نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 عضو هیئت علمی دانشگاه اراک
2 دانشگاه اراک
چکیده
هدف: هدف از این مطالعه بررسی اثر روغن سیاهدانه بر بافت کبد موش در پی سمیت نانو ذرات نقره بود.
روش بررسی: 24 سر موش نر بالغ نژاد NMRI به چهار گروه کنترل، نانوذرات نقره (mg/kg/day 500، گاواژ)، روغن سیاهدانه (ml/kg/day 5، گاواژ) و در نهایت نانوذرات نقره به علاوه روغن سیاهدانه تقسیم و به مدت 35 روز تیمار شد. ارزیابی بافتی کبد با استفاده از روشهای استریولوژیک انجام شد. سطوح سرمی آلانین آمینو ترانسفراز (ALT)، آسپارتات آمینوترانسفراز (AST) و مالون دی آلدئید (MDA) نیز اندازهگیری شد. داده ها با استفاده از آزمون آنالیزواریانس یک طرفه تجزیه وتحلیل آماری شد و تفاوت میانگین ها در حد (05/0P
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Evaluation of the protective effect of Nigella sativa oil on liver in NMRI male mice following silver nanoparticles toxicity.
نویسندگان [English]
1 proffesor
2 Arak University
چکیده [English]
Introduction
The aim of this study was to investigate the effect of Nigella sativa oil (NSO) on mice liver following silver nanoparticles toxicity.
Materials and methods:
24 adult male NMRI mice were divided into 4 groups: control, SNP (500mg/kg/day, gavage), NSO (5ml/kg/day, gavage) and finally SNP plus NSO and treated for 35 days. Histological assessment of liver were performed using stereological methods. The serum levels of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and malondialdehyde (MDA) were also measured.
Results:
A significant decrease in the mean relative weight of liver, the total volume of the central veins, the total volume of the connective tissue, arteries and veins in the portal tracts and a significant increase in the total volume of sinusoids, bile ductules, the hepatocytes cell volume and serum levels of MDA and ALT and AST enzymes were observed in the silver nanoparticles group compared with the control group. The major of silver nanoparticles-induced Liver damages improved in the silver nanoparticles + Nigella sativa oil group to the control ones.
Conclusion:
The results of this study suggest that Nigella sativa oil can protect the liver from silver nanoparticles damage.
کلیدواژهها [English]
ارزیابی اثر حفاظتی روغن سیاهدانه بر بافت کبد موشهای نرNMRI متعاقب سمیت نانو ذرات نقره
سید محمد علی شریعت زاده*، فاطمه مقدمی و پریسا مالکی
ایران، اراک، دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه زیستشناسی
تاریخ دریافت: 14/5/98 تاریخ پذیرش: 26/9/98
چکیده
باوجود استفاده گسترده از نانو ذرات نقره نگرانیهایی در مورد اثرات بیولوژیک آنها بر روی سلامت انسان وجود دارد. هدف از این مطالعه بررسی اثر روغن سیاهدانه بر بافت کبد موش در پی سمیت نانو ذرات نقره بود. 24 سر موش نر بالغ نژاد NMRI به چهار گروه کنترل، نانو ذرات نقره (mg/kg/day 500، گاواژ)، روغن سیاهدانه (ml/kg/day 5، گاواژ) و درنهایت نانو ذرات نقره بهعلاوه روغن سیاهدانه تقسیم و به مدت 35 روز تیمار شد. ارزیابی بافتی کبد بااستفاده از روشهای استریولوژیک انجام شد. سطوح سرمی آلانین آمینو ترانسفراز (ALT)، آسپارتات آمینوترانسفراز (AST) و مالون دیآلدئید (MDA) نیز اندازهگیری شد. دادهها با استفاده از آزمون آنالیزواریانس یکطرفه تجزیهوتحلیل آماری شد و تفاوت میانگینها در حد (05/0P<) معنیدار در نظر گرفته شد. کاهش معنیداری در میانگین وزن نسبی کبد، حجم کل ورید مرکزی، حجم کل شریان، بافت همبند و ورید دستگاه پورتال و افزایش معنیداری در حجم کل سینوزوئیدها، مجرای صفراوی، حجم سلول هپاتوسیت و سطوح MDA و آنزیمهای ALT و AST در گروه نانو ذرات نقره نسبت به گروه کنترل مشاهده شد (05/0P<). اکثر آسیبهای کبدی القاشده توسط نانو ذرات نقره، در گروه نانو ذرات نقره + سیاهدانه در حد گروه کنترل بهبود یافت. نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که روغن سیاهدانه میتواند کبد را از آسیب نانو ذرات نقره محافظت کند.
