نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان
چکیده
هدف از این مطالعه بررسی تاثیر فلز سنگین کروم بر پارامترهای حرکتی اسپرم تاس ماهی ایرانی (Acipenser persicus) در شرایط آزمایشگاهی بود. بدین منظور مایع منی 10 تاس¬ماهی ایرانی جمع¬آوری و در مجاورت یخ به آزمایشگاه منتقل شد. نمونه-های اسپرم به مدت 2،0، 4، 24، 48 و 72 ساعت در معرض غلظت¬های 1/0 و 5 میلی¬گرم بر لیتر کروم قرار گرفتند سپس درصد اسپرم¬های متحرک و مدت زمان تحرک اسپرم اندازه¬گیری شد. نتایج نشان داد که غلظت کروم 5 میلی¬گرم بر لیتر بعد از 2 ساعت انکوباسیون، منجر به توقف کامل حرکت اسپرماتوزوئیدها شد در حالی که غلظت کروم 1/0 میلی¬گرم بر لیتر بعد از 48 و 72 ساعت، مدت زمان تحرک اسپرم را به¬طور معنی¬داری کاهش داد (05/0>P ). هر دو غلظت کروم درصد اسپرم¬های متحرک را نیز تحت تاثیر قرار داد. بنابراین با توجه به اهمیت تحرک اسپرم در تولید مثل، قرارگیری اسپرماتوزوئیدها در معرض کروم می¬تواند موفقیت تولید مثل را کاهش دهد.
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
A study on effect of Chromium on sperm motility of Persian Sturgeon (Acipenserpersicus)
نویسندگان [English]
Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources
چکیده [English]
This study was conducted to determine the effects heavy metal of Chromium on the motility parameters of Acipenser persicus sperm in vitro. For this evaluation semen samples were collected from 10 adult male broodstocks and were transported to the Central laboratory In the vicinity of ice. Then Sturgeon sperm were exposed for 0, 2, 4, 24, 48 and 72h to Chromium at0.1 and 5 mg L− 1 concentrations. After this times percentage off motile spermatozoa and Duration of motility measurement . The results revealed that 5 mg L− 1 concentration of Chromium stay of motility after 2 h Incubation whiles The consentration of 0.1 mg L− 1 Chromium significantly decreased sperm motility (p<0.05) in 48 and 72 h. Percentage of sperm motility significantly reduced in initial incubation and not significant at another time. In conclusion, changes of sperm motility influence the reproduction efficiency and can reduce the reproductive success in this fish.
کلیدواژهها [English]
بررسی تاثیر فلز سنگین کروم بر پارامترهای حرکتی اسپرم تاسماهی ایرانی
(Acipenser persicus)
شیدا گلی*، محمد رضا ایمانپور و گلی نوری
گرگان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی، دانشکده شیلات، گروه شیلات
تاریخ دریافت: 3/10/90 تاریخ پذیرش: 7/8/91
چکیده
هدف از این مطالعه بررسی تاثیر فلز سنگین کروم بر پارامترهای حرکتی اسپرم تاسماهی ایرانی (Acipenser persicus) در شرایط آزمایشگاهی بود. بدین منظور مایع منی 10 تاسماهی ایرانی جمعآوری ودر مجاورت یخ به آزمایشگاه منتقل شد. نمونه های اسپرم به مدت 0،2، 4، 24، 48 و 72 ساعت در معرض غلظتهای 1/0 و 5 میلیگرم بر لیتر کروم قرار گرفتند سپس درصد اسپرمهای متحرک و مدت زمان تحرک اسپرم اندازهگیری شد. نتایج نشان داد که غلظت کروم 5 میلیگرم بر لیتر بعد از 2 ساعت انکوباسیون، منجر به توقف کامل حرکت اسپرماتوزوئیدها شد در حالی که غلظت کروم 1/0 میلیگرم بر لیتر بعد از 48 و 72 ساعت، مدت زمان تحرک اسپرم را بهطور معنیداری کاهش داد (05/0>P ). هر دو غلظت کروم درصد اسپرمهای متحرک را نیز تحت تاثیر قرار داد. بنابراین با توجه به اهمیت تحرک اسپرم در تولید مثل، قرارگیری اسپرماتوزوئیدها در معرض کروم می تواند موفقیت تولید مثل را کاهش دهد.
