نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه هرمزگان

2 دانشگاه علوم پزشکی بندرعباس

چکیده

حفره بدن توتیای‌دریایی با مایع‌سلومیک پر شده که محیط مایع بدن را تشکیل می‌دهد. رنگدانه نفتاکینون موجود در مایع‌سلومیک توتیا، دارای خواص زیستی متعددی از جمله خاصیت ضد‌باکتریایی، ضد‌‌جلبکی و ضد‌اکسیدانی می‌باشد. هدف از مطالعه حاضر، یافتن بهترین حالت استخراج مایع‌سلومیک و استخراج سلول‌های آزاد و سلوموسیت‌لیزات از مایع‌سلومیک توتیای‌دریایی گونه Echinometra mathaei، شناسایی و سنجش کمی و کیفی رنگدانه‌های نفتاکینونی می‌باشد. استخراج مایع‌سلومیک با چهار حالت مختلف انجام شد. کمیت ترکیبات نفتاکینونی هر چهار حالت نیز به کمک روش طیف سنجی محاسبه و سپس کیفیت آن‌ها با استفاده از LC-MS ارزیابی گردید. نتایج نشان داد که بهترین حالت استخراج مایع‌سلومیک، استفاده از حالت بافره است، که می‌توان آن را برای سنجش فعالیت‌های زیستی به‌کار برد. هم‌چنین، نتایج حاصل از شناسایی کمی و کیفی رنگدانه‌های موجود در سلول‌های آزاد و سلوموسیت‌لیزات نشان داد که بیش‌ترین رنگدانه‌ها از نظر کمی، به‌ترتیب، اسپینوکروم A، B، C و اکینوکروم A می‌باشند که نتایج حاصل از LC-MS نیز این یافته‌ها را تاییدکرد. نتایج حاصل از این مطالعه نیز نشان داد که مایع‌سلومیک توتیای‌دریایی E. mathaei به علت دارا بودن رنگدانه‌های مختلف و با توجه به نقش هر یک از آن‌ها، می‌تواند در صنایع دارویی مورد استفاده قرار گیرد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Selection Optimization Extract Coelomic fluid of Sea urchin (Echinometra mathaei) from the Persian Gulf and Identification Naphtaquinone Pigments

چکیده [English]

The body cavity of sea urchin is filled with coelomic fluid, which forms the body's fluid medium. The naphthoquinone pigments were found to possess excellent antimicrobial, antialgal and antioxidant activities. The aim of the present research was undertaken to study the find optimization of coelomic fluid isolation, extraction of free cells and coelomocyte lysate and also identification qualitative and quantitative of pigments of coelomic fluid Echinometra mathaei. coelomic fluid was isolated by four types, The amount of quantity and quality of pigments Measured in the four types using a spectrophotometer and LC-MS. According to the results of the study, optimization extract of coelomic fluid, buffered mode, which it can be used to measure the biological activity. With regard to this, the result showed that pigments of free cells and coelomocyte lysate were Spinochorome A, B, C and Echinochorome A, respectively. Also, The results of LC-MS confirmed these findings. The results of this study showed that coelomic fluid Sea urchin of E. mathaei due to different pigments and with regard to the role of each of them can be used in the pharmaceutical industry.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Coelomic fluid
  • Coelomocyte lysate (CL)
  • free cells (CF)
  • naphthoquinone pigments
  • Echinometra mathaei

انتخاب روش بهینه استخراج مایع­سلومیک توتیای­دریایی (Echinometra mathaei) خلیج­فارس و شناسایی برخی رنگدانه­های نفتاکینونی آن 

