نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه ارومیه، ارومیه، ایران

2 عضو هیئت علمی گروه زیست شناسی، دانشکده علوم ، دانشگاه ارومیه

3 عضو هیات علمی / دانشکده دامپزشکی دانشگاه ارومیه

4 پژوهشکده آرتمیا و آبزی پروری، دانشگاه ارومیه، ارومیه، ایران

چکیده

در این تحقیق تاثیرات استفاده از پپتیدهای زیست فعال استخراج شده از ضایعات موتوماهیان بر فعالیت آنتی اکسیدانی، شاخص های اسپرمی، قطر لوله های منی ساز، ضخامت لایه اپیتلیوم و همچنین آسیب DNA در بافت بیضه رت های تیمار شده با آنتی بیوتیک اوفلوکساسین بررسی شد. برای این منظور تعداد 36 عدد رت نر نژاد ویستار سالم با وزن اولیه 40±200 گرم به 6 قفس منتقل شدند و به مدت 45 روز با تیمارهای غذایی(گروه C کنترل، گروه P 20 میلی گرم پپتید، گروه OF72 و OF360 به ترتیب 72 و 360 گرم اوفلوکساسین، گروه OFP72 و OFP360 به ترتیب 72 و 360 گرم اوفلوکساسین + 20 میلی گرم پپتید) تغذیه شدند. در انتهای دوره آزمایش نتایج تحقیق نشان داد که ظرفیت تام آنتی اکسیدانی در رت هایی که از آنتی بیوتیک و پپتید تغذیه کرده بودند به طور معنی دار نسبت به تیمار کنترل افزایش یافته بود (P

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Protective effects of Bioactive peptides on morphology of the seminiferous tubules and sperm survival in Ofloxacin treated male rats

نویسندگان [English]

  • Zahra Zare 1
  • Ebrahim H. Najdegerami 2
  • Vahid Nejati 1
  • Golamreza Najafi 3
  • Mehdi Niko 4

1 Department of Biology, Faculty of Science, Urmia University, Urmia, Iran

2 Department of BiologyFaculty of Science  Urmia University Urmia - Iran

3 Department of Basic science, Faculty of Veterinary, Urmia University, Urmia, Iran

4 Department of Basic science, Faculty of Veterinary, Urmia University, Urmia, Iran

چکیده [English]

In this study, protective effects of bioactive peptides extracted from Anchovy on total antioxidant capacity, sperm parameters, sperm tubular diameters, epithelium thickness (ET) and DNA damage in ofloxacin treated rats was investigated. Thirty-six healthy male rats (200±40) were randomly assigned to 6 cages and fed with experimental diets (Control, 20mg bioactive peptide P, 72 mg ofloxacin OF72, 360 mg ofloxacin OF360, OF72+P, OF360+P) for 45 days. The results indicated that the rat fed on ofloxacins + peptid had siginificant higher TAC then the control (P

کلیدواژه‌ها [English]

  • Bioactive peptides
  • anchovy
  • Infertility
  • oxidative Stress

اثر حفاظتی پپتیدهای زیست فعال بر شاخص‌های مورفولوژیک لوله‌های سمینیفروس و مانایی اسپرم در رت‌های نر تیمار شده با آنتی­بیوتیک اوفلوکساسین

زهرا زارع1، ابراهیم حسین نجدگرامی1* وحید نجاتی1، غلامرضا نجفی2 و مهدی نیکو3

1 ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده علوم، گروه زیست‌شناسی

2 ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده علوم، گروه علوم پایه

3 ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، پژوهشکده آرتمیا و آبزی‌پروری

تاریخ دریافت: 13/9/1398            تاریخ پذیرش: 10/4/1399

چکیده

دراین تحقیق تأثیرات استفاده از پپتیدهای زیست فعال استخراج شده از ضایعات موتوماهیان بر فعالیت تام آنتی‌اکسیدانی، شاخص‌های اسپرمی، قطر لوله‌های منی ساز، ضخامت لایه اپیتلیوم و همچنین آسیب DNA در بافت بیضه رت­های نر تیمار شده با آنتی­بیوتیک اوفلوکساسین بررسی شد. برای این منظور تعداد 36 عدد رت نر نژاد ویستار سالم با وزن اولیه 40±200 گرم به 6 قفس منتقل شدند و به مدت 45 روز با تیمارهای غذایی(گروه C کنترل، گروه P 20 میلی‌گرم پپتید، گروه OF72 و OF360 به ترتیب 72 و 360 گرم اوفلوکساسین، گروه OFP72 و OFP360 به ترتیب 72 و 360 گرم اوفلوکساسین + 20 میلی‌گرم پپتید) تغذیه شدند. در انتهای دوره آزمایش نتایج تحقیق نشان داد که ظرفیت تام آنتی‌اکسیدانی در رت­هایی که از آنتی­بیوتیک و پپتید تغذیه کرده بودند به‌طور معنی‌دار نسبت به تیمار کنترل افزایش یافته بود (05/0P<). همچنین براساس این نتایج، تغذیه یا تیمارهای غذایی میزان زنده مانی اسپرم‌ها را نسبت به تیمار کنترل کاهش و میزان تحرک آنها را در تیمارهای حاوی آنتی بیوتیک 72 میلی‌گرم افزایش داده بود (05/0P<). همچنین استفاده از پپتیدهای زیست فعال، ضخامت لایه اپیتلیوم را در تیمارهای دارای آنتی­بیوتیک افزایش و میزان آسیب DNA را نسبت به تیمار کنترل کاهش داد. به نظر می‌رسد باتوجه به تأثیرات آنتی‌اکسیدانی پپتیدهای زیست فعال که در تحقیقات قبلی گزارش‌شده بود، این مواد تأثیرات اکسیداتیو آنتی بیوتیک اوفلوکساسین را در بافت بیضه و همچنین اسپرم‌ها تعدیل کرده است.

