نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 خرمشهر، دانشگاه علوم و فنون دریایی، دانشکده علوم دریایی و اقیانوسی، گروه بیولوژی دریا

2 خرمشهر، مرکز تحقیقات شیلات جنوب، گروه بیولوژی دریا

3 خرمشهر، دانشگاه علوم و فنون دریایی، دانشکده منابع طبیعی، گروه شیلات

4 بندر امام خمینی(ره)، مرکز پژوهش پتروشیمی

چکیده

در مطالعه حاضر اثر ماده استروژنیک 4-نونیل فنل بر ساخت ویتلوژنین در جنس نر نابالغ ماهی شانک زرد باله (Acanthopagrus latus) مورد بررسی قرار گرفت. ماهیان در خلال دو هفته و بصورت تزریق درون صفاقی، غلظت­های 10، 50، 100، 150 و 200 میکروگرم بر گرم بر هفته از 4-نونیل فنل را دریافت نمودند. به ماهیان یک گروه نیز 2 میکروگرم بر گرم بر هفته از 17بتا-استرادیول تزریق شد. گروه کنترل حلال، تنها محلول روغن نارگیل و اتانول را دریافت کردند در حالیکه بر روی ماهیان کنترل هیچگونه تزریقی صورت نگرفت. از ماهیان در روزهای 0، 7 و 14 نمونه برداری به عمل آمد. تحریک ساخت ویتلوژنین در پلاسمای ماهیان تیمار شده بصورت غیر مستقیم و با اندازه­گیری فسفات باز ناپایدار (ALP) و کلسیم کل پلاسما مورد بررسی قرار گرفت. مقادیر افزایش یافته این اندیکاتورها در پلاسما، نشان دهنده تحریک وابسته به دوز ساخت ویتلوژنین توسط کبد ماهی های شانک تیمار شده با 4-نونیل فنل بود. همچنین القاء شدن ساخت ویتلوژنین با افزایش شاخص هپاتوسوماتیک (HSI) ماهیان تیمار شده با 4-نونیل فنل نیز قابل تأیید بود. یافته­های این تحقیق حاکی از توانایی نونیل فنل در ایجاد اثر استروژنیک می­باشد به گونه­ای که توسط افزایش سنتز ویتلوژنین و HSI نشان داده شد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

The estrogenic effect of 4-nonylphenol on vitellogenin synthesis in the immature male yellowfin seabream, Acanthopagrus latus (Teleostei: Sparidae) (Houttuyn, 1782)

نویسندگان [English]

  • mohammad naderi 1
  • alireza safahieh 1
  • simin dehghan 2
  • hossein zplgharnein 2
  • ebrahim rajabzadeh 3
  • simin eidivand 4

چکیده [English]

In the present study effects of estrogenic compound 4-nonylphenol was investigated on vitellogenin synthesis in the immature male yellowfin seabream (Acanthopagrus latus). The fish received intraperitoneal injections during a period of two weeks with 10, 50, 100, 150 and 200 µg g-1 week-1 of 4-nonylphenol. One of the treatments also injected with 2 µg g-1 week-1 of 17β-estradiol. Solvent controls received the ethanol-coconut oil only, whereas controls were not injected. The fish were sampled on day 0, 7 and 14. The induction of VTG in plasma of treated fish was determined indirectly by measuring the alkali-labile phosphate and total plasma calcium. Increased concentrations of these indicators indicated a dose–response induced synthesis of vitellogenin in the liver of the 4-nonylphenol-treated seabreams. Induction of vitellogenin synthesis also could be observed by increasing the hepatosomatic index (HSI) in the 4-nonylphenol-treated fish. The findings of this study showed the potency of nonylphenol to exert esterogenic effect as indicated by both increase in vitellogenin synthesis and HSI.

کلیدواژه‌ها [English]

  • 4-Nonylphenol
  • Vitellogenin
  • Alkali labile phosphate ALP
  • 17β-Estradiol
  • Yellowfin seabream (Acanthopagrus latus)

اثر استروژنیک 4-نونیل فنل بر سنتز ویتلوژنین در جنس نر نابالغ ماهی شانک زردباله، latus (Teleostei: Sparidae) (Houttuyn, 1782) Acanthopagrus 

محمد نادری1، علیرضا صفاهیه*، سیمین دهقان مدیسه2، حسین ذوالقرنین2، ابراهیم رجب زاده قطرمی3 و سیمین عیدی وند4

1 خرمشهر، دانشگاه علوم و فنون دریایی، دانشکده علوم دریایی و اقیانوسی، گروه بیولوژی دریا