سولماز سلیمانی١، مرتضی یوسف­زادی1*، سهیلا معین2،3 و نرگس امراللهی بیوکی1

1 بندرعباس، دانشگاه هرمزگان، دانشکده علوم و فنون دریایی، گروه زیست­شناسی­دریا 

2 بندرعباس، دانشگاه علوم پزشکی هرمزگان، مرکز تحقیقات پزشکی مولکولی 

3 بندرعباس، دانشگاه علوم پزشکی هرمزگان، دانشکده پزشکی، گروه بیوشیمی

تاریخ دریافت: 9/2/94                  تاریخ پذیرش: 30/4/94

چکیده

حفره بدن توتیای­دریایی با مایع­سلومیک پرشده که محیط مایع بدن را تشکیل می­دهد. رنگدانه نفتاکینون موجود در مایع­سلومیک توتیا، دارای خواص زیستی متعددی ازجمله خاصیت ضد­باکتریایی، ضد­جلبکی و ضد­اکسیدانی می­باشد. هدف از مطالعه حاضر، یافتن بهترین روش استخراج مایع­سلومیک و استخراج سلول­های آزاد و سلوموسیت­لیزات از مایع­سلومیک توتیای­دریایی گونه Echinometra mathaei، شناسایی و سنجش کمی و کیفی رنگدانه­های نفتاکینونی می­باشد. استخراج مایع­سلومیک با چهار روش مختلف انجام شد. کمیت ترکیبات نفتاکینونی هر چهار روش نیز به کمک روش طیف‌سنجی محاسبه و سپس کیفیت آن­ها با استفاده از کروماتوگرافی مایع با طیف سنجی جرمی (LC-MS) ارزیابی گردید. نتایج نشان داد که بهترین روش استخراج مایع­سلومیک، استفاده از روش بافره است، که می­توان آن را برای سنجش فعالیت­های زیستی به کاربرد. هم­چنین، نتایج حاصل از شناسایی کمی و کیفی رنگدانه­های موجود در سلول­های آزاد و سلوموسیت­لیزات نشان داد که بیش­ترین رنگدانه­ها ازنظر کمی، به­ترتیب، اسپینوکروم  A(1/13=CF، 6/12=CL)،  B(2/11=CF، 1/11=CL)،  C(4/9=CF، 10=CL) و اکینوکروم A (1/7=CF، 9/6=CL) می­باشند که نتایج حاصل از کروماتوگرافی مایع با طیف سنجی جرمی نیز این یافته­ها را تأیید کرد.

واژه­های کلیدی: مایع­سلومیک، سلوموسیت­لیزات (Coelomocyte Lysate)، سلول­های آزاد مایع­سلومیک (Coelomic Fluid)، رنگدانه­های نفتاکینونی، Echinometra mathaei 

* نویسنده مسئول، تلفن: 09121886139 ، پست الکترونیکی: Morteza110110@gmail.com 

مقدمه 

 

توتیاهای­دریایی به شاخه خارپوستان (Echinodermata) از بی­مهرگان دریایی تعلق دارند (17). آن­ها از موجودات بااهمیت اجتماعات کف دریا هستند (2) که از منطقه جزرومدی تا اعماق زیاد اقیانوس­ها گسترش‌یافته‌اند (13) و دارای پنج رده شامل: لاله‌وشان (Crinoidea)، ستاره­سانان (Asteroidea)، مارسانان (Ophiuroidea)، خارداران (Echinoidea) و خیارسانان (Holothuroidea) هستند (1) که هریک دارای نقش­های کلیدی در اکوسیستم­های دریایی می­باشند (5). 

خارپوستان دارای اهمیت اقتصادی، تغذیه­ای-داروئی و بوم‌شناختی می­باشند (1). بیش از یک قرن است که توتیاهای­دریایی به­عنوان ارگانیسم­ مدل برای تحقیقات علمی به کار می­روند. این موجودات به­طور قابل­توجهی در بخش­های علمی مختلف از فرایندهای بیولوژیک، مانند تنظیم بیان ژن، جنین­شناسی مولکولی، بیولوژی لقاح، بیولوژی سلولی، بیولوژی تکاملی، ژنتیک جمعیت و سم­شناسی مورداستفاده قرار می­گیرند. در مقایسه با سایر ارگانیسم­های مدل­ بی­مهره، مثل کرم­ها (Caenorhabditis elegan)، شباهت تاکسونومی توتیای­دریایی به مهره­داران ازجمله انسان بسیار قابل‌توجه است (6). 

حفره بدن خارداران با مایع­سلومیک پرشده که محیط مایع بدن را تشکیل می­دهد و سلوموسیت­ها در آن به­صورت معلق حضور دارند، هم­چنین این مایع، ارگان­های داخلی بدن را در برمی‌گیرد. ترکیب مایع­سلومیک شبیه به آب دریاست و محتوی پروتئین، نمک­های محلول و دیگر مواد معدنی است (13). واکنش­های ایمنی این موجودات در مقابل میکروارگانیسم­های بیماری­زا، به­صورت بروز سلول­های ایمنی و فاکتورهای هومورال در مایع­سلومیک می­باشد (5). در چنین مواقعی مایع­سلومیک، پاسخ­های غیرمستقیمی به زخم، عفونت­های میکروبی، انعقاد، کپسوله کردن و فاگوسیتوز می­دهد (13).

