نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری

چکیده

هدف از مطالعه حاضر بررسی توانایی زیست پلیمر آلژینات به عنوان بستری برای تمایز سلول های مزانشیمی بافت چربی انسانی به سلول های کندروسیت می باشد. بدین منظور سلول های بنیادی مزانشیمی از بافت چربی انسانی افراد سالم توسط کلاژناز نوع I جداسازی و کشت داده شدند. سپس این سلولها در بستر آلژینات با استفاده از اسید اسکوربیک و TGF-β1 به کندروسیت تمایز داده شدند. توانایی بستر آلژینات در تولید سلول های کندروسیت براساس بیان مارکرهای مولکولی مانند کلاژن نوع II به روش RT-PCR و همچنین بیان پروتئوگلیکان های سولفاته به روش رنگ آمیزی Alcian Blue انجام گرفت. رنگ آمیزی ایمونوشیمی با آنتی بادی بر علیه Vimentin نشانگر بالای 95٪ از سلولهای بنیادین مزانشیمی بود. در رنگ آمیزی Alcian Blue درصد سلولهای رنگ شده در سلولهای کنترل و سلولهای کشت داده شذه در بستر آلژینات به ترتیب در روز سوم ( 4.9 ± 56.5 و 0.7 ± 36.5 % ) و در روز چهاردهم ( 2.8 ± 93 و 2.8 ± 83 %) بود. این یافته ها و نسبتها در روزهای سوم و پنجم از نظر آماری اختلاف معنی دار با هم داشتند. در صد بیان کلاژن نوع II سلولهای کنترل و سلولهای کشت داده شذه در بستر آلژینات به ترتیب در روز سوم ( 5 ± 70 و 4.5 ± 43 % ) و در روز چهاردهم ( 1.4 ± 77 و 2.8 ± 54 %) نسبت به بیان ژن GAPDH میباشد. بطور کلی نتایج حاصل کاربری سیستم آلژینات را در مهنسی بافت برای تولید کندروسیت پیشنهاد می کند.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Alginate biopolymer as a 3-dimentional microenvironment for differentiation of human mesenchymal stem cells to chondrocytes

نویسنده [English]

  • َAbdolkhaleg Deezagi

چکیده [English]

The aim of this research was to study the potency of Alginate biopolymer as a microenvironment for differentiation of human adipose tissue derived mesenchymal stem cells (hAMSCs) to chondrocytes. For this purpose, human adipose tissue was prepared from health voluntary donors with liposuction and digested by collagenase type ׀. The mesenchymal stem cells cultured in alginate beads in presence of TGF-β1 and ascorbic acid. Alcian blue staining was done to show the differentiation of mesenchymal stem cell to chondrocytes. RT-PCR was done for the evaluation of collagen type II gene expression as a chondrocytic molecular marker. Immuno-cytochemical staining of isolated cells by anti human Vimentin antibody indicated to more than 95% of positive cells as hAMSCs. After induction of chondrogenic differentiation in alginate beads, alcian blue staining showed expression of sulphated proteoglycans in chondrocytes. Positive stained cells in controls and alginate beaded cultured cells indicated to (36.5% ± 0.7 and 56.5 ± 4.9 at day 3) and ( 83% ± 2.8 and 93 ± 2.8 at day 14) respectively. RT-PCR results indicated to the expression of collagen type II in alginate bead cultured cells and the comparison of results by controls indicated to significant increased expression in alginate bead cultured cells. (43% ± 4.5 and 70 ± 5 at day 3) and ( 54% ± 2.8 and 77 ± 1.4 at day 14) respectively. In conclusion, our result indicated and supported the using of alginate beads as 3 dimentional culture system in tissue engineering for chondrogenic culture system.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Adipose Tissues Derived Mesanchymal Stem cells
  • Alginate Scaffold
  • Chondrogenic differentiation

زیست پلیمرآلژینات بعنوان بستر سه بعدی جهت کشت و تمایز سلولهای بنیادین مزانشیمی بافت چربی انسان به سلولهای کندروسیت غضروف

عبدالخالق دیزجی*، لعیا هدایی و زهرا سهیلا سهیلی

تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، علوم پایه، گروه بیوشیمی

تاریخ دریافت: 20/1/92               تاریخ پذیرش: 12/6/92 

چکیده

هدف از مطالعه حاضر بررسی توانایی زیست پلیمر آلژینات به عنوان بستری برای تمایز سلول­های مزانشیمی بافت چربی انسانی به سلول­های کندروسیت می­باشد. بدین منظور سلول­های بنیادی مزانشیمی از بافت چربی انسانی افراد سالم توسط کلاژناز نوع I جداسازی و کشت داده شدند. سپس این سلولها در بستر آلژینات با استفاده از اسید اسکوربیک و TGF-β1 به کندروسیت تمایز داده شدند. توانایی بستر آلژینات در تولید سلول­های کندروسیت براساس بیان مارکرهای مولکولی مانند کلاژن نوع II به روشRT-PCR  و همچنین بیان پروتئوگلیکان­های سولفاته به روش رنگ آمیزیAlcian Blue انجام گرفت. رنگ آمیزی ایمونوشیمی با آنتی بادی بر علیه Vimentin نشانگر بالای 95% از سلولهای بنیادین مزانشیمی بود. در رنگ­آمیزی Alcian Blue درصد سلولهای رنگ شده در سلولهای کنترل و سلولهای کشت داده شده در بستر آلژینات به ترتیب در روز سوم (4.9 ± 56.5 و 0.7 ± 36.5 %) و در روز چهاردهم (2.8 ± 93 و 2.8 ± 83 %) بود. این یافته­ها و نسبتها در روزهای سوم و پنجم از نظر آماری اختلاف معنی­دار با هم داشتند. درصد بیان کلاژن نوع II سلولهای کنترل و سلولهای کشت داده شده در بستر آلژینات به ترتیب در روز سوم (5 ± 70 و 4.5 ± 43 %) و در روز چهاردهم (1.4 ± 77 و 2.8 ± 54 %) نسبت به بیان ژنGAPDH  می باشد. بطور کلی نتایج حاصل کاربری سیستم آلژینات را در مهندسی بافت برای تولید کندروسیت پیشنهاد می­کند.

