نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران

چکیده

سرطان ریه از رایج ترین سرطان ها در مردان و زنان است و در سطح جهانی در حال گسترش می ‌باشد. مطالعات پیشین نشان دادند که استفاده از نانوذرات اکسیدروی به علت خواص منحصر به فردشان، می‌ توانند عامل امیدبخشی در درمان سرطان باشند. هدف از مطالعه حاضر بررسی اثر نانوذرات اکسیدروی بر استرس اکسایشی در سلول های سرطانی غیرکوچک ریه انسان (A549) می‌ باشد. سلول های A549 با غلظت های مختلف از نانوذره اکسیدروی تیمار شد و سنجش MTT و رنگ آمیزی تریپان بلو برای تعیین IC50 و توان زیستی سلول در روزهای 1، 3، 5 و 7 انجام شد. همچنین برای بررسی اثرات آپوپتوزی غلظت IC50 این نانوذرات از روش‌ های رنگ آمیزی گیمسا و اکریدین اورنج/اتیدیوم بروماید و اندازه‌گیری فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز استفاده‌ شد. نتایج نشان داد که نانوذرات اکسیدروی درصد بقای سلول های A549 را به صورت وابسته به دوز و زمان کاهش داده و غلظت IC50 به دست آمده mg/mL 5 بود. نتایج رنگ ‌آمیزی نشان ‌دهنده افزایش درصد سلول ‌های آپوپتوز یافته در گروه ‌های تیمار سلولی بود. همچنین نتایج آنزیمی ‌نشان داد که فعالیت هر دو آنزیم در گروه ‌های تیمار در مقایسه با گروه کنترل به طور معنی ‌داری افزایش یافت. نتایج این پژوهش نشان داد که نانوذرات اکسیدروی توانایی القای مرگ سلولی را در سلول ‌های سرطانی ریه دارند و امید است که در آینده بتوان با هدفمند کردن این نانوذره به عنوان یک ترکیب دارویی جدید در درمان سرطان مورد استفاده قرار گیرد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

The Effect of Zinc Oxide Nanoparticles on Oxidative Stress in A549 Human Non-small Lung Cancer Cells.

نویسندگان [English]

  • Mahnaz Kesmati
  • Fatemeh Pouratar
  • Elham Hoveizi

Department of Biology, Faculty of Science, Shahid Chamran University of Ahvaz, Ahvaz, Iran

چکیده [English]

Lung cancer is one of the most common cancers in both men and women and it is growing worldwide. Previous studies have shown that using Zinc Oxide nanoparticles (ZnO-NP) can be a promising agent in cancer treatment, because of their unique properties. The purpose of current study is to investigate the effect of ZnO-NP on oxidative stress in A549 human non-small lung cancer cells. A549 cells with were treated with different concentrations of Zinc Oxide nanoparticles. MTT assay and Trypan blue staining were performed to measure IC50 concentration and cell viability on days 1, 3, 5 and 7. Also, to investigate the apoptotic effects of IC50 concentration of these nanoparticles, Giemsa and AO/EB staining methods and anti-oxidant enzymes superoxide dismutase and catalase activity measurements were used. The results showed that ZnO-NP reduced the A549 cells viabilities in a dose and time dependent manner, and the obtained IC50 concentration was 5mg/mL. The results of stainings indicated an increase in percentage of apoptotic cells in treatment groups. Furthermore, enzyme measurement results showed that the activity of both enzymes in treatment groups was significantly increased in comparison to the control group. The results of this study demonstrated that ZnO-NP have the ability to induce cell death in lung cancer cells and we hope that with organizing this nanoparticle as a new medical compound, it will be used in cancer treatment.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Zinc oxide nanoparticles
  • Lung cancer
  • oxidative Stress
  • Apoptosis

اثر نانوذرات اکسیدروی بر استرس اکسایشی در سلول‌های سرطان ریه غیرکوچک انسان A549

مهناز کسمتی*، فاطمه پورعطار و الهام حویزی

ایران، اهواز، دانشگاه شهید چمران اهواز، دانشکده علوم، گروه زیست‌شناسی

تاریخ دریافت: 4/12/97                تاریخ پذیرش: 6/2/99

چکیده

سرطان ریه از رایج‌ترین سرطان‌ها در مردان و زنان است و در سطح جهانی در حال گسترش می‌باشد. مطالعات پیشین نشان دادند که استفاده از نانوذرات اکسیدروی به علت خواص منحصر به فردشان، می‌توانند عامل امیدبخشی در درمان سرطان باشند. هدف از مطالعه حاضر بررسی اثر نانوذرات اکسیدروی بر استرس اکسایشی در سلول‌های سرطانی غیرکوچک ریه انسان (A549) می‌باشد. سلول‌های A549 با غلظت‌های مختلف از نانوذره اکسیدروی تیمار شد و سنجش MTT و رنگ آمیزی تریپان بلو برای تعیین IC50 و توان زیستی سلول در روزهای 1، 3، 5 و 7 انجام شد. همچنین برای بررسی اثرات آپوپتوزی غلظت IC50 این نانوذرات از روش‌های رنگ آمیزی گیمسا و اکریدین اورنج/اتیدیوم بروماید و اندازه­گیری فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز استفاده­ شد. نتایج نشان داد که نانوذرات اکسیدروی درصد بقای سلول‌های A549 را به‌صورت وابسته به دوز و زمان کاهش داده و غلظت IC50 به دست آمده mg/mL 5 بود. نتایج رنگ­آمیزی نشان­دهنده افزایش درصد سلول‌های آپوپتوز یافته در گروه‌های تیمار سلولی بود. همچنین نتایج آنزیمی­نشان داد که فعالیت هر دو آنزیم در گروه‌های تیمار در مقایسه با گروه کنترل به‌طور معنی‌داری افزایش یافت. نتایج این پژوهش نشان داد که نانوذرات اکسیدروی توانایی القای مرگ سلولی را در سلول‌های سرطانی ریه دارند و امید است که در آینده بتوان با هدفمند کردن این نانوذره به‌عنوان یک ترکیب دارویی جدید در درمان سرطان مورد استفاده قرار گیرد.

