نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه ارومیه
2 دانشگاه ارومیه پژوهشکده آرتمیا
چکیده
با توجه به تولید روزافزون نانوذرات روی و اکسیدآهن و کاربردهای مفید آنها در سیستمهای بیولوژیک، تاکنون مطالعات کمی در زمینه اثرات جانبی این مواد بر بدن جانداران صورت گرفته است. هدف از مطالعه حاضر بررسی اثرات تغذیهای نانوذرات روی و اکسیدآهن بر بافتهای کبد و عضله ماهی قزلآلای رنگینکمان (Oncorhynchusmykiss) بود. برای این منظور تعداد 420 قطعه ماهی قزلآلای رنگینکمان (با میانگین وزن اولیه 7/4±45 گرم) از یکی از مزارع پرورش ماهی تهیه و بلافاصله به آزمایشگاه منتقل شدند. بلافاصله ماهیان ضدعفونی و به مدت 10 روز با شرایط آزمایشگاهی سازش یافتند. سپس ماهیان به صورت تصادفی به هفت گروه تقسیم شدند، گروه اول به عنوان شاهد در نظر گرفته شد و سایر گروهها به ترتیب مقادیر 10، 50 و 100 میکروگرم از نانوذرات روی و اکسیدآهن را در هر گرم غذا به مدت 60 روز دریافت کردند. جهت بررسیهای بافتی نمونهبرداری در روزهای صفر، 30، 60 و 75 (15 روز پس از قطع تغذیه با نانوذرات) انجام شد. نتایج حاصل از مطالعه بافت کبد و عضله با رنگآمیزی هماتوکسیلین_ائوزین در گروههایی که نانوذرات روی و اکسیدآهن را دریافت کرده بودند نشان دهنده آسیبهای جدی در هپاتوسیتهای کبدی از جمله: لیپیدوز، التهاب و برهم ریختن نظم لبول کبدی بود. با توجه به نتایج موجود میتوان نتیجه گرفت که کاربرد نانوذرات روی و اکسیدآهن در شرایط in vivo حتی در مقادیر کم در کبد اثرات سوء بافتی دارند در حالیکه سبب بهبود شاخصهای رشد قزلآلای رنگینکمان میشوند.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Effects of Iron oxide and zinc nanoparticles on the liver and muscles in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)
نویسندگان [English]
چکیده [English]
According to production of Zinc and Iron oxide nanoparticles and useful application of them in biological systems, less studies on side effects of these materials has been carried out in animals. The purpose of this study was to evaluate the effect of zinc and Iron oxide nanoparticles on the liver and muscles tissues in rainbow trout. For in purpose four hundred and twenty rainbow trout (with initial weight 45±4.7 g) were prepared from a local fish farm and immediately transferred to the laboratory. Immediately disinfect and acclimatized fish to the laboratory conditions for 10 days, then randomly distributed into seven groups. Group one selected as control group that received normal diet and other groups received different amount of 10, 50 and 100 µg/g of nanoparticles a commercial pellet diet for 60 days. To evaluate the tissue sampling was scheduled at the day of 0, 30, 60 and 75 (after 15 days cessation of feeding with nanoparticles). The results of the liver and muscle histological studies with Hematoxilen and Eosine staining showed that in groups which received Zinc and Iron oxide nanoparticles, serious damages in liver hepatocytes including: lipidose, inflammation and disruption of hepatic lobules. Thus it can be concluded that the application of Zinc and Iron oxide nanoparticles in conditions invivo, even in small amounts, had adverse effects on the liver tissue, however the growth parameters were improved in rainbow trout.
کلیدواژهها [English]
بررسی تأثیر نانوذرات اکسیدآهن و روی بر بافت کبد و عضله در ماهی قزلآلای رنگین کمان (Oncorhynchus mykiss)
اکرم حاجیرحیمی1*، فرح فرخی1 و امیر توکمهچی2
1 ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی
2 ارومیه، دانشگاه ارومیه، پژوهشکده آرتمیا و آبزیان
تاریخ دریافت: 16/10/92 تاریخ پذیرش: 5/7/93
چکیده
با توجه به تولید روزافزون نانوذرات روی و اکسیدآهن و کاربردهای مفید آنها در سیستمهای زیستی، تاکنون مطالعات کمی در زمینه اثرات جانبی این مواد بر بدن جانداران صورت گرفته است. هدف از مطالعه حاضر بررسی اثرات تغذیهای نانوذرات روی و اکسیدآهن بر بافتهای کبد و عضله ماهی قزلآلای رنگینکمان (Oncorhynchus mykiss ) بود. برای این منظور تعداد 420 قطعه ماهی قزلآلای رنگینکمان (با میانگین وزن اولیه 7/4±45 گرم) از یکی از مزارع پرورش ماهی تهیه و بلافاصله به آزمایشگاه منتقل شدند. بلافاصله ماهیان ضدعفونی و به مدت 10 روز با شرایط آزمایشگاهی سازش یافتند. سپس ماهیان بصورت تصادفی به هفت گروه تقسیم شدند، گروه اول بعنوان شاهد در نظر گرفته شد و سایر گروهها بترتیب مقادیر 10، 50 و 100 میکروگرم از نانوذرات روی و اکسیدآهن را در هر گرم غذا به مدت 60 روز دریافت کردند. جهت بررسیهای بافتی نمونهبرداری در روزهای ابتدایی، 30، 60 و 75 (15 روز پس از قطع تغذیه با نانوذرات) انجام شد. نتایج حاصل از مطالعه بافت کبد و عضله با رنگآمیزی هماتوکسیلین-ائوزین در گروههایی که نانوذرات روی و اکسیدآهن را دریافت کرده بودند نشان دهنده آسیبهای جدی در هپاتوسیتهای کبدی از جمله: لیپیدوز، التهاب و برهم ریختن نظم لوبول کبدی بود. با توجه به نتایج موجود میتوان نتیجه گرفت که کاربرد نانوذرات روی و اکسیدآهن در آزمایش بر روی موجودات زنده حتی در مقادیر کم در کبد اثرات سوء بافتی دارند در حالیکه سبب بهبود شاخصهای رشد قزلآلای رنگینکمان میشوند.