2 خرمشهر، مرکز تحقیقات شیلات جنوب، گروه بیولوژی دریا

3 خرمشهر، دانشگاه علوم و فنون دریایی، دانشکده منابع طبیعی، گروه شیلات

4 بندر امام خمینی(ره)، مرکز پژوهش پتروشیمی

تاریخ دریافت: 27/1/90               تاریخ پذیرش: 22/1/91

چکیده 

در مطالعه حاضر اثر ماده استروژنیک 4-نونیل فنل بر ساخت ویتلوژنین در جنس نر نابالغ ماهی شانک زرد باله (Acanthopagrus latus) مورد بررسی قرار گرفت. ماهیان در خلال دو هفته و بصورت تزریق درون صفاقی، غلظت­های 10، 50، 100، 150 و 200 میکروگرم بر گرم بر هفته از 4-نونیل فنل را دریافت نمودند. به ماهیان یک گروه نیز 2 میکروگرم بر گرم بر هفته از 17بتا-استرادیول تزریق شد. گروه کنترل حلال، تنها محلول روغن نارگیل و اتانول را دریافت کردند در حالیکه بر روی ماهیان کنترل هیچگونه تزریقی صورت نگرفت. از ماهیان در روزهای 0، 7 و 14 نمونه برداری به عمل آمد. تحریک ساخت ویتلوژنین در پلاسمای ماهیان تیمار شده بصورت غیر مستقیم و با اندازه­گیری فسفات باز ناپایدار (ALP) و کلسیم کل پلاسما مورد بررسی قرار گرفت. مقادیر افزایش یافته این اندیکاتورها در پلاسما، نشان دهنده تحریک وابسته به دوز ساخت ویتلوژنین توسط کبد ماهی های شانک تیمار شده با 4-نونیل فنل بود. همچنین القاء شدن ساخت ویتلوژنین با افزایش شاخص هپاتوسوماتیک (HSI) ماهیان تیمار شده با 4-نونیل فنل نیز قابل تأیید بود. یافته­های این تحقیق حاکی از توانایی نونیل فنل در ایجاد اثر استروژنیک می­باشد به گونه­ای که توسط افزایش سنتز ویتلوژنین و HSI نشان داده شد.

واژه های کلیدی: 4-نونیل فنل، ویتلوژنین، فسفات باز ناپایدار(ALP)، 17بتا-استرادیول، شانک زرد باله (Acanthopagrus latus)

* نویسنده مسئول، تلفن: 09168331821 ، پست الکترونیکی:  Safahieh@hotmail.com

مقدمه

 

برخی از ترکیبات شیمیایی زنوبیوتیک (Xenobiotic) قادرند از طریق مکانیسم­های مستقیم و غیرمستقیم موجب تداخل در سیستم اندوکرینی انسان و سایر جانوران گردند، از اینرو در سالهای اخیر نگرانی درباره آنها افزایش یافته است (28).

آلکیل فنل­ها (Alkylphenols) ترکیباتی فنلی می­باشند که از اتصال یک یا تعداد بیشتر زنجیره آلکیلی به یک حلقه آروماتیک تشکیل می­شوند. این ترکیبات از واسطه هایی در پالایش نفت و قطران ذغال سنگ به وجود می آیند (41). همچنین از اجزای طبیعی نفت خام بوده و از اینرو مقادیر زیادی از آنها بعد از جداسازی آب از نفت در محل سکوهای نفتی وارد فاز آبی می­گردد (39). نونیل فنل (NP) (Nonylphenol) یکی از اعضای خانواده آلکیل فنل ها بوده که بطور گسترده ای در ساخت فسفیت­های نونیل فنل، اسپری­های حشره­کش آمینوکارب و نونیل فنل اتوکسیلات­ها (Nonylphenol ethoxylates) به کار می رود (25). نونیل فنل اتوکسیلات­ها یک گروه بزرگ از سورفاکتانت­های غیریونی می­باشند که در تولید روغن موتورها، امولسیون کننده ها، پلاستیک­ها، رنگ های لاتکس، دترجنت های خانگی و صنعتی، حلال ها و صنایع کاغذ و منسوجات به کار گرفته می­شوند (37,24). فسفیت های نونیل فنل نیز بطور متداول بعنوان عوامل تثبیت کننده و آنتی اکسیدان در صنایع لاستیک و پلاستیک سازی مورد استفاده قرار می­گیرند. نونیل فنل همانند سایر آلکیل فنل­ها در محیط مقاوم بوده، بسیار چربی دوست می­باشد و متعاقبا میتواند منجر به تجمع زیستی در موجودات آبزی گردد (36,1). بعلاوه مشخص گردیده است که این ترکیب قادر به تحریک رشد سلول­های سرطان پستان انسان در کشت سلولی می­باشد (44,38). به دلیل شباهت ساختاری با 17بتا-استرادیول (E2) ، نونیل فنل اثر این هورمون طبیعی را به وسیله رقابت برای اتصال به گیرنده های استروژن کبدی تقلید کرده و از اینرو قادر است عملکرد طبیعی سیستم اندوکرینی را تحت تاثیر قرار دهد (37). علاوه براین نونیل فنل و نونیل فنل اتوکسیلات ها قادر به ایجاد تغییرات در ساختار بیضه­ای و تحریک سنتز ویتلوژنین (Vitellogenin) در ماهیان، هم در شرایط محیطی و هم در شرایط آزمایشگاهی بوده اند (27,20). 

ویتلوژنین یک گلیکولیپوفسفوپروتئین بزرگ سرم بوده که بصورت طبیعی توسط جنس ماده مهره داران تخم گذار و در پاسخ به استروژن­های درونی در کبد تولید شده به درون خون آزاد گشته و در اووسیت­های در حال رشد ذخیره می­گردد (15). در بررسی­های متعددی از ویتلوژنین جهت تعیین حضور ترکیبات شیمیایی استروژنیک در اکوسیستم­های آبی استفاده شده است. به عنوان مثال در رودخانه­های انگلستان، ماهیان قزل­آلای رنگین کمان (Oncorhynchus mykiss) قرار گرفته در معرض خروجی­های فاضلاب که حاوی مقادیر زیادی از آلکیل فنل­ها بودند، سطوح ویتلوژنینی 500 تا 000/100 برابر بیشتر از ماهیان بالا دست این خروجی­ها داشتند (33). همچنین بررسی­های پیشین نشان داده اند که تیمار با هر دو ترکیب 17بتا-استرادیول و نونیل فنل می تواند منجر به تحریک سنتز این پروتئین در ماهیان آب شیرین گردد (22,6). 

