نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست‌شناسی دریا، دانشکده منابع طبیعی و علوم دریایی، دانشگاه تربیت مدرس، شهرستان نور، ایران

2 گروه زیست شناسی دریا، دانشکده منابع طبیعی و علوم دریایی نور، دانشگاه تربیت مدرس

چکیده

شکم‌پایان با بیشترین فراوانی و تنوع زیستگاهی، بزرگترین رده از شاخه نرم‌تنان هستند. تنوع گونه‌ای لیمپت‌های حقیقی (خانواده Nacellidae) در جزیره هرمز با جمع‌آوری 121 نمونه ‌‌از اعضای این خانواده از دو ایستگاه در نواحی جذر ومدی و در دو فصل پاییز و زمستان سال‌های 1395 و 1396 بررسی شد. مطالعات ریخت‌شناختی بر اساس صفات ریختی پوسته، پا و ساختار رادولا بر روی نمونه‌ها انجام شد و همچنین مطالعه مولکولی با استفاده از داده‌های ژن میتوکندریایی سیتوکروم اکسیداز c زیرواحد 1 (CO1) صورت گرفت. نتایج مطالعات ریخت‌شناختی نشان داد که تمامی نمونه‌های جمع‌آوری شده با وجود دارا بودن فنوتیپ‌های متفاوت و تفاوت از نظر صفات طرح و رنگ پوسته، متعلق به گونه Cellana karachiensis می‌باشند. نتایج مطالعه مولکولی بر روی 6 نمونه نیز این یافته را مورد تایید قرار داد. از این رو نتایج این مطالعه، علاوه بر نشان دادن تنوع فنوتیپی بالا برای گونه C. karachiensis، ارزش آرایه‌شناختی صفات طرح و رنگ پوسته را در شناسایی گونه‌های این خانواده مورد سوال قرار داد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Species Identification of Nacellidae Thiele, 1891 Family in Hormuz Island (Persian Gulf)

نویسندگان [English]

  • Zahra Maysoori 1
  • Mehdi Ghodrati Shojaei 2
  • Jafar Seyfabadi 1

1 Department of Marine Biology, Faculty of Natural Resources & Marine Science, Tarbiat Modares University, Nur, Iran

2 Department of Marine Biology, Marine Science and Natural Resource Faculty, Tarbiat Modares University

چکیده [English]

Gastropods are the largest group of molluscs, with the highest abundance and habitats diversity. The species diversity of true limpets (Nacellidae) in Hormuz Island was investigated by collecting 121 specimens belonging to this family from two stations in the intertidal zone in fall and winter 2016 and 2017. Morphological studies were carried out on the basis of shell morphological characteristics, foot color, radula structure. Besides, the molecular study was also performed using the cytochrome oxidase c subunit 1 (CO1) of the mitochondrial gene. The results of morphological studies indicate that all the specimens, despite having different phenotypes and differences in pattern and color of the shell traits, belonged to Cellana karachiensis which was also confirmed by the molecular finding. Therefore, the results of this study show various phenotypes for C. karachiensis, which also cast doubt on the taxonomic value for identification of this family, based on the color pattern, shell and radula traits.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Patellogastropoda
  • Limpet
  • Radula
  • Hormuz Island

شناسایی گونه‌های خانواده Nacellidae Thiele, 1891 در جزیره هرمز (خلیجفارس)

زهرا میسوری، مهدی قدرتی شجاعیوجعفر سیف‌آبادی*

ایران، نور، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده منابع طبیعی و علوم دریایی، گروه زیست‌شناسی دریا

تاریخ دریافت: 12/9/1398            تاریخ پذیرش: 21/4/1399

چکیده

شکم‌پایان با بیشترین فراوانی و تنوع زیستگاهی، بزرگترین رده از شاخه نرم‌تنان هستند. تنوع گونه­ای لیمپت‌های حقیقی (خانواده Nacellidae) در جزیره هرمز با جمع‌آوری ۱۲۱ نمونه ‌از اعضای این خانواده از دو ایستگاه در نواحی جذرومدی و در دو فصل پاییز و زمستان سال‌های 1395 و 1396 بررسی شد. مطالعات ریخت‌شناختی بر اساس صفات ریختی پوسته، پا و ساختار رادولا بر روی نمونه­ها انجام شد و همچنین مطالعه مولکولی با استفاده از داده‌های ژن میتوکندریایی سیتوکروم اکسیداز c زیرواحد ۱ (CO1) صورت گرفت. نتایج مطالعات ریخت‌شناختی نشان داد که تمامی نمونه­های جمع­آوری شده با وجود دارا بودن فنوتیپ­های متفاوت و تفاوت از نظر صفات طرح و رنگ پوسته، متعلق به گونه Cellana karachiensisمی­باشند. نتایج مطالعه مولکولی بر روی 6 نمونه نیز این یافته را مورد تایید قرارداد. ازاین رو نتایج این مطالعه، علاوه بر نشان دادن تنوع فنوتیپی بالا برای گونه C. karachiensis، ارزش آرایه­شناختی صفات طرح و رنگ پوسته را در شناسایی گونه­های این خانواده مورد سوال قرارداد.

واژه‌های کلیدی: شکم‌پایان کشککی، خاره‌چسب، سوهانک، جزیره هرمز

* نویسنده مسئول، تلفن: 01144998163 ، پست الکترونیکی: seyfabadi@modares.ac.ir

مقدمه

 

شکم‌پایان با بیشترین فراوانی و تنوع زیستگاهی، بزرگترین رده از شاخه نرم‌تنان و یکی از گروه‌های مهم کف­زی در مناطق ساحلی محسوب می‌شوند (۳۴و ۵۱). حفره دهانی در سیستم گوارشی شکم‌پایان از عناصر گسسته متعدد و مرتبطی تشکیل شده است (۴۸) که رادولا اصلی‌ترین اندام تغذیه­ای محسوب می‌شود (۹). ساختار رادولا در مطالعات آرایه‌شناختی و تبارزادی اهمیت بالایی را دارا می‌باشد (۸). چندریختی گونه‌ای در شکم‌پایان با صفات ریختی رادولا بهتر از صفات پوسته و پا نشان داده می‌شود‌‌ (۳۶)، و مقایسه ساختار رادولا بیانگر اختصاصی بودن آن برای هریک از گونه‌ها می‌باشد (۲۵و ۲۹).

