تعیین غلظت نیمه کشنده روی (LC₅₀96h, ZnSO₄) در ماهی کپور (Cyprinus carpio) تحت شرایط آزمایشگاهی 

محمدفرهنگی^1*،^.عبدالمجید حاجی مرادلو² و فرامرز رستمی چراتی³

¹ گنبدکاووس، دانشگاه گنبدکاووس، دانشکده کشاورزی ومنابع طبیعی

² گرگان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان

³ گنبد کاووس، دانشگاه گنبد کاووس، دانشکده علوم پایه

تاریخ دریافت: 8/9/89                 تاریخ پذیرش: 6/10/90 

چکیده

آزمایشات به منظور تعیین غلظت نیمه کشنده فلز روی درماهی کپور انجام شد. آزمایشات به روش آب ساکن  درمدت 96 ساعت اجرا شد. 12 قطعه بچه ماهی کپور با وزن متوسط 2±3 گرم درمعرض غلظت های مختلفی از سولفات روی (270و 250، 200 ، 150، 90 ، 65 ، 30 ، 0 میلی­گرم درلیتر) قرار گرفتند. از نمک سولفات روی بعنوان روی در آزمایشات استفاده شد. یک گروه نیز بعنوان شاهد در نظر گرفته شد. تحت شرایط ثابت و هوادهی غلظت نیمه کشنده و کشنده سولفات روی به ترتیب برابر 07/129و 270 میلی­گرم در لیتر بدست آمده است. آزمایشات نشان داد بیشترین درصد تلفات (80 % < ) در همان ساعات اولیه (7-8 ساعت پس از شروع آزمایش) رخ داد. در غلظت های بالای سولفات روی علائم ظاهری مسمومیت با روی همچون تشنجات عصبی، بلعیدن هوا از سطح آب توسط ماهی، باز و بسته شدن سریع سرپوش های آبششی، پرخونی وخونریزی آبشش و مشاهده شد.

واژه های کلیدی: غلظت نیمه کشنده، خونریزی، پرخونی، سولفات روی، ماهی کپور،Cyprinus carpio 

* نویسنده مسئول، تلفن: 09111789636، پست الکترونیکی: s.farhangi@yahoo.com

مقدمه

ماهی کپور (Cyprinus carpio) یکی از گونه­های مهم پرورشی ایران می باشد، که سهم بزرگی از تولید ماهیان آب شیرین را بخود اختصاص می دهد. بدلیل پراکنش وسیع این ماهی در مناطق مختلف کشور و تحمل بالای ماهی کپور در برابر عوامل نامساعد محیطی، این ماهی از گونه های مهم مطالعاتی می باشد. بطورکلی ماهیان در تماس مستقیم با آب پیرامون خود می باشند. از مهمترین پارامترهای متغیرآب در شرایط پرورشی عوامل شوری، دما، pH، نیترات و سولفات­ها می­باشند (8). بعنوان مثال مطالعات نشان می­دهد، تغییر درpH   آب می­تواند سبب بروز تغییرات قابل توجهی در شاخص­های خونی ماهیان شود (4). حفظ کیفیت آب و آشنایی با مواد شیمیایی سمی موجود در آب و بدست آوردن میزان دقیق غلظت کشنده مواد به عنوان یکی از عوامل مهم در دستیابی به تولید مناسب مطرح می باشد. عوامل شیمیایی، ازجمله مواردی هستند که سبب برهم زدن کیفیت آب می­شوند و همواره از فاکتورهای اساسی کاهش تولید آبزیان بحساب می­آیند. عناصر فلزی موجود در آب، در غلظت­های بالا می­توانند، مسمومیت های کشنده را در ماهی بوجود آورند. فلزات سنگین کمتر از یک درصد وزن بدن موجودات زنده را تشکیل می­دهند، بطوریکه نوسانات غلظت آن سبب ناپایداری محیط و ایجاد اختلال در ماهی می­شود (6). یون روی (Zinc) بعنوان یک عنصر ضروری برای رشد و نمو گیاهان نقش ساختاری و عملکردی فراوانی را در بسیاری از فرآیندهای متابولیکی دارد، ولی مقدار اضافی آنها بخصوص در خاکهای اسیدی یک فاکتور محدود کننده رشد برای گیاه محسوب می­شود (2و3). همچنین عنصر روی به عنوان یک فلز نادر در فرآیندهای متابولیسمی ماهی نقش دارد. عنصر روی می تواند بعنوان یک کوفاکتور آنزیمهای مختلف ازجمله هیدرولاز و ترانسفراز عمل کند (6). استفاده از روش آب ساکن در آزمایشات به منظور تعیین غلظت­های کشنده و نیمه کشنده انواع فلزات از جمله روشهای رایج بحساب­ می­آید. گال و همکارانش (2009) با مطالعه بر روی ماهی گوپی
(Poecilia reticulate) اظهار داشتند LC₅₀96h  برابر با 82/30 میلی گرم در لیتر است. ساجید و جاوید (2006) اثر 5 عنصر سمی روی، آهن، منیزیم، نیکل و سرب را بر روی ماهی Catla catla  با سنین 90و 60،30 روزه بررسی کردند. هرچند تاکنون مطالعه سمیت فلز روی بر سایر گونه­های ماهی بخوبی مطالعه شده است (11،15،18)، با این حال تا­کنون مطالعات کمی درخصوص اثرات فلز روی بر ماهی کپور خصوصا در ایران وجود دارد (7). لذا ضرورت انجام این طرح با هدف تعیین غلظت کشنده سولفات روی در ماهی کپور تحت شرایط آزمایشگاهی صورت می­گیرد. دانستن غلظت کشنده فلز روی در ماهی کپور می تواند کمک شایانی در رفع و پیشگیری این عارضه توسط استفاده از مواد رزینی همچون زئولیت ها نماید.

