اثر کافئین بر روند یادگیری و حافظه متعاقب القای دمیلیناسیون با لیزولسیتین در موش صحرایی نر

ندا دشت بزرگی و شیوا خضری^*

ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 31/3/92               تاریخ پذیرش: 26/7/93 

چکیده

کافئین به عنوان آنتاگونیست رسپتورهای آدنوزینی بوده و می­تواند باعث حفاظت سیستم عصبی شود. هدف از این مطالعه، بررسی اثر کافئین بر اختلال یادگیری و حافظه القا شده متعاقب تزریق درون هیپوکامپی لیزولسیتین در موش های صحرایی نر می­باشد. حیوانات به سه گروه آزمایشی تقسیم شدند. 1. کنترل، 2. گروه بیمار که لیزولسیتین در ناحیه شکنج دندانه دار هیپوکامپ آنها برای ایجاد دمیلیناسیون تزریق شد 3. گروهی تحت تیمار که بعد از تزریق لیزولسیتین در هیپوکامپ، کافئین را به صورت داخل صفاقی و با دوز mg/kg30 به مدت 28 روز دریافت کردند. مطالعه رفتاری توسط دستگاه ماز شعاعی طی سه دوره 7 روزه انجام گرفت. لیزولسیتینن، باعث اختلال حافظه و یادگیری در رت­ها شد که این اختلال در روزهای 5 ام تا 28 ام بعد از تزریق لیزولستین چشمگیر بود. تزریق روزانه کافئین باعث بهبود روند یادگیری و حافظه بویژه در روزهای 14ام تا 28ام شد. نتایج حاصل پیشنهاد می­کند که تیمار با کافئین می­تواند باعث بهبود حافظه در عارضه­های نورولوژیکی مثل دمیلیناسیون باشد.

واژه های کلیدی: لیزولستین، کافئین، هیپوکامپ، حافظه، رت

* نویسنده مسئول، تلفن: 04432752740، پست الکترونیکی: sh.khezri@urmia.ac.ir

مقدمه

مالتیپل اسکلروزیس(MS)، بیماری خودایمنی مربوط به سیستم عصبی مرکزی است که وقایعی همچون تخریب آکسونی، دمیلینه شدن سلول­های عصبی، اختلال سدخونی مغزی، نفوذ ماکروفاژها و لنفوسیت­ها و التهاب سیستم عصبی را در پی دارد (16). سلول­های عصبی، از طریق ارسال پیام­های الکتریکی در طول فیبر آکسونی که توسط غلاف میلین پوشیده شده است با یکدیگر ارتباط دارند. در بیماری MS، سیستم ایمنی بدن به غلاف میلین حمله می کند. با تخریب غلاف میلین یا خود فیبر عصبی، توانایی هدایت ایمپالس­های الکتریکی از سیستم عصبی مرکزی به اندام و بالعکس مختل می­شود و این عامل نشانه­های مختلف مربوط به بیماری را در فرد ایجاد می­کند (23). مالتیپل اسکلروزیس، یک بیماری غیرقابل پیش­بینی است که در جوامع مدرن رو به افزایش است. معمولاً در افراد جوان با میانگین سنی20-40 سال رخ می­دهد و در زنان شایع­تر است (27).

اگرچه علت دقیق بیماری MS ناشناخته مانده است، ایمنی اکتسابی شامل پاسخ سلول­هایT  وB  مراحل اولیه بیماری را تعیین می­کند. لنفوسیت­هایB  و T از سد خونی – مغزی عبور می­کنند به طوریکه غلاف میلین را به عنوان ماده بیگانه شناسایی کرده و آن را تخریب می­کنند و منجر به دمیلینه شدن آکسونها و فیبرهای عصبی می­شوند (10). مکانیسم­های ایمنی ذاتی نیز همراه با فعالیت ماکروفاژها و میکروگلیا، نقش محوری در شروع و پیشرفت بیماری از طریق آزاد کردن فاکتورهای التهابی مثل سیتوکین­ها و کموکاین­ها و نیز گونه­های آزاد اکسیژن و نیتروژن دارد (9). از نشانه­های شایع این بیماری، اختلال در عملکردهای شناختی از جمله حافظه، دقت و توجه، سرگیجه، افسردگی و عدم تعادل است.

تعدادی مدل آزمایشگاهی برای مطالعه عارضه دمیلینه کننده وجود دارد. مدل ویروسی، مدل التهاب مغزی خود ایمنی (EAE) و مدل آسیب شیمیایی (19). در میان مدل­های توکسیک و شیمیایی، استفاده از لیزولسیتین باعث دمیلینه شدن موضعی ماده سفید و خاکستری سیستم عصبی مرکزی می­شود. لیزولسیتین­ها، ترکیبات شیمیایی مشتق از فسفاتیدیل کولین­ها می­باشند که یکی از گروه­های اسیدچرب در آن­ها جابه­جا شده است و برای سلول­های میلین ساز سیستم عصبی سمی هستند (6).