واژه­های کلیدی: نانوذرات اکسیدروی، سرطان ریه، استرس اکسیداتیو، آپوپتوز

*نویسنده مسئول: تلفن: 33331045- 061، پست الکتریکی: m.kesmati@scu.ac.ir

مقدمه

 

امروزه بیماری­های صعب العلاج فراوانی در جامعه بشری گسترش یافته است. با پیشرفت جوامع و رواج سبک زندگی شهری حدود یک چهارم مرگ‌ومیرها به علت سرطان رخ می‌دهند (4و 10). تا اوایل قرن بیستم سرطان ریه ازجمله بیماری­های نادری بود که پس‌ازآن به‌تدریج گسترش یافت به‌طوری که امروزه سرطان ریه اولین عامل مرگ‌ومیر ناشی از سرطان در خانم­ها (26%) و آقایان (29%) و ازنظر آماری دومین سرطان رایج (با نسبت 15 درصد از کل سرطان­ها) پس از سرطان سینه در خانم­ها و پروستات در آقایان است (3).

سرطان ریه را براساس اندازه و بروز سلول­های بدخیم به دو گروه اصلی طبقه‌بندی می­نمایند: سرطان ریه با سلول­های کوچک (SCLC) که 15 درصد از موارد سرطانی را شامل می­شود و سرطان ریه با سلول­های غیرکوچک (NSCLC) که 85 درصد موارد باقیمانده را در بر می­گیرد و NSCLC خود به سه زیر گروه پاتولوژیکی عمده تقسیم می­شود که شامل: 1- سلول­های کارسینومای سنگفرشی 2- سلول­های آدنوکارسینوما 3- کارسینومای ریه با سلول­های بزرگ (11).

نحوه مقابله با سرطان ریه یکی از چالش­های امروز سرطان

شناسان محسوب می­گردد. طی دهه­های اخیر معمولاً از روش­های شیمی‌درمانی، پرتو درمانی و جراحی برای مقابله با این سرطان استفاده شده است. این روش­ها دارای نقاط ضعفی مانند نرسیدن دارو با غلظت کافی به تومور و عدم دقت لازم در دارو رسانی هستند که از عوارض جانبی آن­ها مقاوم شدن بدن در برابر دارو است. بنابراین ابداع راهکارهای درمانی جدید و بدون عوارض جانبی ضروری به نظر می­رسد (3و 27).

یکی از این راهکارهای جدید در زمینه­ی درمان سرطان استفاده از نانو تکنولوژی می­باشد (20). فناوری نانو امکان دستکاری مواد در سطح نانو (1 الی 100 نانومتر) را می­دهد که زمینه کنترل دقیق خواص فیزیکی و شیمیایی نانوذرات و نیز تعاملات آن­ها با سیستم­های بیولوژیکی را فراهم می­سازد (1). با پیشرفت­های تکنولوژی و ابزارهای پزشکی کاربرد نانوذرات رشد چشم­گیری داشته است. نانوذرات مواد طبیعی یا مصنوعی هستند که می­توانند از روش­های مختلف سنتز شوند و معمولاً ساختار کریستالی دارند. تبدیل کردن مواد به مقیاس نانو عمدتاً می­تواند خواص الکتریکی، مغناطیسی، ساختاری، مورفولوژیکی و شیمیایی آن­ها را تغییر دهد (7، 19و 28).

نانوذرات اکسیدروی جزء پرمصرف­ترین نانو مواد در تولیدات مصرفی هستند که به‌طور فزاینده‌ای در صنعت ازجمله الکترونیک، لوازم آرایشی و غیره کاربرد دارند و با داشتن خواص منحصر به فردی مثل اندازه­ی کوچک، نسبت بیشتر سطح به حجم، سازگاری زیستی، قدرت انتخابی بالا، سمیت افزایش یافته، سنتز آسان و عملکرد برترشان اهمیت روز افزونی در درمان مدرن سرطان دارند (16و 21).

بااین‌حال دانش کمی درباره مکانیسم­های سمیت نانوذرات اکسیدروی در سلول­های انسانی وجود دارد. این خواص منجر به واکنش دهندگی شیمیایی بالاتر و افزایش تولید گونه­های فعال اکسیژن (ROS) می­شود. نانوذرات به‌راحتی می­توانند از غشا سلولی عبور کنند و با متابولیسم درون سلولی ارتباط برقرار کنند. همچنین مطالعات پیشین نشان داده است که نانوذرات اکسیدروی منجر به استرس اکسیداتیو، آسیب به هموستازی کلسیم، التهاب و پاسخ­های آپوپتوتیک سلول­های ریه می‌شود (6، 12، 16و 21).

آپوپتوز به­عنوان یک فرایند کلیدی در بیماری سرطان مورد توجه است و توانایی فرار سلول­های سرطانی از آپوپتوز و ادامه­ی تکثیر یکی از ویژگی­های اولیه­ی سلول­های سرطانی محسوب می­شود و بنابراین توانایی القای آپوپتوز در این سلول­ها یک هدف اصلی و مهم در درمان سرطان می‌باشد (6). فرایند آپوپتوز یا مرگ برنامه ریزی شده­ی سلول به‌عنوان روشی حفاظت شده و تحت کنترل ژن­هاست که در تنظیم میزان رشد، تکثیر سلول­ها، تکوین و سلامت بدن بسیار مهم است (5).