واژههای کلیدی: نانو ذرات نقره، روغن سیاهدانه، موش، کبد، استریولوژی
* نویسنده مسئول، تلفن: 4172401(0863)- 09181629026، پست الکترونیکی: S-Shariatzadeh@araku.ac.ir
مقدمه
پیشرفت سریع نانو تکنولوژی و تنوع کاربردهای آن موجب شده است که مواد با ابعاد نانو بطور وسیعی مورد استفاده قرارگیرند. نانو ذرات نقره در بین نانو ذرات مختلف بیشترین مصرف را دارند، بطوریکه30 درصد محصولات حاوی نانو مواد دارای نانو ذرات نقره هستند (29). امروزه نانو ذرات نقره به دلیل خصوصیات بیولوژیکی خاص در جنبههای مختلف زندگی کاربردهای متفاوتی دارند (4). بهعنوان مثال در پزشکی برای ترمیم سوختگی و زخمها، بانداژهای آغشته به نانو ذرات نقره بسیار خوب عمل میکنند .استفاده در ابزار و ادوات دندانپزشکی و مواد مخصوص پرکردن دندان و پروتزهای دندانی، کاربرد در وسایل جراحی و پروتزهای استخوانی، مواد و ابزار جلوگیری کننده از آبستنی، مواد ضد عفونی کننده و شوینده و درمان بیماریهای عفونی مقاوم به آنتیبیوتیکها از موارد دیگر استفاده از این ذرات در پزشکی می باشند (4و 17). درصنایع غذایی نیز برای بسته بندی مواد غذایی، جهت حفاظت از مواد غذایی و برای افزایش ماندگاری و ذخیره مواد غذایی کاربرد دارند (4، 13و 29). نقره در ابعاد نانو دسترسی بیشتری به بافتها، سلولها و مولکولهای بیولوژیک در بدن موجودات زنده دارد (5) و استفاده وسیع آن احتمالاً میتواند سلامت انسان و حتی سایر جانورانی را که در معرض قرار میگیرند، مورد مخاطره قرارداده و آسیبهایی از قبیل تحلیل بافت و بروز اختلال در عملکرد بافتهای مختلف را موجب شود. ازجمله بافتهای هدف نانو ذرات نقره میتوان کبد را نام برد. کبد بزرگترین غده در بدن است که عمده سلولهای تشکیلدهنده آن هپاتوسیتها هستند که عملکردهای متنوعی از قبیل متابولیسم، سمزدایی، ذخیره گلیکوژن و... برعهده دارد. در واقع در معرض آسیب بسیاری از داروها و سموم قراردارد. آسیب کبدی به دنبال مصرف چنین عواملی میتواند برگشتپذیر و درمانپذیر باشد، اما ممکن است منتج به نارسایی کبدی حاد (FHF) و مرگ گردد (14و 23). ازجمله اثرات نامطلوب آن بر روی کبد بهعنوان مهمترین اندام هدف نانو ذرات گزارششده است بهویژه زمانی که از طریق گوارش وارد بدن شود و میتواند با ایجاد استرس اکسیداتیو در عملکرد کبد اختلال ایجاد کند (9). پژوهشها نشان داده است که آنتیاکسیدانها (آنزیمی و غیرآنزیمی) از طریق مکانیسمهای دفاع آنتیاکسیدانی مختلف میتوانند رادیکالهای آزاد را خنثی کرده و توانایی حفظ هموستاز اکسیداتیو و مقابله با استرس اکسیداتیو را دارند (16). گیاه سیاهدانه بانام علمی Nigella sativa از خانواده آلاله گیاهی است که اثرات ضد اکسایشی، ضدالتهابی و... آن باعث شده است اثرات فارماکولوژیک متعددی مانند کاهش قند، دفع صفرا و اسید اوریک، محافظ بافتهای کبد، کلیه و قلب و عروق از آن گزارش شود (3). لذا دراین مطالعه به بررسی اثرات حفاظتی و آنتیاکسیدانی گیاه سیاهدانه بر روی موشهای نر تیمار شده با نانو ذرات نقره میپردازیم.
مواد و روشها
روش بررسی: بهمنظور انجام این تحقیق 24 سر موش نر بالغ از نژادویستار از انیستیتوپاستور ایران خریداری و در خانه حیوانات دانشگاه اراک در شرایط استاندارد (دمای 2±21 درجه سانتیگراد و نور محیطی با شرایط 12 ساعت تاریکی و12 ساعت روشنایی) و دسترسی آزاد به آب و غذا جهت سازگاری با محیط به مدت 2 هفته نگهداری شد. موشهای نر به4 گروه (6n=) ترتیب زیر تقسیم شدند: کنترل، نانو ذرات نقره )500 میلیگرم بر کیلوگرم(، عصاره سیاهدانه) 5 میلیلیتر بر کیلوگرم( و نانوذرات نقره+ عصارهی سیاهدانه.
روش تهیه روغن سیاهدانه: دانههای سیاهدانه، که نمونهای از آن در هر باریوم گروه فارماکوکنوزی مرکز تحقیقات گیاهان دارویی جهاد دانشگاهی نگهداری میشود، تهیه گردید و سپس در هاون چینی آسیاب شد و دانههای آسیاب شده با مقدار مناسبی از اتانول در دستگاه عصاره گیری (سوکسیله) قرارگرفت و حرارتدهی و استخراج ادامه یافت تا حلال کاملاً تبخیر شود. در مرحله بعد رطوبت عصاره بااستفاده از سدیم سولفات بدون آب (Na2So4) حذف شد و روغن حاصل وزن و در یک ظرف تاریک نگهداری و درصد روغن استخراجشده توسط معادله زیر محاسبه شد.