 کافئین، یک آلکالوئید متبلور و تلخ و یکی از اعضای خانواده متیل گزانتین­هاست که ذاتاً ضد التهاب بوده و در برگ های چای (سبز، سیاه، قرمز)، دانه­های قهوه و تولیدات دارویی وجود دارد (11). این ماده به طور گسترده در سراسر بدن منتشر می­شود و در کبد به متابولیت­های اصلی کافئین مثل پاراگزانتین، تئوبرومین و تئوفیلین متابولیزه می­شود که این ترکیبات نیز اثرات عمده­ای بر سیستم عصبی و ایمنی بدن دارند (12). کافئین به علت دارا بودن خواص لیپوفیلیکی به راحتی از سد خونی مغزی عبور می­کند و بعنوان آنتاگونیست گیرنده­های آدنوزینی، اثرات بیوشیمیایی و رفتاری متعدد و پیچیده­ای در سیستم عصبی مرکزی دارد، از جمله باعث افزایش سطح cAMP و نوروترانسمیترهای نورآدرنالین و استیل کولین و نیز مهار گیرنده­های گابا وآنزیم فسفودی استراز می­شود (30). بسیاری از اثرات حفاظتی کافئین از طریق فعال کردن پروتئین کینازA  و افزایش cAMP اعمال می­شود (13). تعدادی از مطالعات حاکی از این است که کافئین به عنوان مهارکننده آنزیم فسفودی استراز و آنتاگونیست گیرنده­های آدنوزینی، می­تواند جنبه­های متفاوت و متنوع پاسخ­های ایمنی ذاتی و اکتسابی را تعدیل کند (14)، از جمله تولید سیتوکاین­های التهابی، تولید رادیکالهای آزاد، تکثیر لنفوسیت­ها (15) و نیز آپوپتوزیس را کاهش می­دهد. کافئین بعنوان یکی از معمول­ترین محرک های روانی شناخته می­شود که بقا وتکثیر سلول­های زایای عصبی را تحت تاثیر قرارداده و باعث افزایش نوروژنز در هیپوکامپ می­شود (33). هیپوکامپ، بخش مهمی از سیستم لیمبیک است که در یادگیری و انواع حافظه نقش دارد. این ساختار، شدیداً در مقابل عارضه­های نورولوژیکی مختلف و تخریب اکسیداتیو آسیب­پذیر است (19). تزریق لیزولسیتین درون هیپوکامپ باعث تخریب میلین می­شود (20). وجود پروسه دمیلیناسیون براساس تزریق درون هیپوکامپی لیزولسیتین یک مدل مناسب برای بررسی اثر مواد موثر بر عارضه دمیلیناسیون مثل MS است. تحقیق حاضر به این سوال پاسخ می­دهد که آیا تیمار با کافئین می­تواند باعث بهبود اختلال یادگیری و حافظه فضایی موش صحرایی بعد از تزریق درون هیپوکامپی لیزولسیتین شود.

مواد و روشها

در این تحقیق از 30 رأس رت نر بالغ از نژاد ویستار در محدوده وزنی (g250-200)، استفاده شد. حیوانات از انستیتو پاستور ایران خریداری شدند و در دمای کنترل شده اتاق (2±23درجه سانتی گراد) با 12ساعت تاریکی – روشنایی و غذا و آب کافی نگهداری می­شدند. در این مطالعه کلیه موازین اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی طبق قوانین مصوب کمیته اخلاق در پژوهش­های پزشکی رعایت شد.  

موش­ها به صورت عمیق با تزریق داخل صفاقی کتامین (mg/kg10) و زایلازین ( mg/kg2) بیهوش شده و در دستگاه استرئوتاکس (Stoelting, USA) در موقعیت جمجمه مسطح مستقر گردیدند. پوست ناحیه سر به حداقل میزان، برش داده شده، پس از کنار زدن بافت­های پوششی اطراف، نواحی برگما و لامبدا شناسایی شده و براساس مختصات ذکر شده در اطلس پاکسینوس ناحیه مربوط به شکنج دندانه­دار هیپوکامپ در سطح جمجمه مشخص گردید و کانول­گذاری انجام شد.