واژه‌های کلیدی: پپتیدهای زیست فعال، موتوماهیان، ناباروری، استرس اکسیداتیو، افلوکساسین

* نویسنده مسئول، تلفن:  09144396276 ،  پست الکترونیکی:  e.gerami@urmia.ac.ir

مقدمه

 

ازجمله رایج‌ترین عفونت‌های باکتریایی که به‌عنوان دومین عامل عفونت در بدن انسـان شناخته می‌شود عفونت دسـتگاه ادراری است که عـدم تشخیص و درمان به‌موقع آن می‌تواند عوارض شـدیدی هــم چــون ناهنجاری‌های دســتگاه ادراری، کلیــوی، فشارخون و مخصوصاً ناباروری در مردان و زنان را موجــب شــود (10، 34و46).

در میان عوارض ذکر شده، ناباروری یکی از مشکلات عمده پزشکی در دنیای امروز است که فراوانی آن از سال 1955 پنجاه درصد افزایش یافته است و هم‌اکنون 15-10 درصد زوجین دارای این مشکل هستند (42). براساس آمارهای موجود، 50-30 درصد ناباروری‌ها مربوط به ناباروری مردانه است که از این میزان، 40-30 درصد آن مربوط به ناهنجاری‌های اسپرم می‌شود (24). علل متعددی ازجمله اختلالات هورمونی و کروموزومی، ناهنجاری‌های ساختاری بیضه، سموم، داروها، تشعشعات و بیماری‌های عفونی باکتریایی باعث اختلال در عملکرد دستگاه تولیدمثل و درنتیجه بروز ناباروری در مردان می‌شود (31و 58). امروزه پزشکان جهت درمان بیماری‌های عفونی باکتریایی در دستگاه ادراری، مصرف درازمدت آنتی بیوتیک­ها را توصیه می‌کنند (51و 57). آنتی­بیوتیک­ها جزو عوامل محیطی و استرسی بوده که اثرات آنها بر روی باروری کمتر مورد توجـه قـرارگرفته است، بااین‌حال گزارشاتی درباره‌ی اثرات سوء از آنها بر روی باروری جنس نر در مطالعات متفاوت وجود دارد که می‌توان به توقف روند اسپرماتوژنیک، کاهش تحرک اسپرم و تغییر در مورفولوژی آن اشاره کرد (41و 48). همچنین باکتریها هم به‌صورت مستقیم (تأثیر بر اسپرماتوزوا) و هم غیرمستقیم (تأثیر بر پلاسمای مایع منی و تولید مواد ضد اسپرم) بر عملکرد تولیدمثلی جنس نر تأثیر می‌گذارند (8).

خانواده فلوروکینولون ها، جزو داروهایی با تأثیرات گسترده برعلیه پـاتوژن هـای میکروبـی و جـزو مـؤثرترین آنها برای درمان عفونتهای ادراری- تناسلی هستند (11، 17و 30). در تحقیقاتی صورت گرفته تأثیرات این دسته از آنتی‌بیوتیک‌ها در تولید گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) و نقش منفی که در تمایز و متابولیسم سلولهای مختلف بدن دارند گزارش شده است (38و 39). ازجمله آنتی­بیوتیک­های این خانواده، می‌توان به اوفلوکساسین اشاره کرد که سنتز DNA و توپوایزومرازIV را در باکتریهای گرم منفی در انسان و حیوانات مهار می‌کند (16، 18و 44). براساس تحقیقات انجام شده این آنتی­بیوتیک موجب اختلال در سیستم تولیدمثلی نر شده و بر تولید اسپرم تأثیر می‌گذارد (6، 13، 17و 33). امروزه محققان برای کاهش تأثیرات استرس اکسیداتیو استفاده از آنتی‌بیوتیک‌ها از آنتی‌اکسیدان‌های طبیعی مانند انواع ویتامین‌ها مانند ویتامین E (27، 32، 37و 43)، ویتامین C (22)، ویتامین D (21) و سایر آنتی­اکسیدانت­ها (47، 54و 55) استفاده می‌کنند. اخیراً در برخی از تحقیقات استفاده از مواد پروتئینی آبکافت شده طبیعی که به نام پروتئین آبکافته (Hydrolysate protein) یا پپتیدهای زیست­فعال (Bioactive peptides) معروف هستند گزارش شده است.

پپتیدهای زیست فعال معمولاً دارای 2تا 20اسیدآمینه با وزن مولکولی 200 تا 1800دالتون هستند که در اثر هیدرولیز آنزیمی و یا تخمیر میکروبی از مواد پروتئینی مانند شیر، سویا و سایر ضایعات پروتئینی تولید می‌شوند (19، 52و 53). در کنار ارزش غذایی، اثرات شبه هورمونی و فیزیولوژیکی این مواد در بدن گزارش شده است که این اثرات بستگی به ترکیب و قرارگیری اسیدآمینه در موقعیت N- و C- ترمینال، طول زنجیره پپتید، نوع بار اسیدهای آمینه تشکیل دهنده‌ی پپتید و خصوصیات آبگریز/هیدروفیل زنجیره اسیدآمینه دارد (36). از جمله اثرات پپتیدهای زیست فعال می‌توان به تأثیرات ضد فشارخون، آنتی‌اکسیدان، ضد سرطان، ضد میکروبی و فعالیت‌های شبیه مواد مخدر و همچنین تعدیل کننده‌ی سیستم ایمنی و کاهنده کلسترول اشاره کرد (9، 23، 50و 53).