100× ( وزن روغن/وزن نمونه) = درصد روغن استخراجشده
روغن گیاه (بهصورت متیلاستر اسیدهای چرب) با استفاده از دستگاه کروماتوگرافی گازی و ردیابFID و نوع ستونSGE-BX70 (به طول 30 متر و قطر 25/0 میلیمتر) و ازت بهعنوان گاز حامل، آنالیز گردید. اجزای روغن توسط مقایسه زمان بازداریشان با نمونه شاهد شناسایی شدند. (محلولهای شاهد شامل متیل استر اسیدهای لوریک، پالمتیک، استئاریک، اولئیک، لینولئیک و ایکوزادینوئیک با غلظت یک درصد بودند.)
روش تیمار: تیمار موشها بافاصله زمانی 24 ساعت به مدت35 روز انجام گرفت که دوز مورد استفاده برای تیمار با نانو ذرات نقره500 میلیگرم بر کیلوگرم در هر روز (12) و برای عصارهی سیاهدانه دوز5 میلیلیتر بر کیلوگرم انتخاب شد.
پس از پایان دوره تیمار ابتدا موشها وزن شدند سپس با دی اتیل اتر بیهوش شدند و پس از تشریح، کبد برداشته و وزن شد و سپس حجم کبد با روش شناورسازی (Immersion) اندازهگیری شد (21).
بعد از شستشو در نرمال سالین بهمنظور ثبوت بافت کبد در فیکساتیو NBF به مدت7 روز قرار داده شد.
بعدازآنکه کبدها در فیکساتیو NBF فیکس شدند از آنها برش IUR گرفته شد. برای تهیه برشهای IUR از بافت کبد از دو ساعت فی (ф) و تتا (θ) استفاده گردید. روش کار به این صورت بود که ابتدا هر لوب کبد به صورت تصادفی بر روی ساعت فی (ф) قرارگرفت سپس عدد تصادفی از جدول اعداد بین صفر تا 9 انتخاب و سپس کبد در امتداد عدد انتخاب شده برش زده شد. نتیجه این برش ایجاد دو قطعه از هرلوب کبد بود. قطعه اول از هرلوب بر روی ساعت تتا (θ) طوری قرارگرفت که سطح برش خورده در طول محور 0-0 ساعت تتا قرارگرفت. سپس یک عدد تصادفی انتخاب و این قطعه مجدداً در امتداد آن عدد برش داده شد. ادامه برشها به صورت موازی و مساوی با برش اول زده شد و قطعه دوم هر لوب بهاندازه 90 درجه چرخانده شد تا سطح برش خورده مماس بر محور 0-0 ساعت تتا (θ) قرارگیرد. سپس یک عدد تصادفی انتخاب و برشها بهموازات عدد انتخاب شده تهیه شد. این برشهای IUR طوری در داخل بسکتها قرارداده شد که درنهایت از سطح دوم برش خورده بافت در میکروتوم برش گرفته شود. سپس برشها آماده شده در دستگاه پاساژ قرارداده شد و فرآیند پاساژ بافتی صورت گرفت. بعد از پاساژ بافتی، قالبگیری و تهیه بلوک پارافینی که حاوی نمونه هستند توسط میکروتوم برشگیری صورت گرفت، از بلوکها برشهای 5 و 15 میکرونی با تنظیم میکروتوم گرفته شد و روی لام قرار میدهیم، سپس لامها در سبدهای مخصوص رنگآمیزی قرارداده شد و به روش هاید ن هان آزان رنگآمیزی شدند.
محاسبهچروکیدگی: برای محاسبه میزان چروکیدگی بااستفاده از تروکار به صورت تصادفی دو یا سه قطعه گرد از برشهای IUR کبد هر موش بااستفاده از کولیس ورنیه دو قطر عمود بر هماندازهگیری و میانگین شعاع آنها محاسبه شد. پس از پاساژ بافتی و رنگآمیزی مجدداً قطر عمود بر هم قطعات اندازهگیری و میانگین شعاع آنها بهعنوان شعاع پس از تثبیت بافتی در نظر گرفته شد و طبق فرمول زیر میزان چروکیدگی مربوط به کبد هر موش محاسبه شد (11).
بااستفاده از فرمول -Shirinkage 1، حجم نهایی نسبت به حجم اولیه محاسبه شد و سپس با ضرب آن در حجمی که به روش Immersion بهدستآمده بود، حجم واقعی کبد به دست آمد.
محاسبه دانسیته حجمی اجزای کبد: برای محاسبه دانسیته حجمی اجزای کبد از میکروسکوپ مدل ) (OlympusB×41TE ساخت ژاپن و نرمافزار Olysia استفاده شد .بااستفاده از روش نمونهگیری تصادفی منظم (Systematic Random sampling) بهطور میانگین 14-10 میدان دید از اسلایدهای 5 میکرونی مورد بررسی قرارگرفت .روش محاسبه کسر حجمی اجزاء کبد بهاینترتیب بود که پروب 25 نقطهای بهطور کاملاً تصادفی و بدون هیچگونه سوگیری روی هر میدان دید انداخته شد و کسر حجمی هپاتوسیتها، سینوزوئیدها، بافت بینابینی، ورید مرکزی، ساختارهای تریاد پورتال شامل: وریدها، سرخرگها و مجاری صفراوی محاسبه شد. شمارش نقاط برای اندازهگیری حجم اجزاء نام برده شده به روش زیر انجام گرفت.