واژههای کلیدی: تاسماهی ایرانی، کروم، درصد اسپرمهای متحرک، تحرک اسپرم
* نویسنده مسئول، تلفن: 09181708278 ، پست الکترونیکی: golisheyda@gmail.com
مقدمه
تاسماهیان به عنوان ماهیان در معرض خطر انقراض دسته بندی شدهاند. جمعیت این ماهیها اخیرا به دلیل صید بی رویه، تخریب زیستگاههای طبیعی به علاوه افزایش آلودگیها در حال کاهش است. بالا بودن سن بلوغ جنسی این ماهیها زمینه را برای تجمع فلزات سنگین در اندامها، بهویژه اندامهای تولید مثلی فراهم میسازد. در سالهای اخیر استفاده از اسپرم در شرایط آزمایشگاهی جهت بررسی اثرات این نوع آلودگیها افزایش یافته است. متاسفانه اطلاعات در مورد تاثیر فلزات سنگین بر سیستم تولید مثلی تاسماهیان محدود میباشد(18).
امروزه فلزات سنگین منبع مهم آلودگی برای موجودات آبزی هستند (6). در این میان کروم یکی از شایعترین آلودگیهای زیست محیطی است که به صورت نامحلول در صخرهها، گیاهان و خاک وجود دارد. افزایش صنایع و دیگر فعالیتهای مربوط به تکامل بشر منجر به انحلال پذیری کروم شده است که به آسانی از خاک به آبهای زیرزمینی و آبهای سطحی شسته میشود. فرم شش ظرفیتی کروم به عنوان شکل سمی آن مطرح است، از این نظر که میتواند به آسانی از غشای سلول عبور کند، وارد سلولشود و به فرم سه ظرفیتی تبدیل میگردد. کروم در این فرم به مولکولهای داخل سلولی متصل شده و در نهایت موجب ایجاد جهش و تغییرات ژنتیکی میگردد (11). سیستم تولید مثلی جنس نر ماهی نسبت به اثرات مضر فلزات سنگین حساستر از جنس ماده میباشد) 19). کیفیت اسپرم معمولاً توسط شدت تحرک، درصد اسپرمهای متحرک و مدت زمان حرکت رو به جلوی اسپرم ارزیابی میگردد (5). تماس ماهیها با فلزات سنگین موجب کاهش شدید پارامترهای حرکتی اسپرم شده و در غلظتهای بالا در کمتر از یک دقیقه به طور کامل حرکات اسپرم را متوقف میسازد ( 22). توانایی لقاح در ماهی به قابلیت اسپرم در حرکت سریع و مناسب برای پیدا کردن تخم بعد از رها سازی در آب بستگی دارد (12). بنابراین آلودگی به فلزاتسنگین به دلیل ایجاد تغییر در سرعت حرکت اسپرم ممکن است کاهش معنیداری در موفقیت لقاح ایجاد کند (18). به دلیل اینکه سلولهای جنسی بیشتر ماهیان وارد آب میشود و میتواند به صورت مستقیم قبل از باروری در معرض آلودگی قرار گیرد، بنابراین ارزیابی اثرات مضر آلودگی فلزات سنگین روی ماهیها به نظر مهم میآید (12). اگر چه مطالعاتی در مورد تاثیر آلایندهها بر تخمک ماهیان انجام شده (13و14)، اما تخمک ماهیان نمیتواند شاخص زیستی مناسبی محسوب شود، زیرا بررسی کیفیت آن متضمن گذشت زمان و بدست آوردن دادههای حاصل از آزمایش لقاحپذیری است (5). کیفیت اسپرم فاکتوری کلیدی در تولید مثل و لقاح موفق محسوب میشود (16). بنابراین اولین قدم در ارزیابی میزان بازدهی تولید مثل ماهیان در مواجهه با آلایندهها، بررسی وضعیت تحرک اسپرماتوزوآی آنها می باشد (21). اسپرم ماهیان در بیضه و لولههای اسپرمبر بیحرکت بوده و پس از ورود به محیط آبی با جذب آب و تنظیم اسمولاریته، قابلیت حرکت را به دست میآورد، اما در کمتر از سه دقیقه حرکات خود را از دست میدهد (7 و20). این قابلیت اسپرم ماهیان، شرایط مناسبی را جهت انجام آزمایشاتی که نیاز به انکوبه کردن اسپرم با مواد مختلف و در زمانهای مختلف دارد، فراهم میسازد. می توان اسپرم آنها را بدون تغییر در فاکتورهای حرکتی برای مدتی همراه با فلزات سنگین در خارج از بدن انکوبه کرد و سپس با فعال نمودن اسپرمها توسط مواد فعال کننده در زیر میکروسکوپ دوربیندار نسبت به ضبط حرکات و آنالیز آنها اقدام نمود (20).
