 2 ساله پرورشی در مزرعه خصوصی (چوبه، رشت، گیلان) مورد بررسی ظاهری قرار گرفتند، غـذادهـی یک روز قبـل از نمونـه­گیری متوقـف و نمونـه­گیری­ها صبح انجام شدند. درجه حرارت آب (9/9 درجه سانتی گراد) و دوره نوری (11 ساعت روشنایی :13 ساعت تاریکی) در زمستان و همچنین درجه حرارت آب (3/13 درجه سانتی گراد) و دوره نوری (13 ساعت روشنایی: 11 ساعت تاریکی) در بهار ثبت شدند. نمونه‌برداری از ماهیان پس از بیهوشی با پودر میخک انجام گرفت (34). طبق دستورالعمل اخلاقی برخورد با موجودات آزمایشگاهی ارائه شده توسط متکاف و کریگ با کمی اصلاحات، ماهیان در دو مرحله نیمه­بیهوشی و بیهوشی تا مرگ کامل، نمونه­گیری شدند (27). برای جلوگیری از تاثیر ماده بیهوشی بر بدن ماهیان و همچنین امکان خونگیری آسان، قبل از نمونه­گیری، ماهیان در آب یخ (نیمه-بیهوشی) نگهداری شدند و نمونه­برداری از گناد نیز پس از بیهوشی کامل (ppm 100) و مرگ انجام شد.

جمع­آوری پلاسما و موکوس: خونگیری از نمونه­ها توسط سرنگ هپارینه 2 میلی لیتر از طریق باله دمی انجام شد. لوله­های مربوطه به آزمایشگاه انتقال داده شدند و پس از سانتریفیوژ (g × 1500 به مدت 20 دقیقه) نمونه­های پلاسما جداسازی و در ویال­های کدگذاری شده در دمای 60- درجه سانتی گراد تا زمان انجام آنالیزهای مدنظر ذخیره شدند (42).

نمونـه­گیری از موکـوس، بدون بیـهوشـی کامل و بـه­صورت جداگانه در هر ماهی با استفاده از سرنگ 2 میلی لیتر (بدون سوزن) انجام شد. موکوس­ عمدتا از نزدیکی باله­های پشتی، سینه­ای و شکمی جمع آوری، با نوک سرنگ به آرامی به­درون سر سوزن کشیده و برداشته شد، بلافاصله در تیوب­های 10 میلی لیتر کد­بندی شده ریخته شده و در جعبه حاوی یخ خشک ذخیره و پس از انتقال به آزمایشگاه مرکزی دانشکده منابع طبیعی دانشگاه گیلان با استفاده از سانتریفیوژ یخچال دار (g × 1500 به مدت 10 دقیقه و دمای 4 درجه سانتیگراد) مایع رویی شیری­رنگ جداسازی شده و در ویال­های مخصوص کدگذاری شده، سپس در دمای 60- درجه سانتی­گراد تا زمان اندازه­گیری فاکتورهای مدنظر نگهداری شدند (43).

بافت­شناسی گناد: پس از نمونه­برداری موکوس و خون، ماهیان کاملا بیهوش شدند و شکم ماهی به وسیله تیغ و قیچی شکافته شده و جداسازی گنادها از بدن با استفاده از پنس صورت گرفت. شاخص گنادوسوماتیک (GSI) با استفاده از فرمول (وزن گناد/ وزن بدن) ×100 مشخص شد (19). در هر نمونه­برداری، گنادهای ماده به صورت تفکیک شده کدگذاری شدند و به مدت 72 ساعت در محلول بوئن (75 میلی لیتر محلول اسید پیکریک اشباع، 25 میلی لیتر فرمالدئید 37% و 5 میلی لیتر اسید استیک گلاسیال) نگهداری و فیکس شدند. سپس در اتانول 70% ذخیره و در آزمایشگاه بافت­شناسی علوم پزشکی دانشگاه نامور (بلژیک) مورد بررسی قرار گرفتند. بافت تخمدان پس از طی مراحل آبگیری، قالب­گیری با پارافین و برش 6 میکرومتری بلوک های بافتی به­وسیله دستگاه میکروتوم (RM 2245 microtome, Leica, Germany) ، با دو روش هماتوکسیلین ائوزین (H & E) و تری کروم سبز، رنگ آمیزی شدند. مراحل رسیدگی جنسی با­استفاده از آنالیز هیستومورفومتریک (7، 9 و 34)، اندازه اووسیت­ها و درصد نسبی اووسیت­ها با شمارش 200 اووسیت در هر نمونه تخمدان ماهی (Fluorescence Microscope, BX63-OLYMPUS, Tokyo, Japan) ثبت شدند.