یافته­های کنونی نشان داده‌اند که ایجاد گونه­های فعال اکسیژن یعنی ROS در سلول­های هدف یکی از تنظیم کننده­های فرایند آپوپتوز می‌باشد (2). در طی فعالیت­های نرمال سلولی گونه­های فعال اکسیژن و نیتروژن تولید می‌گردد، این گونه­های فعال اکسیژن در سطح پایین فیزیولوژیکی به‌عنوان پیام‌رسان ردوکس (اکسایش– کاهش) و تنظیم درون سلولی عمل می‌کنند، در حالیکه در سطح بالا تغییرات اکسیداتیو ایجاد کرده باعث مهار عملکرد پروتئین و پیشبرد مرگ سلولی می‌شوند. برای جلوگیری از عدم تعادل ردوکس و آسیب­های اکسیداتیو، سدهای دفاعی وجود دارد که شامل آنزیم­های آنتی اکسیدانی مانند سوپراکسید دیسموتاز، گلوتاتیون پراکسیداز، کاتالاز و تیوردوکسین ردوکتاز و آنتی‌اکسیدان‌های غیرآنزیمی شامل آسکوربیک اسید (ویتامین C)، ویتامین E، گلوتاتیون و غیره می‌باشند (2).

نشان داده شده است که اثرات سمی‌نانوذرات اکسیدروی در سلول­های سرطانی که سرعت تکثیر بیشتری نسبت به سلول­های نرمال دارند بیشتر است (7) رشما و همکاران در سال 2017 افزایش تولید ROS را به‌عنوان مکانیسم اولیه­ی سمیت در رده­ی سلولی HEK293 معرفی کردند (20). همچنین مشخص شده که نانوذرات اکسیدروی از تکثیر سلولی جلوگیری کرده و آپوپتوز را به‌طور قابل‌ملاحظه­ای در سلول­های آدنوکارسینومای ریه­ی انسان القا می‌کند (26). بدین ترتیب نانوذرات اکسیدروی قابلیت ضد تکثیری را در سلول­های سرطانی دارا می‌باشند. اما سمیت آن برای سلول­های نرمال چالشی است که باید چاره‌ای برای آن اندیشید. ازاین‌رو، هدف از این مطالعه بررسی اثر نانوذرات اکسیدروی بر القای استرس اکسایشی و مرگ سلول‌های سرطانی A549 است.

مواد و روشها

رده­ی سلولی آدنو کارسینومای ریه A549 از بانک سلولی انستیتو پاستور تهران خریداری شده و براساس پروتکل رایج نگهداری و تکثیر شد. به‌منظور سنجش سمیت سلولی از روش رنگ­سنجی MTT استفاده شد. سلول‌ها به تعداد 104 × 1 در هر چاهک پلیت 96 خانه کشت داده شدند. پس از گذشت 24 ساعت با غلظت‌­های4/0، 2/0، 1/0، 05/0 و 01/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر از نانوذره اکسید روی (Lolitec Co., Germany) تیمار شدند. پس از طی 24 ساعت از تیمار 100 میکرولیتر از محلول MTT (Sigma، USA) با غلظت mg/mL 5/0 به هر چاهک اضافه شد و پلیت به مدت 3 الی 4 ساعت در انکوباتور قرارگرفت. سپس 100 میکرولیتر DMSO (Merck، آلمان) به هر چاهک اضافه شد و در ادامه جذب نوری محلول در طول‌موج 570 نانومتر با دستگاه الایزا ساخت شرکت Biotek آمریکا خوانده شد. همچنین این تست در روزهای 1، 3، 5، و 7روز پس از تیمار با غلظتIC50  نیز انجام شد. در ادامه میزان بقای سلولی با روش رنگ­سنجی تریپان بلو برای مدت 1، 3، 5، و 7 روز با غلظتIC50  از تیمار سنجیده شد. بدین صورت که پس از کشت سلول‌ها در پلیت 24 خانه، تیمار سلولی انجام شد. سپس با استفاده از لام نئوبار و میکروسکوپ اینورت شمارش سلولی انجام گرفت. همچنین مورفولوژی سلولی نیز در همه گروه‌ها پس از تیمار با میکروسکوپ اینورت مشاهده و عکس‌برداری شد و به‌منظور تمییز بهتر تغییرات مورفولوژی از رنگ آمیزی گیمسا (سیب زیست فن، ایران) استفاده شد. در ادامه جهت تعیین نوع مرگ سلولی القا شده در گروه‌های تیمار از روش رنگ آمیزی اکریدین اورنج/اتیدیوم بروماید استفاده شد. برای بررسی اثر نانوذره اکسیدروی بر فعالیت آنزیم‌های آنتی اکسیدانی در سلول­های A549 ابتدا عصاره سلولی تهیه شد. بدین صورت که پس از کشت و تیمار سلول‌ها با استفاده از تریپسین EDTA (Gibco، USA) جدا شدند. پس از سانتریفیوژ دو بار با PBS سرد شست‌وشو داده شد. سپس 250 میکرولیتر لیزبافر به رسوب سلول‌ها اضافه شد و پس از 20 دقیقه سانتریفیوژ در دمای 4 درجه با دور RPM 10000 سوپرناتانت حاصل جهت انجام تست مورد استفاده قرارگرفت. اندازه‌گیری پروتئین کل نمونه‌ها با استفاده از روش برادفورد انجام شد. همچنین اندازه‌گیری آنزیم سوپراکسید دیسموتاز براساس مهار احیای نیتروبلو تترازولیوم توسط آنزیم موجود در نمونه انجام گرفت. اندازه‌گیری کاتالاز نیز براساس کاهش پراکسید هیدروژن در واحد زمان در اثر فعالیت آنزیم موجود در نمونه انجام شد. جهت آنالیز آماری داده‌های بدست آمده از نرم‌افزار Instat نسخه­ی 3 و آزمون‌های آماری آنالیز واریانس یک‌طرفه (ANOVA) و آزمون تکمیلی Tukey استفاده شد. نمودارها با کمک نرم‌افزار Excel 2016 رسم و تفاوت‌ها در سطح (05/0 > P) معنی‌دار در نظر گرفته شد.