واژههای کلیدی: قزلآلای رنگینکمان، نانوذره روی، اکسیدآهن، کبد، عضله
* نویسنده مسئول، تلفن: 09360109698 ، پست الکترونیکی: akramhajirahimi@yahoo.com
مقدمه
امروزه فرآوردههای دریایی نقش قابل توجهی در تأمین غذای بشر دارند، با شناسایی ارزش و برتری غذایی این فرآوردهها بر دیگر مواد پروتئینی، روز به روز بر مصرف آنها افزوده میشود (14و25). مزایای تغذیه از پروتئینهای دریایی باعث شده که آبزیان بعنوان مهمترین ماده غذایی تأمین کننده احتیاجات غذایی جوامع بشری مورد توجه قرار گیرند (18). غذاهای دریایی بعلت کیفیت بالای پروتئین، از اهمیت بسیار زیادی برخوردار هستند. غذاهای دریایی تمام آمینواسیدهای لازم را در اختیار بدن قرار میدهند و در ساختمان بافتها و بازسازی آنها نقش بسزایی دارند. غذاهای دریایی براحتی قابل هضم میباشند، زیرا بافتهای پیوندی کمی دارند، به همین دلیل در برخی از رژیمهای غذایی، خوردن گوشت ماهی توصیه میشود. غذاهای دریایی نسبت به غذاهای دیگر از لحاظ پروتئینی غنیتر بوده و چربیهای آنها نیز بیضرر میباشند. همچنین غذاهای دریایی حاوی مقداری آهن، روی و مس میباشند. این مواد به آنزیمها و پروتئینها در فعالیتهای بیوشیمیایی بدن کمک میکنند (11). همگام با رشد تقاضا، افزایش روند آلودگی زیست بومهای دریایی بشکلی جدی، احتمال بروز مشکلات کیفی در این منبع ارزشمند غذایی را تشدید کرده است (42). فناوری نانو حوزه نسبتاً جدید و در حال تکامل است. نانو مواد عموماً رفتاری متفاوت نسبت به هم نوع خود در مقیاس بزرگتر از نانو دارند. در مقیاس نانو، مساحت سطح ذرات بسیار افزایش مییابد که میتواند منجر به واکنشپذیری بیشتر مواد شود، چرا که در این شرایط، اتمها سطح کنترل خواص فیزیکی و شیمیایی ماده را تحت الشعاع قرار میدهند. همچنین خواص نوری، گرمایی و الکتریکی مواد تغییر میکند و اثرات کوانتومی مهم میشود (19). نانوذرات دارای ویژگیهای خاص شیمیایی و فیزیکی از نظر اندازه، شکل و نسبت بالای سطح به حجم میباشند. این صفات کاربرد آنها را در بسیاری از موارد پزشکی و زیست شناسی مناسب ساخته است. گاهی اندازه آنها کوچکتر و یا در حد ساختارهای سلولی، ویروس، پروتئین و یا یک ژن میباشد. این مواد پس از تزریق به جانوران بسرعت در اکثر اندامها و بافتها توزیع شده و پدیده جذب سلولی آنها بسیار شدید میباشد (21). نانوذرات اکسیدآهن دارای کاربردهای زیست پزشکی زیادی از قبیل بازسازی بافتی، ایمنی سنجی، رفع مسمومیت مایعات زیستی، گرما درمانی سلولهای سرطانی و... میباشند (28). نانوذرات اکسیدآهن بعنوان عنصر ایجاد کننده تضاد در MRI (Magnetic Resonance Imaging) استفاده میشوند. امروزه از نانوذرات اکسیدآهن جهت نشانهگذاری سلولهای بنیادی و ردیابی آنها استفاده میشود (6). نانوذرات اکسیدآهن بدلیل خواص فیزیکوشیمیایی که دارند بعنوان حاملهای دارویی در درمان سلولهای سرطانی در محیطهای زنده نیز استفادههای گستردهای دارند (32). مواد معدنی بسته به نقش زیستی خود میتوانند در گروههای مختلفی همچون عناصر ضروری، غیرضروری و سمی طبقهبندی شوند (26). در این طبقهبندی، فلزاتی مثل آهن، روی و مس در گروه عناصر ضروری قرار میگیرند چرا که آنها نقش مهمی در سیستمهای زیستی ایفا میکنند (27). اهمیت و نقش عناصر ضروری در تشکیل و پایداری بافتها، تنظیم فرایندهای مختلف حیاتی، شرکت در جذب مواد غذایی از لوله گوارش و ورود مواد غذایی به داخل سلولها، حفظ PH (potential of hydrogen) خون و مایعات بدن در محدوده فیزیولوژیک و... موجب شده که پژوهش پیرامون نقش و اهمیت این عناصر در حوزههای علوم زیستی و تغذیه از اهمیت ویژهای برخوردار باشد. کمبود عناصر ضروری در بدن که ممکن است ناشی از عدم وجود مقادیر کافی این عناصر در رژیم غذایی و یا منابع طبیعی محل زندگی، عوامل عفونی، بعضی از بیماریهای کاهش دهنده جذب، دفع بیش از اندازه و یا شرایط فیزیولوژیک خاص باشد که در طی آن نیاز بدن به عناصر ضروری افزایش مییابد میتواند موجب بروز اختلالات فیزیولوژیک و علائم بالینی گوناگونی شود (3).