اندازه­گیری فاکتورهای بیوشیمیایی و آنزیمی: میزان پروتئین محلول با استفاده از روش کلرومتریک و بر اساس جذب نوری و دستورالعمل کیت مخصوص (پارس آزمون، کرج، ایران)، در طول موج 546 نانومتر مشخص شد (12). میزان کلسیم با استفاده از روش فوتومتریک اندازه گیری شد (5). بر­­اساس این روش یک ترکیب بنفش رنگ در­معرض کرسولفالتین- کروم تشکیل می­شود. مقدار جذب نوری استاندارد و نمونه­ها در طیف نوری 570 نانومتر طبق دستورالعمل کیت پارس آزمون (کرج، ایران) قرائت و محاسبه شد.

سطح کلسترول و تری­گلیسرید با روش آنزیمی تعیین شد و جذب نوری در طول موج 500 نانومتر بررسی شد (35). اندازه گیری سطح آنزیم  ALPبا استفاده از روش جذب نوری در طول موج 405 نانومتر صورت گرفت (17). اندازه­گیری فاکتورهای بیوشیمیایی ذکر شده در این مطالعه موکوس و پلاسما بر اساس دستورالعمل کیت­های مخصوص (پارس آزمون، کرج، ایران) و دستگاه اسپکتروفتومتر(Unico, New Jersey, USA) انجام شدند (20، 35 و 37).

تجزیه و تحلیل آماری: در تجزیه و تحلیل آنالیزهای آماری پس از بررسی همگنی واریانس­ها و نرمال بودن داده­ها، تفاوت میانگین داده­های به دست آمده از طریق آزمون آنالیز واریانس یکطرفه One-Way-ANOVA و تست دانکن در سطح معنی­داری 05/0 > P صورت گرفت. مقایسـه میانگین داده­های موکوس و پلاسما با استفاده از آنالیز t-test مستقل انجام شد. تعیین رابطه فاکتورهای اندازه­گیری شده از طریق آزمون همبستگی پیرسون در سطح معنی­داری 05/0 > Pو 01/0 > Pصورت گرفت. تمام تجزیه و تحلیل­های آماری با استفاده از نرم­افزار آماری SPSS نسخه 25 (SPSS Inc., IBM, USA) انجام شدند.

نتایج

در مطالعه حاضر، بافت شناسی تخمدان ماهیان قرمز 2 ساله نشان داد که اووگـونیا، اووسیت­های اولیه، اووسیت­های کورتیکال آلوئولی، اووسیت­های در مراحل زرده­سازی و تخمریزی در طی 5 ماه قابل مشاهده است. مراحل رسیدگی جنسی با استفاده از درصد نسبی اووسـیت­ها (جدول 1) (شکل 1) طبقه­بنـدی شدند. نمونـه­های تخمدانی در مراحل اولیه (I) و کورتیکال آلوئولی (II)، در زمستان و تخمدان­های مراحل زرده­سازی اولیه (III)، نهایی (IV) و همچنین در حال تخمریزی (V) در طی نمونه­گیری­های بهاری یافت شدند وGSI  (شکل 2) نیز محاسبه شد.

شکل 3 (الف) سطح پروتئین محلول موکوس و پلاسما را در مراحل مختلف رسیدگی جنسی ماده­ها در ماهی قرمز نشان می­­دهد. به طور کلی، سطح پارامترهای بیوشیمیایی در پلاسمای خون نسبت به موکوس پوست بیشتر بود. سطح پروتئین پلاسما و موکوس در مرحله زرده­سازی نهایی به طور معنی­داری افزایش یافت (05/0 > P). ولی با­این­حال، نتایج نشان داد که میزان پروتئین در پلاسما و موکوس بین گروه­های زرده­سازی و همچنین گروه رشد اولیه دارای تفاوت معنی­داری است (05/0 > P).

میزان کلسیم پلاسما در انتهای زرده­سازی افزایش معنی­داری نشان داد (05/0 > P) (شکل 3-ب). اگرچه در سطح کلسیم موکوس مراحل زرده­سازی و دیگر مراحل مختلف توسعه تخمدان تفاوت معنی­داری مشاهده شد (05/0 > P) اما سطح کلسیم موکوس نسبت به کلسیم پلاسما در تمـام مراحـل به جز تخمریزی به صورت معنی­داری کاهش نشان داد (05/0 > P).

شـکـل 3 سـطـوح چربی­ها، کلستــرول (ج) و تـری­گلیسرید (د) را در طـول دوره تـولید­مثـلی نشـان می­دهد. سطح کلسترول پلاسما در زمان زرده­سازی افزایش قابل توجهی داشت (05/0 > P) و در مرحله تخمریزی رو به کـاهش بود. میزان کلستـرول موکـوس در انتـهای زرده­سازی به صورت معنی­دار افزایش یافت (05/0 > P) و در مرحله تخمریزی نیز همچنـان ثابـت ماند. میزان تری­گلیسرید پلاسما و موکوس در طی رشد اولیه کم بوده و در طی کورتیکال آلوئولی، زرده­سازی اولیه و نهایی نیز ثابت باقی ماند. در مطالعه حاضر، سطوح لیپید پلاسما در مراحل مختف به طور معنی­داری بیشتر از موکوس بود (05/0 > P) که در اندازه­گیری­های تری­گلیسرید، مرحله تخمریزی از این قاعده مستثنی بود.