نتایج

بررسی مورفولوژی سلولی:

ب

الف

سلول‌های سرطانی A549 پس از کشت و تیمار با غلظت IC50 از نانوذره اکسیدروی با میکروسکوپ اینورت مشاهده و بررسی شدند. در مورفولوژی سلولی گروه‌های تیمار در مقایسه با گروه کنترل تغییراتی مشاهده شد که شامل کروی شدن سلول، چروکیده شدن، جمع شدن سلولی و دانه‌دار شدن سلول‌ها بود (شکل 1). باگذشت زمان این تغییرات در تعداد بیشتری از سلول‌های تیمار مشاهده شد به‌طوری که پس از گذشت 7 روز بسیاری از سلول‌های گروه تیمار معلق و مرده بودند. به‌منظور بررسی دقیق‌تر تغییرات مورفولوژیکی پس از تیمار سلول‌ها، با رنگ گیمسا رنگ­آمیزی شدند و به وسیله‌ی میکروسکوپ نوری مشاهده شدند. مورفولوژی سلول‌ها در نمونه کنترل کاملاً طبیعی بود به طوری که، سلول‌ها کاملاً کشیده با غشاء سالم و برخی در حال تقسیم دیده شدند. اما سلول‌های تحت تیمار تغییراتی مانند کاهش حجم سلولی گرانوله شدن سلول‌ها، تراکم کروماتین درون هسته و تولید اجسام آپوپتوزی را از خود نشان دادند (شکل 2).

 

200 µm

200 µm

     

شکل 1- مورفولوژی رده سلولی  A549: در تصویر "الف"، مورفولوژی طبیعی سلول­های A549 بدون هیچ تیمار ویژه‌ای قابل مشاهده می­باشد، در تصویر "ب"، تغییرات مورفولوژیکی سلول­ها پس از تیمار با mg/mL 1/0 نانوذره اکسیدروی نشان داده شده است. کاهش حجم سلول، گرانوله شدن سلول­ها و همچنین چروکیده شدن غشاء سلول­ها در تصاویر "ب" قابل مشاهده می­باشد.

 

شکل 2- رنگ آمیزی رده سلولی A549 : در تصویر "الف" مورفولوژی طبیعی سلول­های A549 بدون هیچ تیمار ویژه‌ای، به وسیله­ی رنگ آمیزی گیمسا قابل مشاهده می­باشد. تصویر "ب"، مورفولوژی سلول­ها پس از تیمار با غلظت IC50، 1/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر نانوذره اکسیدروی و رنگ آمیزی گیمسا نشان داده شده است و چروکیدگی سیتوپلاسم سلولی، کاهش حجم سل ولی، گرانوله شدن سلول­ها، تراکم کروماتین درون هسته و تولید اجسام آپوپتوزی قابل مشاهده می­باشد.


بررسی مرگ سلولی: در ادامه به منظور تعیین نوع مرگ سلولی القا شده توسط نانوذره اکسیدروی بر رده­ی سلولی A549 از روش رنگ آمیزی اکریدین اورنج/اتیدیوم بروماید استفاده شد. در این رنگ­آمیزی سلول‌های زنده به رنگ سبز دیده می‌شوند در حالی که سلول‌هایی که در مرحله­ی آپوپتوز قرار دارند نارنجی‌رنگ مشاهده می‌شوند. در گروه‌های تحت تیمار با نانوذره اکسیدروی تعداد سلول‌ها با رنگ نارنجی  افزایش  چشمگیری  در  مقایسه  با  گروه

کنترل داشتند (شکل 3).

 

  

شکل 3- رنگ آمیزی اکریدین اورنج/اتیدیوم بروماید رده سلولی A549 : در تصویر" چپ"، که نشان­دهنده­ی گروه کنترل است، بیشتر سلول­ها سبز رنگ می­باشند و در حالت نرمال قرار دارند. تصویر "راست"، سلول­ها پس از تیمار با غلظت IC50، 1/0 میلی گرم بر میلی لیتر نانوذره اکسیدروی و رنگ آمیزی اکریدین اورنج / اتیدیوم بروماید نشان داده شده اند و تعداد کمی از سلول­ها زنده با کروماتین سبز رنگ و بیشتر آن­ها سلول­های آپوپتوزی با کروماتین نارنجی رنگ با تراکم بالا و قطعه قطعه شده قابل مشاهده می­باشد.


بقای سلولی: آزمایش MTT جهت بررسی اثر نانوذره اکسیدروی بر زیست­پذیری سلول‌های A549 در زمان 24 ساعت و با غلظت‌های (4/0، 2/0، 1/0، 05/0 و 01/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) انجام شد. نتایج آماری نشان داد که زیست­پذیری سلول­های A549  بعد از مواجهه با این دوز­ها از نانوذره اکسیدروی به‌طور معنی­داری نسبت به نمونه­ی کنترل کاهش یافت به طوری که بقای سلولی به ترتیب به میزان (15/27، 14/33، 08/50، 41/70 و 67/87 درصد) رسید (نمودار 1). IC50 به دست آمده برای سلول­های A549 در دوز 1/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر در نظر گرفته شد.