واژه­های کلیدی: سلول مزانشیمی بافت چربی انسانی، داربست آلژینات، تمایز به کندروسیت

* نویسنده مسئول، تلفن: 02144787377، پست الکترونیکی: deezagi@nigeb.ac.ir

مقدمه

 

هدف اصلی در مهندسی بافت بازسازی و یا تولید بافت یا اندام سالم برای جایگزینی بافت­های ناسالم و یا ترمیم بافت های آسیب دیده یک بیمار می­باشد. ظرفیت محدود سلول­های بالغ یک بافت از نظر تقسیم سلولی و تکثیر و تمایز آنها به سلول­های تمایز یافته و بخصوص عدم رگ­زایی کافی این سلول­ها در محیط آزمایشگاهی از محدودیت کاربردی آنها در مهندسی بافت می­باشد. سه جز اصلی شکل­گیری یک بافت در مهندسی بافت نوع سلول، داربست  و فاکتورهای رشد مورد استفاده می­باشند (12). لذا مهندسی بافت شامل جداسازی سلول­های ویژه و خاص از منبع سلولی مناسب، رشد و تکثیر آنها در داربست­های سه بعدی تحت شرایط کشت سلولی مناسب در محیط In vitro و در نهایت قرار دادن این مجموعه در محل مناسب در بدن بیمار و هدایت تشکیل بافت جدید در میان داربست می­باشد. استفاده از منبع سلولی مناسب به ویژه سلول­های بدست آمده از فرد بیمار تا حدود زیادی موجب کاهش مشکلات مربوط به سیستم ایمنی می­گردد (20). با معرفی و شناخت پتانسیل سلول­های بنیادی در دو دهه گذشته این سلول­ها جایگاه ویژه­ای را در مهندسی بافت پیدا کرده  اند. سلول­های بنیادی سلول­هایی تمایز نیافته می­باشند که توسط دو خصوصیت خود نوسازی (Self-renewal) و توانایی تولید انواع مختلف سلول­های اختصاصی و اجدادی مشخص می­شوند. در استفاده از این سلول­ها در مهندسی بافت در جهت افزایش بازدهی، محققین با دیدگاه­های مختلف عوامل متفاوتی را بررسی می­کنند. از مهمترین آنها می­توان به بررسی پتانسیل سلول­های بنیادی از منابع مختلف بافتی، عوامل و فاکتورهای مؤثر در رشد، عوامل القا کننده تمایز و همچنین عوامل ایجاد کننده بستر و Microenvironment و... اشاره کرد. از میان سلول­های بنیادی فرد بالغ، سلول­های بنیادی مزانشیمی منابع مناسبی برای مهندسی بافت می­باشند (23). این سلول­ها براحتی از بافت­های گوناگون نظیر مغز استخوان، بافت چربی و ... جداسازی و بدون از دست دادن ظرفیت و توانایی خود نوسازی خود در محیطin vitro  کشت داده می­شوند و در نهایت توانایی تمایز به سلول­هایی نظیر کندروسیت­ها، آدیپوسیت­ها و... را دارند (17). سلول­های بنیادی مزانشیمال جمعیتی از سلول­های بنیادین سوماتیک چند توانه می­باشند که تاکنون در بافت­هایی نظیر: مغز استخوان، ماهیچه اسکلتی، مغز، بافت­چربی، خون بندناف، خون محیطی و بافت­های پیوندی پوستی شناسایی شده­اند. سلول­های مزانشیمی، برای مارکرهای سطحی شامل105, 106 and 166)  CD (29, 44, 73, 90, مثبت بوده و فاقد مارکرهای سطحی هماتوپوئتیک و HLA-DR می­باشند (3). این سلول­ها صرف­نظر از منبع مربوط به آن، در پاره­ای از خصوصیات نظیر: توانایی تکثیر و خود نوسازی طولانی مدت تحت شرایط کنترل شده کشت سلول، مرفولوژی دوکی شکل­- فیبروبلاست مانند و پتانسیل تمایز به دودمان مزودرمی و حتی غیر مزودرمی، مشترک می­باشند (19). سلول­های مزانشیمی، پتانسیل تمایز به سلول­های مزودرم احشایی، اﺳﺗﺌوبلاست، آدیپوسیت، کندروسیت و مایوسیت، را دارا می­باشند. همچنین مطالعات اخیر نشان داده­اند که در ریز محیط مناسب، سلول­های مزانشیمی می­توانند به کاردیومیوسیت و یا حتی سلول­هایی از مشتقات غیر مزودرمی نظیر هپاتوسیت­ها و نورون­ها، تمایز یابند. تمامی خصوصیات ذکر شده، سلول­های بنیادی مزانشیمال را تبدیل به منبع سلولی مناسبی جهت کاربرد در مهندسی بافت و سلول درمانی ساخته است (8). مشخص شده است که  سلول­های بنیادین مزانشیمی بدست آمده از بافت چربی ADMSCs)) و مغز استخوان BDMSCs)) هیچ یک از آنتی ژن­های تحریکی نظیر آنتی­ژن­های نوع دوHLA  و همچنین مولکول­های هم- تحریکی نظیر (۸٠CD و ۸۵ (CDرا یا بیان نمی­کنند و یا در سطح بسیار ناچیزی بیان می­کنند و به طور کلی این سلول­ها ذاتاً ایمنوژنیک نبوده و استفاده از این سلولها در مهندسی بافت دارای اثرات تعدیل کنندگی سیستم ایمنی نیز می­باشد (5). از دیگر مسائل مطرح در مهندسی بافت تهیه و آماده سازی داربست­های طبیعی و سنتتیک به عنوان بستر و ماتریکسی برای تکثیر و تمایز سلول­ها در محیط in vitro می­باشد (9). پلیمرهای سنتزی (مانند آلژینات) که تحت شرایط کنترل شده تولید می­شوند می­توانند برای مهندسی بافت مفید باشند. در رابطه با پلیمرهای سنتزی ویژگی­هایی نظیر خواص مکانیکی، هندسه، شیمی سطح، تعداد منافذ و... باید در نظر گرفته شود (16). تاکنون مطالعات و تحقیقات زیادی در رابطه با بکارگیری سلول­های بنیادی و تمایز آنها به بافت­هایی نظیر بافت استخوان، غضروف و... صورت گرفته است. از جمله می­توان تمایز سلول­های بنیادی بدست آمده از مغز استخوان با استفاده از داربست­های هیبریدی بتا-تری کلسیم فسفات-آلژینات-ژلاتین، تمایز سلول­های مزانشیمی بدست آمده از مغز استخوان به سلول­های کندروسیت در بستری از آلژینات را ذکر کرد (4، 10، 14 و 18). با توجه به موارد ذکر شده هدف از مطالعه حاضر بررسی توانایی آلژینات به عنوان ماتریکسی برای سلول­های مزانشیمی بدست آمده از بافت چربی انسانی در تمایز این سلول­ها به سلول­های کندروسیت می­باشد.