با توجه به طولانی بودن دوره تولید مثلی تاسماهیان، بررسی اثرات آلودگی بر کیفیت گامتها مشکل و پر هزینه میباشد، بنابراین در مطالعهی حاضر تلاش شده است که اثرات فلز سنگین کروم بر پارامترهای حرکتی اسپرم قره برون در شرایط آزمایشگاهی بررسی شود.
مواد و روشها
مولدین تاسماهی ایرانی در فروردین و اردیبهشت سال 1390، بعد از صید در سواحل جنوب شرقی دریای خزر به مرکز تکثیر و پرورش ماهیان خاویاری شهید مرجانی منتقل گردیدند، سپس 10 عدد تاسماهی ایرانی نر با طول متوسط 7±150 سانتیمتر و وزن 3/1± 13 کیلوگرم انتخاب شد و مایع منی آنها 24 ساعت بعد از تزریق با عصاره هیپوفیز و حصول اطمینان از فعال بودن آنها با استفاده از سرنگهای استریل 5 میلیلیتری جمعآوری گردید. از آنجا که اسپرم تاسماهی ایرانی به محض تماس با آب شیرین فعال میگردد (9) قبل از جمعآوری مایع منی، جهت جلوگیری از آلوده مایع منی با خون و ادرار، بدن و سوراخ تناسلی ماهیان با دستمال خشک گردید. سپس با فشار آرام به ناحیه شکمی، مایع منی جمع آوری گردید.
نمونههای تهیه شده به صورت جداگانه در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد و در مدت کمتر از 3 ساعت جهت انجام آزمایشات مربوطه به آزمایشگاه منتقل گردیدند.
مایع منی همه ماهیان را با هم مخلوط کرده و سپس با میکروسمپلر مقادیر 1 میلیلیتری از آن را در میکروتیوبهای 5/1 میلیلیتری ریخته و به مدت 3 دقیقه در دمای 4 درجه و با دور 2000 دور در دقیقه سانتریفوژ گردید. سپس مایع رویی حاصله (سوپرنتنت) جمعآوری و به نسبت 1:1، محلول نگهدارنده (20 میلیمول تریس، 10 میلیمول کلرید پتاسیم، 8= PH) به آن اضافه شد. میکروتیوبهای حاوی اسپرم و محلول نگهدارنده تا زمان در معرضگذاری با فلز کروم در یخچال نگهداری شدند.
نمونههای اسپرم در شرایط دمایی 4 درجه سانتیگراد به مدت 0،2،4، 24، 48 و 72 ساعت در معرض غلظتهای 1/0 و 5 میلیگرم بر لیتر کروم قرار گرفتند. در این مدت، تحرک اسپرمها توسط ماده نگهدارنده حفظ میشد.
به منظور فعال نمودن حرکت اسپرمها برای اندازه گیری طول دوره تحرک و درصد اسپرمهای متحرک از محلول فعال کننده (10 میلی مول تریس، 20 میلی مول نمک، 2 میلی مول کلسیم کلرید،5/8PH=) با نسبت رقیق سازی 1 به 2000 در دمای اتاق (22درجه سانتی گراد) استفاده شد. حرکت اسپرم با تاخیر زمانی کمتر از 7 ثانیه بعد از شروع فعالیت، با میکروسکوپ فازکنتراست و با عدسی چشمی 40 ثبت گردید (23). اندازهگیری میزان حرکت برای هر تیمار و در هر زمان، در سه تکرار انجام شد. برای اندازهگیری درصد اسپرمهای متحرک پس از ثبت توسط دوربین، با فاصله زمانی 20 صدم ثانیه توسط نرم افزار آدوب پریمر (Adobe Premiere) عکس برداری شد و درصد اسپرمهای متحرک اندازهگیری شد.