مواد و روشها

آزمایشات تحت شرایط ثابت دما و pH (^°C 1±25 = T ، 2/0 ± 1/8 = pH) در محیط آزمایشگاهی صورت گرفت. آزمایشات به روش آب ساکن (Water Static Method) تحت شرایط هوادهی (استفاده از سنگ هوا با اکسیژن تولیدی 2/2 میلی گرم در لیتر در شبانه روز) در مدت 96 ساعت انجام شد. ازماهیان کپور با وزن متوسط 2±3 گرم در هر تیمار استفاده شد. 12 قطعه بچه ماهی کپور در معرض غلظت­های مختلفی از سولفات روی از 0 تا 270 میلی­گرم در لیتر(­270و 250، 200 ، 150، 90 ، 65 ، 30 ، 0 میلی­گرم درلیتر) قرار گرفتند. تعیین غلظت­ها بر اساس یکسری آزمایشات مقدماتی با غلظت های فرضی (300 و250 ، 225، 200،  150، 125، 90، 65، 30، 20، 5، 0 میلی­گرم درلیتر) بود که در آن تعداد تلفات، درصد تلفات و درصد بقاء ماهی در هر مرحله ثبت گردید. درصد تلفات و میزان بقاء ماهی در هر مرحله ثبت گردید. در طول آزمایش غذا دهی صورت نگرفت. یک گروه از ماهی بعنوان شاهد در نظر گرفته شد که فاقد مقادیر سولفات روی بود. بر حسب غلظت­های کشنده (Sub Lethal Concentration) روی و با استفاده از شیب خط رگرسیون غلظت نیمه کشنده  (Lethal Concentratoin) در مدت 96 ساعت محاسبه شد. ظروف آزمایش، تشت های پلاستیکی با حجم آبی50 لیتر بود. از نمک سولفات روی بعنوان ماده موثر در آزمایشات استفاده شد. نمک مورد نظر پس از تعیین حجم آبی بصورت پودر و پس از انتقال ماهی­ها به ظروف آزمایشی به آب اضافه گردید. علائم ظاهری مسمومیت در ماهی ثبت گردید. این آزمایش با استفاده از طرح کاملاً تصادفی متعادل 7×3  اجرا گردید.  داده ها با استفاده از آنالیز واریانس یکطرفه (ANOVA) در سطح معنی­داری P<0.05   مورد تجزیه وتحلیل آماری قرار گرفتند.