مواد و روشها

جداسازی سلول­های مزانشیمی: بافت چربی زیر جلدی انسانی از طریق آسپیراسیون بافت چربی زیر جلدی از افراد سالم با رضایت بیماران توسط جراح تهیه شد. لیپوآسپیره حاصل به دفعات توسط بافر شستشو دهنده (Hanks Balanced Salt Sigma, St.Louis, MO, USA) Solution (HBSS) حاوی 200mg استرپتومایسین (Fluka, Switzerland) و 120mg پنی­سیلین Fulka, Switzerland)) شستشو داده شد. سپس عمل هضم بافت توسط0.25mg/ml  کلاژناز نوعI  (200unit/mg) (شرکت Calbiochem) در محلول HBSS به مدت ٢ ساعت در°C ۳۷ صورت گرفت سپس سلول های آدیپوسیت شناور از طریق سانتریفوژ از سلول­های بنیادی ته نشین شده جداسازی شدند.

شمارش سلولی و تعیین درصد سلولهای زنده: در تمام مراحل کار برای شمارش سلولی از رنگ متیلن بلو و... برای تعیین درصد سلول­های زنده از روش رنگ­آمیزی تریپان بلو استفاده شد، تعداد کل سلولی و درصد سلولهای زنده با استفاده از لام نئوبار (Hemocytometer) در زیر میکروسکوپ نوری شمارش شد.

کشت سلول­های مزانشیمی: سلول­های حاصل در فلاسک­های کشت سلول cm275 و در محیط کشت سلولیDulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco, Grand Island, NY), FBS (Fetal Bovine Serum), %20، 200 mg استرپتومایسین و 120 mg پنی سیلین، به تعداد تقریبیcm2/5000 cell کشت داده شدند. محیط کشت هر ۳ روز یکبار تعویض شد.  پس از پر شدن فلاسک­ها توسط سلول­های اولیه، سلول­ها با استفاده از ٢۵/٠ % تریپسین-EDTA 1mM  جداسازی شده و به مدت ٢ هفته در محیط یک بعدی کشت داده شدند. پس از ٤-۳ پاساژ سلول­ها در محیط سه بعدی آلژینات کشت و به سلولهای کندروسیت تمایز داده شدند.

‌شناسایی و تعیین خصوصیات سلولهای مزانشیمی جداسازی شده به روش ایمونو سیتوشیمیImmuno cyto chemistry : پس از تهیه لام از سلول­های جداسازی شده توسط دستگاه سیتوسانتریفوژ  Cell Spin(Tharmac) (دور rpm١۵٠٠ به مدت ١۵ دقیقه)، سلول­ها ابتدا توسط متانول در دمای C°١٠ به مدت ۵ دقیقه تثبیت شدند. سپس نمونه­ها با محلول بلوکه کننده (محلول بافر فسفات سالینPBST حاوی١٠% سرم موشی) به مدت ٢٠ دقیقه، به منظور مهار اتصال­های غیر اختصاصی آنتی­بادی انکوبه شدند. پس از پایان ٢٠ دقیقه شستشو با PBST انجام گرفت. سپس آنتی­بادی اولیهMonoclonal Mouse Anti-human vimentin  (DAKO) با غلظت µg/ml٢ در محلول PBST حاوی ۵/١% سرم موشی اضافه و به مدت ١ ساعت در دمای اتاق انکوبه شد. بعد از سه بار شستشو با محلول PBST نمونه­ها توسط آنتی­بادی ثانویه Goat Anti Mouse IgG Peroxidase conjugated (شرکتCalbiochem) با غلظت µg/ml١ در محلول PBST به مدت ٤۵ دقیقه در دمای اتاق انکوبه شدند. لام­ها بعد از سه بار شستشو با PBST با سوبسترای دی آمینو بنزیدین DAB انکوبه شده و بعد از شستشو جهت میانکنش اختصاصی مورد بررسی قرار گرفتند.  

لام­های تهیه شده در زیر میکروسکوپ بررسی و در هر لام ٢٠٠ سلول جهت شناسایی درصد سلول­های رنگ شده و رنگ نشده شمارش گردید.

تهیه بستر و مهره­های آلژینات: تهیه بستر سه بعدی و مهره­های آلژینات برای کشت سلولهای مزانشیمی براساس روش کار  Buccoو همکارانش انجام گرفت. روش کار بطور خلاصه به شرح زیر است. مهره­های آلژینات از طریق مخلوط سازی 2 الی 3 میلیون سلول بصورت سوسپانسیون سلولی (١٠٦×3-2 سلول در هر ml1) با ml۳ آلژینات4% استریل (low-Viscosity Alginic) acid, Sigma, St.Louis, MO, USA تهیه شدند. سوسپانسیون حاصل به سرنگcc ١٠ استریل انتقال داده شد و از میان سوزن ٢١ درجه به روش قطره­ای بیان شدند. سپس عمل ژلاسیون مهره­ها به طور آنی در ml۵ محلولCaCl2   mM١٠٢ در پلیت -Well6 (٢٠مهره در هر خانه، هر مهره به طور تقریبی شامل١٠٤  ×۵)  صورت گرفت. سپس مهره­ها به مدت ١۵ دقیقه به منظور ژلاسیون بیشتر در داخل محلولCaCl2  قرارگرفتند. پس از آن مهره­ها سه بار توسط Nacl  mM ١۵/٠ و یکبار توسط DMEM-HG (DMEM-high glucose) شستشو داده شدند. مهره­ها سپس به مدت ١٤ روز در محیط تمایزی شامل DMEM-HG، مکمل Roche,) , ITS+) Transferrin- Selenium ×insulin-١، TGF- ß1(Roche) ng/ml ١٠ و μg ۵٠ آسکوربیک اسید کشت داده شدند. محیط ذکر شده هر سه روز یکبار تعویض شد.

تهیه بلوک از مهره­های آلژینات حاوی سلولها و رنگ­آمیزیAlcian blue  : مهره­های آلژینات حاوی سلولهای تیمار شده جمع­آوری و به مدت 24 ساعت در پارافرمالدئید 4% در دمای °C ٤ تثبیت شدند. سپس سه بار توسط محلول بافرPBS شستشو و مراحل آبگیری توسط درجات صعودی الکل صورت گرفت. سپس عمل پارافینه کردن بر اساس روش­های پارافینه کردن استاندارد صورت گرفت. مهره­های پارافینه شده حاصل توسط دستگاه میکروتوم به ضخامتμm ۵ برش داده شدند و در نهایت برای شناسایی پروتئوگلیکان­های سولفاته توسط (, St.Louis, MO, USA Sigma)Alcian blue  براساس روش کار Steedman رنگ­آمیزی شدند (21).