 کانول­های راهنما از سرسوزن­های G23 دندان­پزشکی تهیه شدند که در ناحیهDG  هیپوکامپ بر طبق اطلس پاکسینوس با مختصات 8/2- =AP نسبت به براگما، 8/1± =ML و 5/2 + =DV از سطح جمجمه قرارگرفتند. کانول ها توسط سیمان دندان­پزشکی و بافر فوری بر روی جمجمه ثابت شدند. جهت تزریق درون مغز نیز از سر سوزن-های G30 دندان­پزشکی و لوله پلی­اتیلن شماره 10 با طول 20 سانتی­متر متصل به سرنگ همیلتون، استفاده شد. فرآیند تخریب میلین توسط تزریق 2 میکرولیتر لیزولسیتین %1 درسالین 9/0% با سرعت یک میکرولیتر در دقیقه در ناحیهDG  هیپوکامپ انجام شد. رت­ها به گروه­های تحت آزمایش شامل: 1- کنترل (که فقط جراحی شدند)، 2- گروه­های بیمار (LPC) که تحت جراحی قرار گرفتند و سپس 2 میکرولیتر لیزولسیتین در ناحیهDG  هیپوکامپ آن­ها تزریق شد بدون اینکه تیماری دریافت کنند. 3- گروه­های تحت تیمار (LPC+CAF) که جراحی شدند و بعد از تزریق 2 میکرولیتر لیزولسیتین در هیپوکامپشان، کافئین را با دوز mg/kg 30 بصورت درون صفاقی به مدت 28 روز دریافت کردند.

بررسی رفتاری: بعد از طی یک هفته دوره نقاهت، یعنی زمانیکه محل جراحی بهبود یافت، مراحل آموزش با استفاده از دستگاه ماز شعاعی 8 بازویی انجام شد. این ماز از یک سکوی مرکزی با بازوهای شعاعی تشکیل یافته است که 8، 12 یا 16 بازو از سکوی مرکزی به صورت شعاعی جدا می­شوند. در این تست، پاداش (غذا) در انتهای یک بازو قرار داده می­شود. این بازو در طول ترایل­ها، حاوی غذا باقی می­ماند. بعد از محرومیت از غذا، رت در مرکز دستگاه قرار داده می­شود و از آنجا به داخل تمام بازوها می­رود تا پاداش را پیدا کند (7). به آن 5 دقیقه زمان داده می­شود تا بتواند غذا را بیابد. در ترایل­های بعدی باید بخاطر بیاورد کدام بازوها فاقد غذا بوده­اند تا وارد آنها نشود.

مطالعات رفتاری در یک اتاق ساکت و آرام بین10صبح تا4 بعدازظهر انجام شد و تمام رفتارها با دوربین ثبت گردید. 5 روز اول شروع کار، شامل آشنایی و سازگاری رت­ها با ماز شعاعی بود. رت­ها طی سه دوره 7 روزه جهت بررسی تغییر روند یادگیری و حافظه فضایی در دستگاه ماز شعاعی قرارگرفتند. بدین ترتیب که دوره اول مطالعه رفتاری، روزهای 1 تا 7 بعد از تزریق لیزولسیتین، دوره دوم روزهای 12 تا 18 بعد از تزریق لیزولسیتین و دوره سوم نیز روزهای 22 تا 28 بعد از تزریق لیزولسیتین را در برمی­گرفت. بین مراحل مطالعه رفتاری، چند روز جهت استراحت موش­ها در نظر گرفته می­شد تا بدلیل کم شدن غذای روزانه شان، از بین نروند.

پس از پایان آزمایشات رفتاری، نیم میکرولیتر ماده رنگی متیلن بلو به منظور رنگ­آمیزی و مشخص نمودن موقعیت کانول­ها، از طریق کانول­های راهنما تزریق شد. سپس حیوانات کشته شده و مغزشان در فرمالین 10% فیکس و برش هایی از مغز در در ناحیه رنگ­آمیزی شده تهیه گردید تا از صحت جای گذاری مناسب در ناحیه DG هیپوکامپ اطمینان حاصل شود. تنها حیواناتی که ناحیه تزریق در هیپوکامپشان صحیح بود مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفتند.

آنالیزهای آماری: آنالیز داده‌ها با استفاده از نرم افزار SPSS انجام گرفت. از آنالیز واریانس تکراری برای تجزیه تحلیل داده‌ها استفاده شد. داده‌ها به صورت میانگین±  میانگین خطای استاندارد  (Mean±SEM)ارائه شد و5%P< به عنوان حداقل سطح معنی­دار بودن در نظر گرفته شد.

نتایج

نتایج حاصل از مطالعه رفتاری طبق نمودار1، نشان داد زمان یافتن غذا طی دوره اول (روزهای 1 تا 7 بعد از تزریق لیزولسیتین) در گروه بیمار به طور معنی­داری (P<0.01, P<0.001) بالاتر از گروه کنترل بود. گروه بیمار در روزهای 5 ام تا 7 ام در زمان طولانی­تری قادر به یافتن غذا در ماز بودند که احتمالاً به دلیل دمیلینه شدن هیپوکامپ می­باشد که منجر به نقص حافظه شده است. گروه تحت تیمار با کافئین در روزهای 1 تا 4 در زمان کوتاه­تری غذا را پیدا می­کردند و در روزهای 5 تا 7 زمان پیدا کردن غذا افزایش یافت. زمان پیدا کردن غذا در ماز شعاعی در گروه تحت تیمار طی 7 روز به طور معنی­داری بالاتر از گروه کنترل بود و در روزهای 5 ام تا 7 ام اختلاف معنی­دار وجود داشت. مصرف کافئین، زمان یافتن غذا در گروه تیمار شده را در مقایسه با گروه بیمار طی دوره اول کاهش داد به گونه­ای که در روزهای 5 ام تا 7 ام اختلاف معنی­دار بود.