ماهی شانک زرد باله (Acanthopagrus latus) از گونه­های مهم و تجاری خلیج فارس به شمار می­آید. این ماهی قادر به زندگی در آب­های شیرین، لب شور و محیط­های دریایی بوده و ارزش اقتصادی بالا، سازگاری آسان با اسارت و در دسترس بودن تکنولوژی پرورش آن (34,16) موجب شده که در سالهای اخیر پرورش این ماهی در آبهای جنوبی کشور از اهمیت ویژه­ای برخوردار گردد. یکی از زیستگاههای عمده شانک زردباله در آبهای جنوبی کشور، منطقه خورموسی است. از طرف دیگر استقرار صنایع پتروشیمی در اطراف خور و متعاقبا تخلیه حجم زیادی از پسابهای این تاسیسات به آبهای منطقه و همچنین ورود مقادیر بالایی از مواد نفتی، روغن موتور کشتی­ها، فاضلاب­های شهری و غیره موجب گشته که محیط خور موسی به سطوح بالایی از ترکیبات مختل کننده اندوکرینی (Endocrine disrupter chemicals) از جمله نونیل فنل آلوده باشد. از اینرو وجود این ترکیبات می تواند تهدیدی جدی برای آبزیان این منطقه و حتی انسان بشمار آید. بطوریکه سلامت تولید مثلی آبزیان به خطر افتاده و به مرور زمان منجر به کاهش جمعیت­های آنها گردد که این عامل خود پیامدهای سوء دیگری را به همراه دارد. تاکنون بررسی های اندکی در ارتباط با تاثیرات مواد زنواستروژن (Xenoestrogen) در ماهیان دریایی انجام شده و از این حیث در کشور مطالعه­ای صورت نگرفته است. ماهی شانک زردباله یک ماهی هرمافرودیت پروتاندروس است (16). لذا اختلالات اندوکرینی می تواند تمایز جنسی و متعاقبا سلامت تولید مثلی این گونه را به خطر بیاندازد. از طرف دیگر پروتاندروس بودن این ماهی می تواند یک مزیت (نر بودن در مراحل اولیه زندگی) برای استفاده از آن در مطالعه مختل کننده های اندوکرینی باشد.

هدف از مطالعه حاضر بررسی اثر استروژنیک نونیل فنل بر سنتز ویتلوژنین در ماهی شانک زردباله بود. القاء شدن ویتلوژنین می تواند یک هشدار اولیه از اثرات مضر نونیل فنل در این ماهی بشمار آید.

مواد و روشها

تامین ماهی و دوره سازگاری (Acclimation): تعداد 104 قطعه ماهی شانک زرد باله نر نابالغ (میانگین وزنی 4/2±7/133 گرم) از خور زنگی و جعفری (از انشعابات خور موسی، ایران) صید شدند (شکل 1). ماهی­ها پس از انتقال به سوله مرکز تحقیقات ماهیان دریایی بندر امام خمینی (ره) بصورت تصادفی در 8 تانک 300 لیتری (13 ماهی در هر تانک) با آب فیلتر شده دریا که توسط اشعه UV تیمار شده بود (شوری ‰45، 2/0±1/8 pH، دمای 26 درجه سانتی گراد) و تحت سیکل نوری 12 ساعت روشنایی/ تاریکی قرار داده شدند. تعویض آب روزانه 80 درصد و جهت سازگاری ماهی ها با شرایط جدید10 روز در نظر گرفته شد. در کل دوره آزمایش هیچ گونه غذا دهی صورت نگرفت.

تزریق ماهیان: بمنظور مواجهه ماهی شانک زرد باله با 4-نونیل فنل در این تحقیق، از روش تزریق استفاده شد. بدین منظور پس از بیهوش کردن با 2-فنوکسی اتانول 1/0% (Merck, Germany)، ماهیان 5 تیمار با دوزهای 10، 50، 100، 150 و 200 میکروگرم بر گرم از 4-نونیل فنل (TCIEurope, Belgium) در خلال 2 هفته و بصورت درون صفاقی تحت تزریق قرار گرفتند. همچنین ماهیان 1تیمار دوز 2 میکروگرم بر­گرم از 17بتا-استرادیول (Sigma, USA) را دریافت کردند. علت استفاده از 17بتا-استرادیول در این مطالعه آزمودن فرضیه اثر استروژنیک نونیل فنل بود (20). تزریق ها به میزان نصف دوز و دوبار در هفته انجام پذیرفت. گروه کنترل حلال (Solvent control) تنها میزان 1/0 میلی لیتر از حلال (روغن نارگیل + اتانول) را دریافت کردند در حالیکه بر روی ماهیان کنترل هیچگونه تزریقی صورت نگرفت.

نمونه برداری : در روزهای 0، 7 و 14 از ماهیان نمونه برداری به عمل آمد. جهت نمونه برداری، پس از بیهوش نمودن و ثبت طول کل و وزن، از ساقه دمی ماهیان به وسیله سرنگ 2 میلی لیتری تیمار شده با هپارین خونگیری شد. سپس نمونه های خون به مدت 10 دقیقه در دور ×g1000 سانتریفوژ گشته و پلاسما به لوله های اپندرف 5/1 میلی­لیتری منتقل شد. نمونه های پلاسما تا زمان آنالیز در دمای80- درجه سانتیگراد نگهداری شدند. پس از خونگیری کبد ماهیان به سرعت خارج گشته و به وسیله ترازو 001/0 گرم (FX-300AND, Japan) وزن شدند. شاخص هپاتوسوماتیک (HSI) (Hepatosomatic index) از طریق فرمول زیر محاسبه گردید: 

100 × وزن بدن/ وزن کبد = HSI (%)

سنجش ویتلوژنین :جهت سنجش ویتلوژنین از روش غیر مستقیم فسفات باز ناپایدار (ALP) (Alkali labile phosphate) استفاده شد. بطور مختصر پس از رسوب پروتئین های پلاسما به وسیله استن و2 شستشوی پی در پی به وسیله تریس و اتانول، جهت آزاد سازی فسفات های باند شده به ویتلوژنین، پلت پروتئین در دمای 70 درجه سانتی گراد تحت تیمار قلیایی به وسیله NaOH 1 مولار قرار داده شد. در نهایت به وسیله ایجاد کمپلکس آمونیوم فسفومولیبدات و احیاء آن توسط اسکوربیک اسید، رنگ آبی حاصل توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (UNICO UV-2100, USA) قرائت شد (14).