ویژگی‌های رادولا در سطوح خانواده، جنس، شباهت‌ها و در سطح گونه، تفاوت‌های پایدار را نشان می‌دهند. شباهت‌ها و تفاوت‌ها به‌ترتیب در سطح وسیعی برای طبقه‌بندی شکم‌پایان به‌کار گرفته شده‌اند. در تجزیه و تحلیل‌های پیشین از شکم‌پایان جلوآبشش، به جز ریخت‌شناسی رادولا، بعضی صفات دیگر مانند ساختار میکروسکوپی پوسته، دستگاه گوارش، سیستم عصبی، اندام تولیدمثل و ساختار اسپرم را مناسب اهداف طبقه‌بندی نشان داده‌اند (21، 22، 31 و 26). همچنین، می‌توان از تنوع در توالی DNA برای شناسایی و حل ابهام در طبقه‌بندی‌های جانوری و گونه‌های جدید استفاده کرد (35و 19). توالی ژن CO1 میتوکندری جهت تمایز جانوران از یکدیگر کارایی داشته و می‌تواند به‌شکل ابزاری جهان‌شمول به‌عنوان بارکد شناسایی گونه‌ به‌کار آید (18). این تکنیک جهت تمایز در میان گونه‌های نزدیک به‌هم در شاخه‌های مختلف جانوری مناسب می‌باشد (55و 30).

شناسایی لیمپت‌ها در مناطق مختلف مورد توجه بوده (41و 45) و در برخی مقالات از رادولا به‌‌عنوان یک صفت آرایه‌شناختی مهم و همچنین تفکیک گونه‌ها در کنار تأیید مولکولی استفاده شده است (۳۶، 49، 54 و 56).

تاکنون اطلاعات اندکی در رابطه با شناسایی لیمپت‌ها در خلیج‌فارس و دریای عمان وجود دارد (1، 5و 11). همچنین در ایران، استفاده از ساختار رادولا در تفکیک شکم‌پایان در چند سال اخیر مورد توجه قرارگرفته است (3، 4و 10). لذا باتوجه به کمبود اطلاعات پیرامون لیمپت‌ها در خلیج­فارس و دریای عمان و همچنین وجود شواهدی مبنی بر وجود چندین گونه لیمپت حقیقی در این مناطق، پژوهش حاضر به‌منظور بررسی گونه‌های موجود از جمعیت‌های لیمپت‌های حقیقی (زیررده Patellogastropoda) در جزیره هرمز با هدف تفکیک گونه‌ای براساس صفات ریختی پوسته، پا، رادولا و همچنین مطالعات مولکولی با استفاده از داده‌های ژن میتوکندریایی CO1 انجام شده است.

مواد و روشها

نمونه‌برداری: پس از بررسی‌های اولیه میدانی در مناطق جزرومدی جزیره هرمز (46/56 شرقی و 06/27 شمالی)، دو ایستگاه تجمع لیمپت‌های حقیقی (زیررده Patellogastropoda) برای جمع‌آوری انتخاب و موقعیت جغرافیایی آنها ثبت گردید (شکل 1، جدول 1). نمونه‌برداری در زمستان 95، 96 و پاییز 96، در زمان حداکثر جزر انجام شد.

 

 

شکل 1- جزیره هرمز و ایستگاه‌های نمونه‌برداری. ایستگاه 1 (مرکز تحقیقات محیط‌زیست)، ایستگاه 2 (خاک سرخ)

جدول 1- مشخصات ایستگاه‌های نمونه‌برداری در جزیره هرمز

ایستگاه

نام ایستگاه

      مختصات جغرافیایی

توصیف ایستگاه و بستر

1

ایستگاه تحقیقات

محیط زیست

E ً46 ´29 ˚56

N "37 ´02 ˚27

-      منطقه بالای جزر و مدی، صخره‌ای صیقلی

-      میان جزر و مدی، صخره‌ای - ماسه‌ای با پوشش جلبکی روی صخره‌ها

-      ناحیه پایین جزر و مدی، سنگی - ماسه‌ای

2

خاک سرخ

E "32 ´27 ˚56

N "01 ´02 ˚27

-      منطقه بالای جزر و مدی، صخره‌ای صیقلی

-      میان جزر و مدی سنگی، صخره‌ای - ماسه‌ای با پوشش جلبکی پراکنده

-      ناحیه پایین جزر و مدی، سنگی - ماسه‌ای

-      فراوانی املاح معدنی در آب به‌دلیل وجود معدن خاک سرخ


مطالعات ریخت‌شناختی: در اولین گام، با استفاده از کلید شناسایی موجود (۴۴) و سایت معتبر WoRMS، نمونه‌های دارای ویژگی‌های ریختی یکسان، براساس شکل پوسته و رنگ پا در گروه‌های جداگانه قرارداده شدند. در گام بعدی، صفات ریختی لیمپت‌ها ثبت ‌گردید، سپس نمونه‌ها در الکل ۷۰ درصد برای بررسی ساختار رادولا و الکل ۹۶ درصد برای مطالعات مولکولی تثبیت (۲۰) و به آزمایشگاه علوم دریایی منتقل شدند. سپس، اندام رادولا با دقت از بخش دهانی نمونه‌های لیمپت جداسازی و جهت زدودگی از بافت‌های اضافی، به مدت حداقل یک دقیقه در محلول رقیق هیپوکلرید سدیم با نسبت 9:1 (آب ژاول: آب مقطر) قرارداده شد (13و 24). سپس با آب مقطر شستشو داده شد و تا زمان عکس‌برداری در الکل 70 درصد نگه‌داری گردید. در نهایت، رادولاهای فیکس شده به آزمایشگاه میکروسکوپ الکترونی دانشگاه تربیت مدرس منتقل و به‌وسیله دستگاه پوشش‌دهندهبا لایه نازکی از طلا پوشش شدند و با میکروسکوپ الکترونی SEM (مدل XL 30 فیلیپس) از آنها عکس گرفته شد. عکس‌برداری از قسمت میانی رادولا با دو تکرار انجام گردید.

مطالعات مولکولی: استخراج DNA نمونه‌های مورد بررسی با روش فنل–کلروفرم (۵۲) انجام شد. کمیّت DNA ژنومی با استفاده از دستگاه نانودراپ با جذب اشعه ماوراء بنفش مشخص گردید. مقدار پرتو ماوراء بنفش جذب شده به‌وسیله محلول DNA در طول موج 260 و 280 نانومتر اندازه‌گیری شد. برای یک نمونه DNA خالص، نسبت جذب در 260 نانومتر به 280 نانومتر برابر با 2-8/1 می‌باشد. نسبت کمتر از 8/1 نشان دهنده آلودگی با پروتئین و فنل و بالاتر از 2 آلودگی با RNA است (۵۷). پس از اندازه‌گیری کمیّت DNA با نانودراپ، کیفیت نمونه‌ها با استفاده از ژل آگارز ۱ درصد و رنگ‌آمیزی با DNA safe stain تعیین شد. مقدار۱ میکرولیتر DNA استخراجی را داخل چاهک ژل آگارز ۱ درصد بارگیری کرده و پس از انجام الکتروفورز و حرکت DNA در ژل، ژل را به درون دستگاه UV-doc منتقل و عکس‌برداری انجام شد.