در گروه‌های تیمار سلولی با غلظت mg/mL 1/0 (IC50) از نانوذره اکسیدروی باگذشت زمان در روزهای 1، 3، 5 و 7 درصد بقای سلولی به ترتیب به میزان (86/48، 51/23، 68/8 و 69/5 درصد) کاهش یافت که بیانگر وابسته به زمان بودن تیمار­ بود (نمودار 2). از روش رنگ­آمیزی تریپان بلو نیز برای تأیید نتایج حاصل از سنجش MTT استفاده شد. سلول‌های A549 پس از تیمار با غلظت IC50 از تیمار نانوذره اکسیدروی در روزهای 1، 3، 5 و 7 با رنگ تریپان بلو با کمک لام نئوبار شمارش شدند. نتایج حاصل از این روش تأییدی بر نتایج حاصل از سنجش MTT بود (نمودار 3). در روز هفتم پس از تیمار همه­ی سلول­های گروه­ تیمار از کف چاهک جدا شده و در شمارش سلولی زیر لام نئوبار سلولی دیده نشد.

 

نمودار 1- بررسی بقای سلول­ها در گروه‌های کنترل و تیمار با نانوذره اکسید روی با روش MTT. غلظت‌­های 4/0، 2/0، 1/0، 05/0 و 01/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر  نانوذره اکسیدروی بر زیست پذیری سلول­های A549 در زمان 24 ساعت. IC50 به دست آمده برای سلول­های A549 در دوز 1/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر تعیین شد.

*** نشان­دهنده تفاوت معنی­دار درصد بقای گروه­های تیمار با کنترل در سطح (001/0 >P ) است.

** نشان­دهنده تفاوت معنی­دار درصد بقا در مقایسه با کنترل در سطح (01/0 >(P  است.

سنجش فعالیت‌های آنزیمی: جهت اندازه­گیری غلظت پروتئین در همه­ی نمونه­ها، (تیمار و کنترل)، از روش برادفورد استفاده شد و ابتدا نمودار استاندارد آن رسم شد (نمودار 4). سپس با استفاده از نمودار استاندارد و معادله­ی خط آن، غلظت پروتئین اندازه­گیری شد.

 

نمودار 2- مقایسه­ی میزان بقای سلولی A549 در سنجش MTT در غلظت‌­ IC50 از نانوذره اکسیدروی در روزهای مختلف.

*** نشان­دهنده تفاوت معنی­دار درصد بقای گروه­های تیمار با کنترل در سطح (001/0 > (P است.

 

نمودار 3- مقایسه­ی میزان بقای سلولی رده­ی A549 در روش رنگ آمیزی تریپان بلو در غلظت‌­ IC50 از نانوذره اکسیدروی در روزهای مختلف.

*** نشان­دهنده تفاوت معنی­دار درصد بقای گروه­های تیمار با کنترل در سطح (001/0 > (P است.

اندازه­گیری غلظت پروتئین جهت بیان میزان فعالیت آنزیم در میلی‌گرم پروتئین انجام شد. با محاسبه­ی میزان آنزیم سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز در گروه کنترل و گروه تحت تیمار با غلظت IC50 از نانوذره اکسیدروی و آنالیز آماری پس از آن، نمودار آن رسم شد (نمودار 5).

نتایج نشان داد که میزان فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در گروه تیمار با نانوذره اکسیدروی در مقایسه با کنترل به‌صورت معنی­داری افزایش داشت (001/0 > P). نتایج نشان داد که میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در گروه تیمار با نانوذره اکسیدروی در مقایسه با گروه کنترل به‌صورت معنی­داری افزایش داشت (05/0 > P).

 

نمودار 4- نمودار استاندارد برادفورد. جهت اندازه­گیری غلظت پروتئین در همه­ی نمونه­ها، (تیمار و کنترل)، ابتدا نمودار استاندارد آن رسم شد. سپس با استفاده از نمودار استاندارد و معادله­ی خط آن، غلظت پروتئین اندازه­گیری شد. اندازه­گیری غلظت پروتئین جهت بیان میزان فعالیت آنزیم در میلی‌گرم پروتئین انجام شد

 

نمودار 5- مقایسه‌ی فعالیت آنزیم‌های SOD و CAT در گروه‌های کنترل و تیمار نانوذره سلول A549

*** نشان­دهنده تفاوت معنی­دار میزان فعالیت آنزیم‌ها در گروه­ تیمار با کنترل در سطح (001/0 > (P است.

* نشان­دهنده تفاوت معنی­دار میزان فعالیت آنزیم‌ها در گروه تیمار با کنترل در سطح (05/0 > (P است.