برای رنگ­آمیزی نمونه­ها در ابتدا عمل آبدهی به ترتیب با قرارگیری نمونه­های پارافینه شده در Xylene در دو تکرار دقیقه­ای و سپس با قرارگیری در درجات نزولی الکل شامل الکل­های١٠٠، ٩٠ و٧٠ % و هر مرحله به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق، صورت پذیرفت. سپس برای رنگ­آمیزی، در ابتدا نمونه­ها و اسیداستیک ۳% هر کدام به مدت ۵ دقیقه، سپس به مدت ۳٠ دقیقه در رنگ Alcian blue و پس از شستشو با آب مقطر در رنگ Neutlar fast red به مدت١٠ دقیقه قرار گرفتند و در نهایت پس از شستشو با آب مقطر، لامل­ها با ریختن یک قطره چسب هیستوشیمی بر روی لام­ها قرار گرفتند. لام­های تهیه شده در زیر میکروسکوپ بررسی و در هر لام ٢٠٠ سلول جهت شناسایی سلول­های رنگ شده و رنگ نشده شمارش گردید.

استخراج RNA و انجام  RT-PCR برای بیان ژن کلاژن نوع II: استخراج  RNAکل به صورت­های مختلف انجام می­شود. در این تحقیق استخراج RNA با استفاده از محلول RNX (شرکت سینا ژن) انجام گرفت. جهت خارج سازی سلول­ها از مهره­های آلژینات و در نهایت استخراج RNA کل، پس از خارج نمودن محیط کشت، مهره­ها توسط محلول بافر PBS شستشو داده شدند و سپس محلول mM٤٠ EDTA به مدت ١۵ دقیقه جهت هضم آلژینات به پلیت اضافه گردید و در پایان با انجام سانتریفوژ (دور g٢٠٠٠، به مدت ۵ دقیقه در دمای ٤ درجه سانتیگراد) سلول­ها رسوب داده شده و آلژینات و EDTA از محیط حذف شدند. پس از جمع­آوری و رسوب­دهی سلول­ها، به ازای هر ١ میلیون سلول معادل ١ میلی­لیتر محلول RNX به ویال­های مورد نظر افزوده گردید. سپس ویال­ها به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق قرار داده شدند. لیز بیشتر سلول­ها، توسط سرنگml ١ به همراه سرسرنگ درجه ٢٠ صورت گرفت. برای این منظور سوسپانسیون سلولی٢٠ مرتبه از داخل سرنگ عبور داده شد.

پس از تعیین غلظت RNA­های استخراج شده، از مقدار غلظت یکسان ng١۳٠٠ RNA، برای ساخت cDNA استفاده شد. ساخت cDNA طبق بروشور کیت Fermentase با اضافه کردن میزان RNA­های تعیین شده به مواد ارائه شده در کیت، به صورت یک مرحله­ای در دستگاه PCR انجام گرفت.

پس از سنتز cDNA، واکنش PCR به منظور ردیابی بیان ژن کلاژن تیپ دو (به عنوان ژن اختصاصی سلول­های کندروسیت) و ژن GAPDH (به عنوانHousekeeping gene) صورت پذیرفت. پس از تهیه مخلوط واکنش (ذکر شده در بخش مواد) و ورتکس کردن، مجموعه مذکور به دستگاهThermal cycler  منتقل گردید.

محصولات پس از الکتروفورز بر روی ژل آگاروز در محلول اتیدیوم بروماید به مدت ١٠ دقیقه رنگ­آمیزی شد. پس از رنگ­آمیزی و شستن ژل در آب مقطر، تصویر ژل توسط دستگاه UV Transluminator مشاهده و توسط دستگاه UV tec عکسبرداری گردید. با توجه به پرایمرهای انتخاب شده، طول قطعات سنتز شده مربوط به GAPDH و کلاژن تیپ دو به ترتیب برابر ۵٢٠ و  bp۳٦١ می­باشد. باندهای حاصل توسط برنامه Total Lab به صورت کمی در آمدند و سپس عمل نرمال سازی داده­ها بوسیله داده­های مربوط به Housekeeping gene صورت گرفت.

روش­های آماری: برای آنالیز آماری نتایج به دست آمده از برنامه One way Anova به صورت online استفاده شد.

یافته­ها

جداسازی و هضم آنزیمی بافت: نمونه­های لیپوآسپیره تهیه شده دارای حجم تقریبی بین ml١٠٠-٤٠ بوده و وزن آن­ها پس از اندازه­گیری درحدود gr١٤٠-٨٠ برآورد شد. جهت جداسازی سلول­ها از دو آنزیم تریپسین-EDTA و کلاژناز تیپ یک استفاده به عمل آمد که در بخش مواد و روش­ها به آنها اشاره شد. در زمان استفاده از آنزیم تریپسین-EDTA، ٩٩% سلول­های جداسازی شده شامل سلول­های آدیپوسیت بودند و تنها یک درصد سلول­های جداسازی شده را سلول­های مزانشیمی تشکیل می­دادند چرا که این آنزیم به طور کامل، قادر به هضم بافت چربی نمی­باشد. که این امر، دال بر عدم کارایی موفق این آنزیم جهت جداسازی سلول­های مزانشیمی از این بافت می­باشد. در عوض آنزیم کلاژناز تیپ یک، آنزیم مؤثری جهت تفکیک بافت و جداسازی سلول­ها می­باشد.

درصد بقای سلولی در تمامی تکرارها بالای ٩٨% تعیین شد. شایان ذکر است با توجه به محدوده سنی افرادی که مورد عمل قرارگرفته بودند (٢۵-۳۵ سال)، در مورد تمامی نمونه­های تهیه شده توان بقای سلولی و ورود سلول­های بنیادی به حالت فیزیولوژیک فعال، جهت انجام تست­های بعدی به طور مشابهی یکسان بود.

در جدول 1 شمارش سلول­ها بعد از مرحله جداسازی نشان داده شده است، نتایج نشان می­دهد که صرف نظر از حجم های متفاوت از نمونه لیپوآسپیره (ml١٠٠-٤٠) داده­ها از نظر تعداد سلول­های بدست آمده از روند خاصی تبعیت می­کند نتایج تعداد سلول­ها در مرحله نهایی تا حد زیادی منطقی است و از یک روند مشخص مطابق با داده­های موجود در مقالات تبعیت می­کند.