متأسفانه باتوجه به‌مرور منابع، رفرنسی که در رابطه با تأثیرات پپتیدهای زیست­فعال در کاهش استرس اکسیداتیو ناشی از اوفلوکساسین باشد یافت نشد. ولی باتوجه به تأثیرات سایر آنتی­اکسیدانت­های طبیعی مانند ویتامین‌ها و... به برخی از نتایج آنها اشاره می‌شود. تیمور در سال 2010 نشان داد که استفاده از اوفلوکساسین فاصله بین لوله‌های اسپرم‌ساز را در رت­های تیمار شده با این آنتی­بیوتیک افزایش داد (17). همچنین نتایج آنها نشان داد که استفاده از ژل رویال به‌عنوان یک آنتی­اکسیدانت می‌تواند تا حدودی تأثیرات اوفلوکساسین را تعدیل کند. نتایج مشابه در تحقیقات امیرشاهی و همکارانش در سال 2014 و همچنین حسامی و همکاران در سال 1395 در مورد تأثیرات حفاظتی ژل رویال در رت­های تیمار شده با آنتی بیوتیک اوفلوکساسین مشاهده شد (3و 7). براساس نتایج تحقیقات باب الحوائجی و همکاران (1387) استفاده از آنتی­بیوتیک اوفلوکساسین باعث کاهش تحرک اسپرم‌ها و افزایش اسپرم‌های نابالغ شده، در حالیکه استفاده از ژل رویال همراه با این آنتی بیوتیک باعث بهبود پارامترهای کیفی و کمی اسپرم می‌شود (2). همچنین مطالعات فارومبی و همکاران نشان داد که تجویز تتراسایکلین به‌طور معنی‌داری باعث کاهش تحرک اسپرم، درصد اسپرماتوزوئید زنده و شمارش اسپرم و ناهنجاری‌های ناشی از مورفولوژی اسپرم می‌شود و مصرف همزمان آنتی‌اکسیدان­هایی مانند ویتامین C و (NAC) N-acetyl cysteine به میزان قابل‌توجهی از کاهش تحرک اسپرم، درصد اسپرماتوزو زنده و تعداد اسپرم جلوگیری می‌کند (15).

باتوجه به مطالب ذکر شده و نتایج آزمایشات قبلی در خصوص القای استرس اکسیداتیو بوسیله آنتی‌بیوتیک‌های خانواده فلوروکینولون و همچنین تأثیرات آنتی‌اکسیدانی پپتیدهای زیست فعال، این مطالعه باهدف بررسی تأثیرات استفاده از آنتی بیوتیک اوفلوکساسین بر برخی از شاخص‌های اسپرمی و بافتی بیضه و تأثیرات آنتی‌اکسیدانی پپتیدهای زیست فعال استخراج شده از ضایعات موتو ماهیان طراحی و اجرا شد.

مواد و روشها

تعداد 36 عدد رت نر نژاد ویستار سالم با وزن اولیه 40±200 گرم از خانه حیوانات گروه زیست‌شناسی دانشگاه ارومیه برای انجام تحقیق به 6 قفس مربوطه منتقل شدند. رت­ها در طول مدت آزمایش، در درجه حرارت 25 درجه سانتی‌گراد و رژیم نوری 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی با جیره استاندارد تغذیه شدند. بعد از دو هفته آداپتاسیون با شرایط آزمایش به شش گروه آزمایشی تقسیم و با تیمارهای مورد نظر به مدت 45 روز تغذیه شدند. لازم به ذکر است در تیمارهای 3، 4، 5و 6، رت ها به مدت 20 روز با آنتی بیوتیک (6) و پپتیدهای زیست فعال (4 و 29) مورد تغذیه قرارگرفتند و در ادامه تیمار با آنتی­بیوتیک قطع شد. تیمارهای آزمایشی به شرح زیر بودند: گروه کنترل (C)، گروه 20 میلی‌گرم پپتید در کیلوگرم وزن بدن (P)، گروه اوفلوکساسین 72 میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن(OF72)، گروه اوفلوکساسین 360میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن (OF360)، گروه تیمار شده با اوفلوکساسین 72 میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن + 20 میلی‌گرم پپتید (OFP72)، گروه تیمار شده با اوفلوکساسین 360 میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن + 20 میلی‌گرم پپتید (OFP360)

برای تهیه پپتیدهای زیست فعال، از سس تخمیری مهیاوه که از فروشگاه‌های محلی در بندرعباس خریداری شده بود استفاده شد. نمونه تهیه شده در آزمایشگاه با استفاده از خشک‌کن انجمادی خشک شد. قبل از آنالیز، عصاره پپتیدی از طریق حل نمودن 1 قسمت پودر خشک شده با 5 قسمت آب مقطر تهیه و مخلوط حاصل در حمام آبی با دمای 30 درجه سانتی‌گراد به مدت یک ساعت ونیم توسط هم زن الکتریکی بهم زده شد. در انتها، مخلوط به هم زده شده در دور g1000 برای مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ گردید. سوپرناتانت­های حاصل سپس با یکدیگر جمع و توسط کاغذ واتمن فیلتر گردیده تا عصاره پپتیدی شفافی حاصل گردد. عصاره پپتیدی سپس با استفاده از خشک‌کن انجمادی خشک گردیده و در دمای 18- درجه سانتی‌گراد برای استفاده‌های بعدی نگهداری شد. مقدار پروتئین عصاره پپتیدی به روش بیورت با استفاده از آلبومین سرم گاوی (BSA) تعیین گردید (26).

پپتیدهای زیست فعال تهیه شده با روش فوق، در غلظت‌های 20 میلی‌گرم در کیلوگرم وزن بدن موش روزانه در 1 میلی‌لیتر آب مقطر حل‌شده و از طریق گاواژ وارد دستگاه گوارشی رت­ها می‌شد. آنتی بیوتیک اوفلوکساسین از شرکت دارویی دارو پخش تهیه شد و بعد از حل کردن در آب مقطر حاوی 50/0 درصد کربوکسی متیل سلولز سدیم (CMC) به‌صورت روزانه از طریق گاواژ در موش‌ها مورد استفاده قرار می­گرفت (6) لازم به ذکر است که در گروه کنترل به‌جای سایر مواد مورد استفاده، آب مقطر حاوی 5/0 درصد CMC گاواژ شد.

جهت تعیین دوز دارو و پپتید نسبت به وزن موش‌ها، آنها دو بار در هفته وزن‌کشی می‌شدند. بعد از اتمام دوره تیمار موش‌ها با کلروفرم آسان کشی شدند بیضه‌ها با رعایت شرایط استریل از داخل شکم خارج گردید، برای این کار، پوست ناحیه شکمی رت­ها توسط الکل اتانول 70 درصد استریل و سپس در ناحیه شکم برشی ایجاد شد. بعد از جدا کردن بافت­های همبندی اطراف، بیضه‌ها از بدن خارج شدند و دم اپیدیدیم بیضه‌ها به داخل محیط کشت  mR1ECM(40) جهت ارزیابی پارامترهای اسپرمی انتقال داده شد. در نهایت بیضه‌ی چپ رت­ها جهت تثبیت و کارهای بافتی به محلول فرمالین 10 درصد منتقل گشت.