کلسیم کل پلاسما نیز با استفاده از کیت آزمایشگاهی زیست شیمی، به روش ارتوکرزول فتالئین و به وسیله دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه­گیری شد.

تجزیه و تحلیل آماری: جهت آنالیز آماری از نرم افزار SPSS 16 استفاده شد. تمامی مقادیر بصورت میانگین ± خطای استاندارد گزارش شده است. نرمال بودن داده ها توسط تست Shapiro-wilk  بررسی شد. از آنالیز واریانس دوطرفه (ANOVA) بمنظور تعیین معنی­داری اثر تیمارهای مختلف، زمان و برهمکنش آنها استفاده گردید. سپس با استفاده از پس آزمون دانکن معنی­داری اختلاف میان تیمارهای مختلف مشخص شد. آنالیز رگرسیون خطی ساده جهت تعیین معنی­داری ارتباط میان مقادیر ALP با سطوح کلسیم و همچنین ارتباط HSI با دوزهای مختلف 4- نونیل فنل در طول دوره آزمایش انجام پذیرفت. سطح معنی­داری در تمامی آزمون­ها P<0.05 در نظر گرفته شد.

 

 

شکل 1- مکان های جمع آوری نمونه ها در خور موسی.

 

 

شکل 2- غلظت فسفات باز ناپایدار (ویتلوژنین) در پلاسمای جنس نر نابالغ ماهی شانک زرد باله پس از مواجهه با دوزهای مختلف 4-نونیل فنل و 17بتا-استرادیول. علامت (*) بیانگر اختلاف معنی دار با گروه کنترل در (P<0.05). حرف (a) بیانگر اختلاف معنی دار در دوز یکسان نسبت به روز 7 می­باشد (P<0.05). NP، 4-نونیل فنل؛ E2، 17بتا-استرادیول.


نتایج

در طول دوره آزمایش تعداد 6 ماهی تلف شدند. تمامی مرگ و میرها در هفته آخر آزمایش و مربوط به دوزهای 100 (1=n)، 150 (2=n) و200 میکروگرم بر­گرم (2=n) از 4-نونیل فنل و 2 میکروگرم بر­گرم (1=n) از 17بتا-استرادیول بود. همچنین پس از کالبدشکافی جنسیت 2 ماهی، مربوط به یک تیمار از 4-نونیل فنل (50 میکروگرم بر­گرم) و یک تیمار از 17بتا-استرادیول (روز 14)، ماده تشخیص داده شد که نمونه های پلاسما و کبد آنها از جریان آزمایش خارج گشت.

 اثر استروژنیک 4-نونیل فنل به وسیله تحریک سنتز پیش ماده پروتئین های زرده، ویتلوژنین، که بطور طبیعی در جنس نر و نابالغ ماهی شانک زرد باله وجود ندارد مشخص شد. مطابق شکل2، سطوح ALP پلاسما در یک رفتار وابسته به دوز یک هفته پس از تزریق شروع به افزایش کرد (P<0.05). این وابستگی به دوز در پایان هفته دوم مشهودتر بود (P<0.05) با این وجود تفاوت معنی­داری بین سطوح ALP پلاسما در روزهای 7 و 14وجود نداشت. افزایش مشابهی نیز در سطوح ALP ماهیان تیمار شده با 2 میکروگرم بر گرم از 17بتا-استرادیول همانند دوزهای بالای 4-نونیل فنل مشاهده شد (P<0.05، شکل 2). همچنین سطوح کلسیم کل پلاسما در تمامی گروه های تیمار شده با 4-نونیل فنل و 17بتا-استرادیول بالاتر از گروه های کنترل و کنترل حلال بود (P<0.05، شکل 3). افزایش مشابهی در سطوح کلسیم کل پلاسما در ماهیان تیمار شده با 2 میکروگرم بر گرم از 17بتا-استرادیول نیز وجود داشت. با این حال تفاوت معنی­داری بین سطوح کلسیم کل پلاسما در روزهای 7 و 14 مشاهده نشد (P<0.05). علاوه بر این ALP و غلظت های کلسیم پلاسما یک همبستگی مثبت و معنی­دار (97/0= R) را در کل دوره آزمایش نشان دادند (P<0.05، شکل 4).

بطور کلی  HSIدر ماهیان تیمار شده بطور معنی­داری (99/0 =R ) با افزایش دوز 4-نونیل فنل افزایش یافت (P<0.05، شکل 5). میزان وزن تر کبد در روزهای 0، 7 و 14 اختلاف معنی­داری را نشان می داد که بیشترین میزان HSI ثبت شده مربوط به روز 14 بود (P<0.05، جدول 1).


 

 

 

شکل3- غلظت کلسیم کل پلاسمای ماهی شانک زرد باله نر نابالغ پس از مواجهه با دوزهای مختلف 4-نونیل فنل و 17بتا-استرادیول. علامت (*) بیانگر اختلاف معنی دار با گروه کنترل در (P<0.05). حرف (a) بیانگر اختلاف معنی دار در دوز یکسان نسبت به روز 7 می­باشد (P<0.05). NP، 4-نونیل فنل؛ E2، 17بتا-استرادیول.

 

 

شکل 4- همبستگی میان غلظت های ALP و کلسیم کل پلاسما در ماهیان تمیار شده با 4-نونیل فنل .(P<0.05)

 

شکل 5- همبستگی میان دوزهای مختلف 4-نونیل فنل و شاخص هپاتوسوماتیک .(P<0.05)

جدول 1- میانگین شاخص هپاتوسوماتیک (HSI ± S.D) ماهی شانک زرد باله پس از 7 و 14 روز مواجهه با 4-نونیل فنل و 17بتا-استرادیول.