 

جدول ١- درصد نهایی سلول های بنیادی مزانشیمی جدا شده از نمونه لیپوآسپیره

 

 

نمونه

تریپسین-(T)EDTA

حجم اولیه     نمونه

(ml)

حجم نهایی  نمونه (پس از حذف بخش خونی

      (ml)

وزن نهایی  نمونه (پس از حذف بخش خونی)

(gr)

تعداد کل سلول های موجود در بافت*

( تعداد سلول ها
 × وزن نهایی بافت)

تعداد سلول های مزانشیمی پس از هضم بافت چربی

درصد سلول های مزانشیمی جداسازی شده به تعداد کل سلول ها

کلاژناز تیپ (C) Ι

١

T

١٠٠

۵۵

١٠

١٠٩×٤

٠

٠

٢

c

٦٠

۵٠

١٠١

١٠١٠×٠٤/٤

١٠۵×٠٤/٢

۳-١٠ ×٠۷/۵

۳

c

٤٠

٢۳

۵٩

١٠١٠×۳۶/٢

١٠۵ ×١

    ۳-١٠×٢۳/٤

٤

c

٩٠

٦۵

٨٠

١٠١٠×٢/۳

١٠۵ ×۳

۳-١٠×۳۷/٩

۵

c

۵٠

٤٢

٧١/٢

١٠١٠×۸۵/٢

١٠۵ ×٤۵/١

۳-١٠×٠۸/۵

٦

c

۵۵

٤٠

٧٠

١٠١٠×۸/٢

١٠۵ ×١۵/١

۳-١٠×١/٤

٧

c

٧۵

٦٤

٩۵

١٠١٠×۸/۳

١٠۵ ×١/٢

۳-١٠×۵٢/۵


کشت سلول­های بنیادین مزانشیمی: سلول‌های بنیادین مزانشیمی سلول‌های چسبنده هستند که از لحاظ مرفولوژیک، بسیار شبیه سلولهای فیبروبلاست می باشند و در محیط کشت سلولی به صورت اشکال دوکی شکل و کشیده، همراه با زوائد سیتوپلاسمی منشعب مشاهده می شوند. این سلول‌ها در محیط کشتDMEM  حاوی٢٠% سرم FBS و در انکوباتور در شرایط CO2 ۵%، 95% رطوبت و دمای °C۳٧ نگهداری شدند و با تراکم١٠٤×۵ سلول در هر سانتی­مترمربع در ظروف کشت سلولی کشت داده می­شدند و در نهایت پس از ٨-٧ پاساژ برای انجام تست­های ذکر شده در بخش روش­ها استفاده می­شدند. شایان به ذکر است که سلول­ها در تمامی پاساژها دارای خصوصیات مرفولوژیک یکسان بوده و تفاوتی در ظاهر و یا بقای آن­ها مشاهده نشد (شکل1).

 

 

شکل 1-a- سلول های مزانشیمی در پاساژ دوم  b- سلول های مزانشیمی در پاساژ هشتم (بزرگنمایی  ١٠×۳٢ )

 

شکل2- تصویر سلول های مزانشیمی در روش ایمونوهیستوشیمی با آنتی بادی بر علیه Vimentin  میانکنش داده و سپس توسط سوبسترای       DAB   در طی واکنش آنزیمی رنگ شده اند(بزرگنمایی  ١٠×40).


شناسایی سلولهای مزانشیمی جداسازی شده به روشICC: به منظور تأیید سلول­های جداسازی شده به عنوان سلولهای بنیادی مزانشیمی از روش ICC و بکارگیری آنتی­بادی Monoclonal mouse anti-vimentin که قادر به نشانه­گذاری سلول­های مزانشیمی استفاده شد. پس از انجام آزمایش و مشاهده سلول­ها در زیر میکروسکوپ، ٩٩% سلول­های شمارش شده، توسط این آنتی­بادی شناسایی شده و در رنگ­آمیزی نهایی توسط رنگ DAB به رنگ قهوه­ای در آمده بودند، که این نتایج دال بر خلوص سلول­های جداسازی شده به عنوان سلول­های بنیادی مزانشیمی می­باشند (شکل2).   

تمایز سلول­های مزانشیمی به سلول­های کندروسیت با بکارگیری داربست­های آلژینات: پس از تأیید سلول­های جداسازی شده، به عنوان سلول­های مزانشیمی و تکثیر آن­ها، در نهایت این سلول­ها جهت تمایز به سلول­های کندروسیت در داخل مهره­های آلژینات و بر روی ظروف کشت سلولی معمول به عنوان کنترل، کشت داده شدند و برای تمایز محیط تمایزی مطرح شده در بخش مواد به آن­ها افزوده گردید و هر سه روز یکبار این محیط تعویض شد. آنچه در رابطه با سلول­های کشت داده شده در ظروف کشت طبیعی(کنترل) بیشتر سلول­ها چسبندگی خود را با سطح حفظ کرده، اما در ارتباط با مهره­های آلژینات سلولها پس از قرارگرفتن در مهره­های آلژینات سلول­ها به صورت گرد در داخل مهره­ها مشاهده شدند (شکل 3).

 

 

شکل۳-  تصویر مهره ها ی آلژینات تهیه شده به روش قطره ای a – بزگنمایی10 ×1  b – بزگنمایی  10× 5   - c,d تصویر سلول ها درون مهره ها ی آلژینات  بزگنمایی10 ×32


رنگ آمیزی Alcian blue: رنگ­آمیزی فوق به منظور شناسایی گلیکوزآمینوگلیکان­های سولفاته (GAGs) (که به طور فراوان در ماتریکس خارج سلولی کندروسیت­ها وجود دارند) و جهت تأیید تمایز سلول­های مزانشیمی به سلول­های کندروسیت، انجام شد. برای این منظور سلول­های کنترل و سلول­های درون مهره­های آلژینات به روش­های شرح داده شده در بخش روش­ها در روزهای ۳، ۵، ٧ و ١٤ توسط آلشین بلو رنگ­آمیزی شدند و در هر بار ٢٠٠ سلول جهت تعیین سلولهای مثبت (سلولهای رنگ شده) و سلولهای منفی (سلولهای رنگ نشده)، شمارش گردید. در اثر سلول رنگ­آمیزی سلول­ها توسط آلشین بلو بخش­های رنگ شده به رنگ آبی و هسته و سیتوپلاسم در نتیجه رنگ­آمیزی بوسیله رنگ Neutlar fast red به رنگ صورتی در می­آیند (شکل 4).