1- کل نقاط برخورد کرده از پروب با کل میدان دید انتخاب شده شمارش شد. به همین ترتیب نقاط برخورد کرده با هپاتوسیتها و دیگر اجزای کبد شمارش گردید. در همه میدانهای دید انتخابی این عمل انجام گرفت.
2- سپس اعداد به دست آمده از شمارش نقاط برخورد کرده با هریک از اجزاء در همه میدانهای دید مربوط به هر کبد جمع شده و به صورت ΣP بیان شد.
3- با تقسیم مجموع نقاط به دست آمده از هر جزء بهطور جداگانه بر مجموع کل نقاط برخورد کرده با تصویر کبد دانسیته حجمی (Volume density)مربوط به هریک از اجزای نام برده شده حاصل شد. سپس حجم کل مربوط به هریک از اجزاء بهطور غیرمستقیم و بهوسیله ضرب کردن دانسیته حجمی در حجم کل کبد در هر موش تخمین زده شد (21 و22).
Vstructure = Vliver × Vv structure
تخمینتعدادسلولهایهپاتوسیتدربافتکبد: برای محاسبه تعداد سلولهای هپاتوسیت، از روش اپتیکال دایسکتور (optical dissector) و از فریم مخصوص شمارش (unbiased counting frame) استفاده شد، به این صورت که توسط میکروسکوپ با بزرگنمایی 100 از تمامی اسلایدهای 15 میکرونی بهطور میانگین تعدادی میدان دید انتخاب و از دستگاه میکروکیتور برای شمارش استفاده شد. ابتدا از دو ناحیه به نام Guard zoon به ضخامت 5 میکرون از بالا و پایین برشهای 15 میکرونی برای شمارش صرفنظر شد، سلول ذکرشده راکه با فریم موردنظر انتخاب شده و با خط ممنوعه برخورد نکرده بود را شمارش کردیم، برای فیلدهای بعدی نیز این مراحل تکرار شد.
سپس دانسیته عددی سلولها به دست آمد عدد حاصل در حجم کل کبد مربوطه ضرب شد و تعداد کل انواع سلولهای مورد نظر محاسبه شد (21 و22). از فرمول زیر برای محاسبه تعداد سلولها استفاده شد.
N (total)=Nv×V(totalliver)
تخمینحجم سلولهپاتوسیتوهستهآن: برای محاسبه حجم هپاتوسیت و هسته آن از روش نوکلئاتور (Nucleator) استفاده شد. دراین روش از برشهای 15میکرونی استفاده شد و بهطور تصادفی و با استفاده از فریم مخصوص شمارش بدون جهتگیری، از میدان دید انتخاب شده توسط میکروسکوپ Olympus (BX14TE) که به دوربین عکاسی) DP12 (Olympus ساخت ژاپن مجهز بود و نرمافزار Olysaبا100= ob عکس گرفته شد (شکل 1). برای محاسبه کردن حجم هپاتوسیت، از نرمافزار موتیک استفاده شد، به این صورت که از مرکز هسته تا غشای هپاتوسیت اندازهگیری شد و برای حساب کردن حجم هسته، از مرکز هسته تا غشای هسته اندازهگیری شد (21 و 22). اندازهگیریها در دو جهت مختلف انجام شد و حجم بوسیله رابطه زیر محاسبه شد.
Ln =اندازه مرکز هسته تا غشاء هپاتوسیت یا مرکز هسته تا غشاء هسته
محاسبهسنجشمالوندیآلدئیدسرم(MDA): ابتدا محلول تیوباربیوتیک اسید (TBA) 375 درصد (وزن/حجم)، تری کلرواستیک اسید(TCA)15 درصد (وزن/حجم)، اسیدکلریدریک(HCL) 25 درصد نرمال تهیه شد. سپس به نسبت 2 به 1 (2میلیلیتر از محلول و یک میلیلیتر از نمونه) در یک اپندرف مخلوط شد و نمونهها به مدت 15 دقیقه دربن ماری قرار داده شد. بعد از خارج کردن نمونهها از بن ماری، بهسرعت در زیرآب سرد خنک شده و به مدت 10 دقیقه سانتریوفوژ شدند. بعد مایع رویی جدا شد و جذب آن در 532 نانومتر در برابر بلانک که حاوی تمام ترکیبات بهجز نمونه بود، خوانده شد .غلظت مالون دی آلدئید با استفاده از ضریب خاموشی (Cxtinction coefficient) آنکه عبارت است از M-1CM-1 105× 56/1میباشد، محاسبه شد و برحسب میکرومولار بیان شد (8).
سنجش فعالیت آنزیمهای کبدی: سنجش فعالیت آنزیم کبدی آسپارتات آمینو ترانسفراز (AST) با استفاده از کیت آنزیمی CO بیوشیمی (شرکت پارس آزمون 92003.(lot no ، آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) با استفاده از کیت آنزیمی CO بیوشیمی )شرکت پارس آزمون92005.(lot no با کمک دستگاه اتوآنالایزر (COBAS MIRA) انجام شد ( 27).