نمودار 1- بررسی زمان پیدا کردن غذا در ماز شعاعی در روزهای (7-1) بعد از تزریق لیزولسیتین (گروه کنترل، بیمار(LPC) و تیمار با کافئین (LPC+CAF)). داده­ها به صورت mean ± SEM بیان شده­اند.  P<0.01 ** *** P<0.001 در مقایسه با گروه کنترل، P<0.01++  P<0.05+ در مقایسه با گروه LPC در همان روز (10- 7 = n).

مقایسه میانگین زمان پیدا کردن غذا در گروه­های تحت آزمایش طی روزهای 1 تا 7 (نمودار 2)، نشان داد که میانگین زمان در هر دو گروه بیمار (LPC) و تیمار (LPC+CAF)، بصورت معنی­داری (P<0.001) بالاتر از گروه کنترل شده بود که حاکی از دمیلینه شدن هیپوکامپ و اختلال حافظه رت­ها متعاقب تزریق LPC می­باشد و تیمار با کافئین در کوتاه مدت اثر زیادی بر بهبود ترمیم میلین و اختلال حافظه ندارد. اگرچه میانگین زمان یافتن غذا در گروه تحت تیمار به طور معنی­داری پایین­تر از گروه بیمار بود. با توجه به نتایج حاصل از مطالعه رفتاری در نمودار3، زمان پیدا کردن غذا در گروه بیمار طی دوره دوم (روزهای 12 تا 18 بعد از تزریق لیزولسیتین) به طور معنی­داری (P<0.05, P<0.001) بالاتر از گروه کنترل بود. تیمار با کافئین به مدت 12 تا 18 روز، باعث کاهش معنی­دار (P<0.05, P<0.01, P<0.001) زمان رسیدن به غذا در ماز شعاعی طی این روزها نسبت به گروه بیمار شد. همچنین، با وجودیکه در این دوره زمان پیدا کردن غذا در گروه تحت تیمار بالاتر از گروه کنترل بود، اما در روزهای 16 تا 18 اختلاف معنی­داری وجود نداشت. در دوره دوم تست رفتاری، مقایسه بین گروه­های تحت آزمایش طبق نمودار4 نشان داد که میانگین زمان پیدا کردن غذا در گروه بیمار و تیمار به طور معنی­داری (P<0.01, P<0.001)، بالاتر از گروه کنترل بود که حاکی از دمیلینه شدن هیپوکامپ رت­ها در این دو گروه می­باشد.

نمودار2- مقایسه میانگین زمان پیدا کردن غذا در دوره اول بررسی رفتاری بین گروه کنترل، بیمار(LPC) و تیمار با کافئین (LPC+CAF) نشان داد بین گروه­های تحت آزمایش در این دوره اختلاف معنی­دار وجود دارد. داده­ها به صورت mean±SEM بیان شده اند.P<0.001*** در مقایسه با گروه کنترل، P<0.01++ در مقایسه با گروهLPC (10-7 =n).

نمودار3- مقایسه زمان پیدا کردن غذا در ماز شعاعی بین گروه کنترل، گروه بیمار(LPC) و تیمار با کافئین (LPC+CAF) نشان داد بین گروه های تحت آزمایش اختلاف معنی­داری وجود دارد. داده­ها به صورت mean ±SEM بیان شده­اند.P<0.05 *** P<0.001  * در مقایسه با گروه کنترل، P<0.001+++ P<0.01  ++در مقایسه با گروه LPC در همان روز (10- 7 = n).

نمودار4- مقایسه زمان پیدا کردن غذا در ماز شعاعی بین گروه کنترل، بیمار(LPC) و تیمار با کافئین (LPC+CAF) نشان داد بین گروه­های تحت آزمایش اختلاف معنی­دار وجود دارد. داده­ها به صورتmean ± SEM  بیان شده اند.P<0.001*****P<0.01 در مقایسه با گروه  کنترل، P<0.001+++ در مقایسه با گروه LPC (10- 7 = n).

نمودار5- مقایسه زمان پیدا کردن غذا در ماز شعاعی بین گروه کنترل، بیمار(LPC) و تیمار با کافئین ( LPC+CAF) نشان داد بین گروه های تحت آزمایش اختلاف معنی­دار وجود دارد. داده­ها به صورت  mean ± SEM  بیان شده­اند. ** P<0.01 * P<0.05 در مقایسه با  گروه کنترل، P<0.001+++ P<0.01++  در مقایسه  با گروه بیمار (LPC) (10- 7 = n).