 

 

شکل 4- تصویر سلول های مزانشیمی تمایز یافته به سلولهای کندروسیت در بستر آلژینات که با رنگ آمیزی  آلشین بلو رنگ شده اند a – بزگنمایی10 ×10  b – بزگنمایی  10× 40   - c تصویر سلول ها درون مهره ها ی آلژینات  بزگنمایی10 ×32  -d سلولهای کنترل  بزگنمایی  10× 40

 

در رنگ­آمیزی Alcian blue سلول­های درون مهره­های آلژینات به همراه محیط تمایزی در مقایسه با سلول­های درون مهره­ها در شرایط کنترل نشان دهنده بیان گلیکوپروتئوگلیکان­های سولفاته و در نهایت تمایز این سلول­ها به سلول­های کندروسیت می­باشد. لازم به ذکر است که آزمایش فوق سه بار تکرار گردید و نتایج حاصل از شمارش در شکل5 به صورت درصد میانگین سلول­های مثبت در هر روز، قابل مشاهده می­باشند. درصد سلولهای رنگ شده در سلولهای کنترل و سلولهای کشت داده شده در بستر آلژینات به ترتیب در روز سوم (4.9 ± 56.5 و 0.7 ± %36.5) و در روز چهاردهم ( 2.8 ± 93 و 2.8 ± % 83) نسبت به کل سلولهای شمارش شده می­باشد. این یافته­ها و نسبتها در روزهای سوم و پنجم از نظر آماری اختلاف معنی­دار با هم داشتند.

بیان کلاژن نوع  II به روش RT-PCR : استخراج RNA­ی کل از نمونه­های کنترل و نمونه­های مربوط به آلژینات در روزهای ۳، ۵، ٧، 10 و١٤ به منظور استفاده در RT-PCR انجام گرفت. میزان خلوص RNA استخراج شده از نمونه­ها، بوسیله اندازه­گیری نسبت جذبی٢٨٠/٢٦٠ نانومتر تعیین گردید. پس از تعیین غلظت­های استخراج شده، با توجه به کمترین غلظت استخراج شده میزان یکسان ١۳٠٠ نانوگرم RNA از تمامی نمونه­ها جهت ساخت cDNA استفاده شد و در نهایت مطابق آنچه در بخش روش­ها ارائه شد، واکنش PCR برای ژن­های کلاژن تیپ دو (به عنوان مارکر سلول­های کندروسیت) و ژن  GAPDH(به عنوان (Housekeeping gene انجام شد و در پایان محصولات PCR بر روی ژل آگارز ٢% برده شد که در شکل ٦ قابل مشاهده می­باشد. با توجه به پرایمرهای انتخاب شده، طول قطعات سنتز شده مربوط به GAPDH و کلاژن تیپ دو به ترتیب برابر ۵٢٠ و bp ۳٦١ می­باشد.

 

 

شکل 5- نمودار درصد سلول های کنترل و کشت شده در بستر آلژینات  رنگ شده توسط آلشین بلو در روز های ۳، ۵، ٧، 10 و ١٤.

 

شکل ٦- تصویر الکتروفورز محصولات PCR مربوط به تکثیر توالی کلاژن تیپ دو و GAPDH برروی ژل آگارز. MW- مارکر مولکولی DNA  Neg , Pos   نمونه های کنترل مثبت و کنترل منفی.   C3-5- نمونه های کنترل(به ترتیب روزهای۳، ۵، ٧ و١٤). Alg3-14َ- نمونه های آلژینات(به ترتیب روزهای۳، ۵، ٧و 10 و١٤).


باندهای حاصل توسط برنامه Total Lab به صورت کمی در آمدند و سپس عمل نرمال سازی داده­ها بوسیله داده­های مربوط به Housekeeping gene صورت گرفته و نتایج حاصلر براساس داده­های بدست آمده در شکل7 نشان داده شده است. با توجه به نمودار فوق، بیشترین بیان کلاژن نوع II در سلول­های درون مهره­های آلژینات مشاهده می­شود. بطوریکه درصد بیان کلاژن نوع II سلولهای کنترل و کشت داده شده در بستر آلژینات به ترتیب در روز سوم (5 ± 70 و 4.5 ± 43) و در روز چهاردهم (1.4 ± 77 و2.8 ± 54) نسبت به بیان ژنGAPDH  می­باشد.


 

شکل 7- درصد بیان کلاژن نوع دو در سلول های کنترل و آلژینات  در روز های ۳، ۵، ٧، 10 و ١٤


بحث

تحقیقات جهت تولید بافت­ها در محیط آزمایشگاهی قبل از کاشت در درون بدن، یک حوزه تحقیقاتی بسیار گسترده می باشد. این تحقیقات بیشتر تکیه برکشت جمعیت­های ویژه سلولی در Ex vivo در سطح و یا در داخل داربست­های سنتزی و یا طبیعی که مناسب انتقال به بدن و پیوند عضو دارد. کنترل رفتار جمعیت سلولی در محیط Ex vivo و همچنین توجه به پاسخ آن­ها در محیط میزبان بسیار مهم می­باشد. ظرفیت محدود غضروف مفصلی در ترمیم و بازسازی ذاتی خود، به فقدان سیستم عروقی و همچنین به میزان کم و پراکنده سلول­های کندروسیت در ماتریکس خارج سلولی در این بافت نسبت داده می­شود و در پی این محدودیت، یک جراحت و آسیب کوچک منجر به صدمه و تخریب مفصل می­شود. گرچه متدهای بی­شماری نظیر Subchondral drilling، Osteochondral allografting و... در جهت ترمیم ضایعات غضروفی انجام گرفته­اند اما این تکنیک­ها، قادر به باز تولیدی خصوصیات بافت غضروف نمی­باشند. اما امروزه ثابت شده است که تکنیک مهندسی بافت بر پایه سلول­های بنیادی، یکی از مهمترین درمان­های مناسب و امید بخش برای درمان آسیب­های غضروفی می باشد (7).

توانایی سلول­های بنیادی مزانشیمال چه از منابع مغز استخوان و چه از بافت چربی در تمایز به سلول­های غضروفی این سلول­ها را منبع مناسبی برای ایجاد غضروف می­سازد و فنوتیپ غضروفی و بقا آن در این سلول­ها توسط TGF-ß1  القا می­شود (25).

در مطالعه صورت گرفته، نشان داده شد که بافت چربی انسانی، منبع بافتی مناسبی برای جداسازی سلول­های بنیادی مزانشیمال می­باشد چرا که این بافت به راحتی و به طور روتین در مقادیر لیتری از جراحی­های لیپوساکشن در دسترس می باشد و بازده سلولی آن (%5-١) نسبت به منبع بافتی مغز استخوان (%001/٠-٠١/٠) بسیار بالاتر می­باشد (15). سلول­های بنیادی بدست آمده از بافت چربیhASC، سلول­هایی چند توانه بوده و قادر به بیان خصوصیات بیوشیمیایی آدیپوسیت­ها، استئوبلاست­ها، کندروسیت­ها و مایوسیت­ها تحت شرایط کشت مناسب می­باشند. همچنین نشان داده­اند که قادر به برآورده ساختن بسیاری از انتظارات نظیر آنچه در بالا مطرح شد می­باشند و توانایی تولید تعداد کافی سلول جهت کاربردهای مهندسی بافت را دارا می­باشند (11). همچنین در طی این مطالعه نشان داده شده که سلول­های مزانشیمال جداسازی شده از بافت چربی بدون از دست دادن خصوصیات مرفولوژیک خود دارای توانایی تکثیر بالایی در محیط کشت می­باشند.