در شکل 3 (ه) نتایج نشان داد که سطح آنزیمALP  در ماهی قرمز طی مراحل رسیدگی جنسی در موکوس بالاتر از پلاسما است. با­این­حال سطوح ALP موکوس و پلاسما هیچ گونه تفاوت معنی­داری را نشان نداد، به جز در مرحله تخمریزی که سطح ALP پلاسما به صورت معنی­داری از موکوس بالاتر بود (05/0 > P). سطح این آنزیم در پلاسما طی مراحل زرده­سازی و تخمریزی ثابت باقی ماند و در موکوس با ورود به مرحله تخمریزی تفاوت معنی­داری مشاهده شد.

جدول 2 تجزیه و تحلیل همبستگی بین GSI و پارامترهای بیوشیمیایی موکوس و پلاسما را در طول کل دوره رسیدگی جنسی ارائه می­دهد. GSI همبستگی مثبت و معنی­داری با میزان پروتئین محلول در هر دو بافت موکوس پوست و پلاسمای خون ماهی قرمز و همچنین با کلسیم در واحد پلاسما (01/0 > P) دارد. ارتباط GSI با لیپیدها، کلسترول و تری­گلیسرید، در موکوس پوست منفی بود (05/0 > P).

 

 

جدول 1- طبقه­بندی پنج مرحله ای رسیدگی جنسی در ماهی قرمز (Carassius auratus) ماده بر اساس درصد نسبی اووسیت­های تخمدان. تعداد ماهیان ماده در نمونه­گیری عبارتند از: مرحله رشد اولیه (I) (7=n) ، کورتیکال آلوئولی (II) (9=n)، ویتلوژنزیز اولیه (III) (9=n)، ویتلوژنزیز نهایی (IV) (10=n)، شروع تخمریزی(6=n) (V).

مراحل رسیدگی جنسی

 

 

درصد نسبی

اووسیت ها

 

 

 

 

اووگونیا

پری نوکلئوس

کورتیکال آلوئولی

زرده­سازی اولیه

زرده­سازی نهایی

اووسیت ریخته شده

اووسیت اولیه (I)

82/10±47/38

60/13±40/44

78/11±11/17

-

-

-

کورتیکال آلوئولی (II)

11/7±90/42

72/5±08/21

62/4±40/36

-

-

-

زرده­سازی اولیه (III)

-

24/5±69/10

78/7±82/22

81/6±68/60

08/0±07/8

-

زرده­سازی نهایی (IV)

-

-

90/2±05/7

34/6±50/27

23/2±44/65

-

تخمریزی (V)

-

-

2/0±09/19

4/0±01/20

3/0±03/22

1/0±20/39

جدول 2- رابطه همبستگی پیرسون بین شاخص گنادوسوماتیک (GSI) و فاکتورهای بیوشیمیایی پلاسما و موکوس ماهی قرمز (Carassius auratus) در یک دوره تولیدمثلی (15 = n) ]رشد اولیه اووسیت­ها (3=n)، کورتیکال آلوئولی(3=n)، زرده­سازی اولیه (3=n)، زرده­سازی نهایی(3=n) و شروع تخمریزی(3=n)[

ALP

(پلاسما)

پروتئین (پلاسما)

کلسیم (پلاسما)

کلسترول (پلاسما)

تری گلیسرید

(پلاسما)

 

 

184/0-

823/0**

687/0**

497/0-

407/0-

GSI

 

 

ALP

(موکوس)

پروتئین (موکوس)

کلسیم (موکوس)

کلسترول (موکوس)

تری گلیسرید

(موکوس)

 

 

688/0-*

806/0**

458/0

596/0-*

594/0-*

GSI

 

 

 

شکل 1- بخشی از تخمدان­های (نوع تخمدان: غیرهمزمان) ماهی قرمز (Carassius auratus) 2 ساله. شکل سمت راست: رنگ آمیزی H & E و بزرگنمایی 500 میکرومتر، دارای اووگونیا (a)، اووسیت پری نوکلئوس (b)، اووسیت کورتیکال آلوئولی (c) و اووسیت زرده­سازی اولیه (b). شکل سمت چپ: رنگ آمیزی تری کروم سبز و بزرگنمایی 1 میلی­متر، دارای اووسیت زرده­سازی اولیه (a)، اووسیت زرده­سازی نهایی یا رسیده (b) و قسمتی از اووسیت ریخته شده (c).

 

شکل 2- شاخص گنادوسوماتیک (GSI) در طی مراحل مختلف رسیدگی جنسی ماهی قرمز (Carassius auratus) 2 ساله. حروف متفاوت نشان دهنده اختلاف معنی­دار است.