البته عناصر ضروری زمانی که دریافت بیش از حدی داشته باشند، میتوانند اثرات سمی ایجاد کنند (27). کمبود آهن و روی، یکی از مشکلات تغذیهای شایع در کشور ما و بسیاری از کشورهای توسعه یافته به شمار میرود. در این میان کودکان و مادران باردار در معرض خطر بیشتری قرار دارند، زیرا کودکان و نوزادان برای حفظ رشد و تکامل مطلوب، به ریز مغذیهای بیشتری نیازمند هستند (7). در مورد کمبود ریزمغذیها، آنچه کمتر مورد توجه و قابل مشاهده است، کاهش معنیداری است که کمبود ریزمغذیها در رشد و نمو بدنی و ذهنی کودک پدید میآورند (39). روی نیز یکی از عناصر مورد نیاز آبزیان است که در بسیاری از سیستمهای آنزیمی موثر بر متابولیسم مواد غذایی، بعنوان کوفاکتور (کوفاکتورها اجزای غیر پروتئینی برخی آنزیمها هستند و برخی از آنزیمها برای اینکه بتوانند نقش کاتالیزوری خود را انجام دهند به این کوفاکتورها نیاز دارند) عمل میکند (23). موجودات دریایی خصوصاً ماهی منبع بسیار خوبی برای تأمین عناصر معدنی مورد نیاز بدن انسان مانند آهن و روی محسوب میگردند (26). بافتشناسی در حال حاضر بعنوان یکی از رشتههای علمی، به مطالعه ساختمانهای کوچک جانوران و گیاهان با استفاده از روشهای ریزبینی میپردازد. اگر قرار باشد منابع و ذخایر آبزیان حفظ و یا افزایش داده شود و در عین حال هدف توسعه روشهای ماهیگیری فعلی باشد، لازم است اطلاعات و یافتههای بیشتر و کاملتری از فیزیولوژی ماهی تهیه شود. تحقیقات بافتشناسی در اغلب موارد بطور مستقیم و یا غیرمستقیم سهم قابل ملاحظهای در جهت کسب این نتایج، بوجود میآورد. به همین دلیل آسیب شناسی بافت اهمیت فراوانی در تشخیص، سببشناسی و پیشگیری از بیماریها دارد (33). در این پژوهش برای ایجاد ماهی با کیفیت لاشه بالا که احتمالاً بتواند بعنوان منبع غذایی غنی از آهن و روی مورد استفاده قرارگیرد، نانوذرات اکسیدآهن و روی در غلظتهای مختلف جهت تعیین غلظت مفید این عناصر برای ماهی به جیره غذایی اضافه و اثرات بافتی آنها مورد بررسی قرارگرفت.
مواد و روشها
تهیه و ذخیرهسازی ماهی: برای این منظور تعداد 420 قطعه ماهی قزلآلای رنگینکمان با میانگین وزنی 7/4 ± 45 گرم از یکی از مزارع پرورش ماهی میاندواب تهیه شد. سپس ماهیان به کمک تانکر مجهز به کپسول اکسیژن به سالن تکثیر و پرورش آبزیان پژوهشکده آرتمیا و آبزیان، دانشگاه ارومیه منتقل شدند. بلافاصله پس از انتقال، ماهیان با آب نمک (3 گرم در لیتر) ضدعفونی شده و به مدت 10 روز جهت سازگاری با شرایط آزمایشگاهی و هر گونه آلودگی انگلی خارجی در حوضچههای 1000 لیتری مستطیل شکل، سفید پلی ونیل کلراید (Poly Vinyl Chloride) نگهداری شدند. در ضمن برای تغذیه ماهیان در دوره سازش فقط از غذای تجاری آماده (فرادانه، ایران) استفاده شد. پس از اتمام دوره سازش ماهیان بصورت تصادفی به هفت گروه تقسیم شدند و هر گروه دارای سه تکرار بوده و پرورش در استخرهای بتنی با ابعاد (45/0×4/5 متر مربع) که تا ارتفاع 3/0 متر آبگیری شدند، با تراکم 20 قطعه در هر استخر صورت گرفت. گروه اول بعنوان شاهد در نظر گرفته شد و با غذای تجاری بدون افزودن هر گونه نانوذره تغذیه شدند. سایر گروهها بترتیب با غذای تجاری حاوی غلظتهای مختلف نانوذرات مورد تغذیه قرارگرفتند. در بررسی حاضر، نانوذرات مورد استفاده توسط آزمایشگاه شیمی تجزیه پژوهشکده زیست فناوری دانشگاه ارومیه تهیه و در غلظتهای مختلف بر حسب میکروگرم در هر گرم غذا مورد استفاده قرارگرفتند. طول دوره آزمایش 60 روز بود و سپس 15 روز دیگر مطالعه ادامه یافت و در این مدت، ماهیان فقط با غذای گروه شاهد بدون افزودن نانوذرات تغذیه شدند. در طول دوره مطالعه برای بررسی پارامترهای فیزیکوشیمیایی دما، PH (potential of hydrogen)، میزان اکسیژن محلول توسط دماسنج و pH متر (HANNA instrument, USA) و اکسیژن متر دیجیتالی (HANNA instrument, USA) اندازهگیری و ثبت شد.
نحوه سنتز زیستی نانوذرات: در بررسی حاضر، امکان سنتز زیستی کلوئید نانوذرات روی و اکسیدآهن با استفاده از گیاهان دارویی مورد ارزیابی قرارگرفت. برای این منظور در مرحله اول، نانوذرات روی با استفاده از عصاره آبی گیاهان ترنجبین و ریشه گیاه چوبک تهیه شدند. در مرحله دوم، نانوذرات اکسیدآهن با استفاده از عصاره آبی درخت بلوط (گزانگبین) تهیه شدند. نانوذرات اکسیدآهن مورد استفاده در این پژوهش در ابعاد 35 نانومتر و نانوذرات روی در ابعاد 50 نانومتر توسط آزمایشگاه شیمی تجزیه دانشگاه ارومیه تهیه شد (13).
تهیه غذا و نحوه غذادهی ماهیان: جهت افزودن نانوذرات به غذای تجاری، ابتدا مقدار غذای روزانه هر گروه محاسبه و سپس مقدار مورد نیاز از نانوذره توسط ترازوی دیجیتالی وزن و در آب دیونیزه سوسپانسیون شده و برای اطمینان از اتصال نانوذره به غذا میزان 5/0 درصد ژلاتین به تمام قسمتهای غذا اضافه شده و بمدت 2 ساعت در داخل انکوباتور خشک گردید. در طول مطالعه جهت تغذیه ماهیان از غذاهای تجاری (FFT2، GFT1 وGFT2 ، فرادانه، ایران) استفاده گردید. گروه اول بعنوان شاهد انتخاب و در طول مطالعه با غذای تجاری و بدون افزودن هیچ نانوذرهای تغذیه شدند و برای یکسان کردن شرایط همه تیمارها به غذای آنها ژلاتین اضافه گردید. ماهیان گروه 2 تا 4 بترتیب مقادیر 10، 50 و 100 میکروگرم در یک گرم غذا نانوذره اکسیدآهن و ماهیان گروه 5 تا 7 بترتیب مقادیر 10، 50 و 100 میکروگرم در یک گرم غذا نانوذره روی را بمدت 60 روز از طریق جیرهی غذایی دریافت کردند. میزان غذادهی براساس جداول غذادهی، بر حسب وزن بدن ماهیان و درجه حرارت آب پرورشی انجام گرفت. میزان کل غذای روزانه هر تیمار تعیین و سپس به سه قسمت تقسیم شد، بدین ترتیب که غذادهی در سه نوبت صبح، ظهر و شب (بین 8 صبح تا 8 شب) انجام شد.