جهت تعیین درصد تحرک اسپرم‌ها، یک قطره از اسپرم‌های موجود در محیط کشت بر روی لام میکروسکوپی قرار داده شد و 10 میدان دید میکروسکوپی با درشت‌نمایی 400 برابر مورد بررسی قرارگرفت. سپس میانگین کل اسپرم‌های متحرک در این 10 میدان دید به‌عنوان درصد تحرک ثبت گردید (49). برای ارزیابی درصد اسپرم‌های زنده، از رنگ‌آمیزی ائوزین-نگروزین استفاده شد و درصد اسپرم‌های زنده (بی‌رنگ) و مرده (نارنجی تا قرمز) بر اساس متد ویروبک و همکاران در سال 1983 محاسبه گردید (56).

برای اندازه‌گیری قطر لوله‌های اسپرمی در بیضه و همچنین ضخامت لایه اپیتلیوم، نمونه‌های بافتی به مدت 10-7 روز در محلول فرمالین قرارداده شدند. پس از تثبیت نمونه‌ها مراحل مختلف پاساژ بافتی انجام داده شد. برای بررسی خصوصیات فیزیکی اجزاء سلولی و ارتباطات بافت­ها، برش‌های مورد نظر به ضخامت 5 میکرون با هماتوکسیلین- ائوزین(H&E) رنگ‌آمیزی شدند. برای ارزیابی قطر لوله‌های منی ساز (STD) اندازه غشای پایه تا غشای پایه مقابل ملاک عمل قرارگرفت و برای اندازه‌گیری ضخامت لایه اپیتلیوم (ET)، اندازه از غشای پایه تا سطح اپیتلیوم اندازه‌گیری شد (28). برای بررسی میزان آسیب DNA از روش رنگ‌آمیزی آکریدین اورانژ (AO) و روش یوریس عرنپرسیس در سال 2001 استفاده شد (20).

برای مقایسه داده‌های حاصل از تیمارها در انتهای دوره با تیمار کنترل، از آنالیز واریانس یک‌طرفه (One-way ANOVA) برای داده‌های اندازه‌گیری شده و تست کروسکال والیس برای داده‌های شمارشی استفاده شد. قبل از اعمال تست‌های مذکور ابتدا داد ها ازنظر نرمال بودن (تست Kolmogorov–Smirnov) و همگنی واریانسها (تست Levene) بررسی شدند. برای رسم گرافها از نرم‌افزارExcell نسخه 2013 و برای بررسی تغییرات آماری در تیمارهای آزمایشی از نرم‌افزار آماری Spss نسخه 21 استفاده شد.

نتایج

شکل 1 نتایج بررسی ظرفیت تام آنتی­اکسیدانی در بیضه‌ها را نشان می‌دهد. براساس این نتایج استفاده از ترکیب پپتیدهای زیست فعال با آنتی بیوتیک اوفلوکساسین به‌طور معنی‌داری میزان ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام را در مقایسه با تیمار کنترل افزایش می‌دهد (05/0P<). اختلاف معنی‌دار در سایر تیمارها در مقایسه با تیمار کنترل مشاهده نشد (05/0P>).

شکل 2 تأثیرات استفاده از تیمارهای غذایی بر شاخصهای اسپرمی را در مقایسه با تیمار کنترل نشان می‌دهد. براساس نتایج به‌دست‌آمده استفاده از آنتی بیوتیک و همچنین پپتیدهای زیست فعال به همراه آنتی­بیوتیک باعث کاهش معنی‌دار زنده مانی اسپرم‌ها در رت های نر شد (05/0P<). همچنین نتایج نشان داد که استفاده از پپتیدهای زیست فعال به‌صورت مجزا و تیمارهایی که در آنها از غلظت پایین آنتی­بیوتیک استفاده شده بود باعث افزایش تحرک اسپرم می‌شود که با تیمار کنترل اختلاف معنی‌دار داشت (05/0P<). تحرک اسپرم‌ها در تیمارهایی که در آنها از غلظت بالای آنتی­بیوتیک استفاده شده بود به‌طور معنی‌داری در مقایسه با تیمار کنترل کاهش پیدا کرد (05/0P<).

 

 

شکل 1- تأثیرات استفاده از آنتی بیوتیک اوفلوکساسین و پپتیدهای زیست فعال بر ظرفیت تام آنتی‌اکسیدانی در رت های نر نژاد ویستار

* نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار با تیمار کنترل در سطح اطمینان 95 درصد است

 

 

شکل 2- تأثیرات استفاده از آنتی بیوتیک و پپتیدهای زیست فعال بر شاخصهای اسپرمی در رت های نر نژاد ویستار

* نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار با تیمار کنترل در سطح اطمینان 95 درصد است

 

 

شکل 3، نتایج تأثیرات پپتیدهای زیست فعال بر شاخصهای بافتی بیضه و مقایسه این تیمارها با تیمار کنترل و همچنین پپتیدهای زیست فعال را نشان می‌دهد. براساس این نتایج، غلظتهای متفاوت آنتی­بیوتیک و همچنین پپتیدهای زیست فعال به‌طور معنی‌داری میزان شاخص ضخامت لایه اپیتلیوم را در بافت بیضه نسبت به تیمار کنترل کاهش دادند (05/0P<). نتایج مشابه در شاخص قطر لوله‌های سمینفروز مشاهده شد و نتایج نشان داد که استفاده از تیمارهای غذایی میزان این شاخص را نسبت به تیمار کنترل به‌طور معنی‌داری کاهش می‌دهد (05/0P<). همچنین آسیب DNA در بافت بیضه بررسی شد و نتایج نشان داد که استفاده از تیمارهای غذایی میزان آسیب DNA را در بافت بیضه نسبت به تیمار کنترل به‌طور معنی‌داری افزایش می‌دهد (05/0P<).  همچنین براساس این نتایج در تیمارهایی که از آنتی بیوتیک و پپتید زیست فعال استفاده شده بود میزان آسیب DNA نسبت به سایر تیمارها پایین بود.