جهت تکثیر ژن میتوکندریایی CO1، از پرایمرهای(5´-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3´) LCO1490 و HC02198 (5´-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3´) (۱۲) استفاده شد. برای تکثیر این جایگاه‌ها طی واکنش PCR با حجم نهایی ۵۰ میکرولیتر شامل: ۵ میکرولیتر بافر PCR 1x، ۴ میکرولیتر منیزیم کلراید، ۴ میکرولیتر dNTP mix، ۵/۲ میکرولیتر پرایمر رفت و ۵/۲ میکرولیتر پرایمر برگشت، ۱ میکرولیتر آنزیم Taq پلیمراز، ۱ میکرولیترDNA الگو و ۳۰ میکرولیتر آب مقطر استفاده گردید. برنامه دمایی به‌کار رفته برای واکنش PCR: واسرشته‌سازی در دمایC 95 به‌مدت ۵ دقیقه، مرحله دوم شامل ۳۵ چرخه به‌ترتیب واسرشته‌سازی در دمایC 95 به‌مدت ۴۰ ثانیه، هم‌سرشته‌سازی به‌مدت ۴۰ ثانیه در دمای C56 و مرحله بسط به‌مدت ۲ دقیقه در دمایC 72 و در نهایت مرحله بسط نهایی در دمایC 72 به‌مدت ۵ دقیقه انجام شد. محصول PCR به‌دست آمده برای بررسی الگوی باندی و ارزیابی نتایج، در ژل آگاروز یک درصد با ولتاژ 70 ولت به‌مدت ۴۵ دقیقه الکتروفورز شدند. در نهایت با استفاده از دستگاه UV-doc تصاویر مربوطه تهیه گردید.

برای تعیین توالی قطعات تکثیر شده، محصول PCR بر روی ژل آگاروز ۱درصد بارگذاری گردید و پس از استخراج باند مد‌نظر از ژل (۴۷) به شرکت ماکروژن کره جنوبی ارسال شد. در ادامه ۶ توالی به‌دست آمده پس از مشاهده با استفاده از نرم‌افزار Chromas 2.1 (۳۲) اصلاح و مورد تایید قرارگرفت. همچنین علاوه بر توالی­های به دست آمده در این مطالعه، ۵۵ توالی دیگر نیز از بانک ژن، جهت انجام تحلیل­های تبارزادی دراین مطالعه مورداستفاده قرارگرفتند (جدول ۲). در ادامه توالی­ها توسط الگوریتم CLUSTAL W (۵۳)، در نرم افزار  BioEdit 7.0.5(۱۶) هم­تراز شدند. سپس در نرم افزار  MEGA X(۲۸) برای عدم وجود کدون پایانی کنترل شدند. بهترین مدل تکاملی با استفاده از نرم­افزار Modeltest3.7 (۴۳) انتخاب شد. فاصله ژنتیکی بین نمونه‌های بررسی شده در نرم‌افزارMEGA X  (۲۸) پس از انتخاب مدل تکاملی مناسب محاسبه گردید. درخت بیشینه درست­نمایی (MaximumLikelihood) بااستفاده از نرم‌افزار RaxmlGUI 1.3 (۵۰) رسم شد. استحکام گره­ها در درخت بیشینه درست­نمایی با ۱۰۰۰ تکرار bootstrap به‌دست آمد. دراین درخت، مقادیر bootstrap بالای ۷۰ درصد به‌عنوان مقادیر مناسب در نظر گرفته می‌شوند. همچنین درخت تبارزادی Bayesian بااستفاده از نرم­افزار MrBayes 3.2.6 (۴۶) با روش(MCMC) Markov Chain Monte Carlo ترسیم شده و چهار زنجیره به‌طور همزمان برای ۱۰ میلیون نسل راه اندازی شدند. در درخت Bayesian مقادیر احتمال پسین بالای 99 درصد، خیلی خوب و مقادیر بین ۹۰ تا ۹۵ درصد به‌عنوان مقادیر خوب در نظر گرفته می­شوند.

 

 

جدول ۲- توالی های گرفته شده از بانک ژنی NCBI جهت انجام تحلیل های تبارزادی

کد دسترسی

ژن CO1

گونه

نمونه

کد دسترسی

ژن CO1

گونه

نمونه

کد دسترسی

ژن CO1

گونه

نمونه

GQ455962

C. radians

39

KX453282

C. rota

20

AB238547

C. karachiensis

1

GQ455963

C. radians

40

KX453283

C. rota

21

AB433634

C. karachiensis

2

AB433648

C. stellifera

41

AB238550

C. pricei

22

LCO60523

C. karachiensis

3

AB238544

C. denticulata

42

AB238561

C. solida

23

LCO60524

C. karachiensis

4

GQ455938

C. denticulata

43

GQ455974

C. solida

24

LCO60525

C. karachiensis

5

GQ455939

C. denticulata

44

FJ515970

C. tramoserica

25

LCO60526

C. karachiensis

6

AB433649

C. strigilis

45

FJ515971

C. tramoserica

26

KP698009

C. karachiensis

7

KY353129

C. strigilis

46

FJ515972

C. tramoserica

27

KP698010

C. karachiensis

8

KY353130

C. strigilis

47

FJ515973

C. tramoserica

28

KP698011

C. karachiensis

9

KY353131

C. strigilis

48

FJ515974

C. tramoserica

29

KP698012

C. karachiensis

10

KY353132

C. strigilis

49

AB238563

C. tramoserica

30

KP698013

C. karachiensis

11

KY353133

C. strigilis

50

AB238545

C. flava

31

KP698014

C. karachiensis

12

HQ880555

N. deaurata

51

KY353124

C. ardosiaea

32

KP698015

C. karachiensis

13

KX898056

Nacella sp.

52

KY353125

C. ardosiaea

33

KF840075

C. karachiensis

14

GU901248

N.clypeater

53

KY353126

C. ardosiaea

34

KF840076

C. karachiensis

15

KF261314

N. concinna

54

KY353127

C. ardosiaea

35

KF840077

C. karachiensis

16

GU901220

N. macquriensis

55

KY353128

C. ardosiaea

36

KX453279

C. rota

17

 

 

 

AB238551

C. radians

37

KX453280

C. rota

18

 

 

 

GQ455961

C. radians

38

KX453281

C. rota

19


نتایج

ریخت شناختی: درمجموع تعداد ۱۲۱ نمونه شکم‌پای حقیقی (زیررده Patellogastropoda) از دو ایستگاه در جزیره هرمز، طی سه مرحله زمانی، جمع‌آوری شد. نمونه‌ها براساس شکل پوسته، رنگ پا و با استفاده از کلید شناسایی موجود بررسی شدند و کلیه نمونه‌ها متعلق به گونه Cellana karachiensis از خانواده Nacellidae شناسایی شدند. اطلاعات مربوط به ۶ فنوتیپ مشاهده شده از این گونه‌ در جدول ۳ و شکل ۲ آورده شده است.