نمونهبرداری بافتی: در مطالعه حاضر بمنظور ارزیابی اثرات بافتی منابع مختلف آهن و روی نمونهبرداری در روزهای ابتدایی، ٣۰، ٦۰ و ٧٥ انجام شد. برای این منظور در هر دوره پس از بیهوشی، ماهیان از سطح شکمی تشریح شدند و بافتهای کبد و عضله برداشته شد و بلافاصله در محلول فرمالین 10 درصد قرارگرفتند. بعد از کامل شدن تثبیت، بافتها از محلول فرمالین خارج و مقاطع بافتی تهیه و پس از رنگآمیزی با هماتوکسیلین و ائوزین با میکروسکوپ نوری مورد مطالعه قرار گرفتند.
نتایج
تغییرات بافتشناسی در اثر محرکهای داخلی و خارجی ایجاد میشود که در هر صورت در نتیجه آشفتگی در سطح مولکولی سازماندهی زیستی رخ میدهد. بنابراین بررسی بافتشناسی یک شاخص جامع بوده که میتواند بصورت دقیق وضعیت سلامت ماهی و تجمع مواد آلاینده را بیش از حد نرمال در محیط زیست دریایی مشخص نماید (41).
از آنجا که کبد اندامی است که متابولیسم اولیه مواد غیرزیستی را انجام میدهد و با تغییر در ساختار ریختشناسی این مواد در برخی موارد سمزدایی مینماید (35). تأثیر آلایندگی فلزات بصورت افزایش یا کاهش فعالیت آنزیمهای کبدی و آسیبهای بافتی کبد بروز میکند (31). به همین دلیل بررسی آسیبهای بافتی کبد، شیوهای دقیق و مطمئن جهت ارزیابی تأثیر فلزات در محیط و شرایط آزمایشگاهی میباشد. مقایسه بافت آبشش و کبد ماهی کپور میتواند بعنوان یک بیومارکر مناسب جهت سنجش آلودگی در استخرهای پرورش ماهی و یا محیطهای طبیعی مانند رودخانهها به کار رود که با هزینه کمی میتوان آلودگی محیط و همچنین میزان تأثیر آلودگی را بر روی ماهیان مشخص نمود (5).
بافت عضله ماهیان بدلیل نقش مهم در تغذیه انسان و لزوم اطمینان از سلامت آن مورد بررسی میباشند (42).
در پژوهش حاضر تأثیر غلظتهای مختلف نانوذره اکسیدآهن و روی بر ریختشناسی و بافتشناسی کبد و عضله ماهی قزلآلای رنگینکمان مطالعه شد و نتایج بدست آمده شامل موارد زیر میباشد. جهت سهولت در نامگذاری شکلها از حروف لاتین جهت نامگذاری تیمارهای مختلف استفاده شد (جدول 1).
در بافت کبد نمونههای شاهد روز اول، در فضای پورت و بینابینی، دستجات سلولی کوچک و پراکنده و فضای بین سلولی وسیع و سینوزوئیدها بزرگتر بودند (شکل1، C1).
در بررسیهای بافتی کبد نمونههای شاهد روز 30 در در فضای پورت و بینابینی دستجات سلولی بزرگتر شده و سازمان یافتهتر بودند (شکل1،C30 ). در این بازه ی زمانی از پژوهش در هپاتوسیتهای اطراف فضای پورت و ناحیه بینابینی در نمونههای تیمار شده با غلظت 10 میکروگرم نانوذره اکسیدآهن، لیپیدوز کبدی مشاهده شد (شکل1، Fe10). در نمونههای تیمار شده با غلظت 50 میکروگرم نانوذره اکسیدآهن، در فضای پورت اتساع عروقی و در هپاتوسیتها لیپیدوز کبدی، دیده شد (شکل1، Fe50). در نمونههای تیمار شده با غلظت 100 میکروگرم نانوذره اکسیدآهن، علاوه بر لیپیدوز کبدی و اتساع عروقی در فضای پورت، پرخونی در کبد مشاهده شد (شکل1، Fe100). در نمونههای تیمار شده با غلظت 10 و 50 میکروگرم نانوذره روی، ساختار کبد طبیعی بود (شکل1، Zn50,Zn10). در نمونههای تیمار شده با غلظت 100 میکروگرم نانوذره روی، افزایش حجم سلولهای کبدی و سلولهای بیگانه خوار کوپفر، همچنین بهمریختگی دستجات هپاتوسیتها و پرخونی در کبد دیده شد (شکل1، Zn100).
جدول 1- نامگذاری مربوط به شکلهای بافت کبد (L) و عضله (M)
گروههای آزمایش روز |
گروه شاهد (کنترل)
|
غلظت10 میکروگرم اکسیدآهن |
غلظت 50 میکروگرم اکسیدآهن |
غلظت 100 میکروگرم اکسیدآهن |
غلظت 10 میکروگرم روی |
غلظت50 میکروگرم روی |
غلظت100 میکروگرم روی |
روز اول |
C1 |
Fe10 |
Fe50 |
Fe100 |
Zn10 |
Zn50 |
Zn100 |
روز 30 |
C30 |
Fe10 |
Fe50 |
Fe100 |
Zn10 |
Zn50 |
Zn100 |
روز 60 |
C60 |
Fe10 |
Fe50 |
Fe100 |
Zn10 |
Zn50 |
Zn100 |
روز 75 |
C75 |
Fe10 |
Fe50 |
Fe100 |
Zn10 |
Zn50 |
Zn100 |
گروه شاهد (کنترل): در طول دوره پژوهش توسط غذای تجاری تغذیه شدند و نانوذرهای را دریافت نکردند.