بحث و نتیجه گیری

تا امروز تلاش­های کمی برای مطالعه موکوس ترشحی از پوست به­عنوان منبع مهم منعکس کننده کارایی سیستم داخلی، به­ویژه محور تولید­مثل صورت گرفته است. هدف اصلی این پژوهش، تعیین چرخه تولیـد­مثل و بلـوغ گناد با­استفاده از فاکتورهای بیوشیمیایی موکوس به­عنوان ابزار مناسب، سریع و کم­تهاجمی است.

 

 

 

 

 

 

 

شکل 3- مقایسه میزان پروتئین محلول (الف)، کلسیم (ب)، کلسترول (ج)، تری­گلیسرید (د) و آلکالین فسفاتاز قلیایی (ه) طی مراحل مختلف رسیدگی جنسی در پلاسما و موکوس ماهی قرمز (Carassius auratus). حروف متفاوت انگلیسی نشان دهنده اختلاف معنی دار است. اختلاف معنی دار بین پلاسما و موکوس در هر مرحله به صورت جداگانه با علامت ستاره مشخص شده است.

 

 

در این مطالعه، میزان پروتئین محلول سطح موکوس در طول زرده­سازی افزایش یافت که شاخص مناسبی برای متمایز نمودن این مرحله از رسیدگی جنسی در ماده­ها تلقی می­شود. میزان پروتئین پلاسما، مشابه با موکوس در مرحله زرده­سازی افزایش و در تخمریزی کاهش یافت. در واقع، E2 به عنوان یک استروئید جنسی مهم در جنس ماده به­عنوان محرک تولید ترکیب ویتلوژنین بوده و می­تواند سطوح پروتئین را در پروسه زرده­سازی بوسیله افزایش بازتولید پروتئین در کبد افزایش دهد (10، 22 و 48). همچنین مشابه با نتایج این آزمایش، اسووبودا و همکاران افزایش سطح پروتئین کل خون لای ماهی را در زمان قبل از تخمریزی و بلافاصله در مرحله تولید­مثل مورد بررسی قرار دادند که نتایج مشابه دریافت شد (45). فیزیولوژی تولید­مثل ماهی با استفاده از روند تکاملی گناد به راحتی قابل بررسی است. با استفاده از GSI می­توان وضعیت تولیدمثلی ماهی و زمان تخمریزی را مشخص نمود (1 و 28). اکاگاوا و همکاران با بررسـی هورمون­های خون و شاخص­های توسعه تخمدان ماهی قرمز، مشابه با نتایج این تحقیق، بیان کردند که GSI قبل از تخمریزی سریعا افزایش و پس از تخمریزی کاهش می­یابد (21). در این تحقیق، نتایج ارتباط بین GSI، به عنوان یکی از فاکتورهای مهم وضعیت رشد تخمدان با پروتئین پلاسما و موکوس مثبت بوده و می­تواند نشان دهنده تاثیر توسعه گنادی بر ترشحات موکوس باشد. همبستگی توسعه تخمدان با غلظت ویتلوژنین پلاسما، پروتئین کل و کلسیم در بسیاری از مطالعات اثبات شده است (4، 15، 24 و 45). اگرچه در این مطالعه، ارتباط بین GSI و کلسیم فقط در پلاسما مثبت نشان داده شد.

به طور کلی، کلسیم یکی از ابزارهای مهم برای شناسایی شرایط بلوغ ماهی است که با توسعه گناد افزایش می­یابد (4، 24 و 33). نتایج این تحقیق با مقایسه کلسیم در مراحل مختلف رسیدگی تخمدان نشان داد که سطح کلسیم پلاسما در سطح زیاد و قابل توجهی طی مراحل شروع تا انتهای زرده­سازی قرار دارد. اگرچه سطح کلسیم پلاسما به صورت معنی­دار بیشتر از موکوس بود اما کارایی استفاده از اندازه­گیری کلسیم موکوس در تمایز مراحل رسیدگی جنسی قابل تایید بود. در راستای این نتایج، لینارس-کازناو و همکاران تأیید کرده­اند که بین ویتلوژنین پلاسما و کلسیم در مرحله پیش زرده­سازی همبستگی وجود دارد (24). این نتیجه­گیری با مطالعه حاضر مشابه بوده و می­تواند قدم مناسبی برای اثبات مراحل رسیدگی جنسی (به خصوص در تفکیک مراحل پیش زرده­سازی و زرده­سازی) توسط اندازه­گیری میزان کلسیم باشد. عدم همبستگی توسعه تخمدان و کلسیم موکوس را می­توان به عملکرد فیزیولوژی تولید­­مثل ماهی قرمز، نوع تخمدان و غیرهمزمان بودن اووسیت­ها نسبت داد. همچنین یاسمی و همکاران، با اندازه­گیری کلسیم خون ماهی کپور نقره ای Hypophthalmichthys molitrix گزارش کردند که در مراحل مختف و همزمان با پیشرفت رسیدگی جنسی این پارامتر افزایش می یابد (3). فلاحتکار و پورحسین سارمه، تفاوت معنی­داری در میزان کلسیم پلاسمای ماهی سوف Sander lucioperca در زمان پس از تخمریزی با قبل از آن مشاهده نکردند. اگرچه به صورت کلی، میزان کلسیم در مولدهای نر و ماده پس از تخمریزی روند صعودی داشت. آن­ها تغییرات مولدهای ماده را حاکی از تغییرات سطوح ویتلوژنین در گردش خون معرفی کردند (2).