 

 

 

 

 

 

 

شکل 3-تأثیرات استفاده از آنتی بیوتیک و پپتیدهای زیست فعال بر قطر لوله‌های سمینفروز (STD)، ضخامت لایه اپیتلیوم (ET) و آسیب DNA در رت های نر نژاد ویستار، * نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار با تیمار کنترل در سطح اطمینان 95 درصد است

 

شکل 1- مقطع عرضی بافت بیضه در گروه‌های کنترل (A) تمامی رده‌های سلولی اسپرماتوژنز به‌صورت کامل و مرتب قرار دارند، پپتیدزیست فعال(B) در این گروه همانطور که دیده می‌شود در قسمت میانی لوله ایپرم ها به صورت معنی‌داری کاهش‌یافته است، اوفلوکساسین72 (C) این تصویر نشان می‌دهد ارتباط سلولی در بین سلولهای نسل اسپرماتوژنز از بین رفته و گسیختگی ما بین این سلول‌ها دیده می‌شود، اوفلوکساسین360 (D) در این گروه در غالب لوله‌های منی ساز ارتباطات بین سلولی از بین رفته است، اوفلوکساسین72+پپتید(E) در این گروه پپتید باعث شده است لوله‌ها و سلولهای نسل اسپرماتوژنز بهبودیافته است، اوفلوکساسین360 +پپتید(F) دوز بالای آنتی بیوتیک اثرات تخریبی زیادی دارد که پپتید هم نتوانسته است اثرات بهبود خود را بگذارد- (رنگ‌آمیزی H&E، بزرگنمایی10˟

 

 

شکل 2- تصاویر مربوط به رنگ‌آمیزی ائوزین-نگروزین جهت ارزیابی زنده مانی اسپرم- اسپرم مرده(DS)، اسپرم زنده(LS)- (بزرگنمایی1000´)

بحث و نتیجه‌گیری

امروزه برای کاهش یا تعدیل تأثیرات سوء داروهایی مانند آنتی بیوتیک ها بر شاخصهای تولیدمثلی، از آنتی اکسیدانتهای طبیعی مانند ژل رویال (3و 14)، ویتامینE (45) و میکرو المنتهایی مانند روی و سلنیوم (25) استفاده می‌کنند که هرکدام از این مواد دارای محدودیتهایی در استفاده می‌باشند.

دراین مطالعه از پپتیدهای زیست فعال به‌عنوان یک عامل آنتی‌اکسیدانی و تعدیل‌کننده به همراه آنتی بیوتیک افلوکساسین استفاده شد و نتایج نشان داد که استفاده از پپتیدهای زیست فعال به همراه آنتی­بیوتیک در نهایت باعث افزایش ظرفیت تام آنتی‌اکسیدانی در بیضه و کاهش تأثیرات مخرب این آنتی­بیوتیک شود. طبق تحقیقات صورت گرفته توسط حیدری و همکاران در سال 1396 که در مورد تأثیرات پپتیدهای زیست فعال بر روی فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی کبد در رت­های نر تحت استرس بی‌حرکتی انجام شد نتایج نشان داد که استفاده از پپتیدهای زیست فعال باعث افزایش سطح TAC می‌شود. همچنین استفاده از پپتیدهای زیست فعال باعث بهبود تنش اکسیداتیو ناشی از استرس بی‌حرکتی شد و سیستم ایمنی را نیز در کبد تقویت نمود (4). طبق نتایج عبادی مناس و همکاران در سال 2017، استفاده از ژل رویال می‌تواند اختلال در آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی بیضه ناشی از مصرف اوفلوکساسین ازجمله افزایش سطح MDA و کاهش میزان فعالیت آنزیم‌های TACو TTM را بهبود ببخشد (14).

امروزه به‌تبع افزایش مصرف غذاهای دریایی، استفاده از پپتیدهای زیست فعال با منشأ دریایی به‌عنوان یک فراورده مهم و یک آنتی­اکسیدانت طبیعی در تحقیقات مختلف گزارش شده است. این فراورده‌ها ازنظر ساختاری از 2 تا 22 اسیدآمینه تشکیل‌شده‌اند برخی از این اسیدهای آمینه مانند تریپتوفان، تیروزین، متیونین، سیستئین، هیستامین و فنیل آلانین دارای خواص بالای آنتی‌اکسیدانی و فعالیت تمیزکنندگی می‌باشند (12و 35). بنابراین وجود خاصیت احیاء کنندگی و دارا بودن اسیدهای آمینه آنتی‌اکسیدانی می‌تواند ظرفیت مقابله با استرس را در بدن جانداران افزایش دهد. نتایج به‌دست‌آمده در این تحقیق با نتایج تحقیقات پیشین در خصوص تأثیرات آنتی‌اکسیدانی پپتیدهای زیست فعال و همچنین سایر آنتی‌اکسیدان­های طبیعی همخوانی دارد.

عبادی مناس و همکاران در سال 2017 تغییرات هیستومورفومتری و استرس اکسیداتیو ناشی از اوفلوکساسین و اثر ژل رویال را بعنوان یک آنتی اکسیدانت در بیضه موش مورد ارزیابی قراردادند. نتایج گروه‌های آزمایشی نشان داد که اوفلوکساسین باعث کاهش تعداد و زنده مانی اسپرم و همچنین باعث افزایش درصد آسیب DNA می‌شود و استفاده از ژل رویال+ اوفلوکساسین باعث بهبود این شاخص‌ها می‌شود (14). فارموبی و همکاران در سال 2008 تأثیر ویتامین C و استیل سیستئین (NAC) بر اثرات مخرب تتراسایکلین بر سیستم تولیدمثلی رت نر را بررسی کردند و نتایج آنها نشان داد که تجویز تتراسایکلین باعث کاهش تحرک اسپرم اپیدیدیم، درصد اسپرم زنده، تعداد اسپرم و افزایش مورفولوژی غیرطبیعی اسپرم و همچنین القای تغییرات نامطلوب هیستوپاتولوژیک در بیضه‌ها می‌شود، در حالی که ویتامین C و NAC تأثیرات سمی تتراسایکلین را بر پارامترهای اسپرم کاهش داده‌اند (15). در این مطالعه نتایج نشان داد که استفاده از آنتی بیوتیک اوفلوکساسین باعث اختلال در میزان شاخص‌های اسپرمی ازجمله افزایش میزان آسیب DNA اسپرم‌ها، زنده مانی و همچنین تعداد اسپرم‌های بالغ شده است که با نتایج مطالعات پیشین در خصوص تأثیرات منفی آنتی بیوتیک ها بر این شاخص‌ها همخوانی دارد. همچنین نتایج نشان داد که استفاده از پپتیدهای زیست فعال میزان شاخص‌ها به‌طور معنی‌داری بهبود داده است که نشان دهنده تأثیرات آنتی‌اکسیدانی پپتیدهای زیست فعال در کاهش اثرات سوء اوفلوکساسین بر شاخص‌های اسپرمی می‌باشد. 