 

 


گونه

Cellana karachiensis

سطح بیرونی صدف

     

S71

S75

S77

     

M2

M19

M73

سطح داخلی صدف

     
     

سطح شکمی

     
     

شکل ۲- تصاویر رنگ سطح بیرونی صدف، سطح داخلی صدف و سطح شکمی در گونه‌ Cellana karachiensis

جدول 3- جایگاه گونه‌ و مشخصات ریختی آن

اسم گونه

Cellana karachiensis(Winckworth, 1930)

اسم فارسی

حلزون گنبدی صاف

راسته

Archaeogastropoda

خانواده

Nacellidae

اندازه

40-23 میلی‌متر

رنگ پوسته

کرم، قهوه‌ای روشن و تیره

رنگ پا

سبز مایل به طوسی

مشخصات نمونه

پوسته تخم مرغی شکل، دارای خطوط شعاعی برجسته و محکم. نوارهای عرضی قهوه‌ای تیره در سطح خارجی. سطح درونی نقره‌ای و اثر ماهیچه‌ای قهوه‌ای نعل اسبی شکل دارد. . طرح رنگ صدف در نمونه‌های جوانتر به صورت لکه‌های پراکنده قهوایی– قرمز در یک زمینه زرد رنگ ظاهر می‌شود.

پراکندگی و رفتار

بستر سنگی و صخره‌ای صیقلی در ناحیه میانی و پایین جزرومدی، گیاه‌خوار، فراوان

 


ساختار رادولا گونه C. karachiensis:رادولای این گونه‌ دارای ساختار Docoglossan یا Stereoglossan بوده که ابتدایی‌ترین ساختار و بدون تغییر از اجداد اولیه را نشان می‌دهد. دراین نوع رادولا، هرردیف دارای یک دندان مرکزی و معمولا کوچک است که در برخی گونه‌ها ممکن است وجود نداشته باشد. ۱ تا ۳ دندان جانبی و دندان حاشیه‌ای قلابی شکل دارد. هردو دندان جانبی و حاشیه‌ای معمولا کوتاه و محکم هستند و ساختاری سفت و سخت دارند. فرمول این ساختار به صورت «3 + D(Dominant) + 2 + R(Rachis) + 2 + D + 3» یا «3 + D + 2 + 0 + 2 + D + 3» است. تصویر رادولای گونه‌ بررسی شده با بزرگنمایی ۲۰۰ میکرومتر در شکل ۳ آورده شده است.

مطالعات مولکولی: میزان جذب در طول موج ۲۶۰نانومتر، بیانگر مقادیر بیشتر از 7/1 و کمتر از 1/2 بود. نتیجه تکثیر ژن میتوکندریایی CO1، اندازه قطعه مورد انتظار حدود 700 جفت‌ بازی را نشان داد (شکل 4).

نتیجه توالی‌یابی ژن CO1 به روش Sanger، خوانش 551 جفت باز قابل اعتماد بود. کد دسترسی نمونه‌های بررسی شده در بانک ژنوم جهانی NCBI در جدول ۴ آورده شده است.

 

شکل ۳- تصویر میکروسکوپی SEM از رادولای گونه C. karachiensis

 

شکل ۴- طول قطعات تکثیر شده در واکنش PCR بر روی ژل آگارز ۱ درصد (M: Molecular Marker)

نتایج براساس هر دو درخت تبارزادی بیشینه درست‌نمایی و بیزین نشان می­دهد که نمونه‌های 1، 3، 5، 6، 7 و 8 متعلق به گونه C. karachiensis از خانواده Nacellidae می­باشند. براساس هر دو درخت، نمونه­های مذکور متعلق به کلاد C. karachiensis و کلاد خواهری گونهC. rotaمی­باشند. جایگاه آرایه­شناختی نمونه­های مورد مطالعه و تعلق آن­ها به کلاد ذکر شده، با مقادیر bootstrap و احتمال پسین بالایی، به‌ترتیب در هر دو درخت بیشینه درست‌نمایی و Bayesian حمایت می‌شود.

 

 

جدول ۴ -کد دسترسی ژن CO1 نمونه‌های مورد بررسی ثبت شده در بانک ژنی NCBI

کد دسترسی ژن CO1

محل نمونه‌برداری

گونه

نمونه

MH795133

جزیره هرمز

Cellana karachiensis

1

MH795134

جزیره هرمز

Cellana karachiensis

3

MH795136

جزیره هرمز

Cellana karachiensis

5

MH795137

جزیره هرمز

Cellana karachiensis

6

MH795138

جزیره هرمز

Cellana karachiensis

7

MH795139

جزیره هرمز

Cellana karachiensis

8

 

 

محاسبه فواصل ژنتیکی براساس مدل K2P نشان می­دهد فاصله ژنتیکی در میان نمونه‌های مورد مطالعه برابر با صفر و همچنین فاصله ژنتیکی بین نمونه­های مورد مطالعه و گونه C. karachiensis برابر با 1/0 درصد می­باشد. همچنین میزان فاصله ژنتیکی بین نمونه­های مورد مطالعه با C. rota و همچنین گونه C. karachiensis با C. rota، برابر با 4/10 درصد است که این میزان کمتر از اختلاف ژنتیکی این گونه با دیگرگونه‌ها می‌باشد. نمونه­های مربوط به ایران بیشترین فاصله ژنتیکی را نیز با گونه C. ardosiaea (3/20 درصد) دارا می­باشند (جدول 6). اسامی نمونه‌های ایران در درخت تبارزادی به‌ترتیب زیر می‌باشد (جدول 5).

بحث

مطالعات ریخت شناختی: براساس نتایج این  پژوهش،  از

مجموع 121 نمونه لیمپت حقیقی در 6 فنوتیپ، تنها یک گونه C. karachiensis از خانواده Nacellidae شناسایی شد.

جدول 5- نام و کد نمونه‌های ایران

نمونه

اسم گونه

کد

1

Cellana karachiensis

S73

3

Cellana karachiensis

S75

7

Cellana karachiensis

M19

5

Cellana karachiensis

M2

8

Cellana karachiensis

S77

6

Cellana karachiensis

S71

خانواده این گونه در اطلس نرمتنان خلیج‌فارس (۲) به اشتباه Patellidae ذکر شده است. مقایسه ریختی نمونه­ها براساس صفات شکل پوسته، رنگ پا و ساختار رادولا نشان ­داد که کلیه نمونه­ها متعلق به گونه C. karachiensisمی‌باشند. تنها تفاوت در بین این نمونه‌ها مربوط به طرح و رنگ پوسته بود. از این رو به‌نظر می­رسد با توجه به این که افراد متعلق به یک گونه طرح و رنگ پوسته متفاوتی را نشان می­دهند، این صفات فاقد اعتبار آرایه­شناختی در شناسایی گونه‌ها ‌باشند، اما باتوجه به این که در این مطالعه تمامی نمونه­ها متعلق به یک گونه بودند، لازم است اعتبار آرایه­شناختی این صفات بااستفاده از تعداد نمونه­های بیشتر متعلق به گونه‌های متفاوت و در محدوده جغرافیایی وسیع‌تر نیز مورد بررسی قراربگیرد.