بسیاری از تحقیقات تاکنون شرایط ضروری جهت غضروف­زایی برای سلول­های مزانشیمی انسانی نظیر محیط­های کشت سه بعدی، فاکتورهای رشد، محیط­های رشد با میزان کم سرم و یا فاقد سرم را نشان داده­اند (24).

Ballock و همکارانش نشان دادند که دستکاری و تغییرات غلظت سرم به سطوح مطلوب کمتر از ١/٠ و٠١/٠ درصد در محیط کشت تمایزی ایجاد غضروف منجر به تشکیل جنبه­های ایجاد توسعه در معماری غضروف می­شود (2).

در مطالعات صورت گرفته، چندین سیتوکاین گزارش شده­اند که در تبدیل سلول­های مزانشیمال به سلول­های کندروسیت مؤثر می­باشند. در این میان TGF-β در استخوان بسیار متراکم می­باشد و مقدار آن متجاوز از μg/kg٢٠٠ در بافت می باشد. این فراوانی در میزان TGF-β بیان کننده نقش مهم این سیتوکاین در این بافت می­باشد (13). برخی دیگر از محققین نشان داده­اند که چندین عضو از خانواده TGF-β، نقش مهمی را در تمایز غضروفی ایفا می­کنند (24).

در مطالعه انجام شده، ما از 1TGF-β به منظور تمایز سلول­های مزانشیمال به سلول­های کندروسیت استفاده کردیم و با توجه به نتایج حاصل از رنگ­آمیزی هیستوشیمی صورت گرفته توسط آلشین بلو و بیان پروتئوگلیکان­های سولفاته و نتایج حاصل از تست RT-PCR و بیان ژن کلاژن تیپ دو به عنوان مارکر سلول­های کندروسیت در شرایط کشت کنترل و آلژینات و در مقایسه با کنترل منفی مربوط به سلول­های مزانشیمی در روز صفر، نشان داده شد که 1TGF-β فاکتور رشد مؤثری در تمایز سلول­های مزانشیمی به سلول­های کندروسیت و القاء فنوتیپ ویژه غضروفی در این سلول­ها در جهت تأیید مطالعات قبلی در رابطه با این سایتوکاین، می­باشد. برخی از محققین نشان داده­اند که سلول­ها قابلیت تمایز در بسترهایی مانند آگار، آلژینات، ژلاتین و حتی محیط­های سوسپانسیون که توانایی حفظ شکل گرد شده کندروسیتی را داشته باشند، دارند و به نظر می­رسد وجود این بسترها برای حفظ فنوتیپ سلول­ها ضروری می­باشد (24).

در مقایسه با سیستم­های کشت شرح داده شده به صورت سیستم­های کشت تک لایه دو بعدی برای کشت سلول­های غضروفی، امروزه تکنیک­های کشت سلول سه بعدی با هدف تولید داربست­های متخلخل که موجب تسهیل اتصال سلول و رشد آن­ها می­شوند، با بکارگیری انواع گسترده­ای از بیومواد شامل پلیمرهای سنتزی تا پلیمرهای طبیعی، بسیار توسعه یافته اند و در این میان بیشترین استفاده از سیستم­های کشت مربوط به ژل آگارز که موجب تحریک شبکه­های سه بعدی پروتئوگلیکان­ها در طی کشت می­شود، به عمل آمده است (1).

در رابطه با مرفولوژی سلول­ها همان طور که بیان شد با انتقال سلول­های مزانشیمال به درون مهره­های آلژینات و تمایز این سلول­ها به سلول­های کندروسیت، سلول­ها فنوتیپ ویژه کندروسیتی را از خود نشان داده و به شکل گرد در آمدند. در حالیکه سلول­ها در شرایط کنترل و بر روی ظروف کشت معمولی (پلاستیک) پس از تمایز نیز مرفولوژی فیبروبلاستی شکل خود را حفظ کرده و به صورت چسبیده به سطح باقی می­مانند و تنها تعداد محدودی از سلول­ها (کمتر از1%) فنوتیپ ویژه کندروسیتی را از خود نشان دادند. پایداری فنوتیپ کندروسیتی مشکل اصلی و اساسی در مطالعات In vitro در رابطه با مهندسی بافت غضروف می­باشد. نکته قابل توجه این است که بقاء فنوتیپ ویژه غضروفی برای حفظ ساختار و خصوصیات بیومکانیکی غضروف بسیار مهم می­باشد (22).

همان طور که در بخش نتایج نشان داده شد در رنگ­آمیزی هیستوشیمیایی توسط آلشین بلو، سلول­های مزانشیمال پس از تمایز به سلول­های کندروسیت در شرایط ذکر شده آلژینات پروتئوگلیکان­های سولفاته را که به طور فراوان در سلول­های کندروسیت یافت می­شود، را بیان کردند. که این رنگ­آمیزی مثبت خود، تأیید کننده تمایز سلول­های مزانشیمال جداسازی شده به سلول­های کندروسیت می­باشد. اما تفاوت، در میزان سلول­های بیان کننده این ماکرو مولکول­ها در شرایط مطرح شده می­باشد. با گذشت زمان در بررسی بیان پروتئوگلیکان­های سولفاته از روز صفر تا روز چهاردهم از تمایز، افزایش تعداد سلول­های بیان کننده این ماکرو مولکول­ها در شرایطی که سلول­ها درون مهره­های آلژینات قرار داشتند نسبت به سلولهای کنترل کشت داده شده، گویای این مطلب است که سلول­های مزانشیمال بیشتری درون مهره­های آلژینات به سلول­های کندروسیت تمایز می­یابند. بنابراین می­توان این گونه نتیجه گرفت که مهره­های آلژینات شرایط مطلوب­تری را برای تمایز سلول­های مزانشیمال به سلول­های کندروسیت نسبت به  کنترل مهیا می­کنند.

از تست­های انجام شده در رابطه با تأیید و چگونگی تمایز سلول­های مزانشیمال به سلول­های کندروسیت، بررسی بیان ژن کلاژن تیپ دو به عنوان یک ژن مشخص در سلول­های کندروسیت به روش RT-PCR می­توان اشاره کرد. پس از نرمال سازی داده­های بدست آمده از محصولات PCR مربوط به تکثیر توالی کلاژن تیپ دو نسبت بهHousekeeping gene(GAPDH)، مشخص شد که بیان این ژن در روزهای مختلف تمایز در ارتباط با سلول­های درون آلژینات بیشتر از دو شرایط دیگر می­باشد و بیشترین میزان بیان در روز چهاردهم از تمایز مشاهده گردید. این نتایج نیز در تأیید نتایج حاصل از رنگ­آمیزی هیستوشیمیایی توسط آلشین بلو، نشانه آن است که سلول­های مزانشیمال بیشتری درون مهره­های آلژینات به سلول­های کندروسیت تمایز می­یابند و بیان قویتری برای این سلول­ها در رابطه با کلاژن تیپ دو در شرایط آلژینات نسبت به کنترل تفاوت معنی­داری در میزان بیان این ژن در آن­ها مشاهده می­شود.