سه دسته از سلوموسیت­ها در مایع­سلومیک توتیای­دریایی مشاهده شده است (13) که شامل 76 درصد آمبوسیت­ها (amoebocytes)، 12 درصد سلول­های ارتعاشی (vibratile cells) و 12 درصد گویچه­های کوچک قرمز و بی­رنگ (red and uncoloured spherulocytes) می­باشد. گزارشاتی در خصوص عملکردهای ایمنی آمبوسیت­ها و گویچه­های بی­رنگ وجود دارد. آمبوسیت­ها و گویچه­های­کوچک، عمده سلوموسیت­ها را تشکیل می­دهند. به نظر می­رسد که آن­ها در مقابل بسیاری از پاسخ­های ایمونولوژی ازجمله فاگوسیتوز، سمیت­سلولی، فعالیت آنتی­باکتریال، واکنش­های التهابی، فعالیت آنزیم پروفنولوکسیداز و جفت کردن واکنش­ها مسئولیت دارند (5). براساس نتایج مطالعات مختلف، می­توان خواص زیستی گویچه­های قرمز را به اکینوکروم­های A موجود در آن نسبت داد (14). رنگدانه­ها دارای خواص زیستی متعدد ازجمله خاصیت آنتی‌اکسیدانی، به­خصوص توانایی مهار رادیکال­های آزاد (7)، خاصیت سیتوتوکسیک (به علت وجود فاگوسیتوز­ها) (13) و هم­چنین خاصیت آنتی­باکتریال در برابر هر دو نوع باکتری گرم مثبت و گرم منفی می­باشند. هم­چنین براساس گزارشات متعدد اکینوکروم A نقش قابل‌توجهی را در ظهور پاسخ ایمنی در توتیای­دریایی بازی می­کند (14).  

لیدر و گلاسر (1938) برای اولین بار رنگدانه کینوئید (اسپینوکرومA) را در خار توتیای­دریایی (Paracentrotus lividus) شناسایی کردند (9) و از آن زمان به بعد، حدود 30 نوع رنگدانه کینوئید از گونه­های مختلف توتیای­دریایی استخراج شد (17). هم­چنین گزارشاتی در خصوص وجود محدود رنگدانه­ها، در بخش­های دیگر بدن آن­ها مانند مایع­سلومیک، تخم، تخمدان­ها و دیگر ارگان­ها ارائه‌شده است (4). رنگدانه­های پلی­هیدروکسیلات 1 و 4 نفتاکینون (PHNQ) موجود در مایع­سلومیک توتیای­دریایی، خواص زیستی متعددی ازجمله خاصیت آنتی­باکتریال، ضد­جلبک، ضد­بیماری­های قلبی و آنتی­اکسیدانی را نشان می­دهند (17). در حالت کلی، به سلول­های گویچه­قرمز، آمبوسیت و به سلول­های گویچه­کوچک، گرانولوسیت گفته می­شود. این سلول­های کوچک، حاوی اکینوکروم A با خاصیت آنتی­باکتریال هستند (13).

هدف از مطالعه حاضر، یافتن بهترین روش استخراج سلول­های آزاد و سلوموسیت­لیزات مایع­سلومیک توتیای­دریایی گونه Echinometra mathaei، شناسایی و سنجش کمی و کیفی رنگدانه­های نفتاکینونی آن­ها می­باشد.

مواد و روشها

توتیاهای­دریایی گونه Echinometra mathaei (شکل1) در فروردین‌ماه 1393 از ناحیه بین­جزرومدی ساحل پارک زیتون جزیره قشم واقع در خلیج­فارس جمع­آوری گردید (شکل2). توتیاهای­دریایی در آب­دریا با حفظ شرایط بیولوژیک و به‌صورت زنده به آزمایشگاه زیست­شناسی دانشگاه هرمزگان منتقل شدند.

نمونه­های جمع‌آوری‌شده جهت شناسایی، به ظروف پلاستیکی محتوی فرمالین 10 درصد منتقل گردید. سپس نمونه­ها در آزمایشگاه با استفاده از لوپ مورد بررسی و شناسایی قرارگرفتند. سپس مشاهدات حاصل با کلید شناسایی منطقه­ای مطابقت داده شد (11، 10).

 

شکل1- توتیای­دریایی، گونه مورد مطالعه Echinometra mathaei

شکل2- نقشه مکان نمونه­برداری که با ستاره سیاه مشخص شده است.