آنالیزآماری: درنهایت دادههای حاصل توسط نرمافزار Spss مدل 16 و روش آنالیز واریانس یکطرفه (Oneway ANOVA)و تست Tukeyمورد تجزیهوتحلیل آماری قرارگرفت و تفاوت میانگینها در سطح (05/0>P) معنیدار در نظر گرفته شد.
نتایج
وزن موش و کبد (gr): از مقایسه میانگین وزن موش و وزن کبد پس از اتمام دوره تیمار در بین گروههای مختلف اختلاف معنیداری مشاهده نشد (05/0P>). میانگین وزن نسبی کبد در پایان دوره تیمار در گروه نانو ذرات نقره در مقایسه با گروه کنترل (03/0P<) و گروه روغن سیاهدانه (04/0P<) کاهش معنیداری را نشان داد (جدول 1).
حجم کل کبد، حجم ورید مرکزی، حجم سلول هپاتوسیت، حجم هسته هپاتوسیت
میانگین حجم کبد در پایان دوره تیمار در بین گروهها اختلاف معنیداری را نشان نداد (05/0P>). حجم ورید مرکزی در گروه نانو ذرات نقره نسبت به گروه کنترل کاهش معنیداری داشت (001/0P<) اما درگرو تیمار همزمان نانو ذرات نقره و روغن سیاهدانه حجم ورید مرکزی نسبت به گروه نانو ذرات نقره افزایش داشت اما این افزایش معنیدار نبود. میانگین حجم سلول هپاتوسیت درگروه نانوذرات نقره نسبت به گروه کنترل افزایش معنیداری داشت (003/0P<) و در گروه نانو ذرات نقره + روغن سیاهدانه حجم سلول هپاتوسیت در حد گروه کنترل بود. بررسی حجم هسته هپاتوسیت در بین گروههای مختلف موش تفاوت معنیداری نشان نداد (جدول 2).
جدول1- مقایسه میانگین وزن موش ووزن کبددرگروه های مختلف موش نربالغ پس از 35 روزتیمار با نانو ذرات نقره (/kg/day mg500) و روغن سیاهدانه (ml/kg/day5). مقادیر به صورت means±sd میباشند. میانگینهای باکد حرفهای متفاوت دارای تفاوت معنیدار میباشند (05/0P< و(one way ANOVA, Tukeys test
جدول 2- مقایسه میانگین حجم کبد، حجم ورید مرکزی برحسب (mm3 )، حجم سلول هپاتوسیت و هسته آن برحسب(μm3) درگروه های مختلف موش نربالغ پس از 35 روزتیمار با نانو ذرات نقره /kg/day) mg500) و روغن سیاهدانه(ml/kg/day5). مقادیر به صورت means±sd میباشند. میانگینهای باکد حرفهای متفاوت دارای تفاوت معنیدار میباشند(05/0P< و(one way ANOVA, Tukeys test)
میانگین حجم هپاتوسیت ها، حجم سینوزوئیدها و حجم بافت بینابینی:میانگین کل حجم هپاتوسیتها در بین گروههای مختلف تفاوت معنیداری را نشان نداد. میانگین حجم سینوزوئید ها در گروه نانو ذرات نقره نسبت به گروه کنترل افزایش معنیدار(03/0P<) و میانگین حجم بافت بینابینی کاهش معنیداری داشت (02/0 P<)(جدول 3).
تعداد هپاتوسیتها (108×)، تعداد سلولهای هپاتوسیت (108×) در بافت کبد موشهای تیمار شده با نانو ذرات نقره نسبت به گروه کنترل و گروه عصاره کاهش معنیداری نشان داد (001/0P< ). تعداد این سلولها در گروه نانو ذرات نقره + روغن سیاهدانه تا حدی افزایش یافت ولی به حد گروه کنترل نرسید (جدول 4).
غلظت مالون دی آلدئیدو آنزیمهای کبدی: غلظت مالون دی آلدئید در گروه نانو ذرات نقره نسبت به گروه کنترل (001/0P<)، گروه سیاهدانه (004/0P<) و گروه نانو ذرات نقره + روغن سیاهدانه (001/0P<) افزایش معنیداری نشان داد. غلظت مالون دی آلدئید در گروه نانو ذرات نقره + روغن سیاهدانه تا حدودی کاهش یافت و به گروه کنترل نزدیک شد.
مقدار آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز(ALT) درگروه نانو ذرات نقره نسبت به گروه کنترل افزایش معنیداری داشت (006/0P<). همچنین نسبت به گروه نانو ذرات نقره + سیاهدانه( 02/0P<) و گروه سیاهدانه (001/0P<) تفاوت معنیدار را نشان داد (جدول 5).
جدول3- مقایسه میانگین حجم هپاتوسیت ها، حجم سینوزوئید هاو حجم بافت بینابینی برحسب (mm3) درگروه های مختلف موش نربالغ پس از 35 روزتیمار با نانو ذرات نقره /kg/day) mg500( و روغن سیاهدانه(ml/kg/day5). مقادیر به صورت means±sd میباشند. میانگینهای با کد حرفهای متفاوت دارای تفاوت معنیدار میباشند( 05/0P< وone way ANOVA, Tukeys test)).