تیمار Fe10: گروهی که مقدار10 میکروگرم نانوذره اکسیدآهن را دریافت کردند.
تیمار Fe50: گروهی که مقدار 50 میکروگرم نانوذره اکسیدآهن را دریافت کردند.
تیمار Fe100: گروهی که مقدار 100 میکروگرم نانوذره اکسیدآهن را دریافت کردند.
تیمار Zn10: گروهی که مقدار10 میکروگرم نانوذره روی را دریافت کردند.
تیمار Zn50: گروهی که مقدار50 میکروگرم نانوذره روی را دریافت کردند.
تیمار Zn100: گروهی که مقدار100 میکروگرم نانوذره روی را دریافت کردند .
نتایج مربوط به یافتههای مطالعه بافت کبد در روز اول و 30
LC1 |
LC30 |
LFe10 |
LFe50
|
LFe100 |
LZn10
|
LZn50
|
LZn100
|
شکل 1- مقاطع عرضی تهیه شده از بافت کبد ماهی قزلآلای رنگینکمان در روز اول و 30 تیمار با نانوذرات اکسیدآهن و روی، بزرگنمایی 100×، رنگآمیزی H&E، تعداد نمونه n=8
نتایج حاصل از مطالعه بافت کبد در روز 60 بر روی تیمارهای شاهد نشان داد دستجات سلولی در فضای پورت و بینابینی نسبت به کبد نمونههای شاهد در روز اول و 30 بزرگتر و سازمان یافته تر بودند (شکل2، C60) در بافت کبد ماهیان روز 60، در هپاتوسیتها، لیپیدوز و تا حدودی بهم ریختگی دستجات سلولهای کبدی در نمونههای تیمار شده با غلظت 10 میکروگرم نانوذره اکسیدآهن مشهود بود (شکل2، Fe10). در نمونههای تیمار شده با غلظت 50 میکروگرم نانوذره اکسید آهن، شدت لیپیدوز و بهم ریختگی دستجات سلولهای کبدی افزایش یافته بود (شکل2، Fe50). در نمونههای تیمار شده با غلظت 100 میکروگرم نانوذره اکسیدآهن، آسیبهای کبد (لیپیدوز و بهم ریختگی دستجات سلولهای کبد) مشهودتر از آسیبهای ایجاد شده توسط غلظتهای 10 و 50 میکروگرم نانوذره اکسیدآهن بود (شکل2، Fe100). در نمونههای تیمار شده با غلظت 10 میکروگرم نانوذره روی، آسیبهای بافتی مشاهده شده در کبد عبارت بود از: واکوئلدار شدن هپاتوسیتها، اتساع ورید مرکزی و بهمریختگی دستجات سلولهای کبدی (شکل2،Zn10). با افزایش غلظت نانوذره روی به 50 و 100 میکروگرم در هر گرم غذای ماهیان، آسیبهای بافتی مشاهده شده در غلظت کم این نانوذره (10 میکروگرم در هر گرم غذای ماهیان) با شدت بیشتری بروز پیدا کردند (شکل2، Zn100,Zn50).
نتایج مربوط به یافتههای مطالعه بافت کبد در روز اول و 60
LC1 |
LC60 |
LFe10
|
LFe50
|
LFe100
|
LZn10 |
LZn50 |
LZn100 |
شکل 2- مقاطع عرضی تهیه شده از بافت کبد ماهی قزلآلای رنگینکمان در روز اول و 60 تیمار با نانوذرات اکسیدآهن و روی، بزرگنمایی 100×، رنگآمیزی H&E، تعداد نمونه n=8
در کبد نمونههای شاهد در روز 75 ساختار کبد نرمال بود (شکل3، C75). 15 روز پس از قطع تغذیه ماهیان (روز 75) توسط این نانوذرات، ترمیم بافت کبد در تمام گروههای تحت تیمار با نانوذرات اکسیدآهن به طور قابل ملاحظهای مشاهده شد (شکل3، Fe100,Fe50,Fe10). در نمونههای تیمار شده با غلظتهای کم و متوسط نانوذرات روی نیز 15 روز پس از قطع تغذیه ماهیان (روز 75) توسط این نانوذرات ترمیم بافت کبد مشهود بود (شکل3، Zn50,Zn10) اما در نمونههای تیمار شده با غلظت بالای نانوذره روی حتی 15 روز پس از قطع تغذیه ماهیان (روز 75) توسط این نانوذره هیچگونه ترمیم و بهبودی در بافت کبد مشاهده نشد (شکل3، Zn100).
در بافت عضله نمونههای شاهد در تمام طول دوره سلولهای عضلانی کوچک و تحلیل عضلانی دیده شد (شکل4، شکل5، شکل6، ,C75,C60,C30,C1). در نمونههای روز 30 تیمار شده با غلظت 10 میکروگرم نانوذره اکسیدآهن، سلولهای عضلانی نسبت به گروه شاهد رشد اندکی داشته و تحلیل عضلانی کمتر بود (شکل4، Fe10). در نمونههای تیمار شده با غلظت 50 و 100 میکروگرم نانوذره اکسیدآهن ترمیم و رشد بافت عضله روند صعودی داشت (شکل4، Fe100,Fe50). در نمونههای تیمار شده با غلظت 10 میکروگرم نانوذره روی نیز ترمیم و رشد مشاهده شد (شکل4، Zn10). در نمونههای تیمار شده با غلظت 50 میکروگرم نانوذره روی این ترمیم و رشد روند رو به رشدی را نشان میداد و در نهایت در نمونههای تیمار شده با غلظت 100 میکروگرم نانوذره روی ترمیم و رشد سلولهای عضلانی بسیار چشمگیر بود (شکل4، Zn100,Zn50).