ویتلوژنین ماهی قرمز شامل فسفولیپیدها (19) و پروتئین­های زرده شامل لیپوویتلین­ها و فوسفویتین­ها (46) می­باشد که می­تواند منجر به افزایش سطح فسفولیپید در مراحل ویتلوژنین شود. همچنین این امکان وجود دارد که مـاهی لیـپوپروتئـین­هـا را برای گـردش کلسـترول و تری­اسیل­گلیسرول نیاز داشته باشد (23 و 40). علاوه بر این پارامترهای محیطی می­توانند بر خروجی­های تولید­مثل  ازجمله استروئیدهای جنسی پلاسما که در میزان سطوح لیپوپروتئین دخیل هستند، تاثیر بگذارند (31 و 39). تری­گلیسرید پلاسما در مراحل ابتدایی رشد و تخمریزی مولدها کاهش یافته که مشابه با یافته­های کوکامن و همکاران مبنی بر نوسان تری­گلیسرید در قزل آلای رنگین کمان Oncorhynchus mykiss طی بلوغ و تخمک­گذاری است (23). رابطه­ای بین سطوح چربی پلاسما در جنس نر و ماده ، تغییرات محیطی (11) و همچنین وضعیت تولیدمثل وجود دارد (45 و 47). در­واقع، چربی­­ها انرژی لازم را بوسیله متابولیک در طول زمان زرده­سازی تامین می­کنند (4 و 23). در مطالعه حاضر، تری­گلیسرید موکوس در ماهی قرمز شاخص مناسب­تری در طی مراحل تولید­مثلی قبل از تخمریزی برای میزان اعتبار حضور زیاد چربی بود. این فرضیه وجود دارد که نه تنها ویتلوژنین منبع مهم تامین چربی اووسیت­هاست، بلکه لیپوپروتئین­ها نیز ممکن است در انتقال چربی به تخمدان دخیل باشند (4).

افزایشALP  پلاسما ماهی قرمز به عنوان آنزیم فعال در مراحل زرده­سازی مشاهده شده است و فرض بر این است که تجزیه و تحلیل ALP یک معیار مناسب جهت اندازه­گیری غیرمستقیم عملکرد ویتلوژنین می باشد (4 و 33). در مطالعه حاضر، موکوس پوست نتایج متفاوت و جالبی را ارائه داد، به­این­صورت که میزان این آنزیم در طول تخمریزی در سطح بالایی باقی ماند. مشابه با نتایج این تحقیق، ALP پلاسما به طور معنی­داری در مولدین ماهی آزاد اقیانوس اطلس Salmo salar و لای ماهی Tinca tincaدرطی زرده­سازی به طور قابل توجهی افزایش یافته است (18 و 45). این موضوع نقش حیاتی سیستم آنزیمی را به­عنوان منبع ذخیره­سازی فسفات برای سنتز کبدی ویتلوژنین نشان می­دهد (5 و 32). نکته قابل ملاحظه در این مطالعه، افزایش بیشتر فعالیت APL موکوس نسبت به پلاسما در طی مراحل رسیدگی جنسی قبل از تخمریزی بود و درنتیجه تفکیک مرحله زرده­سازی و تخمریزی را به­خوبی نشان داد. در ماهی کپور نقره اینیز میزان آنزیم آلکالین فسفاتاز خون در جنس نر و ماده در تمامی مراحل رسیدگی جنسی تفاوت داشت (3). علاوه بر ALP، اندازه­گیری سطح کلسیم موکوس می­تواند در تمایز ماهیان بالغ (مراحل زرده سازی) و ماهیان مرحله اولیه رشد اووسیت­ها مورد استفاده قرار بگیرد. اندازه­گیری پروتئین کل در موکوس برای تفکیک مرحله انتهایی زرده­سازی و مراحل پایین­تر و همچنین تخمریزی قابل استناد می­باشد. استفاده از کلسترول و تری­گلیسرید نیز، تنها در تشخیص مراحل انتهایی زرده­سازی و رشد اولیه اووسیت­ها قابل بررسی است.

نتایج حاصل از مطالعه کنونی بیانگر امکان استفاده از موکوس سطحی پوست برای شناسایی مراحل مختلف رسیدگی جنسی در ماهی قرمز ماده است. دیدگاه مثبت این تحقیق، کارایی موکوس پوست در چرخه تولید­مثلی به عنوان یک روش کم­تهاجمی است. این تحقیق اولین بررسی روی فاکتورهای بیوشیمیایی موکوس ماهی است و نیازمند تحقیقات بیشتری در سایر گونه­ها به­خصوص گونه­های بومی و با ارزش که نیازمند به دانستن چرخه تولید­مثلی و بازسازی ذخایر مولدین هستند، می­باشد.