 

 

 

شکل ۵- درخت تبارزادیBayesian  براساس داده­های ژن میتوکندریایی CO1، اعداد روی هر شاخه بیانگر مقادیر احتمال پسین می‌باشند

جدول ۶- فاصله ژنتیکی حاصل از توالی­های ژن CO1 بین نمونه‌های مورد مطالعه با گونه‌های مختلف

13

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1/0

C. karachiensis

1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0

1/0

نمونه­های 1، 3، 5، 6، 7 و 8

2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0

4/10

4/10

C. rota

3

 

 

 

 

 

 

 

 

 

-

2/14

15

15

C. pricei

4

 

 

 

 

 

 

 

 

2/0

1/16

1/17

3/15

4/15

C. solida

5

 

 

 

 

 

 

 

0

1/10

2/18

6/18

3/16

3/16

C. tramoserica

6

 

 

 

 

 

 

-

1/11

9/10

17

6/15

5/14

4/14

C. testudinaria

7

 

 

 

 

 

-

9/14

6/16

2/16

5/16

3/16

3/17

3/17

C. flava

8

 

 

 

 

1

6

7/15

5/16

6/15

16

9/15

3/20

2/20

C. ardosiaea

9

 

 

 

9/0

6/8

5/18

4/15

3/15

5/16

2/18

1/18

5/18

4/18

C. radians

10

 

 

-

1/10

9/9

2/10

2/18

9/18

3/17

8/17

6/16

9/17

9/17

C. stellifera

11

 

1/0

2/17

5/17

6/15

9/15

16

1/14

5/18

6/18

5/18

4/18

4/18

C. strigilis

12

7/0

3

1/16

7/16

2/14

4/15

4/15

7/14

3/17

3/19

5/17

1/18

18

C. denticulata

13

* اعداد برجسته شده در قطر ماتریس فاصله درون گونه­ای را نشان می­دهند

 

 

شکل ۶- درخت تبارزادی بیشینه درست­نمایی بر اساس داده­های ژن میتوکندریایی CO1، اعداد روی هر شاخه بیانگر مقادیر bootstrap می‌باشند

 

 

بهره‌برداری از منابع تغذیه‌ای مشخص توسط جانوران در هریک از محیط‌ها منجر به تکامل ساختارها و مکانیسم‌های تغذیه‌ای مختلف، از جمله رادولا شده است. باتوجه به رژیم غذایی و نیاز جانور، ساختار رادولا در شکم‌پایان نیز متفاوت بوده و ابعاد و اشکال مختلف دندان‌های رادولا عملکرد خاص خود را دارند. مطالعات اولیه پیرامون رادولا نیز بیانگر این است که ساختار رادولا حتی در گونه‌های مختلف یک جنس نیز دارای تفاوت است و بنابراین می‌تواند در تفکیک گونه‌های یک جنس مورد استفاده قراربگیرد (25و 33) و ازاین رو در مطالعات آرایه‌شناختی و تبارزادی از اهمیت بالایی برخوردار است (8). از طرف دیگر برخی از مطالعات نیز به شکل‌پذیری اندام رادولا و تشکیل دندان‌های مشابه در گونه‌های یک جنس که از شرایط تغذیه‌ای یکسانی برخوردار بودند، اشاره کرده­اند (42).

دراین پژوهش، بررسی 30 قطعه عکس از ساختار رادولای C. karachiensis به‌وسیله میکروسکوپ SEM در مقیاس‌های 200 و 500 میکرومتر نشان دهنده جایگاه مشخص دندان‌ها و ابعاد آنها می‌باشد. ولی تنوع رادولا در گونه‌های یک جنس در فراساختارهایی همچون ابعاد مختلف دندان‌ها قراردارد که بررسی آنها نیاز به عکس‌هایی با وضوح بالا دارد و توصیه می‌شود دندان‌های مرکزی، کناری و حاشیه‌ای جهت اندازه‌گیری دقیق‌تر، قبل از عکس‌برداری از یکدیگر جدا شده و با انجام محاسبات آماری به بیان دقیق تفاوت میان آنها پرداخته شود (17، 23و 36).

خواص مکانیکی دندان‌ها بیشتر تحت تاثیر اندازه، شکل، مواد تشکیل دهنده، خواص مواد غذایی و فعل و انفعالات میان دندان‌ها در طول تغذیه می‌باشد که تعیین کننده نیاز هرگونه به رادولای خاص می‌باشد. نوع رادولا به‌عنوان یک ابزار تغذیه‌ای مهم شناخته شده است. شکل دندان‌ها و برآمدگی‌های آن در ساختارهای مختلف رادولا نشان دهنده عملکرد متفاوت آن در گروه‌های مختلف با رژیم غذایی متفاوت می‌باشد که می‌تواند باعث ایجاد قابلیت‌ها و محدودیت‌های تغذیه‌ای در شکم‌پایان شده و به تفسیر چگونگی تعامل گونه‌هایی با رژیم غذایی مشابه بدون رقابت برای حذف یکدیگر کمک کند. نوع رادولا و تعداد دندان‌های آن نشان دهنده تکامل در تغذیه شکم‌پایان از گیاهخواری به گوشتخواری است. به‌طور کلی شکم‌پایان جهت تراشیدن جلبک به دندان‌های بسیار و گوشتخواران به دندان‌های کمتر، به‌خصوص دندان‌های جانبی و حاشیه‌ای نیاز دارند. گونه‌ C. karachiensis گیاه‌خوار بوده و دارای دندان‌های بسیاری است که عموما جهت تراش اجتماعات جلبکی بر روی صخره‌های صیقلی نواحی جزر و مدی به‌کار گرفته می‌شوند.

مطالعات مولکولی: خانواده Nacellidae شامل گونه‌های گرمسیری (Cellana)، سردسیری (Nacella) و احتمالاً گونه اندمیک استرالیا (Naccula) است. گونه‌های Cellana در حال حاضر به‌طور گسترده‌ای در غرب حوضه آرام-هند توزیع شده و بیشترین تنوع را در استرالیا نشان می‌دهد. Naccula به استرالیای جنوبی محدود می‌شود. تنها بررسی‌های تبارزادی این خانواده مربوط به مطالعه (۴۴) می­باشد. باتوجه به آخرین گزارشات، Nacella شامل ۱۵ گونه است در حالی که Cellana شامل ۳۷ گونه و زیرگونه می‌باشد.

مطالعات تبار­زادی انجام شده بر روی 5 گونه از جنس Cellana با استفاده از داده­های دو ژن 12S rRNA و 16S rRNA (۲۷و ۳۷) و همچنین مطالعه تبار­زادی صورت گرفته بر روی ۱۸ گونه از این جنس با استفاده از داده­های دو ژن مذکور و همچنین ژن CO1 (۳۸)، نشان می­دهد که گونه‌های نیوزلند و استرالیا، گروه اصلی در جنس Cellana بودند. این مساله با تجزیه و تحلیل ۲۳ نمونه از این گونه­ها و بااستفاده از ژن‌های CO1 و هیستونی هسته H3 نیز پشتیبانی شد (۳۹). مطالعات مولکولی در جنس Cellana اخیرا توسط چند محقق منتشر شده است (6، 7، 15و 40). جهت مطالعه منشا تمامی گونه‌ها و همچنین زیرگونه‌های شناخته شده Cellanaدر نیوزلند، ژن‌های 12S rRNA و 16S rRna مورد بررسی قرار داده شد (۱۴).