بحث و نتیجه‌گیری

در طول صد سال گذشته مرگ‌ومیر ناشی از سرطان سیر صعودی داشته است، در این بین سرطان ریه شایع‌ترین علت مرگ‌ومیر ناشی از سرطان است و سالانه بیش از یک‌میلیون مرگ‌ومیر در سراسر جهان به سرطان ریه NSCLC (که 85 درصد از موارد ریه را به خود اختصاص داده) مربوط می­شود (13و 17). استراتژی­های درمانی به‌شدت و نوع بدخیمی و مرحله­ی سرطان در زمان تشخیص بستگی دارد، اما در اغلب موارد شامل ترکیبی از جراحی، شیمی‌درمانی و پرتو درمانی می­باشد. استفاده از این روش­ها در درمان سرطان دارای معایبی است یکی از این معایب آسیب رسیدن به سلول­های سالم اطراف تومور می­باشد (8). بنابراین یافتن اثرات درمانی ترکیبات جدید که بتواند از آن­ها به‌عنوان دارو در ترکیب با دارو­های موجود برای از بین بردن سلول­های سرطانی استفاده کرد، یکی از اولویت­های کلیدی محسوب می­شود. تحقیقات نشان داده است که نانوذرات می­توانند خواص بیولوژیکی متعدد ازجمله خاصیت ضد ویروس و ضد توموری داشته باشند (8، 14و 15). در این مطالعه اثرات ضد سرطانی نانوذرات اکسیدروی با غلظت‌­های مختلف بر رده­ی سلولی (A549) مورد بررسی قرارگرفت و  زیست­پذیری و تکثیرپذیری سلول­ها بررسی شد. آنالیز بقای سلولی نشان داد که نانوذرات اکسیدروی دارای اثرات سیتوتوکسیک بر رده سلولی A549 به صورت وابسته به دوز و زمان بودند، به گونه‌ای که در غلظت‌­های پایین رشد سلول­ها نسبت به گروه کنترل، تغییر کمتری یافته بود اما در غلظت‌­های بالاتر به‌طور بسیار معنی­داری باعث مهار رشد این سلول­ها نسبت به گروه کنترل شد. و با گذشت زمان نیز کاهش بقای سلولی شدیدتر و ازنظر آماری معنی‌دار بود. همچنین نتایج به دست آمده از دو آزمون رنگ آمیزی تریپان بلو و MTT در یک راستا بوده و یکدیگر را تأیید کردند.

باتوجه به این موضوع که آپوپتوز مرگ فیزیولوژیک سلولی است که در شرایط طبیعی سبب حذف سلول­های پیر و آسیب دیده، اضافی و مضر می­شود و روند مهمی در جهت کنترل تکثیر سلول­ها و حفظ هوموستاز طبیعی بدن محسوب می‌شود (5) بنابراین القای آپوپتوز در سلول­های سرطانی یکی از مکانیسم­های عملکردی داروهای مورد استفاده در شیمی‌درمانی است و در درمان سرطان ضروری می­باشد. ازاین رو پژوهش گران در جهت درمان سرطان و در راستای فعال کردن سازوکار مرگ برنامه ریزی شده در تلاش هستند (15). در ادامه­ی کار توانایی ایجاد آپوپتوز توسط نانوذره اکسیدروی در رده­ی سلولی A549 بررسی شد در این پژوهش پس از رنگ آمیزی رده سلولی سرطانی با رنگ گیمسا، تغییرات مورفولوژیک سلولی بررسی شد. نتایج نشان داد که درگروه­های سلولی تیمار شده با نانوذره اکسیدروی، تمامی سلول­ها از حالت کشیده خارج، کروی شده و هسته­ها به صورت متراکم مشاهده گردید. در حالی که در گروه­های سلولی کنترل تمامی سلول­ها سالم، سرحال، کشیده و با مورفولوژی نرمال دیده شدند.

همچنین برای تعیین نوع مرگ سلولی القا شده توسط نانوذره اکسیدروی از رنگ آمیزی اکریدین اورنج / اتیدیوم بروماید استفاده شد. نتایج نشان داد که در گروه تیمار تعداد سلول­های نارنجی رنگ آپوپتوز یافته بیشتر از سلول­های سالم سبز رنگ  بود و درگروه کنترل تقریباً تمامی سلول­ها سالم و سبز رنگ دیده شدند. از مجموعه بررسی­های مورفولوژی با رنگ­های گیمسا واکریدین اورنج / اتیدیوم بروماید می­توان دریافت که تیمار نانوذره اکسیدروی، منجر به فعال شدن روند آپوپتوز در رده سلول­های سرطانی A549 می­شود. در مطالعه‌ای که توسط سلواکوماری و همکارانش انجام گرفت، اثر نانوذره اکسیدروی بر سلول­های سرطانی ریه (A549) و سلول­های سرطانی سینه (MCF7) سنجیده شد و نشان داده شد که این نانوذره باعث سمیت قابل ملاحظه و تغییرات مورفولوژیکی در هر دو رده­ی سلولی می­شود (20 و 22). وانگ و همکارانش در سال 2014 تحقیقی در مورد اثر سمیت نانوذره اکسیدروی، بر رده­ی سلولی آدنوکارسینومای ریه­ی انسان (LTEP-a2) انجام دادند و بقای سلولی را با استفاده از روش­های MTT و تریپان بلو سنجیدند. نتایج تحقیقاتی این گروه نشان داد که نانوذرات اکسیدروی از تکثیر سلولی جلوگیری کرده و آپوپتوز را به‌طور قابل ملاحظه‌ای در این سلول­ها القا می­کنند (26).

شارما و همکارانش در سال 2012 گزارش دادند که قرار دادن سلول­های HepG2 در معرض نانوذرات اکسیدروی باعث افزایش مرگ سلولی آپوپتوزی از طریق مسیر داخلی میتوکندری می­شود (21و23). رشما و همکارانش در تحقیقات خود نشان دادند که نانوذرات اکسیدروی سبب سمیت در سلول­های جنین کلیه انسان HEK293 به صورت وابسته به دوز و زمان می­شود. آن­ها همچنین نشان دادند که تعاملات نانوذرات اکسیدروی با این سلول­ها سبب تولید ROS در فعالیت­های میتوکندری و منجر به مرگ سلولی برنامه‌ریزی شده، گردید (18). به‌علاوه در مطالعه‌ای که توسط اختر و همکارانش انجام شد، گزارش شد که نانوذرات اکسیدروی از طریق افزایش میزان ROS، از مسیر P53 باعث القا آپوپتوز در سلول­های سرطان کبد HepG2 و سرطان ریه A549 و برونکوس BEAS-2B می­شود. این در حالی است که تأثیر چندانی بر سلول­های طبیعی (آستروسیت موش و هپاتوسیت­ها) نداشت (7).