                   تیمار 

روز 0

روز7 

روز14 

کنترل

58/0    ± 02/0

57/0    ± 02/0

58/0    ± 03/0

کنترل حلال

 

58/0    ± 02/0

57/0    ± 02/0

10 میکروگرم بر گرم 4-نونیل فنل

 

74/0    ± 03/0

71/0    ± 04/0

50 میکروگرم بر گرم 4-نونیل فنل

 

33/1    ± 06/0 a

43/1    ± 11/0 a

100 میکروگرم بر گرم 4-نونیل فنل

 

32/1    ± 04/0 a

97/1    ± 11/0 a,b

150 میکروگرم بر گرم 4-نونیل فنل

 

41/1    ± 09/0 a

34/2    ± 12/0 a,b

200 میکروگرم بر گرم 4-نونیل فنل

 

68/1    ± 13/0 a

94/2    ± 23/0 a,b

2 میکروگرم بر گرم 17بتا-استرادیول

 

38/2    ± 08/0 a

36/3    ± 25/0 a,b

    علامت (a) نشان دهنده تفاوت معنی دار با گروه کنترل است (P<0.05).

   علامت (b) نشان دهنده تفاوت معنی دار HSI نسبت به روز 7 در غلظت یکسان است (P<0.05).


بحث

ویتلوژنین یک نشانگر زیستی مناسب جهت ارزیابی قرار گرفتن جانوران تخم گذار در معرض استروژن ها یا ترکیبات شبه استروژنی است. نرها و نابالغ ها بصورت طبیعی قادر به سنتز ویتلوژنین نمی باشند اما به دلیل وجود ژن ویتلوژنین در کبد، مواجهه با ترکیبات استروژنیک منجر به تحریک ساخت این پروتئین در آنها خواهد شد (9). 

در مطالعه حاضر اثر استروژنیک یک ماده آلکیل فنلی، 4-نونیل فنل، بر روی ساخت ویتلوژنین در جنس نر نابالغ ماهی شانک زرد باله مورد بررسی قرار گرفت. پیش از این در بررسی­های متعددی نشان داده شده بود که ALP یک شاخص بسیار مطمئن از حضور ویتلوژنین در پلاسمای ماهیان می باشد (23,4). در حقیقت ویتلوژنین به عنوان تنها پروتئین حاوی فسفات در خون مهره داران تخم گذار در نظر گرفته می­شود (7) و این عامل همراه با درجه بالای فسفری شدن، سنجش غیر مستقیم ویتلوژنین را از طریق ALP امکان پذیر می سازد (14). Kramer و همکاران (1998) در یک بررسی افزایش معنی­دار سطوح ALP پلاسمای ماهی قنات سرچرب (Pimephales promelas) را همراستا با افزایش غلظت 17بتا-استرادیول نشان دادند (40). در بررسی حاضر نیز سطوح ALP بطور معنی­داری در تمامی گروه های تیمار شده با 4-نونیل فنل (به استثنای دوز 10 میکروگرم بر گرم در هفته اول) افزایش یافت (شکل 2). سطوح ALP فلاندر­های نر (P. flesus) نیز که طی 14 روز در معرض دوزهای مختلف از 4-نونیل فنل قرار گرفته بودند بطور معنی­داری بالاتر از گروه کنترل بود (7). همچنینChristiancen  و همکاران (1998) در طی 25 روز با بررسی تاثیر 4-نونیل فنل در دوزهای پایین و بالا (10 و100 میکروگرم بر گرم) بر روی
Zoarces viviparous نشان دادند که نونیل فنل با تقلید اثر 17بتا-استرادیول همانند یک استروژن عمل کرده و موجب سنتز ویتلوژنین می­گردد (8). با این وجود سنتز ویتلوژنین در دوزهای پایین قابل توجه نبود. نتایج مطالعه حاضر نیز نشان داد که دوز 10 میکروگرم بر گرم نسبت به سایر تیمارهای 4-نونیل فنل، توانایی کمتری در تحریک سنتز ویتلوژنین دارد. این موضوع اشاره دارد که نونیل فنل در یک رفتار وابسته به دوز موجب تحریک سنتز ویتلوژنین می شود بطوریکه در چندین مورد برای قزل آلای رنگین کمان (O. mykiss) گزارش شده بود (19,18). در یک مطالعه نونیل فنل موجب افزایش تراکم گیرنده استروژنی و mRNA ویتلوژنین در کشت سلولی هپاتوسیت های قزل آلای رنگین کمان شد (10). از اینرو پیشنهاد گردید که این ترکیب از طریق اتصال به گیرنده استروژنی در یک مسیر رقابتی اما با توانایی بسیار کمتر (1000 مرتبه) از 17بتا-استرادیول منجر به ایجاد اثر استروژنیک می گردد (10). مطالعات دیگر نیز بطور مشابهی اظهار داشته اند که نونیل فنل مستقیماً و از طریق اتصال به گیرنده استروژنی موجب سنتز ویتلوژنین در کشت سلول­های کبدی ماهیان می شود (35,31). با این حال مکانیسم دقیق اثر اندوکرینی این زنواستروژن در موجودات زنده هنوز ناشناخته باقی مانده است. تحقیقات اخیر اشاره دارد که نونیل فنل از طریق مکانیسم­های غیرمستقیم منجر به اثرات استروژنیک می­گردد. به گونه­ای که در ماهی قنات سرچرب
(P. promelas) تمیار نونیل فنل به جای اثر مستقیم، به وسیله افزایش سطوح 17بتا-استرادیول پلاسما منجر به افزایش تولید ویتلوژنین شد (12).