نتایج مربوط به یافتههای مطالعه بافت کبد در روز اول و 75
LC1 |
LC75 |
LFe10
|
LFe50
|
LFe100
|
LZn10 |
LZn50 |
LZn100 |
شکل 3- مقاطع عرضی تهیه شده از بافت کبد ماهی قزلآلای رنگینکمان در روز اول و 75 (15 روز پس از قطع تیمار با نانوذرات اکسیدآهن و روی)، بزرگنمایی 100×، رنگآمیزی H&E، تعداد نمونه n=8
نتایج مربوط به یافتههای مطالعه بافت عضله در روز اول و 30
MC1 |
MC30 |
MFe10
|
MFe50
|
MFe100
|
MZn10
|
MZn50
|
MZn100
|
شکل 4- مقاطع عرضی تهیه شده از بافت عضله ماهی قزلآلای رنگینکمان در روز اول و 30 تیمار با نانوذرات اکسیدآهن و روی، بزرگنمایی 100×، رنگآمیزی H&E، تعداد نمونه n=8
پس از 60 روز، در نمونههای تیمار شده با غلظتهای مختلف نانوذره اکسیدآهن، ترمیم و رشد سلولهای عضلانی بدون کوچکترین اثری از تحلیل عضلانی مشاهده شد (شکل5، Fe100,Fe50,Fe10). در نمونههای تیمار شده با غلظت 10 میکروگرم نانوذره روی در عین حال که رشد مناسبی در سلولهای عضلانی به چشم میخورد مقداری تحلیل عضلانی نیز مشهود بود اما در نمونههای تیمار شده با غلظت 50 و 100 میکروگرم نانوذره روی ترمیم و رشد قابل ملاحظهای مشاهده شد که این ترمیم و رشد در غلظت بالا بیشتر بود (شکل5، Zn100,Zn50,Zn10).
15 روز پس از قطع تغذیه ماهیان (روز 75) توسط نانوذرات، بافت عضله که به مرور زمان و افزایش غلظت هر کدام از نانوذرات رشد چشمگیری را از خود نشان داده بود و تحلیل عضلانی جای خود را به سلولهای یکدست و منسجم داده بود، ساختار طبیعی خود را از دست داده و تحلیل عضلانی در همه گروههای آزمایش مشاهده شد (شکل6، Zn100,Zn50,Zn10,Fe100,Fe50,Fe10).
نتایج مربوط به یافتههای مطالعه بافت عضله در روز اول و 60
MC1
|
MC60
|
MFe10
|
MFe50
|
MFe100
|
MZn10
|
MZn50
|
MZn100
|
شکل 5- مقاطع عرضی تهیه شده از بافت عضله ماهی قزلآلای رنگینکمان در روز اول و 60 تیمار با نانوذرات اکسیدآهن و روی، بزرگنمایی 100×، رنگآمیزی H&E، تعداد نمونه n=8
نتایج مربوط به یافتههای مطالعه بافت عضله در روز اول و 75
MFe50
|
MFe10
|
MC75
|
MC1
|
MFe100
|
MZn10
|
MZn50
|
MZn100
|
شکل 6- مقاطع عرضی تهیه شده از بافت عضله ماهی قزلآلای رنگینکمان در روز اول و 75 (15 روز پس از قطع تیمار با نانوذرات اکسیدآهن و روی)، بزرگنمایی100×، رنگآمیزی H&E، تعداد نمونه n=8
نتیجهگیری کلی
مطالعه میکروسکوپی بافت کبد و مقایسه گروههای تیمار شده با نانوذرات با گروههای شاهد نشان داد که با مصرف نانوذرات آسیبهای بافتی در کبد ایجاد و با افزایش غلظت نانوذرات شدت این آسیبها بیشتر میشود اما سلولهای بافت کبد در تمام غلظتهای نانوذره اکسیدآهن و غلظت کم و متوسط نانوذره روی با برداشتن عامل القایی میتوانند دوباره فعالیت فیزیولوژیک خود را از سر بگیرند و ساختار بافت کبد ترمیم پیدا میکند و آسیبهای بافتی ایجاد شده برگشت پذیر بودند در حالی که بعد از قطع نانوذره روی در بالاترین غلظت خود این ترمیم در بافت کبد دیده نشد و آسیب بافتی ایجاد شده برگشت پذیر نبود.
مطالعه میکروسکوپی بافت عضله و مقایسه گروههای تیمار شده با نانوذرات با گروههای شاهد نشان داد که استفاده از نانوذرات در غذای ماهی جهت ترمیم عضلات مفید بوده و احتمالاً ماهیان روز اول و همچنین ماهیان گروه شاهد که هیچ نانوذرهای را دریافت نمیکردند به دلیل تحلیلی که در سلولهای عضلانی مشاهده شد دچار کمبود عناصر آهن و روی بودند که مصرف نانوذرات باعث ترمیم و رشد سلولهای عضلانی شد. همچنین این مطالعه نشان داد که نانوذره اکسیدآهن نسبت به نانوذره روی تغییرات سریعتری در بافت ایجاد میکند. این پژوهش نشان داد که تأثیر نانوذره آهن در بافت فقط وابسته به غلظت بوده و با افزایش غلظت تأثیرات بیشتر و سریعتری در بافت دارد و تأثیر نانوذره روی در بافت هم وابسته به غلظت و هم وابسته به زمان است به گونهای که با افزایش غلظت و گذشت زمان تأثیرگذاری بیشتری از این نانوذره مشاهده شد.