برای استخراج مایع­سلومیک از توتیای­دریایی، ابتدا مایع­سلومیک 30 توتیای­دریایی، پس از برش غشای پریستومیال با استفاده از سرنگ ظریف با سوزن شماره 18، با 4 روش مختلف به شرح زیر جمع­آوری و جداسازی گردید و در داخل ظروف استریل ریخته و بلافاصله در یخچال نگه­داری شد.

روش اول: استخراج مایع­سلومیک بدون استفاده از محلول ایزواسموتیک و ضد انعقاد (16).

روش دوم: استخراج مایع­سلومیک با استفاده از محلول ایزواسموتیک و ضدانعقاد 05/0 مولار تریس، 15/0 مولار سدیم­کلرید، پی­اچ برابر با 8 با نسبت 1:2 (15).

روش سوم: استخراج مایع­سلومیک با استفاده از محلول ایزواسموتیک و ضدانعقاد (ISO-EDTA)20 میلی­مولار تریس، 15/0 مولار سدیم­کلرید، 70 میلی­مولار EDTA-Na ، پی­اچ برابر با 5/7 با نسبت 1:2 (5).

روش چهارم: استخراج مایع­سلومیک با استفاده از محلول ایزواسموتیک و ضدانعقاد (ISO-EDTA)20 میلی­مولار تریس، 15/0 مولار سدیم­کلرید، 70 میلی­مولار EDTA-Na ، پی­اچ برابر با 5/7 و به صورت بافره، که در آن تنها یک بار سرنگ از بافر پر و خالی و یک میلی­لیتر بافر نیز در ظرف محتوی مایع­سلومیک ریخته شد.

مایع­سلومیک بلافاصله پس از استخراج با چهار روش، به مدت 10 دقیقه (با دور 4000 در دقیقه و در 4 درجه سانتی­گراد) سانتریفیوژ و دو فاز (مایع و جامد) تشکیل شد، پس‌ازآن فاز مایع، که درواقع سلول­های آزاد مایع­سلومیک (CF) هستند از سلوموسیت­ها ( فاز جامد ته‌نشین شده) جدا و در دمای20- درجه سانتی­گراد نگهداری شد (5). فاز جامد ته‌نشین شده (پلیت) در مرحله استخراج سلول­های آزاد مایع­سلومیک که محتوی سلوموسیت می­باشد، در بافر مربوط به هر روش استخراج، حل شد (پلیت روش اول، در آب دریا فیلتر شده حل شد) و برای 4 دقیقه در معرض سونیکت در دمای صفر درجه (یک ضربه در ثانیه) قرار­گرفت. در این مرحله، سلول­های درون فاز جامد (پلیت) شکسته شد و محتویات آن­ها به خارج از سلول ریخته و سپس در دور 12000 در دقیقه برای 20 دقیقه در 4 درجه سانتی­گراد سانتریفیوژ شد. در این مرحله نیز دو فاز (مایع و جامد) تشکیل شد. فاز مایع که حاوی محتویات دورن سلول­ها که همان سلوموسیت­لیزات (CL) هستند جدا و در دمای20- درجه سانتی­گراد نگهداری شد. فاز جامد در این مرحله نیز حاوی سلول­های شکسته شده می­باشد که هیچ استفاده دیگری ندارد و دور ریخته شد (5 ،16).

شناسایی رنگدانه­های نفتاکینونی CF و CL ، با استفاده از روش طیف­سنجی و به کمک دستگاه اسپکتروفتومتری انجام شد. هم­چنین میزان هریک از رنگدانه­ها از طریق ضریب­خاموشی­مولی مربوط به آن (جدول1) مانند، اسپینوکروم­A ( 3311 = ԑ در طول­موج520 نانومتر)، اسپینوکروم­B (4898= ԑ در طول­موج480 نانومتر)، اسپینوکروم­C (5888 = ԑ در طول­موج 463 نانومتر)، اکینوکروم­A (7413=  ԑ در طول­موج 490 نانومتر) و کمیت هر یک از رنگدانه­ها از طریق فرمول زیر محاسبه گردید (7).

A = ԑcl

A میزان نور جذب شده توسط محلول، ԑ ضریب خاموشی­مولی (مول بر لیتر بر سانتی­متر)، c غلظت ماده مورد نظر (مول بر لیتر)، l مسافتی که نور طی می­کند (قطر کووت، 1 سانتی­متر).