نتایج

نتایج حاصل از آزمایشات درجدول 1 آورده شده است. پس از گذشت 96 ساعت غلظت کشنده کاتیون روی برای ماهی کپور 270 میلی­گرم در لیتر بدست آمد. درصد تلفات ماهی در غلظت های مختلف روی (270و 250، 200، 150، 90 ، 65 ، 30 ، 0 میلی­گرم در لیتر)  بعد از گذشت 96 ساعت به ترتیب برابر با 100و 66/91 ، 66/66، 33/58، 66/41،33/33 ،33/8 ،0 بدست آمد (جدول 1). با توجه به درصد تلفات ماهی و منحنی شیب خط رگرسیون غلظت نیمه کشنده (LC₅₀) کاتیون روی برابر با  07/129 میلی گرم درلیتر بدست آمد (شکل 1). علائم ظاهری مسمومیت با روی در طی آزمایشات بصورت تشنجات عصبی، برخورد ماهی با کناره های تشت،  سعی در بیرون پریدن از آب، خونریزی و پرخونی شدید در آبشش ها را نشان داد.

شکل 1- منحنی رگرسیون درصد تلفات ماهی درمعرض غلظت های مختلف روی بعد از گذشت 96 ساعت.

جدول 1- درصد تلفات ماهی در برابر غلظت های مختلف روی بعد از گذشت 96 ساعت تحت شرایط ثابت (2 ±25 = T ، 2/0 ± 1/8 = pH)

بحث

آزمایشات به منظور تعیین غلظت کشنده فلز روی در ماهی کپور به مدت 96 ساعت تحت شرایط آزمایشگاهی صورت گرفت. آزمایشات مختلفی در خصوص تعیین مسمومیت با سموم وعناصر فلزی در انواع ماهیان صورت گرفته است (7، 14 و 17). اما اطلاعات در خصوص سمیت با روی در ماهی کپور خصوصاً در ایران ناچیز است. حساسیت ماهی به مواد سمی یک فاکتور مهم برای تعیین غلظت نیمه کشنده مواد است. عواملی مختلفی در مقاومت ماهی در برابر سموم نقش دارند که از جمله سن، جنس ماهی، گونه و شرایط محیطی خصوصا دما وpH   قابل ذکر می­باشد (13و­20). ماهی کپور از جمله ماهیان مهم پرروشی کشورمان است که سهم بزرگی از تولید در ایران را به خود اختصاص داده است. ماهیان به عنصر روی (Zn) به عنوان یکی از عناصر نایاب در فرآیند­های فیزیولوژیکی نظیر رشد و تقسیم سلولی، متابولیسم، بهبود زخم ها وسیستم دفاعی بدن نیازمندند (12 و 10). همچنین استفاده از روی به عنوان بارورکننده استخر، در افزایش تولید پلانکتونی و افزایش محصول ماهی موثر می باشد (9). با این حال افزایش بیش از حد عنصر روی در محیطهای آبی می توانند سبب مسمومیت شدید ماهی با آن شود. علائم ظاهری مسمومیت با فلز روی در آزمایشات بصورت پرخونی رشته­های آبششی، سعی در بیرون پریدن ماهی از تشت­های آزمایش، بلعیدن هوا از سطح و تشنجات عصبی بود. رنگ پریدگی در ماهی به وضوح مشخص بود و ماهیان در غلظت­های بالا به شدت در اطراف سنگهای هوا تجمع کرده و سعی در بیرون پریدن از تشت ها را داشتند. این امر با یافته های ناجی و همکاران (1386)؛ همچنین گال وهمکاران (2009) مطابقت دارد. ناجی وهمکاران (1386) با مطالعه بر روی ماهیان کپور با وزن 150-120 گرم نشان دادند که غلظت نیمه کشنده سولفات روی در96 ساعت برابر با 50 میلی گرم درلیتر است. آنها همچنین نشان دادند، بیشترین ضایعه رخ داده شده در آبشش ماهی شامل ادم (Edema)، هیپرپلازی (Hyperplasiya) و پرخونی می باشد.