جدول 4- مقایسه میانگین تعداد هپاتوسیت ها (8 10×)، درگروه های مختلف موش نربالغ پس از 35 روزتیمار با نانو ذرات نقره /kg/day) mg500( و روغن سیاهدانه (ml/kg/day5). مقادیر به صورت means±sd میباشند. میانگینهای با کد حرفهای متفاوت دارای تفاوت معنیدار میباشند (05/0P< و (one way ANOVA, Tukeys test.
جدول 5- مقایسه میانگین غلظت مالون دی آلدئید(n mol/ml) و مقدار آنزیمهای کبدی درگروه های مختلف موش نر بالغ پس از 35 روزتیمار با نانو ذرات نقره /kg/day) mg500) و روغن سیاهدانه (ml/kg/day5). مقادیر به صورت means±sd میباشند. میانگینهای باکد حرفهای متفاوت دارای تفاوت معنیدار میباشند (05/0P< و (one way ANOVA, Tukeys test)
B |
A |
C |
D |
شکل1- تصاویر میکروسکوپی از بافت کبد موشها در گروههای مختلف، تیمار شده با نانو ذرات نقره(500 mg/kg/day) و روغن سیاهدانه ( ml/kg/day 5)، برشهای 5 میکرونی، (رنگآمیزی هایدن هاین آزان، بزرگنمایی400X ).A) بافت طبیعی کبد در گروه کنترل. B) بافت کبد در گروه تیمار نانو ذرات نقره (التهاب سینوزوئید ها و دژنراسیون هپاتوسیتها توسط پیکان نشان داده شده است). C) بافت کبد در گروه تیمار روغن سیاهدانه (به گروه کنترل شباهت زیادی دارد). D) بافت کبد در گروه نانو ذرات نقره+ عصاره سیاهدانه (وضعیت هپاتوسیت ها و سینوزوئیدها نسبت به گروه نانو ذرات نقره بهبودیافته است).
بحث
نانوتکنولوژی با تولید نانو ذرات و کاربرد وسیع آنها در سراسر جهان رشد سریعی داشته است. مطالعات زیاد در شرایط آزمایشگاهی حاکی از این است که این مواد اثر سمی بر سلولهای جداشده از کبد، پوست، ریه، مغز، سیستم عروقی و اندامهای تناسلی دارند (2). مکانیسمهای القای اثر سمیت نقره شامل تأثیر این ذرات بر غشای سلولی، میتوکندری، و ماده ژنتیکی میباشد. در این بررسی تیمار موشهای بالغ نژاد NMRI با نانو ذرات نقره در دوز500 میلیگرم بر کیلوگرم روزانه به مدت 35 روز، عدمتغییر وزن موش، کاهش وزن نسبی کبد و کاهش حجم ورید مرکزی مشاهده شد. در بررسی که توسط فاطمی و نوری در خصوص تأثیر نانو ذرات نقره در دوره شیردهی بر کبد نوزادان موش صحرایی صورت گرفت درگروه تیمارنانوذرات نقره (25میلیگرم بر کیلوگرم) به صورت گاواژ و به مدت 12 روز، هیچگونه اختلاف معنیداری در وزن بدن نسبت به گروه کنترل دیده نشد (9). در مطالعه اون جونگ پارک و همکارانش در سال 2010، در موشهای تیمارشده با نانو ذرات نقره (22، 42 و 71 نانومتر) و دوز1میلیگرم بر کیلوگرم به مدت 14روز، تغییر معنیداری در وزن موش و وزن نسبی کبد مشاهده نشد (7). در مطالعه Rashno و همکارانش در سال 2014، که بر روی موشهای ماده باردار صورت گرفت پس از 28 روز تیمار با نانو ذرات نقره (10نانومتر) در غلظتهای 50،5 میلیگرم بر کیلوگرم از طریق تزریق زیر جلدی هیچگونه تغییر معنیداری در وزن بدن مادران و نوزادان در مقایسه با گروه کنترل مشاهده نشد (25). باتوجه به مطالعات دیگران، کاهش وزن نسبی کبد در مطالعه حاضر میتواند ناشی از استفاده از دوز بالای نانو نقره در این مطالعه یا بیشتر بودن طول مدت تیمار نسبت به مطالعات گذشته باشد. دراین مطالعه حجم سلول هپاتوسیت در گروه نانو ذرات نقره نسبت به گروه کنترل افزایش معنیداری نشان داد. در مطالعه Najjaran و همکارانش روی موشهای صحرایی، مصرف خوراکی نانو ذرات نقره با سایز 70 نانومتر و دوز 50،100،200 ،25 میلیگرم بر کیلوگرم به مدت 28 روز، در دوز (50میلیگرم) و دوزهای بالاتر تورم و هایپرتروفی سلولهای هپاتوسیت اطراف ورید مرکزی مشاهده شد (19). در مطالعه Zamani و همکارانش در سال 2013، گروهی از موشهای نر توسط نانو ذرات نقره با دوز ppm3000 به مدت 20 روز به روش داخل صفاقی تیمار شدند، درنهایت تجمع سلولهای التهابی و تورم هپاتوسیتها در فضای پورتال و اطراف ورید مرکزی دیده شد (30). در مطالعهای که توسط Ziaee Ghahnavieh و همکارانش در سال 2013 بر روی 32 سر موش سوری نر نژاد آلبینو با میانگین وزنی 25 گرم صورت گرفت، پس از تماس پوستی نانو ذرات طلا با غلظت ppm100،50،25 به میزان 2/0 میلیگرم به مدت 14 روز متوالی، تورم و هایپرتروفی سلولهای هپاتوسیت مشهود بود (31). نانو نقره در طولانیمدت سرطانزا میباشد و توسط آنزیمها در میکروزومهای کبدی متابولیزه میشود و این خود منجر به آسیب هپاتوسیتها، آپاپتوز و درنهایت نکروز میشود. آلودگی طولانیمدت با نانو نقره مخصوصاً در دوزهای بالا منجر به فیبروز کبدی (رسوب کلاژن و التهاب وتورم هپاتوسیتها) میشود (19). پژوهشگران با استناد به یافتههای دانشمندی به نام Del Monte و همکارانش در سال 2005 دلیل بروز چنین شرایطی را در سلولهای کبدی اختلال در عملکرد غشا و ورود حجیم آب و یون سدیم به درون سلول ناشی از اثر ذرات نانو عنوان کردهاند (6). این تورم سلولی میتواند همراه با نشت آنزیمهای هیدرولیز کننده لیزوزومی بوده و منجر به تخریب سیتوپلاسم و تولید ماکرو مولکولهای ابری شکل شود.