 

جدول1- ساختار شیمیایی، وزن مولکولی و طول موج بالاترین جذب رنگدانه­های عمده نفتاکینون در توتیای­دریایی­ارغوانی(7)

ساختارشیمیایی رنگدانه­ها 

 

 

 

 

وزن مولکولی 

04/266

03/264

02/222

02/280

طول­موج بالاترین جذب(نانومتر)

490

343

520

317

480

385

323

463

285

جدول2-نتایج به­دست آمده از استخراج مایع سلومیک در روش­های مختلف آزمایش

 

روش اول

روش دوم

روش سوم

روش چهارم

مایع سلومیک

منعقد شد

اندکی منعقد شد (رگه رگه)

منقعد نشد ولی رقیق بود

منعقد نشد و تقریبا غلظتی برابر با روش اول داشت

 

 

بعد از اندازه­گیری میزان رنگدانه­ها و شناسایی مقدماتی توسط کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا، به منظور تایید وجود رنگدانه­ها از روش کروماتوگرافی مایع با طیف سنجی جرمی استفاده گردید. تجزیه­و­تحلیل آماری با استفاده از نرم­افزار­های 2010 Excel و 19 SPSS انجام شد. برای تعیین تفاوت معنی­داری بین میانگین­ها از آزمون تجزیه واریانس یک طرفه (در سطح 95 درصد) و آزمون دانکن استفاده گردید.

نتایج

با مقایسه خصوصیات ظاهری توتیای­دریایی با کلیدهای شناسایی منطقه­ایی، گونه Echinometra mathaei برای نمونه توتیای­دریایی مورد آزمایش در این مطالعه تشخیص داده شد.

نتایج حاصل از استخراج 40 میلی­لیتر مایع­سلومیک توتیای­دریایی E. mathaei به‌صورت بافره نشان داد که از این میزان، به ترتیب، 62/68 میلی­گرم بر میلی­لیتر سلول­های آزاد مایع­سلومیک (CF) و 33/14 میلی­گرم بر میلی­لیتر سلوموسیت­لیزات (CL) استخراج شد.

نتایج حاصل از استخراج مایع­سلومیک در روش­های مختلف نشان داد که مایع­سلومیک، در روش اول و دوم منعقد شد. اما این انعقاد در روش دوم کم­تر و تنها به­صورت رگه­هایی مشاهده گردید. درحالی ‌که در مایع­سلومیک استخراج‌شده با روش­های سوم و چهارم انعقادی مشاهده نشد. غلظت نهایی آن­ها، تفاوت این دو روش را نشان می­دهد، که روش سوم به دلیل استفاده از حجم بیش­تر بافر (نسبت 1:2) نسبت به روش چهارم (یک میلی­لیتر) رقیق­تر بود. همان­طور که از نتایج جدول 2 مشخص است بهترین روش استخراج، استفاده از روش بافره است.

میزان رنگدانه­های موجود در CF و CL در هریک از حالات استخراج مایع­سلومیک نیز به ترتیب در نمودار 1 و 2 نشان داده شده است.

 

 

نمودار 1- میزان رنگدانه­های سلول­های آزاد مایع­سلومیک (CF) استخراج شده با روش­های مختلف از مایع­سلومیک (میکروگرم بر میلی­لیتر)

حروف غیر مشابه بیانگر اختلاف معنی­دار در سطح احتمال 05/0≤  P است.

 

 

نمودار 2- میزان رنگدانه­های سلوموسیت­های (CL) استخراج شده با حالات مختلف از مایع سلومیک (میکروگرم بر میلی­لیتر)

حروف غیر مشابه بیانگر اختلاف معنی­دار در سطح احتمال 05/0≤  P است.

 

بیش­ترین میزان رنگدانه اسپینوکروم A و B در CF حاصل از روش سوم استخراج، مشاهده شد. درحالی‌که کم­ترین میزان رنگدانه اسپینوکروم A و B در CF روش دوم اندازه­گیری شد. همان­گونه که از نمودار 1 برمی­آید، در CF حاصل از روش اول استخراج نیز، رنگدانه اسپینوکروم B قابل‌توجهی مشاهده شد که براساس شاخص­های آماری نیز تفاوت معنی­داری بین دو روش وجود ندارد. بیش­ترین میزان اسپینوکروم C درروش اول و کم­ترین میزان آن درروش دوم نشان داد. CF حاصل از روش سوم دارای بیش­ترین میزان رنگدانه اکینوکروم A بوده است و کم­ترین میزان این رنگدانه در روش دوم مشاهده گردید. براساس نتایج حاصل از میزان رنگدانه­ها (نمودار 1)، اختلاف معنی­داری بین میزان رنگدانه­ها در روش­های مختلف استخراج مایع­سلومیک مشاهده شد (05/0 P≤).