همچنین براساس یافته‌های عبادی مناس و همکاران در سال 2017، آنتی بیوتیک اوفلوکساسین باعث کاهش قطر لوله‌های سمنی فروز و ضخامت اپیتلیوم زایا و فاصله بین لوله‌های اسپرم‌ساز شد. نتایج آنها نشان داد که استفاده از ژل رویال به‌عنوان یک آنتی اکسیدانت می‌تواند تا حدودی تأثیرات مخرب اوفلوکساسین را در این خصوص را تعدیل کند (14). کیانی و همکاران در سال 1396 اثرات حفاظتی ال کارنیتین بر سیستم تولیدمثلی رت های تحت درمان با سیپروفلوکساسین را بررسی کردند و نتایج کاهش میانگین قطر لوله‌های منی ساز، قطر لومن لوله‌های منـی سـاز، ضـــخامت اپـــیتلیـــوم و قطـــر تونیکاآلبوژینـــا را نشــان داد. ال کارنیتین باتوجه به خاصیت آنتی‌اکسیدانی خود توانست کاهش ناشی از سیپروفلوکساسین را جبران کند (5). در مطالعه حاضر نتایج نشان داد که استفاده از آنتی بیوتیک افلوکساسین به مدت 20روز متوالی، ضخامت لایه زایا (ET) را کاهش می‌دهد که با نتایج تحقیقات پیشین در خصوص تأثیرات منفی آنتی­بیوتیک براین شاخص‌ها همخوانی دارد. همچنین نتایج نشان داد که استفاده از پپتیدهای زیست فعال که خاصیت آنتی‌اکسیدانی آن در مطالعات قبلی به اثبات رسیده است، باعث افزایش ضخامت اپیتلیوم (ET) و تعدیل تأثیرات منفی اوفلوکساسین می‌شود که با تأثیرات تعدیل کنندگی سایر آنتی اکسیدانت ها طبیعی همخوانی دارد.

به نظر می‌رسد پپتیدهای زیست­فعال با استفاده خاصیت آنتی‌اکسیدانی خود که در مطالعات مختلف گزارش شده است (1و 4) رادیکالهای آزاد حاصل از عملکرد آنتی بیوتیک اوفلوکساسین در بیضه را تعدیل و شرایط را برای عملکرد مناسب سلولهای منی ساز فراهم کرده‌اند. برای بررسی و نتیجه‌گیری دقیق این مسئله، نیاز به ارزیابی مجدد چند شاخص اکسیدانی و یا آنتی‌اکسیدانی اوفلوکساسین و پپیتدهای زیست­فعال و همچنین مکانیسم عمل پپتیدهای زیست­فعال در این خصوص می‌باشد. نتایج این تحقیق نشان می‌دهد استفاده از پپتیدهای زیست­فعال در غلظت 20 میلی‌گرم در کیلوگرم رت­های نر، می‌تواند تأثیرات اکسیداتیو آنتی بیوتیک اوفلوکساسین بر بافت بیضه و همچنین شاخص‌های اسپرمی را تا حد زیادی تعدیل کرده و ریسک باروری را با توجه به نتایج این تحقیق افزایش دهد.

سپاسگزاری

نویسندگان مقاله از معاونت پژوهشی دانشگاه ارومیه بابت حمایت مالی و همچنین کارشناسان بخش فیزیولوژی جانوری گروه زیست‌شناسی دانشکده علوم و دامپزشکی دانشگاه ارومیه نهایت سپاس و تشکر را دارند.

1- احمدی، ز.، حسین نجدگرامی، ا.، نجاتی، و.، و نیکو، م.، 1398. بررسی تأثیرات مثبت پپتیدهای زیست فعال (Bioactive peptides) بر آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی بیضه و سمیت تولیدمثلی حاصل از سایمتیدین در موش‌های رت نر، پایان‌نامه کارشناسی ارشد، دانشگاه ارومیه
2-باب الحوائجی، ه.، و فیضیان، م.، 1387. بررسی فراوانی اختلال عملکرد جنسی در مردان نابارور مراجعه‌کننده به بیمارستان فاطمیه همدان، مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی همدان، دوره 15،شماره 2، صفحه 8.
3-حسامی، س.، نجاتی، و.، 2016. مطالعه تأثیر آنتی بیوتیک افلوکساسین بر قطر لوله‌های اسپرماتوژنز دررت نر بالغ و اثر درمانی ژله رویال بر آن، مجله پژوهش‌های جانوری (مجله زیست‌شناسی ایران) 29، صفحات 146-154.
4-حیدری، ش.، حسین نجدگرامی، ا.، و نیکو، م.، 1395. تأثیر مخلوط پپتیدهای زیست فعال ماهی ساردین بر ظرفیت آنتی‌اکسیدانی سرم، پراکسیداسیون چربی‌ها و فراسنجه های خونی در موش‌های بزرگ آزمایشگاهی ویستار تحت استرس بی‌حرکتی، مجله پژوهشهای جانوری(مجله زیست شناسی ایران)، جلد30، شماره 3، 279-288.
5-کیانی، م.، و پرتو، پ.، 1396. اثر حفاظتی ال-کارنیتین روی پارامترهای اسپرم در موش‌های تحت درمان با سیپروفلوکساسین، مجله علوم پزشکی اردبیل، شماره4، صفحات 401-392.
 