سپاسگزاری

بدین وسیله از پژوهشکده دریای خزر که نقش اصلی در تامین بودجه این پژوهش را بر­عهده داشتند، کمال تشکر و قدردانی را داریم. از زحمات آقای مهندس سلیمی مدیر "مزارع پرورش گلدفیش، چوبه"، آقای دکتر عبدالعلی راهداری و خانم ها مهندس سکینه ابراهیمی، نغمه جعفری و راضیه نظری طی نمونه­گیری و همچنین همکاری آقای مهندس زمانی مسئول آزمایشگاه شیلات (دانشکده منابع طبیعی، دانشگاه گیلان) قدردانی می­گردد. از زحمات بی­دریغ آقای دکتر Benoit Balau در "آزمایشگاه هیستولوژی دانشکده پزشکی نامور بلژیک" نیز در­راستای آموزش روش­ها و استفاده از دستگاه­ها قدردانی می گردد.

  1. حسینی ع، ستوده ا، موسوی ز، محمدی م و عباس زاده ا. 1396. زیست شناسی تولیدمثل سیاه­ماهی (Capoeta capoeta intermedia) دررودخانه شاپور (استان بوشهر). مجله پژوهشهای جانوری (مجله زیست شناسی ایران). 30 (1)، 51-59.
  2. فلاحتکار ب و پورحسین سارمه، س. تغییرات بیوشیمیایی، استروئیدهای جنسی و پارامترهای هماتولوژیک در قبل و پس از تخمریزی ماهی سوف سفید Sander licioperca. مجله پژوهشهای جانوری (مجله زیست شناسی ایران). 26(3)، 343-333.
  3. یاسمی م، رفیع پرهیزکار ح، تیزکار ب و یوسفی جوردهی ا. 1395. تغییرات سطوح هورمون های استروئید جنسی، یون کلسیم و آنزیم آلکالین فسفاتاز طی مراحل مختلف رسیدگی جنسی در مولدین کپور نقره ای Hypophthalmichthys molitrix‎.. مجله پژوهشهای جانوری (مجله زیست شناسی ایران). 29(4)، 503-514.
    1. Akhavan, S.R., Salati, A.P., Falahatkar, B., and Jalali, S.A.H., 2016. Changes of vitellogenin and lipase in captive Sterlet sturgeon Acipenser ruthenus females during previtellogenesis to early etresia. Fish Physiology and Biochemistry, 42 PP: 967-978.
    2. Baginski, E.S., Marie, S.S., Clark, W.L., and Zak, B., 1973. Direct micro determination of serum calcium. Clinica Chimica Acta, 46 PP: 46-54.
    3. Barkowski, N.A., and Haukenes, A.H., 2014. Investigating the utility of measuring 11α-ketotestosterone and vitellogenin in surface mucus as an alternative to plasma samples in assessments of the reproductive axis of white bass. North American Journal of Aquaculture, 76 PP: 112-118.
    4. Blazer, V.S., 2002. Histopathological assessment of gonadal tissue in wild fishes. Fish Physiology and Biochemistry, 26 PP: 85-101.
    5. Chu-Koo, F., Dugué, R., Aguilar, M.A., Daza, A.C., Bocanegra, F.A., Veintemilla, C.C., Duponchelle, F., Renno, J.F., Tello, S., and Nunez, J., 2009. Gender determination in the Paiche or Pirarucu (Arapaima gigas) using plasma vitellogenin, 17β-estradiol, and 11-ketotestosterone levels. Fish Physiology and Biochemistry, 35 PP: 125-136.
    6. Crime, L.W., and Glebe, B. D., 1990. Reproduction (in: Methods for fish biology edit, Schreck & Moyle), American Fisheries Society Publication, PP: 529-553.
    7. Dahle, R., Taranger, G.L., Karlsen, Ø., Kjesbu, O.S., and Norberg, B., 2003. Gonadal development and associated changes in liver size and sexual steroids during the reproductive cycle of captive male and female Atlantic cod (Gadus morhua L.). Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology, 136 PP: 641-653.
    8. De Pedro, N., Guijarro, A.I., López‐Patiño, M.A., Martínez‐Álvarez, R., and Delgado, M.J., 2005. Daily and seasonal variations in haematological and blood biochemical parameters in the tench, Tinca tinca Linnaeus, 1758. Aquaculture Research, 36 PP: 1185-1196.
    9. Doumas, B.T., Bayse, D.D., Carter, R.J., Peters, T., and Schaffer, R., 1981. A candidate reference method for determination of total protein in serum. I. Development and validation. Clinical Chemistry, 27 PP: 1642-1650.
    10. Dzul-Caamal, R., Salazar-Coria, L., Olivares-Rubio, H.F., Rocha-Gómez, M.A., Girón-Pérez, M.I., and Vega-López, A., 2016. Oxidative stress response in the skin mucus layer of Goodea gracilis (Hubbs and Turner, 1939) exposed to crude oil: A non-invasive approach. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology, 200 PP: 9-20.
    11. Falahatkar, B., Akhavan, S.R., Tolouei Gilani, M.H., and Abbasalizadeh, A., 2013. Sex identification and sexual maturity stages in farmed great sturgeon, Huso huso L. through biopsy. Iranian Journal of Veterinary Research. 14(2): 133-139.