مکانیسم­های مولکولی دقیق نانوذرات هنوز به‌طور کامل شناخته نشده است. نانوذرات میزان رادیکال‌های آزاد داخل سلولی را افزایش می­دهند، بنابراین استرس اکسیداتیو می­تواند به‌عنوان پاسخی برای آسیب سلولی در نظر گرفته شود. تولید رادیکال آزاد در مورد هر نانوذره دارای مکانیسم سلولی و مولکولی متفاوت است (9). استرس اکسایشی می­تواند تعدادی از آنزیم­های آنتی‌اکسیدان را در سلول فعال یا مهار کند. در ادامه­ی کار فعالیت آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز را که جزئی از سیستم دفاع آنتی اکسیدانی هستند و در سرکوب گونه­های فعال اکسیژن نقش بسیار مهمی را ایفا می­کنند، به‌عنوان بیومارکر­هایی از استرس اکسایشی بررسی شد. نتایج نشان داد که فعالیت آنزیم کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز در گروه­های سلولی تیمار شده با نانوذرات اکسیدروی از رده­ی سلولی نسبت به گروه­های کنترل به‌طور قابل‌توجهی افزایش یافت، که این نتیجه می­تواند تأییدی بر مکانیسم سمیت نانوذره اکسیدروی از طریق القا ROS باشد.

در مطالعه‌ای که توسط احامد و همکاران در سال 2011 صورت گرفت مشخص شد که نانو رادهای (نانوذره میله‌ای شکل) اکسیدروی منجر به تولید ROS بین سلولی می­شود و سطوح آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز را در سلول­های آدنوکارسینوما ریه (A549) تیمار شده افزایش می‌دهند. آن­ها در مطالعه خود پیشنهاد کردند که استرس اکسایشی مکانیسم اولیه­ی سمیت نانو رادهای اکسیدروی در سلول­های A549 باشد (6). نتایج ما در این مطالعه نیز مطابق با این تحقیق بود.

وهاب و همکاران در تحقیق خود نشان دادند که نانوذرات اکسیدروی باعث ایجاد سمیت و آپوپتوز در سلول­های سرطانی HepG2 و MCF7 می­شوند و این اثرات احتمالاً از طریق تولید ROS و استرس اکسیداتیو می­باشد (25). نل و همکارانش در سال 2006 بیان کردند که تولید ROS در نانو مواد مختلفی ازجمله نانوذرات اکسید فلزی فولرن­های کربن و نانولوله­های کربنی دیده شده است. ROS و تولید رادیکال­های آزاد یکی از مکانیسم­های اصلی نانو ذرات است که باعث استرس اکسیداتیو، التهاب و منجر به آسیب ارگانیسم­های سلولی می­شود (18). کئونگ نام و چنگ تنگ و همکارانشان اظهار داشتند که هنگامی که استرس اکسیداتیو بیش از توانایی آنتی اکسیدانی سلول باشد آسیب اکسیداتیو بر بیومولکول­های حیاتی سلولی رخ می­دهد و منجر به مرگ سلول می­شود از این‌رو ROS ناشی از نانوذرات اکسیدروی را یکی از علل مستقیم مرگ سلولی ناشی از نانوذرات اکسیدروی دانسته‌اند (24و 29). باتوجه به نتایج این تحقیق، نانوذره اکسیدروی با غلظت 1/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر به صورت وابسته به دوز و زمان درصد بقای سلول‌های سرطانی A549 را کاهش داد و باعث القای مرگ سلولی بواسطه استرس اکسیداتید در آن‌ها شد. بااین‌حال لازم است که مطالعات بیشتری برای روشن ساختن مکانیسم عمل القای مرگ سلولی ناشی از نانوذرات اکسیدروی در سلول‌های سرطانی مختلف صورت گیرد.

سپاسگزاری

هزینه  این  تحقیق  از  محل  اعتبارات  پژوهانه  سال  98 معاونت  پژوهشی  دانشگاه   شهید   چمران   اهواز  تأمین

گردیده است. نویسندگان این مقاله کمال تشکر و قدردانی خود را از معاونت پژوهشی و فن­آوری دانشگاه شهید چمران اهواز به خاطر حمایت­های مالی اعلام می­ دارد.

1- بایرامی، ا.، شیدایی، پ.، و اربابی، س.، 1397. بررسی اثرات سمیتی نانوذرات دی اکسید تیتانیوم بر پارامتر‎های خونی و سرمی موش سفید آزمایشگاهی، مجله پژوهش­های جانوری، دوره سی و یکم، شماره 4، صفحات 482- 472.
2- خوش طبیعت، ل.، و مهدوی، م.، 1394. نقش استرس اکسیداتیو در تکثیر بی‌رویه و مرگ سلولی، مجله دانشگاه علوم پزشکی مازندران، دوره بیست و پنجم، شماره 127، صفحات 145-130.
3- عسکریان، س.، و کاظمی اسکویی، ر.، 1394. انتقال SiRNA به سرطان ریه با استفاده از نانوذرات، مجله تازه‌های بیوتکنولوژی سلولی-مولکولی، دوره ششم، شماره بیست و یکم، صفحات 20-10.
4-کاروی، ع.، شاهانی پور، ک.، و منجمی، ر.، 1396. مقایسه اثر آنتی اکسیدانی و سیتوتوکسیک عصاره‌های آبی و هیدرو الکلی گیاه سداب (Ruta graveolens)بر رده سلولی سرطان پروستات(DU145)، مجله پژوهش­های جانوری، سال سی‌ام، شماره 3، صفحات 352 - 345.
5- هنردوست، م.، سلیمانجاهی، ح.، و رجایی، ف.، 1392، آپوپتوز: مرگ برنامه‌ریزی شده سلولی، مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی قزوین، سال هفدهم، شماره 3، صفحات 57-48.
 