در گروه تیمار شده با کافئین به مدت  12 تا 18 روز، میانگین زمان پیدا کردن غذا در ماز شعاعی به صورت معنی­داری (P<0.001)، پایین­تر از گروه LPC بود که نشان دهنده اثر تیمار با کافئین در بهبود یادگیری و حافظه است. نتایج همچنین نشان داد که در دوره سوم (روزهای 22 تا 28 بعد از تزریق لیزولسیتین)، زمان یافتن غذا در گروه بیمار بصورت تدریجی کاهش یافت که احتمالاً بدلیل ترمیم داخلی و طبیعی میلین در هیپوکامپ است که البته اثر کمی در بهبود حافظه داشته است چرا که در تمام روزهای دوره سوم به طور معنی­داری (P<0.01) بالاتر از گروه کنترل بود. مصرف کافئین در گروه تحت تیمار به مدت 22 تا 28 روز، زمان یافتن غذا را در ماز شعاعی بصورت معنی­داری (P<0.01, P<0.001) در مقایسه با گروه بیمار کاهش داد. همچنین با وجودیکه زمان یافتن غذا در گروه تیمار با کافئین بالاتر از گروه کنترل بود، اما تفاوت معنی­داری مشاهده نشد (نمودار5) که حاکی از بهبود روند یادگیری و حافظه در آن­ها می­باشد. میانگین زمان پیدا کردن غذا در ماز شعاعی در دوره سوم نیز در گروه بیمار (LPC) بصورت معنی­داری (P<0.001) بالاتر از گروه کنترل بود. گروه تحت تیمار طی این دوره عملکرد بهتری داشتند و میانگین زمان یافتن غذا در آن­ها به طور معنی­داری (P<0.001) پایین­تر از گروه بیمار بود. همچنین بین گروه تیمار و کنترل تفاوت معنی­داری وجود نداشت (نمودار 6).

نمودار6- مقایسه میانگین زمان پیدا کردن غذا در ماز شعاعی بین گروه کنترل، بیمار(LPC) و تیمار با کافئین(LPC+CAF) نشان داد بین گروه­های تحت آزمایش اختلاف معنی­دار وجود دارد. داده­ها به صورت mean ± SEM  بیان ­شده­اند.P<0.001 *** در مقایسه با گروه کنترل­، P<0.01+++  در مقایسه با گروه  LPC (10- 7 = n).

بحث و نتیجه گیری

یادگیری و حافظه، پروسه­های شناختی متمایزی برای اکتساب، به رمز درآوردن، تثبیت و به یاد آوردن اطلاعات در مورد محیط اختصاصی می­باشند (17). ام اس، یکی از معمول­ترین عارضه­های نورولوژیکی در افراد جوان با میانگین سنی حدود 30 سال است (27) که مشخصه آن التهاب و دمیلینه شدن سیستم عصبی مرکزی که نقص­های حافظه­ای را بدنبال دارد. در سیستم عصبی مرکزی، فرایند تخریب میلین توسط حمله مستقیم سلول­های ایمنی به الیگودندروسیت ها که غلاف میلین را ساخته و محافظت می­کنند، انجام می­شود (31)، بنابراین می­تواند یک جنبه تشخیصی برای بیماری MS باشد. الیگودندروسیت­ها، سلول­های میلین ساز اصلی سیستم عصبی هستند که از سلول­های زایای منطقه تحت بطنی مشتق می­شوند. خطوط سلولی الیگودندروسیتی هدایت الکتریکی در طول مسیرهای فیبری مرتبط را تشدید می­کنند (28).

لیزولسیتین­ها، ترکیبات شیمیایی مشتق از فسفاتیدیل کولین­ها می­باشند که برای سلول­های میلین ساز سمی هستند و باعث تحریک فعالیت سلول­های فاگوسیت کننده سیستم عصبی وآپوپتوزالیگودندروسیت ها می­شوند (32).

هیپوکامپ، به عنوان یکی از مواد خاکستری مهم که شدیداً در مقابل عارضه­های نورولوژیکی مختلف و بویژه تخریب اکسیداتیو آسیب پذیر است و تحت تاثیر دمیلیناسیون قرار می­گیرد، شناخته می­شود. مشخص شده که 25 تا 60 درصد بیماران مبتلا به MS، از ضایعات هیپوکامپ رنج می­برند (21).