6-Abd-Allah, A. R. A., and Aly, H., 2000. Adverse testicular effects of some quinolone members in rats. Pharmacological research 41, PP: 211-219.
7-Amirshahi, T., and Nejati, V., 2014. Protective effect of royal jelly on fertility and biochemical parameters in bleomycin-‎ induced male rats. Iranian journal of reproductive medicine, 12(3), 209 p.
8-Agarwal, A., Rana, M., Qiu, E., AlBunni, H., Bui, A. D., and Henkel, R., 2018. Role of oxidative stress, infection and inflammation in male infertility, Andrologia 50, e13126 p.
9-Arihara, K., 2006. Functional properties of bioactive peptides derived from meat proteins. Advanced technologies for meat processing, PP: 245-274.
10-Beyene, G., and Tsegaye, W., 2011. Bacterial uropathogens in urinary tract infection and antibiotic susceptibility pattern in jimma university specialized hospital, southwest ethiopia. Ethiopian journal of health sciences 21, PP: 141-146.
11-Calogero, A. E., Condorelli, R. A., Russo, G. I., and La Vignera, S., 2017. Conservative nonhormonal options for the treatment of male infertility: antibiotics, anti-inflammatory drugs, and antioxidants. BioMed research international, 2017 p.
12-Davalos, Miguel, 2004. Antioxidant activity of peptides derived from egg white proteins by enzymatic hydrolysis, Journal of Food Protection 67, PP: 1939-1944.
13-Djurdjevic, P. T., and Jelikic-Stankov, M., 1999. Study of solution equilibria between aluminum (III) ion and ofloxacin. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis 19, PP: 501-510.
14-Ebadimanas, Najafi, 2017. Protective effects if royal jellly on the histomorphologic oxidative stress and sperm parameters in Ofloxacin treated rat. Comparative clinical pathology.
15-Ebenezer, O., Farombi Mercy, C., Ugwuezunmba Teclar, T., Ezenwadua, Matthew, O., and Oyeyemi, Martins Ekor., 2008. Tetracycline-induced reproductive toxicity in male rats: Effects of vitamin C and N-acetylcysteine. Experimental and Toxicologic Pathology 60, PP: 77–85.
16-El-Nekeety, A. A., El-Kholy, W., Abbas, N. F., Ebaid, A., Amra, H. A., and Abdel-Wahhab, M. A., 2007. Efficacy of royal jelly against the oxidative stress of fumonisin in rats, Toxicon 50, PP: 256-269.
17-El‐Harouny, M., Zalata, A., Naser, M., Abo El‐Atta, H., El‐Shawaf, I., and Mostafa, T., 2010. Long‐term ofloxacin testicular toxicity: an experimental study, Andrologia 42, PP: 92-96.
18-Elmas, M., Tras, B., Kaya, S., Bas, A. L., Yazar, E., and Yarsan, E., 2001. Pharmacokinetics of enrofloxacin after intravenous and intramuscular administration in Angora goats, Canadian journal of veterinary research 65, 64 p.
19-Erdmann, K., Cheung, B. W., and Schröder, H., 2008. The possible roles of food-derived bioactive peptides in reducing the risk of cardiovascular disease. The Journal of nutritional biochemistry 19, PP: 643-654.
20-Erenpreis, J., Bars, J., Lipatnikova, V., Erenpreisa, J., and Zalkalns, J., 2001. Comparative study of cytochemical tests for sperm chromatin integrity, Journal of andrology 22, PP: 45-53.
21-Fu, L., Chen, Y. H., Xu, S., Ji, Y. L., Zhang, C., Wang, H., Yu, D. X., and Xu, D. X., 2017. Vitamin D deficiency impairs testicular development and spermatogenesis in mice. Reproductive Toxicology 73, PP: 241-249.
22-Gholami, M., Abbaszadeh, A., Khanipour Khayat, Z., Anbari, K., Baharvand, P., and Gharravi, A., 2018. Honey improves spermatogenesis and hormone secretion in testicular ischaemia–reperfusion‐induced injury in rats. Andrologia 50, e12804 p.
23-Giri, A., and Ohshima, T., 2012. Bioactive marine peptides: Nutraceutical value and novel approaches, Advances in food and nutrition research. Elsevier, PP: 73-105.
24-Godmann, M., Lambrot, R., and Kimmins, S., 2009. The dynamic epigenetic program in male germ cells: Its role in spermatogenesis, testis cancer, and its response to the environment, Microscopy research and technique 72, PP: 603-619.
25-Goel, A., Dani, V., and Dhawan, D., 2005. Protective effects of zinc on lipid peroxidation, antioxidant enzymes and hepatic histoarchitecture in chlorpyrifos-induced toxicity, Chemico-Biological Interactions 156, PP: 131-140.
26-Gornal, A., Bardawill, C., and David, M., 1949. Protein–Biuret colorimetric method. J., Biol., Chem 177, 751p.
27-Hajihashemil, 2017. effects ofcobalamin (vitamin B12) on gentamicin induced nephrotoxicity in rat, Drug research(Stuttg) 67, 710 p.
28-Haron, M. N., D'Souza, U. J., Jaafar, H., Zakaria, R., and Singh, H. J., 2010. Exogenous leptin administration decreases sperm count and increases the fraction of abnormal sperm in adult rats. Fertility and sterility 93, PP: 322-324.
29-Heidari, S. H., Najdegerami, E., and Nikoo, M., 2017. The effect of bioactive peptides mixture extracted from sardine on total antioxidant capacity of serum, lipid peroxidation and blood parameters in rats exposed to restraint stress. Journal of Animal Research (Iranian Journal of Biology) 30, PP: 279-288.
30-Herbold, B. A., Brendler-Schwaab, S. Y., and Ahr, H. J., 2001. Ciprofloxacin: in vivo genotoxicity studies. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 498, PP: 193-205.
31-Huang, Y., 2010. Varicocele and male infertility, Zhonghua nan ke xue National journal of andrology 16, 195p.
32-Khajehei, 2009. Randomised double-blind trial of the effect of vitamin C on dyspareunia and vaginal discharge in women receiving doxycycline and triple sulfa for chlamydial cervicitis. Australian and New Zealand Journal of Obstetrics and Gynaecology 49, 525 p.