همچنین طی بررسی دادخواه و همکاران اسانس برخی مواد، کبد را در برابر آسیب اکسیداتیو القاء شده توسط
نانو ذرات محافظت مینماید و این تأثیر محافظتی با خواص آنتیاکسیدانی اسانس ارتباط دارد (1). در مطالعه حاضر تعداد هپاتوسیتها در گروه نانو ذرات نقره نسبت به گروه کنترل کاهش معنیداری نشان داد. در مطالعه Zamani و همکارانش در سال 2013، گروهی از موشهای نر توسط نانو ذرات نقره با دوز ppm 3000 به مدت 20 روز به روش داخل صفاقی تیمار شدند که در نهایت دژنراسیون هپاتوسیتها و بافت کبد مشاهده شد (30). در بررسی که در سال 2015 توسط Heydarnejad و همکارانش بر روی موشهای نر و ماده نژاد (بالبسی) Balb cصورت گرفت در گروه تیمارنانوذرات نقره با دوز ppm 50 (خوراکی)، به مدت 14روز، واکوئله شدن سیتوپلاسم هپاتوسیتها همراه با دژنراسیون و نکروز مشاهده شد (10). نانو ذرات نقره میتوانند گونههای فعال اکسیژن (ROS) و رادیکالهای آزاد را تولید نموده، تجمع بیشازحد ROS میتواند پاسخ التهابی را آغاز کند و منجر به تخریب میتوکندری شود در نتیجه سطح GSH (گلوتاتیون سولفات هیدروژناز) به دلیل التهاب کاهش مییابد، بنابراین فاکتورهای آپاپتوز ازجمله سیتوکرومC آزاد شده و منجر به مرگ سلولی میشود (19).
بهعنوان یک مکانیسم پیشنهادی برای توجیه این مشاهدات میتوان این نظریه را مطرح کرد که تخریب سیتوپلاسمی و هسته سلولهای کبدی به دنبال تجویز این نانو ذرات گویای این نکته است که این ذرات با پروتئینها و آنزیمهای بافت کبدی واکنش نشان داده و سبب اختلال در عملکردهای دفاعی علیه آنتیاکسیدانها در این بافتها شده و با تولید ترکیبات دارای اکسیژن فعال باعث آتروفی (Atrophy) و نکروز در این بافت ها شده است (6). برخی دانشمندان دلایل دیگری را برای تغییرات مشاهده شده در سلولهای کبدی مطرح میکنند. این دانشمندان معتقدند که به دنبال تماس ترکیبات آسیبرسان به این بافت فعالیت بیشازحد طبیعی سلولهای کبدی برای متابولیزه کردن و بیرون ریختن این ترکیبات سمی از بدن طی مراحل سمزدایی سبب بروز این تغییرات در سلولهای کبدی میشود (24).
حجم سینوزوییدها در گروه نانو ذرات نقره نسبت به گروه کنترل افزایش معنیداری داشت. در مطالعه Fatemi و همکارش روی موشهای صحرایی، مصرف خوراکی نانو ذرات نقره با دوز (25میلیگرم بر کیلوگرم) به مدت 12 روز، موجب اتساع و پرخونی سینوزوئید ها شد (9).
در بررسی که در سال 2015 توسط Heydrnejad و همکارانش بر روی موشهای نر و ماده نژاد بالبسی صورت گرفت در گروه تیمار نانو ذرات نقره با دوز ppm 50 (خوراکی)، به مدت 14روز، التهاب و پرخونی و درنتیجه افزایش حجم سینوزوییدها دیده شد (10).
در مطالعهای که توسط Ziaee Ghahnavieh و همکارانش در سال 2013 بر روی 32 سر موش سوری نر نژاد آلبینو با میانگین وزنی 25 گرم صورت گرفت، پس از تماس پوستی نانو ذرات طلا با غلظت ppm100،50،25 به میزان 2/0 میلیگرم به مدت 14 روز متوالی، در غلظت ppm 50، افزایش حجم سینوزوید ها مشاهده شد (31).