CL استخراج‌شده از مایع­سلومیک درروش اول، دارای بیش­ترین میزان رنگدانه اسپینوکروم A بوده است در­حالی که کم­ترین میزان این رنگدانه درروش سوم مشاهده شد. در خصوص رنگدانه اسپینوکروم B نیز بیش­ترین میزان در روش اول و کم­ترین آن در روش سوم اندازه­گیری شد. هم­چنین، CL حاصل از روش اول دارای بیش­ترین میزان اسپینوکروم C است درصورتی‌که کم­ترین میزان رنگدانه اسپینوکروم C درروش سوم دیده می­شود. براساس نتایج، روش چهارم نیز دارای میزان قابل ملاحظه­ایی اسپینوکروم C می­باشد که در مقایسه با روش اول تفاوت معنی­داری وجود ندارد.

نتایج حاصل در مورد استخراج رنگدانه اکینوکروم A نشان داد که بیش­ترین میزان این نوع رنگدانه در CL استخراج‌شده از روش اول و کم­ترین میزان آن درروش سوم وجود دارد. براساس نتایج درروش کلی، میزان رنگدانه­های استخراجی از مایع­سلومیک در روش­های مختلف دارای تفاوت معنی­داری هستند (05/0 P≤)(نمودار 2).

میزان درصد هریک از رنگدانه­ها در CL و CF حاصل از چهار روش استخراج مایع سلومیک، در حجمی برابر با 1 میلی­لیتر، در جدول 3 نشان داده‌شده است.

 

جدول 3- درصد رنگدانه­ها در CL و CF روش­های مختلف استخراج مایع­سلومیک در یک میلی­لیتر

 

اسپینوکروم A

اسپینوکروم B

اسپینوکروم  C

اکینوکروم A

CF روش اول

5/15

3/13

2/13

4/8

CL روش اول

7/15

0/12

1/10

5/7

CF روش دوم

1/8

9/6

9/5

4/4

CL روش دوم

5/7

3/6

8/5

8/3

CF روش سوم

1/18

6/13

2/12

6/8

CL روش سوم

1/6

8/4

4/4

0/3

CF  روش چهارم

1/13

2/11

4/9

1/7

CL  روش چهارم

6/12

1/11

0/10

9/6

 

کروماتوگرافی هریک از رنگدانه­ها در رایج­ترین طول­موج آن­ها (285، 317، 323 و 343 نانومتر به ترتیب برای اسپینوکروم C، اسپینوکروم A، اسپینوکروم B و اکینوکروم A) ثبت شد. ازآنجایی‌که آن­ها به‌طور کامل در طیف­ها و طول­موج­های مختلف قرار دارند هریک از رنگدانه­ها حضور خود را در رنگدانه­های پلی­هیدروکسیلات نفتاکینون تأیید می­کنند.

برای تأیید بیش­تر با استفاده از کروماتوگرافی مایع در حالت منفی انجام شد. شکل 3 کل یون کروماتوگرام را نشان می­دهد. همان­طور که در شکل 3 نشان داده‌شده است، با استفاده از HPLC-DAD چهار قله به دست آمد. ازآنجایی‌که در طیف­سنج جرمی در حالت منفی، همه رنگدانه­ها در یون [H-M] ظاهر شد. درنتیجه، یون­ها در M/Z 221، 279، 265 و 263 به ترتیب، اسپینوکروم B، اسپینوکروم C، اکینوکروم A و اسپینوکروم A را نشان داد.

 

شکل 3- (a) LC-ESI-MS کل یون­ (TIC، در حالت منفی) رنگدانه­های PHNQ و مشخصات رنگدانه­های PHNQ مورد مطالعه و (b، c، d و e) طیف آن­ها؛ b، c، d و e به­ترتیب، با اسپینوکروم B، اسپینوکروم C، اکینوکروم A و اسپینوکروم A متناظر است.