6- Ahamed, M., Akhtar, M. J., Raja, M., and Ahmad, I., 2011. ZnO nanorod-induced apoptosis in human alveolar adenocarcinoma cells via p53, survivin and bax/bcl-2 pathways: Role of oxidative stress. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 7, PP: 904-913.
7- Ahamed, M., Javed Akhtar, M., Kumar, S., Khan, M., Ahmad, J., and Alrokayan, S. A., 2012. Zinc oxide nanoparticles selectively induce apoptosis in human cancer cells through reactive oxygen species. International Journal of Nanomedicine, 7, PP: 845-857.
8- Babu, A., Templeton, A. K., Munshi, A., and Ramesh, R., 2013. Nanoparticle-based drug delivery for therapy of lung cancer: Progress and challenges, Journal of Nanomaterials, 2013, PP: 1-11.
9- Bisht, G., and Rayamajhi, S., 2016. ZnO Nanoparticles: A Promising Anticancer Agent, Nanobiomedicine, 3, PP: 1-9.
10- Boyle, P., 2000. ABC of colorectal cancer: Epidemiology. British Medical Journal, 321, PP: 805-808.
11- Dela Cruz, C. S., Tanoue, L. T., and Matthay, R. A., 2011. Lung Cancer: Epidemiology, Etiology, and Prevention. Clinics in Chest Medicine, 32, PP: 605-644.
12- Fu, J., Dang, Z., Deng, Y., and Lu, G., 2012. Regulation of c-Myc and Bcl-2 induced apoptosis of human bronchial epithelial cells by zinc oxide nanoparticles, Journal of Biomedical Nanotechnology, 8, PP: 669-675.
13- Gursoy, O., and Kİnİk, O., 2010. Probiotics: a new popular option for cancer inhibition. International Journal of Dairy Science, 5, PP: 241-244.
14- Jithan, A. V., Madhavi, K., Madhavi, M., and Prabhakar, K., 2011. Preparation and characterization of albumin nanoparticles encapsulating curcumin intended for the treatment of breast cancer. International journal of pharmaceutical investigation, 1, 119 p.
15- Kalepu, S., and Nekkanti, V., 2016. Improved delivery of poorly soluble compounds using nanoparticle technology: a review. Drug delivery and translational research, 6, PP: 319-332.
16- Kumar, V., Sharma, N., and Maitra, S. S., 2017. In vitro and in vivo toxicity assessment of nanoparticles. International Nano Letters, 7, PP: 243-256.
17- Kummalue, T., 2005. Molecular mechanism of herbs in human lung cancer cells. Journal of the Medical Association of Thailand, 88, PP: 1725-1734.
18- Nel, A., Xia, T., Madler, L., and Li, N., 2006. Toxic Potential of Materials at the Nanolevel. SCIENCE, 311, PP: 622-627.
19- Rasmussen, J. W., Martinez, E., Louka, P., and Wingett, D. G., 2010. Zinc oxide nanoparticles for selective destruction of tumor cells and potential for drug delivery applications. Expert opinion on drug delivery, 7, PP: 1063-1077.
20- Reshma, V. G., and Mohanan, P. V., 2017. Cellular interactions of zinc oxide nanoparticles with human embryonic kidney HEK 293 cells, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 157, PP: 182-190.
21- Scherzad, A., Meyer, T., Kleinsasser, N., and Hackenberg, S., 2017. Molecular mechanisms of Zinc oxide Nanoparticle-induced genotoxicity short running title: Genotoxicity of ZnO NPs. Materials, 10, PP: 1-19.
22- Selvakumari, D., Deepa, R., Mahalakshmi, V., Subhashini, P., and Lakshminarayan, N., 2015. Anti Cancer activity of zno nanoparticles on MCF7 breast cancer cell and A549 lung cancer cell. ARPN Journal of Engineering and Applied Sciences, 10, PP: 5418-5421.
23- Sharma, V., Anderson, D., and Dhawan, A., 2012. Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria mediated apoptosis in human liver cells HepG2. Apoptosis, 17, PP: 852-870.
24- Teng Ng, C., Qing Yong, I., Prakash hande, M., Nam Ong, C., Yu, I., huat Bay, B., and hun Baeg, G., 2017. Zinc oxide nanoparticles exhibit cytotoxicity and genotoxicity through oxidative stress responses in human lung fibroblasts and Drosophila melanogaster. International Journal of Nanomedicine, 12, PP: 1621-1637.
25- Wahab, R., Siddiqui, M. A., Saquib, Q., Dwivedi, S., Ahmad, J., and Musarrat, J., et al. 2014. ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 117, PP: 267–276.
26- Wang, C., Hu, X., Gao, Y., and Ji, Y., 2015. ZnO nanoparticles treatment induces apoptosis by increasing intracellular ROS levels in LTEP-a-2 cells, BioMed Research International, 2015, PP: 1-9.
27- Wang, X., Yang, L., Chen, Z., and Shin, D. M., 2008. Application of Nanotechnology in Cancer Therapy and Imaging. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 58, PP: 97-110.
28- Wingett, D. G., Louka, P., B Anders, C., Zhang, J., and Punnoose, A., 2016. A role of ZnO nanoparticle electrostatic properties in cancer cell cytotoxicity, Nanotechnology, Science and Applications, 9, PP: 29-45.
29- Yu, K. N., Yoon, T. J., Minai-Tehrani, A., Kim, J. E., Park, S. J., and Jeong, M. S., et al., 2013. Zinc oxide nanoparticle induced autophagic cell death and mitochondrial damage via reactive oxygen species generation, Toxicology in Vitro, 27 (4), PP: 1187–1195.