در این مطالعه، اثر تیمار مزمن کافئین بر بهبود حافظه و یادگیری در موش صحرایی بعد از تزریق لیزولسیتین (LPC)، بررسی شد. کافئین، از اعضای خانواده متیل گزانتین­ها می­باشد که دارای خواص ضد التهابی است. در بسیاری از عارضه­های تخریب عصبی از جمله بیماری­های آلزایمر، پارکینسون و ایسکمی نشان داده شده که کافئین اثرات حفاظت عصبی اعمال می­کند (24). همچنین، این ماده می­تواند به عنوان آنتاگونیست گیرنده­های آدنوزینی، اثرات بیوشیمیایی و رفتاری متعدد و پیچیده­ای در سیستم عصبی داشته باشد.

نتایج بدست آمده از مطالعه رفتاری در دوره اول، نشان داد که رت­های بیمار تا 4 روز اول بعد از تزریق LPC، در زمان کوتاه­تری غذا را پیدا می­کردند و در روزهای 5 ام تا 7 ام زمان پیدا کردن غذا افزایش یافت. در این 7 روز، زمان پیدا کردن غذا در گروه بیمار (LPC) بصورت معنی­داری بالاتر از گروه کنترل بود، همچنین زمان یافتن غذا در گروه تحت تیمار با کافئین در تمام روزهای دوره اول، بالاتر از گروه کنترل بود و در روزهای 5 ام تا 7 ام تفاوت معنی­دار، مشاهده شد که نشان می­دهد اثر لیزولسیتین بر دمیلینه شدن هیپوکامپ و اختلال حافظه در این روزها، بیشتر بوده است. نتایج همچنین نشان می­دهد مصرف کافئین در کوتاه مدت اثر زیادی روی ترمیم میلین ندارد اگرچه در تمام روزهای این دوره زمان یافتن غذا در گروه تیمار (LPC+CAF)، بطور معنی­داری، پایین­تر از گروه بیمار بود.

در دوره دوم مطالعه رفتاری که روزهای 12­ام تا 18­ام بعد از تزریق لیزولسیتین را در بر می­گرفت، زمان پیدا کردن غذا در گروه LPC، بیشتر از دوره اول و نیز بصورت معنی­دار، بیشتر از گروه کنترل بود. بطوریکه در این روزها، رت های بیمار به کندی در ماز شعاعی حرکت می­کردند و به میزان زیاد وارد بازوهای تکراری و یا فاقد غذا می­شدند و در به یاد آوردن بازوی محتوی غذا با مشکل مواجه می­شدند. این موارد نشان می­دهد تزریق لیزولسیتین در ناحیه هیپوکامپ، دمیلینه شدن این ناحیه و بیشترین اثر تخریبی را طی این روزها را در پی داشته که می­تواند در نتیجه فعال شدن سیستم ایمنی بدن از جمله سلول­های T باشد که سیتوکاین­های التهابی و گونه­های آزاد اکسیژن را تولید می­کنند که منجر به افزایش التهاب، تخریب غلاف میلین و آپوپتوزسلول­های عصبی می­شود (20). بدین ترتیب در نتیجه از بین رفتن غلاف میلین و مرگ نورون­ها و سلول­های میلین­ساز، ارتباط سیناپسی بین سلول­های عصبی در هیپوکامپ دچار مشکل شده و اختلال حافظه و یادگیری را بدنبال داشته است.

نتایج پژوهش حاضر با یافته­های Makinodan و همکاران در سال 2008 مطابقت دارد. آنها با استفاده از تزریق موضعی لیزولسیتین، دمیلیناسیون را در ناحیه هیپوکامپ القا کردند. مطالعات رفتاری آن­ها نشان داد که لیزولسیتین منجر به اختلال حافظه و یادگیری فضایی رت­ها شده است و اعلام نمودند، متعاقب تزریق LPC، اثری از بلوغ الیگودندروسیت­ها دیده نشد که حاکی از آزاد سازی فاکتورهای التهابی و اثرات تحریکی آن­ها روی مرگ سلولی الیگودندروسیت­ها بود که باعث شد میلین­سازی با تاخیر صورت گیرد (18).

طی روزهای 12­ام تا 18­ام (دوره دوم) بعد از تزریق لیزولسیتین، مصرف کافئین به مدت 12 تا 18 روز، باعث کاهش زمان پیدا کردن غذا در گروه (LPC+CAF) در مقایسه با گروه بیمار شد. رت­های تیمار شده در این روزها، خطای کمتری در پیدا کردن غذا در ماز شعاعی داشتند. با وجودی که در این دوره زمان پیدا کردن غذا در گروه تحت تیمار بالاتر از گروه کنترل بود، اما در روزهای 16 تا 18 اختلاف معنی­داری مشاهده نشد. این موارد نشان دهنده اثر مثبت کافئین در ترمیم میلین و بهبود روند یادگیری و حافظه است و نشان می­دهد کافئین توانسته علیه عارضه دمیلینه کننده اثر حفاظت عصبی داشته باشد.