با توجه به نتایج و بحثهای ارائه شده می­توان نتیجه­گیری کرد که زیست پلیمر و مهره­های آلژینات می­تواند یک سیستم In vitro مناسب جهت کاربری در تولید و مهندسی بافت غضروف انسانی باشند.

1.Bahrami, S., Stratmann, U., Wiesmann, h., Mokrys, K., Bruckner, P., and Szuwart, T., 2000. Periosteally derived osteoblast-like cells differentiate into chondrocytes in suspension culture in agarose. Journal of The Anatomical record. 259, PP: 124-130.

2.Ballock, R. T., and Reddi, A. H., 1994. Thyroxine is the serum factor that regulates morphogenesis of columnar cartilage from isolated chondrocytes in chemically defined medium. Journal of Cell biology. 126, PP: 1311-1318.

3.Barry, F. P., and Murphy, J. M., 2004. Mesenchymal stem cells: clinical applications and biological characterization. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 36, PP: 568–584.

4.Bianco, P., and Robey, P. G., 2001. Stem cells in tissue engineering. Journal of Nature. 414: 6859, PP: 118-121.

5.Bochev, I., Elmadjian, G., Kyurkchiev, D., Tzvetanov, L., Altankova, I., Tivchev, P., and Kyurkchiev, S., 2008. Mesenchymal stem cells from human bone marrow or adipose tissue differently modulate mitogen-stimulated B-cell immunoglobulin production in vitro. Journal of Cell Biology International. 32, PP: 384-393.

6.Bucco. M., Ghidoni. I., et al., 2008. Alginate cell encapsulation: new advances in reproduction and cartilage regenerative medicine. Cytotechnology. 58, PP: 49–56.

7.Chen, G., Liu, D., Tadokoro, M., Hirochika, R., Ohgushi, H., Tanaka, J., and Tateish, T., 2004. Chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells cultured in a cobweb-like biodegradable scaffold. Journal of Biochemical and Biophysical Research Communications. 322, PP: 50-55

8.Chen, Y., Shao, J., Xiang, L., Dong, X., and Zhan, G., 2008. Mesenchymal stem cells: A promising candidate in regenerative medicine. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40, PP: 815–820.

9.Dawson, E., Mapili, G., Erickson, K., Taqvi, S., and Roy, K., 2008. Biomaterials for stem cell differentiation. Journal of Advanced Drug Delivery Reviews. 60, PP: 215–228.

10.Drury, J. L., and Mooney, D. J., 2003. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Journal of Biomaterials, 24, PP: 4337–4351.

11.Gimble, J., and Guilak, F., 2003. Adipose-derived adult stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential. Journal of Cytotherapy, 5, PP: 362–9.

12.Gomillion, C. T., and Burg, K. J. L., 2006. Stem cells and adipose tissue engineering. Biomaterials. 27, PP: 6052-6063.

13.Iwasaki, M., Nakata, K., Nakahara, H., Nakase, T., Kimura, T., Kimata, K., Capla, N. A. I., and Ono, K., 1993. Transforming Growth Factor-β1 Stimulates Chondrogenesis and Inhibits Osteogenesis in High Density Culture of Periosteum-Derived Cells. Journal of Endocrinology. 132, PP: 1603-1608.

14..Liao, S., Chan, C. K., and Ramakrishna, S., 2008. Stem cells and biomimetic materials strategies for tissue engineering. Journal of Materials Science and Engineering C. 28, PP: 1189–1202.

15.Merceron, C., Vinatier, C., Clouet, J., Colliec-Jouault, S., Weiss, P., and Guicheux, J., 2008. Adipose-derived mesenchymal stem cells and biomaterials for cartilage tissue engineering. Joint Bone Spine. 75:6, PP: 672-674.

16.Nair, L. S., and Laurencin, C. T., 2007. Biodegradable polymers as biomaterials Journal of Progress in Polymer Science. 32, PP: 762–798.

17.Nardi, N. Beyer, and da Silva Meirelles, L., 2006. "Mesenchymal Stem Cells: Isolation, In Vitro Expansion and Characterization". Anna M., Boheler, Kenneth. Stem Cells. Handbook of experimental pharmacology. 174, PP: 249–82.

18.Sachlos, E., and Czernuszka, J. T., 2003. Making tissue engineering scaffolds work. Review on the application of solid freeform fabrication technology to the production of tissue engineering scaffolds. Journal of European Cells and Materials. 5, PP: 29-40.

19.Sethe, S., Scutt, A., and Stolzing, A., 2006. Aging of mesenchymal stem cells. Journal of Ageing Research Reviews. 5, PP: 91–116.

20.Shin, H., Jo, S., and Mikos, A. G., 2003. Biomimetic materials for tissue engineering. Biomaterials, 24, PP: 4353-4364.

21.Steedman, H. F., 1950. Alcian blue 8GS, A new stain for mucin. Quarterly Journal of Microscopic Science. 91, PP: 477-479.

22.Stokes, D. G., Liu, G., Dharmavaram, R., Hawkins, D., Piera-velazquez, S., and Jimenez, A., 2001. Regulation of type ІІ collagen gene experession during human chondrocyte de-differentiation and recovery of chondrocyte-specific phenotype in culture involves Sry-type high-mobility-group (SOX) transcription factors. Journal of Biochemical. 360, PP: 461-470.

23.Tae, S., Lee, S., Park, J., and Im, G., 2006. Mesenchymal stem cells for tissue engineering and regenerative medicine, Biomed. Mater. 1, PP: 63–71.

24.Yang, I. H., Kim, S., Kim, Y. H., Sun, H. J., Kim, S. J., and Lee, j. W., 2004. Comparison of phenotypic characterization between Alginate bead and pellet culture systems as chondrogenic differentiation models for human mesenchymal stem cells. Journal of Yonsei Medical Journal, 45, PP: 891-900.

25.Zeiter, S., Lezuo, P., Ito, K., 2009. Effect of TGF beta1, BMP-2 and hydraulic pressure on chondrogenic differentiation of bovine bone marrow mesenchymal stromal cells. Biorheology. 46(1), PP: 45-55.