تجزیه و تحلیل دادهها: بررسی نتایج از طریق آزمون آنالیز واریانس یکطرفه و مقایسه میانگین تیمارها با استفاده از آزمون دانکن در سطح اطمینان 5 درصد صورت گرفت. رسم نمودارها نیز با استفاده از نرمافزار EXCEL انجام شد.
نتایج
نتایج حاصل از جدول آنالیز واریانس نشان داد که اثر زمان، غلظت کروم و اثر متقابل آنها بر تحرک اسپرم معنی دار بود (جدول 1).
جدول 1- آنالیز واریانس طول دوره تحرک اسپرم
جدول 2- طول دوره تحرک اسپرم ماهی قرهبرون تحت تاثیر غلظت کروم در زمانهای مختلف اندازهگیری
72 |
48 |
24 |
4 |
2 |
0 |
زمان (ساعت) تیمار |
6/10±7/29ef |
57±7de |
7/157±6/28bc |
3/175±5/17 bc |
3/201±2/36ab |
a 2/55 ±224 |
شاهد |
74/8±7/42ef |
7/49±5/12e |
154±6/37c |
3/159±1/10bc |
7/168±9/42bc |
3/161±3/11bc |
کروم1/0 |
0±0f |
0±0f |
0±0f |
0±0f |
3/30±8/17ef |
7/91±22d |
کروم5 |
مقادیر به صورت میانگین± انحراف معیار بیان شدهاند. حروف مشابه نشاندهنده عدم اختلاف معنیدار میباشد (05/0= α).
طبق نتایج حاصل از آزمون دانکن، در لحظه اول تماس اسپرم با غلظت های 1/0 و 5 میلیگرم بر لیتر کروم، طول دوره تحرک اسپرم در هر دو گروه نسبت به گروه شاهد کاهش معنیداری را نشان داد (05/0p< ). در حالی که با افزایش زمان در معرضگذاری، طول دوره تحرک اسپرم تنها در تیمار 5میلیگرم بر لیتر نسبت به گروه شاهد کاهش معنیداری را نشان داد (05/0p< ). بطوری که بعد از 2 ساعت، طول دوره تحرک اسپرم در این تیمار به صفر رسید (جدول 2).
بررسی روند تغییر دوره تحرک اسپرم در تیمار، با غلظت کروم 1/0 میلیگرم بر لیتر نشان داد میزان تحرک اسپرم در زمانهای صفر، 2 ساعت، 4 ساعت و 24 ساعت بعد از در معرضگذاری اختلاف معنیداری نداشتند (05/0P >). اما بعد از 48 ساعت کاهش معنیداری در مدت زمان تحرک اسپرم مشاهده شد (05/0p< ) و تا پایان دوره آزمایش تغییر معنیداری را نشان نداد (05/0P >) (شکل 1).
شکل1- نمودار طول دوره تحرک اسپرم درتیمار با غلظت 1/0 میلیگرم بر لیتر کروم در طی زمانهای مختلف.
بررسی روند تغییر دوره تحرک اسپرم در تیمار با غلظت کروم 5 میلیگرم بر لیترنشان داد این غلظت تاثیر نسبتاً شدیدتری روی تحرک اسپرم داشت و اسپرمها فقط در زمانهای صفر و 2 ساعت قابلیت تحرک داشتند و بعد از آن به صورت کامل متوقف شدند (شکل 2).
شکل 2- نمودار دوره تحرک اسپرم در تیمار با غلظت 5 میلیگرم بر لیتر کروم در زمانهای مختلف.