گال و همکارانش (2009) با مطالعه بر روی ماهی گوپی (Poecilia reticulate) اظهار داشتند LC₅₀96h  برابر با 82/30 میلی گرم در لیتر است. آنها تغییر رفتار ماهیانی را که درمعرض انواع غلظت­های سولفات روی قرار داشتند بصورت شنای عمودی، حرکت به پشت، تشنجات عصبی، حرکات ناگهانی و فرورفتن به عمق بیان داشتند.  همانطوریکه در نمودار 1 نشان داده شده است، با افزایش غلظت روی در آزمایشات درصد تلفات ماهی نیز افزایش می یابد. با این وجود آزمایشات نشان داد، بیشترین درصد تلفات ماهی در ساعات اولیه پس از آزمایش رخ داد. آزمایشات مختلفی که بر روی انواع ماهی­ها صورت گرفته است این امر را تایید می­کند (1، 4 و5 ). با مطالعه آزمایش فوق و مقایسه آن با آزمایشات دیگران بر نقش شرایط آزمایشی (دما، pH)، سن و سایز (در یک گونه) و همچنین گونه مورد مطالعه پی می­بریم (9 و­16). آزمایشات مقدماتی نشان داد، در غلظت 20 میلی­گرم در لیتر هیچگونه تلفاتی مشاهده نشد (NOEC) (No Observed Effect Concentration).  لام (1998) با مطالعه بر روی ماهی کپور با وزن 8-5 گرم غلظت نیمه کشنده روی را درمدت 24 و 96 ساعت به ترتیب برابر 23 و 17 میلی گرم درلیتر بدست آورد. وونگ و همکاران (1997) اثرات سمیت دو عنصر روی و مس را بر روی دو گونه از کپور ماهیان (کپورمعمولی و کپور علفخوار) مورد مطالعه قراردادند. آنها در مطالعات خود نشان دادند، ماهی کپور در مقابل مس حساس تر بوده در حالیکه ماهی علفخوار به روی حساسیت بیشتری نشان داد. البته سمیت مس نسبت به روی به مراتب بیشتر است. مطالعات نشان می دهد، ماهیانی که به یک ماده حساسیت بیشتری نشان می دهند، نسبت به مواد دیگر حساسیت کمتری را درغلظت های یکسان نشان  می دهند. ساجید و جاوید (2006) اثر 5 عنصر سمی روی، آهن، منیزیم، نیکل و سرب را بر روی ماهی Catla catla   با سنین 90و 60، 30 روزه بررسی کردند.

آنها ضمن تعیین غلظت­های نیمه کشنده فلزات مورد آزمایش بیان کردند، ماهیان جوان حساسیت بیشتری از خود نشان می دهند. بطوریکه در بررسیهای بعمل آمده مشخص شد، ماهیان 30 روزه حساسیت بیشتر ی ازخود نشان می دهند، بطوریکه غلظت نیمه کشنده روی درمدت 96 ساعت برای ماهیان30 روزه برابر­66/20 میلی­گرم در لیتر بود.

این درحالی است که غلظت نیمه کشنده روی برای ماهیان 60 و 90 روزه به ترتیب برابر با 30/23 و 88/25 می باشد. دراین آزمایش از ماهیان کوچک که حساسیت بیشتری را نشان می دهند استفاده شد. اگرچه غلظت بدست آمده دراین آزمایش برای ماهیان کوچک (270 میلی گرم درلیتر) خیلی بیشتر از میزان بدست آمده برای ماهیان درشتر در آزمایش ناجی و همکاران (1386) می باشد (50 میلی گرم درلیتر).