مطالعه حاضر با استفاده از داده‌های ژن میتوکندریاییCO1 نشان داد که نمونه‌های 1، 3، 5، 6، 7و 8 متعلق به گونه C. karachiensisمی­باشند. براساس هر دو درخت تبارزادی بیشینه درست‌نمایی و Bayesian در این مطالعه، نمونه­های مذکور متعلق به کلاد C. karachiensis و کلاد خواهری گونهC. rotaمی­باشند (شکل­های 5و 6). کلاد شامل هر دو گونه C. karachiensis و C. rota، کلاد خواهری گونه C. pricei می­باشد. نتایج این مطالعه نشان می­دهد آرایش هر دو درخت Bayesian و بیشینه درست نمایی، تا حد بسیار زیادی با هم مطابقت دارد، ولی تفاوت­هایی نیز بین آرایش مربوط به هر دو درخت تبارزادی مشاهده می­شود. مهم­ترین تفاوت مشاهده شده مربوط به جایگاه آرایه­شناختی کلاد شامل سه گونه C. solida، C. tramoserica و C. testudinaria می­باشد. براساس درخت Bayesian کلاد شامل سه گونه ذکر شده، کلاد خواهری سه گونه C. karachiensis، C. rota و C. pricei می­باشد ولی این جایگاه از حمایت بالایی برخوردار نیست. بر اساس درخت بیشینه درست­نمایی کلاد مذکور، کلاد خواهری گونه­های C. flava، C. ardosiaea، C. radians،C. stellifera، C.strigilis و C. denticulata می­باشد، ولی این جایگاه نیز از حمایت پایینی برخوردار است. در کل موقعیت آرایه­شناختی این کلاد مورد سوال است و احتمال می­رود با استفاده از داده­های مولکولی بیشتر، مانند داده­های ژن هسته­ای و نیز سایر داده­های ژن میتوکندری، جایگاه آرایه­شناختی این کلاد بهتر مشخص شود. تفاوت دیگر در بین دو درخت تبارزادی، مربوط به کلاد شامل دو گونهC.strigilis و C. denticulata می باشد. در درخت Bayesian این دو گونه، دو کلاد مجزا را تشکیل می­دهند، ولی در درخت بیشینه درست­نمایی، هرچند در بین این دو گونه واگرایی ژنتیکی مشاهده می­شود، ولی هر دو گونه درون یک کلاد قرار می­گیرند. باتوجه به روابط تبارزادی این دو گونه و همچنین فاصله ژنتیکی پایین بین این دو گونه (جدول ۶)، این احتمال می­رود که این دو گونه به تازگی از یکدیگر اشتقاق یافته باشند و هنوز در مراحل اولیه انشعاب باشند. براساس هر دو درخت تبارزادی جایگاه کلاد مربوط به این دو گونه، به عنوان کلاد خواهری گونه­های C. flava، C. ardosiaea، C. radians، C. stelliferaمی­باشد. استفاده از داده­های مولکولی بیشتر می تواند روابط تبارزادی این دو گونه را نیز بهتر مشخص کند.

محاسبه فواصل ژنتیکی حاصل از توالی­های ژن CO1، نشان می­دهد که فاصله ژنتیکی در میان نمونه‌های مورد بررسی بین 1/0 تا 3/20 درصد متغیر می‌باشد. کمترین میزان فاصله ژنتیکی بین نمونه­های مورد مطالعه و گونه C. karachiensis و بیشترین فاصله ژنتیکی نیز بین نمونه­های مورد مطالعه و گونه C. ardosiaeaو پس از آن بین دو گونه C. karachiensisوC. ardosiaea (2/20 درصد) مشاهده می­شود. تمامی نمونه‌های متعلق به گونه C. karachiensis، در محدوده جغرافیایی خلیج فارس، دریای عمان و سواحل غربی هند واقع در اقیانوس هند، پراکنش دارند. نمونه‌های مورد مطالعه از نظر جغرافیایی، فاصله کمتری را با نمونه­های گونه C. karachiensis، در مقایسه با سایر گونه­های این جنس دارا هستند. محدوده پراکنش جغرافیایی گونه C. karachiensis یک محدوده از سواحل به هم پیوسته است که نمونه­های مورد مطالعه در نواحی میانی این محدوده جغرافیایی قرار می­گیرند. احتمال می­رود عامل زیست جغرافیایی پراکندگی در الگوی پراکنش این گونه نقش داشته است. گونه C. ardosiaeaدر سواحل جزایر کشور شیلی پراکنش دارد که با محدوده پراکنش گونه C. karachiensis فاصله جغرافیایی بسیار زیادی را دارا می­باشد. این مساله می‌تواند احتمالاً بیانگر نقش فاصله جغرافیایی در ایجاد جدایی و واگرایی ژنتیکی باشد. باتوجه به این که غالباً گونه­هایی که فاصله ژنتیکی کمتری را دارا می‌‌باشند از نظر جغرافیایی نیز به یکدیگر نزدیکتر و گونه­هایی که فاصله ژنتیکی زیادی دارند، فاصله جغرافیایی زیادی را نیز دارا هستند. در تایید این موضوع می توان به دو گونه C.strigilis و C. denticulate اشاره کرد. این دو گونه هردو در سواحل کشور نیوزیلند پراکنش دارند و فاصله جغرافیایی کمی با یکدیگر دارند. فاصله ژنتیکی بین این دو گونه کمترین میزان فاصله ژنتیکی بین گونه­ای در این مطالعه و برابر با ۳ درصد می­باشد. همچنین فاصله ژنتیکی بین دو گونهC.strigilisوC. denticulateبرابر با ۳ درصد می­باشد که این نتیجه، نتایج درخت­های تبارزادی مبنی بر روابط نزدیک بین این دو گونه را مورد تایید قرار می­دهد. همچنین میزان فواصل ژنتیکی درون گونه­ای نیز بین صفر تا ۱ درصد متغیر می­باشد که بیشترین میزان فاصله ژنتیکی درون گونه­ای مربوط به گونه C. ardosiaea می­باشد (جدول ۶). محاسبه فواصل ژنتیکی درون گونه­ای برای برخی از گونه­ها به علت وجود تنها یک توالی از آن ها در بانک ژن مقدور نبود.

نتایج مطالعه مولکولی انجام شده براساس داده­های ژن CO1، با نتایج مطالعات ریخت‌شناختی مطابقت نشان می دهد و تعلق نمونه­های مورد مطالعه را به گونه C. karachiensisرا مورد تایید قرار می­دهد. نتایج فوق بیانگر اهمیت انجام مطالعات دقیق بر روی شناسایی گونه‌های زیررده Patellogastropoda با استفاده از ابزارهای مختلف ریختی و و مولکولی همچون ساختار رادولا و توالی CO1 در کنار صفات ظاهری پوسته و پا می‌باشد.