بحث و نتیجهگیری
در گزارشی توسط شوبایر و همکاران مشخص شد که مهمترین علت عدم تأثیرات سمی نانوذرات اکسیدآهن بر جانوران، حذف سریع آنها از جریان خون توسط ماکروفاژهای موجود در کبد، طحال و گرههای لنفاوی است که البته این حذف سریع پس از پدیده اپسونیزاسیون (تجمع پروتئینهای خون در اطراف نانوذرات) رخ میدهد که باعث تحریک سیستم ایمنی و دفع نانوذرات میشود. بنابراین بسیاری ازنانوذرات تزریق شده به سرعت از جریان خون خارج و فقط مقدار کمی از آنها فرصت نفوذ و ورود به اندامهای مختلف بدن را پیدا میکنند و در نتیجه اثرات جانبی چندانی ایجاد نمیکنند (38). در تحقیق حاضر تیمار ماهیان با نانوذرات اکسیدآهن و روی در فواصل زمانی مختلف مورد تحقیق و پژوهش قرارگرفت تا در اثر تماس طولانی مدت ماهیان با این نانوذرات همچنین تأثیر این نانوذرات قابل بررسی و در صورت مشاهده اثرات سوء یا مفید بافتی نقطهی عطفی برای انجام پژوهشهای بعدی در زمینهی این عناصر در سطح نانوذره باشد. اطلاعات نسبتاً کمی در مورد جذب و متابولیسم آهن در ماهی و سایر موجودات آبزی وجود دارد بنظر میرسد که مکانیسم جذب آهن از لوله گوارش و ذخیره و ترشح آن در ماهیان مشابه سایر مهرهداران باشد. اگر چه قسمت اعظم جذب آهن در موکوس روده صورت میپذیرد، بخشی نیز از طریق غشای آبششها جذب میشود، اما غذا منبع اصلی تأمین آهن برای متابولیسم است. در ماهی قزلآلای رنگینکمان آهن از حفره صفاقی جذب شده و در غلظتهای بالاتر در کبد، طحال و قسمت قدامی کلیه ذخیره میشود (8). در تحقیق حاضر نیز جهت بررسی تأثیر نانوذرات اکسید آهن و روی این نانوذرات در غلظتهای مختلف به غذای ماهیان افزوده شدند. بررسیهای بیشتر نشان میدهد که نانوذرات اکسیدآهن در غلظتهای بالا (150 میکروگرم بر کیلوگرم) باعث افزایش معنیداری در غلظت آنزیم ALT (Alanine Amino transferase) میشوند. این آنزیم برای کبد اختصاصی بوده و آسیب سلولهای کبدی باعث افزایش آزاد شدن این آنزیم میگردد. از این رو ممکن است دلیل افزایش این آنزیم تأثیر تخریبی نانوذرات اکسیدآهن روی سلولهای کبدی باشد (10). نانوذرات اکسیدآهن در غلظتهای بالا (150 میکروگرم بر کیلوگرم) اثرات سمی بر فعالیت کبد و تیروئید دارند و فعالیت آنها را مهار میکنند و از آنجایی که سیستم هورمونی تیروئیدی نقش بسیار مهمی را در اعمال متابولیکی بافتها ایفا میکند و هرگونه اختلال در عملکرد این سیستم آندوکرینی خسارات جبرانناپذیری را به بافتها وارد میکند به نظر میرسد تغییرات در میزان آنزیمهای کبدی بدلیل اثرات نانوذرات اکسیدآهن بر هورمونهای تیروئیدی باشد (1). براساس یافتههای آگاه و همکاران (2009) در پنج گونه از ماهیان خلیجفارس مشخص شد که تجمع زیستی فلزات در کبد بیشتر از عضله میباشد (2). عسکری ساری و ولایت زاده (1390) به بررسی غلظت سرب و روی در بافتهای کبد و عضله دو گونه ماهی پرورشی کپور معمولی و قزلآلای رنگینکمان پرداختند. در این تحقیق مشاهده گردید که میزان روی در کبد بیشتر از عضله است (4). روی بطور عمده در استخوان و پوست تجمع مییابد، گرچه کبد، آبشش و کلیه نیز میزان قابل توجهی از این عنصر را جمع میکنند (20). مطالعات میکروسکوپی کلیه و طحال در موش صحرایی نر (در اثر تزریق سولفات روی) نشان داد که آسیبهای بافتی در کبد بیشتر است اما تغییرات بافتی و سلولی بیشتر از نوع برگشتپذیر بودند. از جمله این تغییرات میتوان به: متراکم شدن هسته سلولها، افزایش سلولهای التهابی (که با برداشتن عامل آسیب بافتی سلولها میتوانند دوباره فعالیت فیزیولوژیک خود را از سر بگیرند) اشاره کرد (40). نانوذرات طلا و نقره اثرات سوء بر سلولهای کبد ماهی قزلآلای رنگینکمان در غلظتهای کم دارند (12). القای مرگ برنامهریزی شده سلولی و استرس اکسیداتیو بوسیله نانوذرات نقره در کبد گورخر ماهی (zebrafish) بالغ باعث ایجاد سمیت در کبد ماهی بالغ میشوند (9). نانوذره اکسید روی نیز میتواند با ایجاد استرس اکسیداتیو به سلولها آسیب برساند (43). رضایی رنجبر سرداری (1389) سمیت نانوذره نقره را در رتها مورد بررسی قرار داد. نتایج این پژوهشگر نشان داد که با افزایش غلظت، اثرات سمیت بیشتری در حیوان ایجاد میشود. بررسیهای آسیبشناسی نشان داد که طحال و کبد اندامهای هدف برای نانوذرات نقره هستند. آسیب بافتی و ضایعات بزرگ در کبد و طحال موشهایی که در معرض غلظت بالاتر قرارگرفته بودند دیده شد. طحال کاهش وزن قابل توجهی ناشی از کاهش حجم خون و افزایش پالپهای سفید داشت و در کبد تحلیل سلولی، خونریزی و چربی در اطراف مراکز وریدی بافت کبد دیده شد. آسیبهای ایجاد شده به اندازه، غلظت و نحوه ورود نانوذره بستگی دارد (34). در بررسیهای دقیقتر ثابت شد که سلولهای کوپفر کبد نقش اصلی و مرکزی را در خارج کردن نانوذرات مختلف از جریان خون بر عهده دارند (36). مطالعات بیشتر نشان داد در اثر تزریق سولفات روی در موش صحرایی اختلالاتی در ترشح آنزیمهای آلکالینفسفاتاز و آسپارتات آمینوترانسفراز و