درصد اسپرمهای متحرک در هر دو تیمار با غلظت 1/0 و 5 میلیگرم برلیتر کروم در لحظات اولیه در معرضگذاری نسبت به گروه شاهد بطور معنیداری کاهش یافت که این کاهش در تیمار با غلظت 5 میلیگرم برلیتر کروم نسبت به غلظت 1/0 میلیگرم برلیتر بطور معنیداری بالاتر بود. اما بعد از گذشت 2 ساعت تا پایان دوره آزمایش، درصد اسپرمهای متحرک تنها در تیمار با غلظت 5 میلیگرم برلیتر کروم نسبت به گروه شاهد کاهش را نشان داد بطوری که بعد از گذشت 2 ساعت این میزان به صفر رسید. در حالی که تیمار با غلظت 1/0 میلیگرم برلیتر کروم اختلاف معنیداری را با گروه شاهد نشان نداد (05/0P >). طبق نتایج حاصله حساسیت اسپرماتوزوئیدها در مواجه با کروم در دقایق اولیه انکوباسیون قابلتوجه بوده و با افزایش غلظت کروم، درصد اسپرمهای متحرک کاهش معنیداری را نسبت به گروه شاهد نشان داد. برای کروم 5 میلیگرم بر لیتر بعداز 2 ساعت انکوباسیون هیچ اسپرمی قابلیت حرکت نداشت. اما در کروم 1/0 میلیگرم بر لیتر فقط در ساعات اولیه انکوباسیون حساسیت بالا بود و با شاهد اختلاف معنیدار داشت، بطوریکه در زمانهای بعدی انکوباسیون تفاوت معنیداری را با شاهد نشان نداد (شکل 3).
شکل 3- نمودار تغییر درصد اسپرمهای متحرک در غلظتهای مختلف کروم.
بحث و نتیجهگیری
فلزات سنگین به طرق مختلف میتوانند سلولهای جنسی آبزیان را تحت تاثیر قرار دهند. شدت این اثرات و حساسیت اسپرمها در گونههای مختلف و نسبت به انواع فلزات سنگین میتواند متغییر باشد (17). در قزلآلای رنگین کمان (Oncorhynchus mykiss) که اسپرم و تخمک آنها در معرض غلظت 5 میکروگرم در لیتر کروم قرار گرفته بود کاهش معنیداری در درصد لقاح مشاهده شد (8). این در حالی بود که غلظتهای 0 تا 266 میکروگرم در لیتر کروم تفاوت معنیداری در درصد لقاح ماهیان چینوک (Oncorhynchus tshawytscha) ایجاد نکرده بود (11). همچنین تحقیقات انجام شده در پستانداران از جمله موشها نشان داده است که، تغذیهی موشها با اکسید کروم 10 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن باعث کاهش معنیدار در تعداد اسپرمهای موجود در اپیدیدیم و افزایش تعداد اسپرمهای غیر طبیعی و ناقص شده بود )19).
اسپرم آبزیان بعد از رهاسازی در آب فرصت زیادی برای زندهمانی ندارند. بنابراین موفقیت لقاح آنها میتواند تحت تاثیر فلزات سنگین موجود در محیط آبی قرار گیرد (11). در مطالعات متعددی بیان شده است که قدرت تحرک اسپرمها در صورت افزایش رادیکالهای آزاد و محصولات نهایی روند LPO (پراکسیداسیون چربیها Lipid Peroxidation, LPO) درمحیط بطور معنیداری کاهش مییابد (2). بدنبال تأثیر LPO اختلالات عملکردی زیادی در سلولهای اسپرم پدیدار میگردد، که میتوان به کاهش قدرت تحرک اسپرم و اختلالات جدی در غشاء سلول، مهار فعالیت آنزیمها و ایجاد شکستگی در DNA سلول های اسپرم اشاره نمود (3). طبق مطالعهی صورت گرفته توسط زی و همکاران فلز سنگین کروم، با افزایش سطح LPO سلول اسپرم و کاهش فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدان باعث مهار قدرت حرکتی اسپرم میشود. همچنین ورود این فلز به درون سلول اسپرم و اتصال آنها با رشته های پروتئینهای موثر در حرکت مناسب و متقارن اسپرم یا با آنزیمهای موثر در متابولیسم سلول اسپرم می تواند باعث کاهش یا توقف حرکت اسپرم و به دنبال آن کاهش درصد لقاح شوند (18).