1-بیرامی، ن.، سیف‌آبادی، ج.، و علوی یگانه، ص.، 1395. شناسایی ریختی گونه‌های جنس Nerita رده شکم‌پایان، خانواده Neritidae در ناحیه جزرومدی بندرلنگه، فصلنامه علمی پژوهشی محیط زیست جانوری، سال هشتم، شماره ۳، صفحات 92-87.
2-حسین‌زاده صحافی، ه.، دقوقی، ب.، و رامشی، ح.، 1379. اطلس نرم‌تنان خلیج‌فارس، انتشارات موسسه تحقیقات شیلات ایران، تهران، 248 صفحه.
3-عیسی‌پور، م.، سیف‌آبادی، ج.، دقوقی، ب.، 1394 (الف). ساختار رادولا در دو گونه شکم‌پای خلیج‌ فارس،Conomurex persicus (Strombidae) و Mauritia grayana (Cypraeidae)، فصلنامه علمی پژوهشی علوم و فنون شیلات، جلد 4، شماره 1، صفحات 115-118.‎
4- عیسی‌پور، م.، سیف‌آبادی، ج.، و دقوقی، ب.، 1394 (ب). مقایسه ریخت‌شناسی رادولا در دو گونه شکم‌پای Conus textile و C. coronatus از خانواده Conidae، اقیانوس‌شناسی، جلد 6، شماره 22، صفحات 77-82.
 