آلانینترانسفراز دیده میشود، که این حاکی از آسیب سلولهای کبدی است (40). نتایج حاصل از مطالعه و بررسی بافت کبد در این تحقیق نیز تغییرات قابل ملاحظهای در بافت کبد نشان داد. این تغییرات به شکل لیپیدوز، تورم، التهاب، برهم ریختن نظم لوبول کبدی و پرخونی در کبد بود که آسیب وارده به کبد با دوز مصرفی نانوذرات ارتباط مستقیم داشت. به عبارت دیگر آسیبهای بافتی و ضایعات بزرگ در کبد ماهیانی که در معرض غلظت بالاتر قرارگرفته بودند دیده شد. نکتهی قابل توجه اینکه در راستای نتایج حاصل از کار سایر پژوهشگران در این پژوهش نیز با حذف نانوذرات اکسیدآهن در تمام غلظتهای مصرفی و نانوذرات روی در دو غلظتهای 10 و 50 میکروگرم در هر گرم غذای ماهیان، ساختار بافت کبد ترمیم یافت. البته این تغییرات در طولانی مدت ممکن است برگشتپذیر نبوده و سلولها و متعاقب آن بافت مورد نظر از بین برود. این در حالی بود که بعد از قطع نانوذره روی در بالاترین غلظت مصرفی (100 میکروگرم در هر گرم غذا) ترمیم در کبد دیده نشد بنابراین در این پژوهش نیز مانند سایر کارهایی که در این زمینه انجام شده تأثیر نانوذرات روی بر کبد بیشتر از عضله بود. مطالعات پیرامون نقش عناصر آهن و روی، نشان میدهند که تمرینات شدید موجب کاهش زیاد غلظت این عناصر در بدن میشود. کاهش غلظت این عناصر منجر به کاهش قدرت و استقامت عضلانی میشود (30). گروهی از محققان نیز نقش این عناصر را در فعالیتهای حرکتی بررسی و وجود این عناصر را در عضلات موجب افزایش قدرت و استقامت عضلانی (22) و کمبود آن را موجب کاهش عملکرد حرکتی گزارش کردهاند (16). نتیجه یک مطالعه نشان داد نوزادانی که با کمبود روی در خون بند ناف متولد میشوند در آینده کاهش رشد و تکامل عصبی، حرکتی و افزایش سایر عوارض را نشان میدهند (15). در پژوهشی دیگر به اثبات رسیده که نیاز تغذیهای و فیزیولوژیک به عناصر ضروری از جمله آهن، روی و مس در دوره بلوغ جنسی و بعد از آن که با جهش رشد همراه است بیش از دوره قبل از بلوغ است از این رو تأمین این عناصر در رژیم غذایی از طریق غنی سازی مواد اولیه در صنایع غذایی و یا تجویز داروهای مکمل ضروری به نظر می رسد (3).
اُگینو و یانگ (1978) میزان نیاز روی در ماهیان قزلآلای رنگینکمان را 30-15 میلیگرم در هر کیلو غذا بیان کردند. آنها اظهار داشتند که کمبود روی (1 میلیگرم در هر کیلو غذا) باعث توقف رشد، کاهش هضمپذیری پروتئین و کربوهیدرات و به احتمال زیاد در نهایت سبب کاهش فعالیت آنزیم کربوکسی پپتیداز میشود (29). ساتو و همکاران (1987) بیان کردند که افزودن 40 میلیگرم روی در غذا به همراه پودر ماهی در جیره باعث بهبود عملکرد رشد ماهیان قزلآلا و کپور میشود (37). نتایج حاصل از مطالعه و بررسی بافت عضله در این تحقیق نیز حاکی از تغییرات قابل ملاحظه در بافت عضله بود. با تغذیه ماهیان توسط نانوذرات ترمیم در بافت عضلانی اتفاق افتاد. ترمیم بافت عضله با افزایش دوز نانوذره ارتباط مستقیم داشت. در این پژوهش مشخص شد که تأثیر نانوذره آهن در ترمیم عضله بیشتر و سریعتر از نانوذره روی است. در واقع نتایج حاصل از این پژوهش حاکی از این است که تأثیر بافتی نانوذره اکسیدآهن فقط وابسته به غلظت میباشد در صورتی که تأثیر بافتی نانوذره روی هم وابسته به غلظت و هم وابسته به زمان میباشد. مطالعات نشان دادهاند که ماهیان کپور و قزلآلا قادرند مقدار ١۹٠۰-1700 میلیگرم روی در هر کیلو غذا را بدون نشان دادن علائم سمیت ظاهری تحمل کنند. میزان نیاز این دو ماهی به روی 30-15 میلیگرم گزارش شده است (24). قابلیت دسترسی زیستی به عناصر ضروری متغیر است و بستگی به ترکیب جیره غذایی دارد (17). ماهی مهمترین منبع آهن برای کودکان و بزرگسالان می باشد که کمبود این عنصر سبب کم خونی میگردد (42).
براساس یافتههای بدست آمده از این تحقیق نیز میتوان نتیجه گرفت که جذب زیستی نانوذرات اکسیدآهن و روی نیز تحت تأثیر مقادیر این عناصر در جیره قرار دارد. در مطالعه حاضر تغییرات بافتی در اثر استفاده از نانوذرات اکسیدآهن و روی در بافت کبد بصورت تخریب بافت کبد و در عضله به صورت ترمیم و افزایش کارایی عضله ماهیان رخ داد و با قطع نانوذرات و گذشت 15 روز به همین منوال تغییرات ایجاد شده برگشتپذیر بودند. تنها غلظتی که با قطع نانوذره تغییرات بافتی آن برگشتپذیر نبود تغییرات ایجاد شده در بافت کبد ماهیان تغذیه شده با غلظت بالای روی بود. در نهایت لازم به ذکر است که کاربرد نانوذرات مختلف، مطالعات دقیق و جامعتری را پیرامون تأثیرات این نانوذرات بر روی موجودات زنده میطلبد. استفاده از مدلهای حیوانی و نحوههای مختلف تیمار و نانوذرات به دست آمده از قارچها و گیاهان با ترکیبات و قطرهای مختلف، افقهای نوینی را جهت بررسی کاربردهای فناوری نانو در زیستشناسی نمایان میکند.
تشکر و قدردانی
نویسندگان این مقاله مراتب تقدیر و تشکر خود را از دانشکده علوم و پژوهشکده آرتمیا و جانوران آبزی دانشگاه ارومیه بخاطر حمایتهای مالی ابراز میدارند.