بحث

در مطالعه حاضر، در استخراج مایع­سلومیک با روش اول، مایع­سلومیک به‌ سرعت منعقد شد که این مسئله باعث بروز مشکلاتی در جداسازی CF و CL می­گردد. این در حالی است که استبیلی و همکاران (1996) مایع­سلومیک توتیای­دریایی Paracentrotus lividus را بدون استفاده از بافر استخراج و خاصیت آنتی­باکتریال آن را مورد بررسی قراردادند (16). در استخراج مایع­سلومیک با روش دوم، مایع­سلومیک به میزان اندکی منعقد شد. درحالی‌که استبیلی و همکاران (1992)، مایع­سلومیک را مطابق با روش دوم استخراج نمودند و فعالیت همولیتیک آن را آزمایش کردند (15). نتایج حاصل از تحقیق حاضر نشان می­دهد که استخراج مطلوب مایع­سلومیک، با استفاده از بافر روش سوم و چهارم می­باشد. هم­چنین، مطالعات آریزا و همکاران (2007) نیز نشان داد که استخراج مایع­سلومیک توتیای­دریایی با استفاده از بافر روش سوم جهت سنجش فعالیت سیتوتوکسیک و کشت سلوموسیت­ها مناسب است (5). استخراج مطلوب مایع­سلومیک، در روش سوم و چهارم به علت حضور EDTA-Na در بافر مربوطه اتفاق می­افتد که مانع از انعقاد مایع­سلومیک می­شود. در مقایسه این دو روش، بهترین روش استخراج، مربوط به روش چهارم می­باشد که در آن انعقادی صورت نمی­گیرد و محلول یکنواختی مشاهده می­شود. هم­چنین، به علت استفاده از تنها، یک میلی­لیتر بافر مربوطه، مایع­سلومیک استخراج‌شده در این روش غلظت خود را حفظ می­نماید و برای سنجش ترکیبات و فعالیت­های زیستی مناسب است.

رنگدانه­های بررسی‌شده در این مطالعه، ترکیبی از هیدروکسیلات نفتاکینون است که احتمالاً داری چندین گروه هیدروکسیل در مولکول می­باشد. بنابراین، میزان درصد هریک از رنگدانه­های اسپینوکروم A، B، C و اکینوکروم A موجود در سلول­های آزاد مایع­سلومیک و سلوموسیت­لیزات در حجم یک میلی­لیتر محاسبه گردید که در جدول 3 مشاهده شد. هم­چنین، با توجه به نتایج به­دست­آمده از این جدول می­توان با اطمینان بیش­تری بیان کرد که محتویات موجود در مایع­سلومیک استخراج‌شده با روش­های اول و چهارم تقریباً برابر است.

کواهارا و همکاران (2009) رنگدانه اسپینوکروم A را در پوسته توتیای­دریایی ارغوانی (Anthocidaris crassispina) شناسایی کردند و میزان این رنگدانه را نسبت به وزن خشک اولیه پوسته، 1/0 درصد بیان نمودند (8). این درحالی است که گزارش دیگری درباره کمیت رنگدانه­ها مطرح نشده است. به­علاوه، تاکنون گزارشی از شناسایی رنگدانه­های موجود در مایع­سلومیک ارائه نشده و مطالعه حاضر اولین تلاش در خصوص شناسایی و بیان کمیت رنگدانه­های موجود در مایع­سلومیک می­باشد.

نتایج LC-MS نیز تأیید می­کند که این‌گونه از توتیای­دریایی (E. mathaei) حاوی رنگدانه پلی­هیدروکسیلات نفتاکینون (PHNQ) مشابه با دیگر توتیاهای­دریایی است. درواقع، اسپینوکروم­های اصلی و اکینوکروم­های مشتق شده در توتیاهای­دریایی ارغوانی Stronglycentrotus nudus (17) و Anthocidaris crassipina (7) به رنگدانه­های شناسایی‌شده در گونه مورد مطالعه در این تحقیق شبیه بود. بنابراین، انتظار نمی­رود که میزان رنگدانه­های شناسایی‌شده در توتیاهای­دریایی قرمز- قهوه­ای Psammechinus miliaris (9) و Stronglycentrotus franciscanus (3) و توتیاهای­دریایی سبز Stronglycentrotus droebachiensis  (3،11) و این‌گونه توتیای­دریایی ارغوانی متفاوت باشند.

درواقع تفاوت در ترکیب رنگدانه پلی­هیدروکسیلات نفتاکینون در گونه­های مختلف توتیای­دریایی بارنگ‌های متفاوت بیان‌شده است، که احتمالاً علت آن، تفاوت در نمک­های تشکیل­دهنده رنگدانه، کلسیم یا منیزیم موجود در پوسته و خار و یا اختلاف پی­اچ به وجود آمده باشد (3).