33-Khaki, A., and Mekaniksannati, A., 2008. Evaluation of the effects of streptomycin and ofloxacin antibiotics on leydig cell apoptosis in rat, Scientific Journal of Kurdistan University of Medical Sciences 12, PP: 23-31.
34-Kothari, A., and Sagar, V., 2013. Antibiotic resistance in pathogens causing community-acquired urinary tract infection in india: a multicancer stdy, Journal if family and community medicine 20, 20 p.
35-Lassoued, I., Mora, L., Nasri, R., Jridi, M., Toldrá, F., Aristoy, M. C., and Nasri, M., 2015. Characterization and Comparative assessment of antioxidant and ACE inhibitory activities of thornback ray gelatin hydrolysates, Journal of Functional Foods 13, PP: 225-238.
36-Li, Y., and Yu, J., 2015. Research progress in structure-activity relationship of bioactive peptides, Journal of medicinal food 18, PP: 147-156.
37-Manali, P., 2011. Evaluation of vitamin E and N-acetyl cysteine in gentamicin-induced nephrotoxicity in rats. Renal Failure 10, PP: 1171-1188.
38-Manas, G. E., and Najafi, G., 2017. Protective effects of royal jelly on the histomorphologic, oxidative stress and sperm parameters in Ofloxacin treated rat, Comparative Clinical Pathology 26, PP: 1111-1115.
39-Montanari, M., Prenna, M., Mingoia, M., Ripa, S., and Varaldo, P., 1998. In vitro antibacterial activity of trovafloxacin and five other fluoroquinolones, Chemotherapy 44, PP: 85-93.
40-Oh, S. H., Miyoshi, K., and Funahashi, H., 1998. Rat oocytes fertilized in modified rat 1-cell embryo culture medium containing a high sodium chloride concentration and bovine serum albumin maintain developmental ability to the blastocyst stage. Biology of reproduction 59, PP: 884-889.
41-Olayemi, F., 2010. Review on some causes of male infertility. African Journal of Biotechnology 9.
42-Oliva, A., Spira, A., and Multigner, L., 2001. Contribution of environmental factors to the risk of male infertility, Huuman Reproduction 16, 1776 p.
43-Ourique, G. M., Saccol, E. M., Pes, T. S., Glanzner, W. G., Schiefelbein, S. H., Woehl, V. M., Baldisserotto, B., Pavanato, M. A., Goncalves, P. B., and Barreto, K. P., 2016. Protective effect of vitamin E on sperm motility and oxidative stress in valproic acid treated rats. Food and Chemical Toxicology 95, PP: 159-167.
44-Petri, W., 2001. Antimicroial agents: Sulphonamides trimethoprim-sulfamethoxazole, quinolones and agents for urinary tract infection. IN THE Pharmacological Basis of therapeutics. 10, 1171 p.
45- Ronald, A., Nicolle, L., Stamm, E., Krieger, J., Warren, J., Schaeffer, A., Naber, K., Hooton, T., Johnson, J., Chambers, S., 2001. Urinary tract infection in adults: research priorities and strategies. International journal of antimicrobial agents 17, 343-348.
46-Ronald, A., Nicolle, L., Stamm, E., Krieger, J., Warren, J., Schaeffer, A., Naber, K., Hooton, T., Johnson, J., and Chambers, S., 2001. Urinary tract infection in adults: research priorities and strategies. International journal of antimicrobial agents 17, PP: 343-348.
47-Sansone, A., Gandini, L., Lombardo, F., and Lenzi, A., 2017. Carnitine in Male Infertility, Antioxidants in Andrology, Springer, PP: 35-41.
48-Schlegel, P. N., Chang, T., and Marshall, F. F., 1991. Antibiotics: potential hazards to male fertility. Fertility and sterility 55, PP: 235-242.
49-Selvakumar, E., Prahalathan, C., Sudharsan, P. T., and Varalakshmi, P., 2006. Chemoprotective effect of lipoic acid against cyclophosphamide-induced changes in the rat sperm, Toxicology 217, PP: 71-78.
50-Shahidi, F., and Zhong, Y., 2008. Bioactive peptides, Journal of AOAC International 91, PP: 914-931.
51-Silici, S., Ekmekcioglu, O., Eraslan, G., and Demirtas, A., 2009. Antioxidative effect of royal jelly in cisplatin-induced testes damage, Urology 74, PPl 545-551.
52-Taheri, A. S. F. K., Jacobsen, C., and Baron, C. P., 2014. Antioxidant activities and functional properties of protein and peptide fraction isolated from salted herring brin, Food Chemistry, 142, PP: 318-326.
53-Tonolo, F., Folda, A., Cesaro, L., Scalcon, V., Marin, O., Ferro, S., Bindoli, A., and Rigobello, M. P., 2020. Milk-derived bioactive peptides exhibit antioxidant activity through the Keap1-Nrf2 signaling pathway, Journal of Functional Foods 64, 103696 p.
54-Vahidinia, A., Rahbar, A. R., and Shakoori Mahmoodabadi, M. M., 2017. Effect of astaxanthin, vitamin E, and vitamin C in combination with calorie restriction on sperm quality and quantity in male rats, Journal of dietary supplements 14, PP: 252-263.
55-Williams, E. A., and Pacey, A., 2020. Reply to the letter: Lycopene improves sperm motility and morphology: a promising agent for treating male infertility, European journal of nutrition, PP: 1-1.
56-Wyrobek, A. J., Gordon, L. A., Burkhart, J. G., Francis, M. W., Kapp Jr, R. W., Letz, G., Malling, H. V., Topham, J. C., and Whorton, M. D., 1983. An evaluation of the mouse sperm morphology test and other sperm tests in nonhuman mammals: A report of the US Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology 115, PP: 1-72.
57-Yoshida, S., Takakura, A., Ohbo, K., Abe, K., Wakabayashi, J., Yamamoto, M., Suda, T., and Nabeshima, Y. I., 2004. Neurogenin3 delineates the earliest stages of spermatogenesis in the mouse testis. Developmental biology 269, PP: 447-458.
58-Zhang, H.a.J., BF, 2010. Azoospermia factor and male infertility. Zhonghua nan ke xue National journal of andrology 16, 166 p.