در این مطالعه اثرات سمی کروم بر تحرک اسپرماتوزوئیدها کاملا مشهود بود، و نشان داده شد که کروم با غلظت 5 میلیگرم بر لیتر نسبت به غلظت 1/0 تاثیر شدیدتری بر تحرک اسپرماتوزوئیدها داشته است. تحرک اسپرمها در 2 ساعت اول در معرضگذاری به صورت معنیداری کاهش یافته بودند که این نتایج با نتایج زی و همکاران (18) که تاثیر فلزات سنگین کروم و کادمیوم را بر تحرک اسپرم تاسماهی استرلیاد (Acipenser ruthenus) بررسی کرده بودند همخوانی دارد. حساسیت نسبتاً بالای اسپرماتوزوئیدها نسبت به غلظت بالای کروم زمانی که درصد اسپرمهای متحرک کاهش یافته بود میتواند به دلیل کاهش میزان ذخایر انرژی، تحلیل قدرت میتوکندریایی و ناهنجاریهای حرکت و اختلالات متابولیسمی باشد(24).
مطالعات صورت گرفته در دیگر فلز سنگین از جمله مس نشان میدهد که این فلز در غلظتهای بالای 100 میلیگرم در لیتر قادر به تاثیرگذاری بر میزان تحرک اسپرم در ماهی Dicentrarchus labrax شده است. کادمیوم نیز در غلظت 1 میلیگرم در لیتر باعث توقف تعدادی از پارامترهای حرکتی اسپرم گربه ماهی آفریقایی( Clarias gariepinus) شده بود (15) و در غلظت 100 میلیگرم در لیتر توقف کامل را در اسپرم قزلآلای رنگین کمان، استورژن و استرلیاد ایجاد کرده بود. بررسیهای صورت گرفته در مورد جیوه نیز نشان داده است که جیوه میتواند باعث ایجاد اختلال در مکانیزمهای تنفسی اسپرم، قطع ارتباط سر اسپرم با قطعهی میانی و در نهایت مرگ سریع آنها شود (10). در بعضی از مطالعات افزایش اندازهی سر اسپرم در قزلآلای رنگین کمان، کپور معمولی (Cyprinus carpio) و گربه ماهی آفریقایی در اثر تماس با فلزات سنگین گزارش شده است (1).
علاوه بر شاخص طول دوره تحرک اسپرماتوزوآی ماهیان- که یکی از خصوصیات مهم در لقاح موفقیتآمیز عنوان شده است- توجه به شاخص تراکم اسپرمها و یا به عبارتی درصد اسپرمهای متحرک، نیز میتواند نتایج قابل قبولی در ارزیابی کیفیت اسپرماتوزوآی ماهیان فراهم سازد(4). همان طور که نتایج نشان داد درصد اسپرم های متحرک نیز تحت تاثیر کروم قرار گرفت و در غلظت بالا (5 میلیگرم بر لیتر) بعد از گذشت 2 ساعت انکوباسیون هیچ اسپرمی قابلیت حرکت نداشت.
اگرچه اثرات کوتاه مدت فلزات سنگین روی سیستم تولید مثلی تاسماهیان در محیط طبیعی بطور دقیق مشخص نیست، اما بر اساس مطالعات صورت گرفته، با استفاده از اسپرم در شرایط آزمایشگاهی نیز میتواند اثرات احتمالی فلزات سنگین را روی پارامترهای حرکتی اسپرم پیش بینی کرد (18). با توجه به نتایج حاصل از این مطالعه، اهمیت جلوگیری از آلوده شدن زیستگاههای طبیعی تاسماهیان نسبت به کروم و همچنین جلوگیری از بالا رفتن غلظت این ترکیبات در مکانهای تولید مثلی این ماهیان، لازم و ضروری به نظر میرسد.
تشکر و قدردانی
بدینوسیله از همکاری صمیمانه مسئولین مرکز تکثیر و پرورش ماهیان خاویاری شهید مرجانی بخصوص جناب آقای مهندس شهریاری، همچنین از راهنماییهای جناب آقای دکتر سید علی جوهری و سرکار خانم مهندس مرضیه ابوالفتحی تشکر میگردد.