ویتلوژنین یک لیپوفسفوپروتئین غنی از کلسیم می­باشد، از اینرو در زمان سنتز آن مقادیر زیادی از کلسیم به درون پروتئین انتقال می یابد (13). این کلسیم های باند شده به ویتلوژنین در جهت افزایش حلالیت این پروتئین بزرگ در خون می باشند (11). پیش از این در چندین بررسی افزایش همزمان کلسیم و غلظت ویتلوژنین پلاسما به دنبال تحریک استروژنی نشان داده شده بود (5,3). نتایج بررسی حاضر نیز نشان دهنده سطوح بالاتر کلسیم کل پلاسما در تمامی گروههای تیمار شده با 4-نونیل فنل و 17بتا-استرادیول در مقایسه با گروه های کنترل و کنترل حلال بود (شکل 3). در بررسی دیگری تزریق 17بتا-استرادیول (2 میکروگرم بر­گرم) و 4-نونیل فنل (150 میکروگرم بر­گرم) به سالمون آتلانتیکی (Salmo salar) پس از 14 روز منجر به افزایش همزمان کلسیم کل پلاسما و ویتلوژنین شد که بطور آشکاری سنتز کبدی ویتلوژنین را نشان می داد (26).

کلسیم به گروههای فسفات مولکول ویتلوژنین متصل می باشد (30)، از اینرو انتظار می­رفت همراه با افزایش غلظت ALP، سطوح کلسیم نیز در پلاسما افزایش یابد. در مطالعه حاضر نیز یک همبستگی مثبت و قوی بین غلظت های ALP و کلسیم کل پلاسما مشاهده شد (شکل4). Verslycke و همکاران (2002) هم بطور مشابهی یک افزایش معنی­دار را در سطوح کلسیم، ALP و پروتئین کل پلاسمای قزل آلای رنگین کمان (O. mykiss) که با دوزهای مختلف از 17آلفا-اتینیل استرادیول (17α-Ethinylestradiol) تزریق شده بودند را در مقایسه با ماهیان کنترل و کنترل حلال نشان دادند. تمامی این پارامترها بطور معنی داری با یکدیگر همبستگی داشتند (42).

به عنوان یک نتیجه کلی، القاء شدن سنتز ویتلوژنین با افزایش متابولیسم کبد منجر به بزرگ شدن اندازه آن و متعاقبا افزایش شاخص هپاتوسوماتیک می­گردد (21). در یک بررسی شاخص هپاتوسوماتیک ماهی
Tautogolabrus adspersus تیمار شده با 17بتا-استرادیول (2 و20 میلی گرم بر کیلوگرم) بعد از 4 هفته بطور معنی داری افزایش یافت (31). با این حال Pait و همکاران (2003) افزایش معنی­داری را در شاخص هپاتوسوماتیک Fundulus heteroclitus تزریق شده با 3 ماده استروژنیک 4-نونیل فنل، 4-(ترت-اوکتیل فنل) (4-(tert-octyl)Phenol) و بیس فنل-آ (Bisphenol-A)، مشابه با دوزهای به کار رفته در آزمایش حاضر، مشاهده نکردند (32). همچنین با وجود سنتز ویتلوژنین در ماهی کپور معمولی (Cyprinus carpio)، که به مدت 28 تا 31 روز در معرض 4/5-05/0 میکروگرم بر لیتر از نونیل فنل قرار گرفته بودند، اختلاف معنی­داری در HSI میان تیمارهای مختلف گزارش نگردید (43). با این وجود نتایج مطالعه حاضر نشان دهنده افزایش شاخص هپاتوسوماتیک همراستا با افزایش دوز 4-نونیل فنل بود (شکل 5). علاوه براین HSI در ماهیان تیمار شده با 2 میکروگرم بر­گرم از 17بتا-استرادیول، مشابه با ماهیانی که دوزهای بالای نونیل فنل را دریافت کرده بودند افزایش یافت (جدول 1). از اینرو بنظر می رسد که 4-نونیل فنل به وسیله عملکردی مشابه با 17بتا-استرادیول اما با قدرت کمتر قادر به تحریک کبد به منظور سنتز ویتلوژنین و در نهایت افزایش اندازه آن می باشد. این افزایش در HSI به احتمال زیاد ناشی از تکثیر دستگاه گلژی و شبکه آندوپلاسمی جهت تولید و تغییر ویتلوژنین است که هایپرپلازی (Hyperplasia) (افزایش در تعداد سلول ها) و یا هایپرتروفی (Hypertrophy) ( بزرگ شدن بیش از اندازه سلول ها) سلول های کبدی را به دنبال دارد (2).

نتیجه گیری نهایی

نتایج بررسی حاضر نشان داد که نونیل فنل قادر به تحریک سنتز ویتلوژنین در جنس نر نابالغ ماهی شانک زرد باله است بطوریکه سطوح ویتلوژنین بطور معنی­داری در ماهیان تیمار شده با دوزهای مختلف از این ترکیب افزایش یافت. این افزایش در ماهیان تیمار شده با 17بتا-استرادیول نیز قابل مشاهده بود. همچنین نونیل فنل و 17بتا-استرادیول اثرات مشابهی را بر روی کبد ایجاد کردند. از اینرو احتمالاً اثرات مشاهده شده ناشی از توانایی نونیل فنل در اعمال اثر استروژیک بوده است. با توجه به نتایج به دست آمده از این تحقیق، انجام مطالعه محیطی بر روی ترکیبات مختل کننده اندوکرینی به ویژه نونیل فنل و اثرات آن بر روی ماهیان و سایر آبزیان منطقه خورموسی ضروری بنظر می رسد. در این میان ماهیان هرمافرودیت همانند شانک زردباله با دارا بودن مرحله حساس تمایز جنسی، از اهمیت بیشتری جهت مطالعه نسبت به سایر گونه ها برخوردار می باشد.

تشکر و قدر دانی

بخشی از این مطالعه با حمایت مالی مرکز پژوهش پتروشیمی بندر امام خمینی (ره) صورت پذیرفته است. نویسندگان مقاله­ی حاضر بر خود لازم می دانند از آقایان رضا صحراییان، احمد غبیشاوی و احمد نگین تاجی که در انجام مراحل مختلف این تحقیق ما را یاری نمودند تقدیر نمایند.