این امر می تواند بیانگر تفاوت در سایر فاکتورهای شرایط آزمایشی (دما، سختی و pH) باشد. نتایج بدست آمده در آزمایش ناجی و همکاران (1386) و ساجید و جاوید (2006) این امررا ثابت می کند. ساجید و جاوید (2006) آزمایشات خود را تحت شرایط دمایی 30 درجه سانتیگراد و pH برابر 1/7 اجرا نمودند. همانطوریکه مشخص است افزایش دما می تواند عامل مهمی در افزایش اثرات سمی یک فلز داشته باشد. بهرحال در شرایط طبیعی غلظت های مختلف مواد می توانند در تعیین سمیت مواد بر روی ماهی نقش داشته باشند، که این فاکتورها در شرایط آزمایشی وجود ندارند. مطالعات نشان داده است با افزایش عناصر سمی در آب ضمن اثرات مستقیم سمیت مواد بر روی اندامهای ماهی، این مواد بطور غیرمستقیم می­توانند اثرات سمیت را تشدید کنند. این امر از طریق افزایش دفع آمونیاک توسط ماهی و کاهش شدید اکسیژنی، نتیجه استرس وارده به ماهی و تشدید مصرف اکسیژن توسط ماهی صورت می­گیرد (19). عواملی همچون کمبود اکسیژن، درجه حرارت و افزایش اسیدیته معمولاً حساسیت ماهی را به مواد سمی افزایش می­دهد، در حالیکه مواد معدنی همچون سختی و شوری سبب کاهش سمیت مواد می شود (20). غلظت های تاثیرگذار (Effect Concentration) مواد سمی می توانند بر متابولیسم ماهی و کارآیی بافت های ماهی تاثیر بسزایی بگذارند. مالیک و همکاران (1998) اثرات سمیت روی را بر روی ترکیبات شیمیایی کبد و بافت ماهیجه ای ماهی Channa punctatus بررسی نمودند. آنها بیان داشتند، با افزایش زمان قرارگیری ماهی درمعرض فلز روی میزان متابولیسم ماهی کاهش یافته و ترکیبات شیمیایی کبد و بافت ماهیچه ای بطور معنی داری کاهش می یابد،  بطوریکه ارزش انرژِی زایی چربی، پروتئین و گلیکوژن کبد و ماهیچه کاهش می یابد. خوانیاکاری و همکاران (2001) سمیت عناصر مس، روی و نیکل را بر روی ماهی Poecilia reticulata مورد مطالعه قرار دادند. آنها بیان کردند در ماهیانی که درمعرض مواد سمی قرار گرفتند، ترشح موکوس افزایش یافته و دفع بیش از اندازه صورت می گیرد. پیرسون (1981) اثرات مسمومیت حاد با فلز روی را بر رشد، بلوغ جنسی، انباشت زیستی و تولید مثل در ماهی گوپی Poecilia reticulate بررسی کردند. آنها نشان دادند، ماهیان ماده­ای که در معرض 607/0 میلی­گرم در لیتر از روی به مدت 134 روز قرار داشتند، باعث افزایش لگاریتمی رشد و شاخص رسیدگی جنسی در ماده ها می­شود. این در حالی است که وزن­تر ماده­ها به میزان40% کاهش یافت. باگدوناز و واسیلین (2006) سمیت نیمه کشنده دو عنصر مس و روی و اثر متقابل این دو فلز را بر فاکتورهای خونی ماهی قزل آلای رنگین کمان بررسی کردند. آنها در آزمایشات خود میزان مشخصی (25/0 میلی گرم در لیتر از غلظت نیمه کشنده) از غلظت نیمه کشنده مس (16/0 میلی­گرم در لیتر) و روی (948/0 میلی­گرم در لیتر) را مورد استفاده قرار دادند.

آنها بیان کردند، اگرچه غلظت­های نیمه کشنده مس و روی بر تعداد اریتروسیت خون ماهی قزل­آلای رنگین کمان اختلاف معنی­داری را نسبت به گروه شاهد نشان نداد، اما غلظت مخلوط نیمه کشنده روی و مس اختلاف معنی­داری را در کاهش میزان اریتروسیتها نسبت به گروه شاهد نشان می­دهد. آنها همچنین نشان دادند، میزان هماتوکریت خون ماهیان در غلظت­های نیمه کشنده مس و روی و غلظت انتخابی مخلوط این دو فلز نسبت به گروه شاهد اختلاف معنی­داری (P<0.05) دارند. همچنین بیان کردند، اگرچه دو عنصر روی و مس سبب کاهش میزان گلبولهای سفید در ماهی می شود، غلظت مخلوط این دو عنصر تا 60% سبب کاهش گلبولهای سفید مورد مطالعه می شود.

همانطوریکه مشخص است رفتارهای ظاهری مسمومیت با عناصر سمی به ویژه روی می­تواند نتیجه تغییرات ساختاری اندامهای داخلی ماهی باشد. در این خصوص پیشنهاد می­گردد، فاکتورهای خونی و آسیب شناسی اندامهای داخلی ماهی نیز مورد ارزیابی قرارگیرد.