 هیپوکامپ، مجموعه­ای از ساختارها است که بطور نزدیک با هم در کسب و بقای اطلاعات فضایی شرکت دارند و غنی از رسپتورهای آدنوزینی بخصوص A1 و A2 می­باشند (14). کافئین بسیاری از اثرات حفاظت عصبی­اش را از طریق آنتاگونیست بودن رسپتورهای آدنوزینی و مهار آنزیم فسفودی­استراز اعمال می­کند. تراکم گیرنده­های آدنوزینی در هیپوکامپ که برای حافظه و یادگیری ضروری است، زیاد می­باشد. این گیرنده­ها متصل به سیستم کولینرژیک می باشند .مطالعات فارماکولوژیکی نشان می­دهند که سیستم کولینرژیک مغز در یادگیری و حافظه دخیل می­باشد. آزاد سازی استیل­کولین در هیپوکامپ طی یادگیری فضایی افزایش می­یابد و این افزایش استیل­کولین با بهبود عملکرد فرد طی یادگیری رابطه مستقیمی دارد (8).

Angelucci و همکاران در سال 2002 نشان دادند، کافئین، تثبیت حافظه را بعد از آموزش در موش­های صحرایی بهبود می­بخشد (4). آنها اعلام کردند که فعالیت رسپتورهای آدنوزینی، بطور قوی آزاد سازی استیل کولین از نورون های پیرامیدال هیپوکامپ مهار می­نماید. در سال 2010 مطالعه دیگری توسط Botton و همکاران انجام گرفت که در آن نیز تخریب نورون­های کولینرژیک به عنوان بخشی از کاهش عملکردهای شناختی مطرح شد (5).

بنابراین با توجه به یافته­ها در تحقیق حاضر می­توان بلوکه شدن رسپتورهای آدنوزینی توسط کافئین و کمک به افزایش رها سازی استیل­کولین را مکانیسم احتمالی آن در افزایش حافظه گروه تیمار نسبت به گروه بیمار دانست.

فعالیت رسپتورهای آدنوزینی بخصوص A3، باعث مهار کردن آنزیم آدنیلیل سیکلاز می­شود و در نتیجه ATP نمی تواند به cAMP تبدیل شود (6). کافئین به عنوان مهارکننده قوی آنزیم فسفودی استراز شناخته شده است (3) که علاوه بر آن، با بلوکه کردن گیرنده­های آدنوزینی باعث افزایش cAMP درون سلولی می­شود. cAMP با فعال کردن مسیر وابسته به پروتئین کیناز A هم اثرات ضد التهابی اعمال می­کند و هم باعث افزایش حافظه و یادگیری می­شود (1). همچنین، فعالیت مسیر PKA/cAMP باعث مهار رها سازی فاکتورهای التهابی می­شود (13). بنابراین از آنجا که تزریق لیزولسیتین باعث کاهش یادگیری و حافظه در رت­های بیمار شد، می­توان تاثیر کافئین بر افزایش cAMP و نیز مهار فاکتورهای آپوپتوتیک را که توسط LPC فعال می­شوند، از جمله مکانیسم­های آن در بهبود روند یادگیری و ترمیم میلین گروه تحت تیمار دانست.

از آنجا که در اثر تزریق لیزولسیتین سلول­های عصبی از بین می­روند و روند یادگیری مختل می­شود. بنابراین، نیاز به سلول­های زایا می­باشد تا جایگزینی برای سلول­های از دست رفته ایجاد کنند. سلول­های زایا در منطقه تحت بطنی (SVZ) و در میان دیواره بطن­های جانبی می­باشند که طی نوروژنز تکثیر یافته و به سایر نواحی مهاجرت می­کنند و به انواع سلول­های عصبی اختصاصی در مدارهای نورونی تثبیت شده متمایز می­شوند. نوروژنز در جنبه­های مربوط به یادگیری و انواع حافظه دخالت دارد. کافئین می­تواند با کمک به روند تکثیر و تمایز سلول­های زایا باعث افزایش سرعت نوروژنز شود (33). بنابراین این ماده متیل گزانتینی به این دلیل می­تواند هوشیاری و حافظه را افزایش دهد و اجرای رفتارهای نیازمند به دقت و توجه را بهبود بخشد.

در پژوهش حاضر، در دوره سوم تست رفتاری، زمان یافتن غذا در گروه بیمار، در تمام روزهای دوره سوم بصورت معنی­داری بالاتر از گروه کنترل بود و موش­های صحرایی در یافتن غذا دچار خطا می­شدند. مصرف کافئین در گروه تحت تیمار به مدت 22 تا 28 روز، زمان یافتن غذا را در ماز شعاعی بطور معنی­داری نسبت به گروه بیمار، کاهش داد. همچنین با وجودی که زمان یافتن غذا در گروه (LPC+CAF) بالاتر از گروه کنترل بود اما تفاوت معنی­داری وجود نداشت. در این روزها، موش­های تحت تیمار به ندرت وارد بازوهای فاقد غذا می­شدند و در زمان بسیار کوتاهی در مقایسه با دوره دیگر غذا را پیدا می­کردند. این موارد نشان می­دهد که تیمار مزمن کافئین اثرات حفاظتی در مقابل دمیلینه شدن سلول­های عصبی دارد و باعث بهبود روند حافظه فضایی و یادگیری وابسته به آسیب هیپوکامپ می باشد.