  1. Ahel, M., Giger, W., and  Schaffner, C., 1994. Behaviour of alkylphenol polyethoxylate  surfactants in the aquatic environment. II. Occurrence and transformation in rivers. Water Research. 28, 1143-152.
  2. Arukwe,  A., and Goksoyr,  A., 1998. Xenobiotics, Xenoestrogens and Reproduction Disturbances in Fish. Sarsia. 83, 225-241.
  3. Bjornsson, B. T., and Haux, C., 1985. Distribution of calcium, magnesium and inorganic phosphate in plasma of estradiol-17β treated rainbow trout. Jornal of Comparative Physiology. 155 B, 347-352.
  4. Burzawa-Gerard, E., and Dumas-Vidal, A., 1991. Effects of 17β-estradiol and carp gonadotropin on vitellogenesis in normal and hypophysectomized european silver eel (Anguilla anguilla) employing a homologous radioimmunoassay for vitellogenin. General Comparative Endocrinology. 84, 264-276.
  5. Carragher, J. F., and Sumpter, J. P., 1991. The mobilization of calcium from calcified tissues of rainbowtrout (Oncorhynchus mykiss) induced to synthesize vitellogenin. Comparative Biochemistry and Physiology. A 99, 169-172.
  6. Casini, S., Fossi, M. C., Mori, G., and Bjornstad, A., 2002. Vitellogenin induction in Cyprinus carpio treated with 17β-estradiol and 4-nonylphenol. Environmental Monitoring and Assessment. 75, 235-239.
  7. Christensen, L. J., Korsgaard, B., Bjerregaard, P., 1999. The effect of 4-nonylphenol on the synthesis of vitellogenin in the flounder (Platichthys flesus). Aquatic Toxicology. 46, 211-219.
  8. Christiansen, T., Korsgaard, B., and Jespersen, A., 1998. Induction of vitellogenin synthesis by nonylphenol and 17β-estradiol and effects on the testicular structure in the eelpout (Zoarces viviparous). Marine Environmental Research. 46, 141-144.
  9. Denslow, N. D., Chow, M. C., Kroll, K. J., and Green, L., 1999. Vitellogenin as a biomarker of exposure for estrogen or estrogen mimics. Ecotoxicology. 8, 385-398.

10. Flouriot, G., Pakdel, F., and Valotaire, Y., 1995. Influence of xenobiotics on rainbow trout liver estrogen receptor and vitellogenin gene expression. Jornal of  Molecular Endocrionology. 15, 143-151.

11. Follett, B. K., and Redshaw, M. R., 1974. The physiology of vitellogenesis. In: Lofts B (ed) Physiology of the amphibia, vol 2. Academic Press, New York PP: 219-308.

12. Giesy, J. P., Pierens, S. L., Snyder, E. M., Miles-Richardson, S. M., Kramer, V. J., Snyder, S. A., Nichols, K. M., and Villeneuve, D. L., 2000. Effects of 4-nonyl phenol on fecundity and biomarkers of estrogenicity in fathead minnows (Pimephales promelas). Environmental Toxicology and Chemistry. 19, 1368-1377.

13. Gillespie, D. K., and Peyster, A. D., 2004. Plasma calcium as a surrogate measure for vitellogenin in fathead minnows (Pimephales promelas). Ecotoxicology and Environmental Safety. 58, 90-95.  

14. Hallgren, P.,  Martensson, A., and Mathiasson, L., 2009. Improved spectrophotometric vitellogenin via alkali-labile phosphate in fish plasma-a cost effective approach for assessment of endocrine disruption. International Journal of Environmental  Analytical Chemistry. 89, 1023-1042.

15. Heppell, S. A., Denslow, N. D., Folmar, L. C., and Sullivan, C. V., 1995. Universal Assay of Vitellogenin as a Biomarker for Environmental Estrogens. Environmental Health Perspective. 103, 9-15.

16. Hesp, S. A., Potter, I. C., and Hall, N. G., 2004. Reproduction biology and protandrous experimental or field exposure in the gills and the hermaphroditism in Acanthopagrus latus. Environmental Biology of Fishes. 70, 252-272.

17. Jobling, S., Sheahan, D. A., Osborne, J. A., Matthiessen, P., and Sumpter, J. P., 1996. Inhibition of testicular growth in rainbow trout (Onchorynchus mykiss) exposed to estrogenic alkylphenolic chemicals. Environmental Toxicology and Chemistry. 15, 194-202.

18. Jobling, S., and Sumpter, J. P., 1993. Detergent components in sewage effluent are weakly oestrogenic to fish: an in vitro study using rainbow trout (Onchorynchus mykiss) hepatocytes. Aquatic Toxicology. 27, 361-372.

19. Kinnberg, K., Korsgaard, B., Bjerregaard, P., and Jespersen, A., 2000. Effects of nonylphenol and 17β-estradiol on vitellogenin synthesis and testis morphology in male platyfish (Xiphophorus maculates). Jornal of  Expreimental Biology. 203, 171-181.

20. Korsgaard, B., Emmersen, J., and Petersen, I. M., 1983. Estradiol induced hepatic protein synthesis and transaminase activity in the male flounder (Platichthys flesus). General Comparative Endocrinology. 50, 11-17.

21. Korte, J. J., Kahl, M. D., Jensen, K. M., Pasha, M. S., Parks, L. G., LeBlanc, G. A., and Ankley, G. T., 2000. Fathead minnow vitellogenin: Complementary DNA sequence and messenger RNA and protein expression after 17β-estradiol treatment. Environmental Toxicology and Chemistry. 19,972-981.