دراین مطالعه غلظت مالون دی آلدئیدو فعالیت ALT در گروه نانو ذرات نقره نسبت به گروه کنترل و سایر گروهها افزایش معنیداری نشان داد. در واقع لیپیدها از مهمترین مولکولهایی هستند که مورد تهاجم رادیکالهای آزاد قرار میگیرند .دراین میان غشای سلولها که غنی از اسیدهای چرب غیراشباع است بیشتر از سایر قسمتهای سلول به پراکسیداسیون حساس است. پراکسیداسیون لیپیدها منجر به کاهش سیالیت غشاء و از بین رفتن ساختمان و عملکرد آن میشود که در پاتوژنز بسیاری از بیماریها دخالت دارد. محصول نهایی ناشی از پر اکسیداسیون لیپیدها مالون دی آلدئید میباشد (12).
سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز؛ آنزیمهای آنتیاکسیدانی هستند که یک سیستم تدافعی را علیه گونههای فعال اکسیژن Reactive Oxygen (Species; ROS ) تشکیل دادهاند (15).
افزایش میزان مالون دی آلدئید در موشهای دریافتکننده نانو ذرات نقره، نشاندهنده افزایش واکنشهای پراکسیداسیونی است که به ضعف مکانیسمهای تدافعی آنتیاکسیدانی منجر میشود و بدین ترتیب ممانعت از تشکیل مفرط رادیکالهای آزاد مقدور نخواهد بود (18).
ALT وAST جزء آنزیمهای غیرعملکردی پلاسما هستند که بهطور طبیعی در سلولهای برخی از اندامها ازجمله کبد قرارگرفتهاند. یکی از دلایل افزایش سطح سرمی این آنزیمها ممکن است تغییر در نفوذپذیری غشای پلاسمایی سلولهای کبدی و یا صدمات سلولی حاصل از قرارگرفتن در معرض نانوذره نقره باشد (27). زمانی که نانو مواد از طریق گوارش وارد بدن میشوند پس از ورود، در کبد، طحال و بیضهها تجمع مییابند که منجر به جذب سلولی میشود. حذف نانو مواد توسط ماکروفاژهای کبدی منجر به تولید رادیکالهای آزاد میشود (31). احتمالاً رادیکالهای آزاد حاصل از نانو ذرات نقره با آسیب به کبد باعث پراکسیداسیون لیپیدهای غشای آن و درنتیجه کاهش سیالیت غشاء و از بین رفتن ساختمان و عملکرد آن شده و متعاقباً منجر به افزایش غلظت آنزیمهای کبدی در خون شده است. بنابراین بالا رفتن این آنزیمها نشانهای از تخریب سلولهای کبدی است (27) ازآنجاکه کبد یک ارگان مهم در متابولیسم و سمزدایی مواد خارجی و سمی است و با آسیبپذیری خود طی متابولیزه کردن مواد بیگانه در واکنشهای پیچیده که خود باعث اثرات مخرب بر بافت کبد میشود، موجب کاهش صدمه به بدن میگردد (20). ایزو آنزیمهایAST هم در میتوکندری و هم در سیتوپلاسم و آنزیم ALT فقط درسیتوپلاسم سلولها وجود دارد (26)، بنابراین افزایش سطح ALT دلیلی بر آسیب غشای میتوکندری و غشای هپاتوسیت های کبد به علت حمله اکسیدانی رادیکالهای آزاد حاصل از نانو ذرات میباشد.
بازگشت مقادیر افزایشیافته آنزیمهای سرمی شاخص آسیب کبد به حالت طبیعی خود بهوسیله عصاره سیاهدانه میتواند در اثر جلوگیری از نشت آنزیمهای داخل سلولی به دلیل حفظ یکپارچگی غشای سلول و یا نوزایش و ترمیم سلولهای آسیبدیده کبد باشد (28).
نتیجهگیری
با توجه به نتایج این پژوهش نانو ذرات نقره قادر به القاء
سمیت در بافت کبد موش میباشد. نتایج ما کاهش معنیداری در میانگین وزن نسبی کبد، حجم کل ورید مرکزی، حجم کل شریان، بافت همبند و ورید دستگاه پورتال و افزایش معنیداری در حجم کل سینوزوئیدها، مجرای صفراوی، حجم سلول هپاتوسیت و سطوح MDA و آنزیمهای ALT و AST در گروه نانو ذرات نقره نسبت به گروه کنترل نشان داد. عصاره سیاهدانه نیز با خاصیت آنتیاکسیدانی قوی خود توانست اثرات سوء نانو نقره را بر بافت کبد در این مطالعه کاهش دهد.
تشکر و قدردانی
این مقاله حاصل پایاننامه خانم فاطمه مقدمی برای اخذ درجه کارشناسی ارشد در رشته زیست سلولی تکوینی از دانشکده علوم پایه دانشگاه اراک بود و با حمایت مالی حوزه معاونت محترم پژوهشی و فناوری دانشگاه اراک به انجام رسیده است. در ضمن از کمکهای ارزشمند خانم نادری در این مطالعه صمیمانه سپاسگزاری میشود.