نتایج بدست آمده از این مطالعه با نتایج رفتاری Alhaider در زمینه اثر تیمار مزمن کافئین، مطابقت دارد. در سال 2010، مطالعه ای توسط Alhaider انجام شد که در آن، رت­ها کافئین را با دوز mg/kg 30 به مدت 4 هفته دریافت کردند. مطالعه رفتاری آنها نشان داد رت­های تیمار با کافئین که محرومیت از خواب داشتند، در سرعت یکسانی با گروه کنترل یاد می­گرفتند در حالیکه رت­های دچار محرومیت از خواب که کافئینی دریافت نکرده بودند به طور معناداری در ترایل­های بعد از آموزش دچار خطا و اشتباه می­شدند که نشان از اثر کافئین در بهبود حافظه و یادگیری فضایی بود (3). وقایع پاتولوژیکی مثل استرس اکسیداتیو منجر به تولید بالای رادیکال­های آزاد می­شود که بطور معنی­داری عملکردهای شناختی و یادگیری را کاهش می­دهد (2). طبق مطالعات، مصرف روزانه کافئین به دلیل اثرات حفاظتی­اش روی سیستم آنتی­اکسیدانتی داخلی بدن که موجب افزایش گلوتاتیون می­شود می­تواند اثرات سودمندی روی حافظه و یادگیری داشته باشد (2). نشان داده شده که کافئین، غشا سلول­های عصبی بخصوص در هیپوکامپ و قشر مغز را از استرس اکسیداتیو توسط توانایی آنتی­اکسیدانتی­اش حفاظت می­کند (15).

لیزولسیتین می­تواند باعث آپوپتوزالیگودندروسیت­ها شود. این سلول­های گلیال به استرس اکسیداتیو حساس بوده و ظرفیت آنتی­اکسیدانتی پایینی دارند. کافئین، احتمالاً با اعمال اثرات آنتی­اکسیدانتی می­تواند مانع از آپوپتوز بیشتر سلول های عصبی شود و با مهار استرس اکسیداتیو و اختلال سیستم کولینرژیک و نیز اثرات ضد التهابی نقش مهمی در بهبود حافظه داشته باشد. هیپوکامپ به طور قوی در هر دو حافظه فضایی و مرجع نقش دارد. حافظه فضایی توسط نقص­های گیرنده­های NMDA نیز مختل می­شود (22).

در شرایط عادی، گلوتامات به عنوان یک نوروترانسمیتر خروجی در سیستم عصبی مرکزی عمل می کند و نقش مهمی درانتقال سیناپسی بر عهده دارد و باعث افزایش LTP (پتانسیل طولانی مدت) و در نتیجه افزایش حافظه می­شود (22). ثابت شده است که آدنوزین در هیپوکامپ، اثر مهاری رویLTP  دارد (26) و رهاسازی نوروترانسمیترخروجی مثل گلوتامات را از انتهاهای عصبی مهار می­کند. بدین ترتیب آدنوزین پروسه­های یادگیری و حافظه را در سطح سیناپسی مختل می­کند. به علاوه، آدنوزین از طریق فعال کردن رسپتورهای آدنوزینی بخصوص A1 و A2، انعطاف­پذیری سیناپسی در هیپوکامپ را مختل می­کند (3). غیرفعال کردن رسپتورهای آدنوزینی، نشان داده که نقص­های شناختی و حافظه­ای را می­تواند خنثی کند (25). بدین نحو، کافئین می­تواند با بلوکه کردن رسپتورهای آدنوزینی باعث افزایش رها سازی نوروترانسمیتر گلوتامات و در نتیجه افزایش پتانسیل طولانی مدت شود. نتیجه گرفته می­شود که کافئین با اعمال اثرات ضد التهابی و ضد آپوپتوتیک همراه با افزایش نوروژنز و رها سازی نوروترانسمیترهای دخیل در افزایش حافظه، باعث مهار اثرات ایجاد شده با لیزولسیتین و هدایت صحیح پیام­های الکتریکی شود که این موارد افزایش حافظه و یادگیری را بدنبال دارد. بنابراین کافئین، می تواند به عنوان یک ماده موثر در بهبود عارضه های دمیلینه کننده پیشنهاد شود.

تقدیر و تشکر

این پژوهش با حمایت مالی دانشگاه ارومیه به انجام رسیده است. بدین وسیله از مساعدت­های معاونت محترم پژوهشی دانشگاه کمال تشکر و قدردانی می­گردد.