5-Asgari, M., Amini Yekta, F., and Izadi, S., 2012. Dominant Intertidal Crustacean and Gastropod Species in Qeshm Island, Iran, Northern Persian Gulf, Marine Biodiversity Records, 5, e87 p.
6-Ayre, D. J., Minchinton, T. E., and Perrin, C., 2009. Does Life History Predict Past and Current Connectivity for Rocky Intertidal Invertebrates across a Marine Biogeographic Barrier, Molecular Ecology, 18(9), PP: 1887-1903.
7-Bird, C. E., Holland, B. S., Bowen, B. W., and Toonen, R. J., 2007.Contrasting Phylogeography in Three Endemic Hawaiian Limpets (Cellana spp.) with Similar Life Histories, Molecular Ecology, 16(15), PP: 3173-3186.
8-Christiaens, J., 1973.Révision du Genre Patella (Mollusca, Gastropoda), Muséum National d'Histoire Naturelle, 3(82), PP: 1305-1392.
9-Cruz, R., Lins, U., and Farina, M., 1998. Minerals of the Radular Apparatus of Falcidens sp. (Caudofoveata) and the Evolutionary Implications for the Phylum Mollusca, The Biological Bulletin, 194(2), PP: 224-230.
10-Eisapour, M., Seyfabadi, S. J., and Daghooghi, B., 2015. Comparative Radular Morphology in some Intertidal Gastropods along Hormozgan Province, Iran, Journal of Aquaculture Research and Development, 4(6) p.
11-El-Sorogy, A., Youssef, M., Al-Kahtany, K., and Al-Otaiby, N., 2016. Distribution of Intertidal Molluscs along Tarut Island Coast, Arabian Gulf, Saudi Arabia, Pakistan, Journal of Zoology, 48(3), PP: 611-623.
12-Folmer, R. H. A., Nilges, M., Folkers, P. J. M., Konings, R. N. H., and Hilbers, C. W., 1994. A Model of the Complex between Single-Stranded DNA and the Single-Stranded DNA Binding Protein Encoded by Gene V of Filamentous Bacteriophage M13, Journal of Molecular Biology, 240(4), PP: 341-357.
13-Franklin, J. B., Fernando, S. A., Chalke, B. A., and Krishnan, K. S., 2007. Radular Morphology of Conus (Gastropoda: Caenogastropoda: Conidae) from India, Molluscan Research, 27(3), PP: 111-122.
14-Goldstien, S. J., Gemmell, N. J., and Schiel, D. R., 2006(a). Molecular Phylogenetics and Biogeography of the Nacellid Limpets of New Zealand (Mollusca: Patellogastropoda), Molecular Phylogenetics and Evolution, 38(1), PP: 261-265.
15-Goldstien, S. J., Schiel, D. R., and Gemmell, N. J., 2006(b). Comparative Phylogeography of Coastal Limpets across a Marine Disjunction in New Zealand, Molecular Ecology, 15(11), PP: 3259-3268.
16-Hall, T. A., 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT, In Nucleic acids symposium series ,41(41), PP: 95-98.
17-Harding. J. M., Gera, S. M., and Mann, R., 2008. Radula Morphology in Veined Rapa Whelks, Rapana venosa (Valenciennes, 1846 (Gastropoda: Muricidae) from Chesapeake Bay, USA, Nautilus, 122(4), PP: 217-227.
18-Hebert, P. D., Ratnasingham, S., and De Waard, J. R., 2003. Barcoding Animal Life: Cytochrome C Oxidase Subunit 1 Divergences among Closely Related Species, Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences, 270(1), PP: S96-S99.
19-Hebert, P. D., Penton, E. H., Burns, J. M., Janzen, D. H., and Hallwachs, W., 2004. Ten Species in One: DNA Barcoding Reveals Cryptic Species in the Neotropical Skipper Butterfly Astraptes fulgerator, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101(41), PP: 14812-14817.
20-Holford, M., Puillandre, N., Terryn, Y., Cruaud, C., Olivera, B., and Bouchet, P., 2009. Evolution of the Toxoglossa venom Apparatus as Inferred by Molecular Phylogeny of the Terebridae, Molecular Biology and Evolution, 26(1), PP: 15-25.
21-Houbrick, R. S., 1988. Cerithioidean Phylogeny, Malacological Review Supplement, 4, PP: 88-128.
22-Jamieson, B. G. M., Hodgson, A. N., and Bernard, R. T. F., 1991. Phylogenetic Trends and Variation in the Ultrastructure of the Spermatozoa of Sympatric Species of South African Patellid Limpets (Archaeogastropoda, Mollusca), Invertebrate Reproduction and Development, 20(2), PP: 137-146.
23-Jørgensen, A., 2001. Variation in Radular Teeth and Acuspid side of the Radula in Lacuna pallidula, L. parva and L. vincta (Gastropoda: Littorinidae) from the Isle of Wight, United Kingdom. Helgoland Marine Research, 55(2), 95 p.
24-Kantor, Y. I., and Taylor, J. D., 2000. Formation of Marginal Radular Teeth in Conoidea (Neogastropoda) and the Evolution of the Hypodermic Envenomation Mechanism, Journal of Zoology, 252(2), PP: 251-262.
25-Kantor, Y. I., 2006. On the Morphology and Homology of the “Central Tooth” in the Radulae of Turrinae (Conoidea: Turridae), Ruthenica, 16(1-2), PP: 47-52.
26-Kool, S. P., 1993. The Systematic Position of the Genus Nucella (Prosobranchia: Muricidae: Ocenebrinae), The Nautilus, 107(2), PP: 43-57.
27-Koufopanou, V., Reid, D. G., Ridgway, S. A., and Thomas, R. H., 1999. A Molecular Phylogeny of the Patellid Limpets (Gastropoda: Patellidae) and its Implications for the Origins of their Antitropical Distribution, Molecular Phylogenetics and Evolution, 11(1), PP: 138-156.
28-Kumar, S., Stecher, G., Li, M., Knyaz, C., and Tamura, K., 2018. MEGA X: molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms, Molecular Biology and Evolution, 35(6), PP: 1547-1549.
29-Kumbhar, J. V., and Rivonker, C. U., 2012. A New Record of Morula anaxares with a Description of the Radula of Three Other Species from Goa, Central West Coast of India (Gastropoda: Muricidae), Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 12(1), PP: 189-197.
30-Lakra, W. S., Goswami, M., and Gopalakrishnan, A., 2009. Molecular Identification and Phylogenetic Relationships of Seven Indian Sciaenids (Pisces: Perciformes, Sciaenidae) Based on 16S rRNA and Cytochrome C Oxidase Subunit I Mitochondrial Genes, Molecular Biology Reports, 36(5), PP: 831-839.
31-Lindberg, D. R., 1988.The Patellogastropoda, Malacological Review Supplement, 4, PP: 35-63.
32-McCarthy, C., 1996. Chromas Version 1. 45., School of Health SCIENCE, Griffifth University, Gold Coast Campus, Queensland, Australia.
33-Mclean, J. H., 2011: Reinstatement of the Fissurellid Subfamily Hemitominae, with the Description of New Genera, and Proposed Evolutionary Lineage, Based on Morphological Characters of Shell and Radula (Gastropoda: Vetigastropoda), Malacologia, Vol, 54(2), PP: 407-427.
34-Miller, S. L., 1974. The Classification, Taxonomic Distribution, and Evolution of Locomotor Types among Prosobranch Gastropods, Journal of Molluscan Studies, 41(3), PP: 233-261.
35-Moritz, C., and Cicero, C., 2004. DNA Barcoding: Promise and Pitfalls, PLoS Biology, 2(1), PP: 1529-1531.
36-Mutaf, B. F., and Aksit, D., 2009. Further SEM Assessment of Radular Characters of the Limpets Patella caerulea Linneaus 1758 and P. rustica Linneaus 1758 (Mollusca: Gastropoda) from Antalya Bay, Turkey, Turkish Journal of Zoology, 33(3), PP: 359-365.
37-Nakano, T., and Ozawa, T., 2004. Phylogeny and Historical Biogeography of Limpets of the Order Patellogastropoda Based on Mitochondrial DNA Sequences, Journal of Molluscan Studies, 70(1), PP: 31-41.
38-Nakano, T., and Ozawa, T., 2007. Worldwide Phylogeography of Limpets of the Order Patellogastropoda: Molecular, Morphological and Palaeontological Evidence, Journal of Molluscan Studies, 73(1), PP: 79-99.
39-Nakano, T., Yazaki, I., Kurokawa, M., Yamaguchi, K., and Kuwasawa, K., 2008. The Origin of the Endemic Patellogastropod Limpets of the Ogasawara Islands in the Northwestern Pacific, Journal of Molluscan Studies, 75(1), PP: 87-90.
40-Nakano, T., Marshall, B. A., Kennedy, M., and Spencer, H. G., 2009. The Phylogeny and Taxonomy of New Zealand Notoacmea and Patelloida species (Mollusca: Patellogastropoda: Lottiidae) Inferred from DNA Sequences, Molluscan Research, 29(1), 33 p.
41-Nakano, T., and Sasaki, T., 2011. Recent Advances in Molecular Phylogeny, Systematics and Evolution of Patellogastropod Limpets, Journal of Molluscan Studies, 77(3), PP: 203-217.
42-Padilla, D. K., 1998. Inducible Phenotypic Plasticity of the Radula in Lacuna (Gastropoda: Littorinidae), The Veliger, 41, PP: 201-204.
43-Posada, D., and Crandall, K. A., 1998. Modeltest: Testing the Model of DNA Substitution. Bioinformatics (Oxford, England), 14(9), PP: 817-818.
44-Powell, A. W. B., 1973. The Patellid Limpets of the World (Patellidae), Indo-Pacific Mollusca, 3, PP: 75-206.
45-Reisser, C. M. O., Marshall, B. A., and Gardner, J. P. A., 2012. A Morphometric Approach Supporting Genetic Results in the Taxonomy of the New Zealand Limpets of the Cellana strigilis Complex (Mollusca: Patellogastropoda: Nacellidae), Invertebrate Systematics, 26(2), PP: 193-203.
46-Ronquist, F., Teslenko, M., Van Der Mark, P., Ayres, D. L., Darling, A., Höhna, S., and Huelsenbeck, J. P., 2012. MrBayes 3.2, Efficient Bayesian Phylogenetic Inference and Model Choice Across a Large Model Space, Systematic Biology, 61(3), PP: 539-542.
47-Sambrook, J., Russell, D. W., 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, PP: 7.42–7.45 and 17.48–17.51.
48-Scheltema, A. H., Kerth, K., and Kuzirian, A. M., 2003. Original Molluscan Radula: Comparisons among Aplacophora, Polyplacophora, Gastropoda, and the Cambrian Fossil Wiwaxia corrugata, Journal of Morphology, 257(2), PP: 219-245.
49-Scuderi, D., and Eernisse, D. J., 2016. A New Alien Limpet for the Mediterranean: Lottia sp. (Patellogastropoda: Lottiidae), Biodiversity Journal, 7(2), PP: 287–293.
50-Silvestro, D., and Michalak, I., 2012. Raxmlgui: A Graphical Front-End for RAxML, Organisms Diversity and Evolution, 12(4), PP: 335-337.
51-Strong, E. E., Gargominy, O., Ponder, W. F., and Bouchet, P., 2008. Global Diversity of Gastropods (Gastropoda: Mollusca) in Freshwater: In Freshwater Animal Diversity Assessment, Springer Netherlands, 595(1), PP: 149-166.
52-Taggart, J. B., Hynes, R. A., Prodöuhl, P. A., and Ferguson, A., 1992. A Simplified Protocol for Routine Total DNA Isolation from Salmonid Fishes, Journal of Fish Biology, 40(6), PP: 963-965.
53-Thompson, J. D., Higgins, D. G., and Gibson, T. J., 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic acids research, 22(22), PP: 4673-4680.
54-Valdovinos, C., and Ruth, M., 2005. Nacellidae Limpets of the Southern End of South America: Taxonomy and Distribution, Revista Chilena de Historia Natural, 78(3), PP: 497-517.
55-Ward, R. D., Zemlak, T. S., Innes, B. H., Last, P. R., and Hebert P. D., 2005. DNA Barcoding Australia's Fish Species, Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 360(1462), PP: 1847-1857.
56-Willassen, E., Williams, A. B., and Oskars, T. R., 2016. New Observations of the Enigmatic West African Cellana Limpet (Mollusca: Gastropoda: Nacellidae), Marine Biodiversity Records, 9(1), 60 p.