22. Kramer, V. J., Richardson, S. M., Pierens, S. L., and Giesy, J. P., 1998. Reproductive impairment and induction of alkaline-labile phosphate, a biomarker of estrogen exposure, in fathead minnows (Pimephales promelas) exposed to waterborne 17β-estradiol. Aquatic Toxicology. 40, 335-360.

23. Lee, H. B., 1999. Review of analytical methods for the determination on nonylphenol and related compounds in environmental samples. Quality Research Journal of Canada. 34, 3-35.

24. Maguire, R. J., 1999. Review of the persistence of nonylphenol and nonylphenol ethoxylates in aquatic environments. Water Quality Research Journal of Canada. 34, 37-78.

25. McCormick, S. D., O’Dea, M. F., Moeckel, A. M., Lerner, D. T., and Bjornsson, B. T., 2005. Endocrine disruption of parr-smolt transformation and seawater tolerance of Atlantic salmon by 4-nonylphenol and 17β-estradiol. General Comparative Endocrinology. 142, 280-288.

26. Meucci, V., and Arukwe, A., 2005. Detection of vitellogenin and zona radiata protein expressions in surface mucus of immature juvenile Atlantic salmon (Salmo salar) exposed to waterborne nonylphenol. Aquatic Toxicology. 73, 1-10.

27. Mills, L. J., and Chichester, C., 2005. Review of evidence: Are endocrine-disrupting chemicals in the aquatic environment impacting fish populations?. Science of the Total Environment. 343,1-34.

28. Mills, L. J., Gutjahr-Gobell, R. E., Haebler, R. A., Horowitz, D. J. B., Jayaraman, S., Pruell, R. J., McKinney, R. A., Gardner, G. R., and Zaroogian, G. E., 2001. Effects of estrogenic (o,p-DDT; octylphenol) and antiandrogenic (p,p-DDE) chemicals on indicators of endocrine status in juvenile male summer flounder (Paralichthys dentatus). Aquatic Toxicology. 52,157-176.

29. Mommsen, T. P., and Walsh, P. J., 1988. Vitellogenesis and oocyte assembly. In: Hoar, W.S., Randall, D.J. (Eds.), Fish Physiology, Vol. XI. The Physiology of Developing Fish, Part A. Academic Press, NewYork, PP: 347-405.

30. Monteverdi, G. H., and Di Giulio, R. T., 1999. An enzyme-linked immunosorbent assay for estrogenicity using primary hepatocytes cultures from the channel catfish (Octalurus punctatus). Archives of Environmental Contamination and Toxicology‏. 37, 355-375.

31. Pait, A. S., and Nelson, J. O., 2003. Vitellogenesis in male (Fundulus heteroclitus) (killifish) induced by selected estrogenic compounds. Aquatic Toxicology. 64, 331-342.

32. Purdom, C. E., Hardiman, P. A., Bye, V. J., Eno, N. C., Tyler, C. R., and Sumpter, J. P., 1994. Estrogenic effects of effluents from sewage treatment works. Chemical Ecology. 8, 275-285.

33. Sa, R., Pousao-Ferreira, P., and Oliva-Teles, A., 2006. Effect of dietary protein and lipid levels on growth nickel on glycogen reserves and protein levels in and feed utilization of white sea bream (Diplodus sargus) juveniles. Aquaculture Nutrition. 12, 310-321.

34. Segner, H., Navas, J. M., Schafers, C., and Wenzel, A., 2003. Potencies of estrogenic compounds in in vitro screening assays and in life cycle tests with zebrafish in vivo. Ecotoxicology and Environmental Safety .54, 315-322.

35. Snyder, S. A., Keith, T. L., Pierens, S. L., Snyder, E. M., and Giesy, J. P., 2001. Bioconcentration of nonylphenol in fathead minnows (Pimephales promelas). Chemosphere. 44, 697-702.

36. Soares, A., Guieysse, B., Jefferson, B., Cartmell, E., and Lester, J. N., 2008. Nonylphenol in the environment, A critical review on occurrence, fate, toxicity and treatment in wastewaters. Environment International. 34, 1033-1049.

37. Soto, A. M., Justica, H., Wray, J. W., and Sonnenshein, C., 1991. p-Nonyl-phenol: An estrogenic xenobiotic released from ‘modified’ polystyrene. Environmtal Health Perspective. 92, 167-173.

38. Thomas, K. V., Balaam, J., Hurst, M. R., and Thain, J. E., 2004. Identification of in vitro estrogen and androgen receptor agonists in North Sea offshore produced water discharges. Environmental Toxicology and Chemistry. 23, 1156-1163.

39. Tyler, C. R., Sumpter, J. P., and Bromage, N. R., 1988. In vivo uptake and processing of vitellogenin in the rainbow trout (Salmo gairdneri). Jornal of Experimental Zoology. 246, 171-179.

40. Vazquez-Duhalt, R., Marquez-Rocha, F., Ponce, E., Licea, A. F., and Viana, M. T., 2005. Nonylphenol, an integrated vision of a pollutant. Scientific review. Apply Ecology and Environment Research.4,1-25.

41. Verslyke, T., Vandenbergh, G. F., Versonnen, B., Arijs, K., and Janssen, C. R., 2002. Induction of vitellogenesis in 17α-ethinylestradiolexposed rainbowtrout (Oncorhynchus mykiss): a method comparison. Comparative Biochemistry Physiology. 132 C, 483-492.

42. Villeneuve, D. L., Villalobos, S. A., Keith, T. L., Snyder, E. M., Fitzgerald, S. D., and Giesy, J. P., 2002. Effects of waterborne exposure to 4-nonylphenol on plasma sex steroid and vitellogenin concentrations in sexually mature male carp (Cyprinus carpio). Chemosphere. 47, 15-28.

43. White, R., Jobling, S., Hoare, S. A., Sumpter, J. P., and Parker, M. G., 1994. Environmentally persistent alkylphenolic compounds are estrogenic. Endocrinology. 13, 175-182.