    12. Falahatkar, B., Poursaeid, S., Meknatkhah, B., Khara, H., and Efatpanah, I., 2014. Long-term effects of intraperitoneal injection of estradiol-17β on the growth and physiology of juvenile stellate sturgeon Acipenser stellatus. Fish Physiology and Biochemistry, 40 PP: 365-373.
    13. Fast, M.D., Sims, D.E., Burka, J.F., Mustafa, A., and Ross, N.W., 2002. Skin morphology and humoral non-specific defence parameters of mucus and plasma in rainbow trout, coho and Atlantic salmon. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology, 132 PP: 645-657.
    14. Fischbach, F., and Zawta, B., 1992. Age-dependent reference limits of several enzymes in plasma at different measuring temperatures. Klin Lab, 38 PP: 555-61.
    15. Johnston, C.E., Horney, B.S., Deluca, S., MacKenzie, A., Eales, J.G., and Angus, R., 1994. Changes in alkaline phosphatase isoenzyme activity in tissues and plasma of Atlantic salmon (Salmo salar) before and during smoltification and gonadal maturation. Fish Physiology and Biochemistry, 12 PP: 485-497.
    16. Hori, S.H., Kodama, T., and Tanahashi, K., 1979. Induction of vitellogenin synthesis in goldfish by massive doses of androgens. General and Comparative Endocrinology, 37 PP: 306-320.
    17. Hrubec, T.C., and Smith, S.A., 1999. Differences between plasma and serum samples for the evaluation of blood chemistry values in rainbow trout, channel catfish, hybrid tilapias, and hybrid striped bass. Journal of Aquatic Animal Health, 11 PP: 116-122.
    18. Kagawa, H., Young, G., and Nagahama, Y., 1984. In vitro estradiol-17β and testosterone production by ovarian follicles of the goldfish, Carassius auratus. General and Comparative Endocrinology, 54 PP: 139-143.
    19. Kobayashi, M., Sohn, Y.C., Yoshiura, Y., and Aida, K., 2000. Effects of sex steroids on the mRNA levels of gonadotropin subunits in juvenile and ovariectomized goldfish Carassius auratus. Fisheries Science, 66 PP: 223-231.
    20. Kocaman, E.M., Yanik, T., Erdogan, O., and Ciltas, A.K., 2005. Alterations in cholesterol, glucose and triglyceride levels in reproduction of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Journal of Animal and Veterinary Advances, 4 PP: 801-804.
    21. Linares-Casenave, J., Kroll, K.J., Van Eenennaam, J.P., and Doroshov, S.I., 2003. Effect of ovarian stage on plasma vitellogenin and calcium in cultured white sturgeon. Aquaculture, 221 PP: 645-656.
    22. Loke-Smith, K.A., Sundberg, M.A., Young, K.A., and Lowe, C.G., 2010. Use of morphology and endocrinology to predict sex in California sheephead: evidence of altered timing of sex change at Santa Catalina Island, California. Transactions of the American Fisheries Society, 139 PP: 1742-1750.
    23. Maltais, D., and Roy, R.L., 2009. Purification and partial characterization of vitellogenin from shorthead redhorse (Moxostoma macrolepidotum) and copper redhorse (Moxostoma hubbsi) and detection in plasma and mucus with a heterologous antibody. Fish Physiology and Biochemistry, 35 PP: 241-254.
    24. Metcalfe, J.D., and Craig, J.F., 2011. Ethical justification for the use and treatment of fishes in research: an update. Journal of Fish Biology, 78 PP: 393-394.
    25. Migaud, H., Fontaine, P., Sulistyo, I., Kestemont, P., and Gardeur, J.N., 2002. Induction of out-of-season spawning in Eurasian perch Perca fluviatilis: effects of rates of cooling and cooling durations on female gametogenesis and spawning. Aquaculture, 205 PP: 253-267.
    26. Moncaut, N., Nostro, F.L., and Maggese, M.C., 2003. Vitellogenin detection in surface mucus of the South American cichlid fish Cichlasoma dimerus (Heckel, 1840) induced by estradiol-17β. Effects on liver and gonads. Aquatic Toxicology, 63 PP: 127-137.
    27. Nelson, E.R., Allan, E.R., Pang, F.Y., and Habibi, H.R., 2010. Thyroid hormone and reproduction: regulation of estrogen receptors in goldfish gonads. Molecular Reproduction and Development, 77 PP: 784-794.
    28. Orlando, E.F., Binczik, G.A., Denslow, N.D., and Guillette Jr, L.J., 2007. Reproductive seasonality of the female Florida gar, Lepisosteus platyrhincus. General and Comparative Endocrinology, 151 PP: 318-324.
    29. Popesku, J.T., Martyniuk, C.J., Mennigen, J., Xiong, H., Zhang, D., Xia, X., Cossins, A.R., and Trudeau, V.L., 2008. The goldfish (Carassius auratus) as a model for neuroendocrine signaling. Molecular and Cellular Endocrinology, 293 PP: 43-56.
    30. Pottinger, T.G., Pulman, K.G.T., Carrick, T.R., and Scott, A.P., 2005. Evaluation of biochemical methods for the non‐destructive identification of sex in upstream migrating salmon and sea trout. Journal of Fish Biology, 67 PP: 1514-1533.
    31. Potki, N., Falahatkar, B. and Alizadeh, A., 2018. Growth, hematological and biochemical indices of common carp Cyprinus carpio fed diets containing corn gluten meal. Aquaculture International, 26 PP:1573-1586.
    32. Rifai, N., Bachorik, P.S., and Albers, J.J., 1999. Lipids, Lipoproteins and Apolipoproteins. Tietz textbook of clinical chemistry. 3rd ed. Philadelphia: WB Saunders Company. 809-861.
    33. Rinchard, J., and Kestemont, P., 1996. Comparative study of reproductive biology in single‐and multiple‐spawner cyprinid fish. I. Morphological and histological features. Journal of Fish Biology, 49 PP: 883-894.
    34. Roosta, Z., Ghiasi, S., and Falahatkar, B., 2018. Comparative study on hormones and biochemistry indices in plasma, ovarian fluid and oocytes of LHRHa2-induced female Stellate sturgeon (Acipenser stellatus). Aquaculture Research. 10.1111/are.13876
    35. Schultz, D.R., Perez, N., Tan, C.K., Mendez, A.J., Capo, T.R., Snodgrass, D., Prince, E.D., and Serafy, J.E., 2005. Concurrent levels of 11‐ketotestosterone in fish surface mucus, muscle tissue and blood. Journal of Applied Ichthyology, 21 PP: 394-398.
    36. Sharpe, R.L., and MacLatchy, D.L., 2007. Lipid dynamics in goldfish (Carassius auratus) during a period of gonadal recrudescence: effects of β-sitosterol and 17β-estradiol exposure. Comparative Biochemistry and Physiology Part C, 145 PP: 507-517.
    37. Shepherd, R.H., and Koch, E.A. 1994. Function for fish mucus. Reviews in Fish Biology and Fisheries 4: 401-429.
    38. Stahl, M.T., Whitledge, G.W., and Kelly, A.M., 2009. Reproductive biology of middle Mississippi River shovelnose sturgeon: insights from seasonal and age variation in plasma sex steroid and calcium concentrations. Journal of Applied Ichthyology, 25 PP: 75-82.
    39. Spanò, L., Tyler, C.R., van Aerle, R., Devos, P., Mandiki, S.N.M., Silvestre, F., Thomé, J.P., and Kestemont, P., 2004. Effects of atrazine on sex steroid dynamics, plasma vitellogenin concentration and gonad development in adult goldfish (Carassius auratus). Aquatic Toxicology, 66 PP: 369-379.
    40. Subramanian, S., MacKinnon, S.L., and Ross, N.W., 2007. A comparative study on innate immune parameters in the epidermal mucus of various fish species. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 148 PP: 256-263.
    41. Subramanian, S., Ross, N.W., and MacKinnon, S.L., 2008. Comparison of antimicrobial activity in the epidermal mucus extracts of fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 150 PP: 85-92.
    42. Svoboda, M., Kouřil, J., Hamáčková, J., Kalab, P., Savina, L., Svobodova, Z., and Vykusova, B., 2001. Biochemical profile of blood plasma of tench (Tinca tinca L.) during pre-and postspawning period. Acta Veterinaria Brno, 70 PP: 259-268.
    43. Tyler, C.R., and Sumpter, J.P., 1990. The development of a radioimmunoassay for carp, Cyprinus carpio, vitellogenin. Fish physiology and Biochemistry, 8 PP: 129-140.
    44. Wallaert, C., and Babin, P.J., 1994. Age-related, sex-related, and seasonal changes of plasma lipoprotein concentrations in trout. Journal of Lipid Research, 35 PP: 1619-1633.
    45. Webb, M.A., Feist, G.W., Foster, E.P., Schreck, C.B., and Fitzpatrick, M.S., 2002. Potential classification of sex and stage of gonadal maturity of wild white sturgeon using blood plasma indicators. Transactions of the American Fisheries Society, 131 PP: 132-142.
    46. Wiegand, M.D., and Peter, R.E., 1980. Effects of sex steroids on plasma lipids in the goldfish, Carassius auratus. Canadian Journal of Zoology, 58 PP: 967-972.