با توجه به نتایج بدست آمده از این مطالعه و هم­چنین گزارشات پیشین، بهترین روش استخراج مایع­سلومیک، استفاده از روش بافره است که می­توان جهت بررسی خواص بیولوژیک از آن استفاده کرد. هم­چنین، بیش­ترین میزان رنگدانه­ها، در CF و CL تمام حالات استخراج مایع­سلومیک، به­ترتیب، اسپینوکروم A، B، C و اکینوکروم A می­باشد که با توجه به نقش و کاربرد رنگدانه­های موجود در مایع­سلومیک، پیشنهاد می­شود ضمن تخلیص رنگدانه­ها و تعیین نقش اختصاصی هریک از آن­ها، برای ساخت ترکیبات از این مواد اقدام شود.

نتایج حاصل از این مطالعه نیز نشان داد که مایع­سلومیک توتیای­دریایی E. mathaei به علت دارا بودن رنگدانه­های مختلف و با توجه به نقش هریک از آن­ها، می­تواند در صنایع دارویی مورد استفاده قرار گیرد.

تشکر و قدردانی

این تحقیق با حمایت معاونت پژوهشی دانشگاه هرمزگان با شماره قرارداد 74/200/93 صورت گرفته است.

1- خالقی، م.، صفاهیه، ع.، سواری، الف.، دوست­شناس، ب.، و عوفی، ف.، 1391. بررسی تراکم و الگوی پراکنش و پایداری توتیای­دریایی (Echinoidea: Stomopneustes variolaris) در نواحی بین جزرومدی خلیج چابهار، مجله اقیانوس شناسی، شماره 9، صفحات 15-9.

2- شکوری، آ.، نبوی، س.م.، کوچنین، پ.، سواری، الف.، و صفاهیه، ع.، 1391. بررسی الگوی پراکنش و پایداری خیارهای دریایی در ناحیه شرقی خلیج چابهار، مجله اقیانوس­شناسی، شماره 12، صفحات 18-11.

 

3- Amarowicz, R., Synowiecki, J., and Shahidi, F., 2012. Chemical composition of shells from red (Strongylocentrotus franciscanus) and green (Strongylocentrotus droebachiensis) sea urchin. Food Chemistry, 133, PP: 822–826.

4- Anderson, H.A., Mathieson, J.W., and Thomson, R.H., 1969. Distribution of Spinochrome Pigments in Echinoids. Comparative Biochemistry and Physiology, 28, PP: 333- 345.

5- Arizza, V., Giaramita, F.T., Parrinello, D., Cammarata, M., and Parrinello, N., 2007. Cell cooperation in coelomocyte cytotoxic activity of Paracentrotus lividus coelomocytes. Comparative Biochemistry and Physiology, 147, PP: 389–394.

6- Bodnar, A., 2013. Proteomic profiles reveal age-related changes in coelomic fluid of sea urchin species with different life spans. Experimental Gerontology, 48, PP: 525–530.

7- Kuwahara, R., Hatate, H., Chikami, A., Murata, H., and Kijidani, Y., 2010. Quantitative separation of antioxidant pigments in purple sea urchin shells using a reversed-phase high performance liquid chromatography. LWT-Food Science and Technology, 43, PP: 1185-1190.

8- Kuwahara, R., Hatate, H., Yuki, T., Murata, H., Tanaka, R., and Hama, Y., 2009. Antioxidant property of polyhydroxylated naphthoquinone pigments from shells of purple sea urchin Anthocidaris crassispina. LWT - Food Science and Technology, 42, PP: 1296–1300.

9- Lederer, E., Glaser, R., 1938. Sur l’echinochrome et le spinochrome. C R Hebd Seanc Acad Sci Paris 207:454–456.

10- Powell, C., Hughes, A.D., Kelly, M.S., Conner, S., and McDougall, G.J., 2014. Extraction and identification of antioxidant polyhydroxynaphthoquinone pigments from the sea urchin, Psammechinus miliaris. LWT - Food Science and Technology, 59, PP: 455-460.

11- Price, A.G., 1983. Fauna of Saudi Arabia, Echinoderms of Saudi Arabia, Echinoderms of the Persian Gulf coast of Saudi Arabia, 28, PP: 29-109.

12- Price, A.G., 1986. A field guide to the sea shores of Kuwait and the Persian Gulf, Phylum Echinodermata. Blandrdford Press, 32, PP: 16-95.

13- Smith, L.C., Ghosh, J., Buckley, K.M., Clow, L.A., Dheilly, N.M., Haug, T., Henson, J.H., Li, C., Lun, C.M., Majeske, A.J., Matranga, V., Nair, S.V., Rast, J.P., Raftos, D.A., Roth, M., Sacchi, S., Schrankel, C.S., and Stensvag, K., 2010. Echinoderm Immunity. Sӧderhäll, K., (ED). Handbook of Invertebrate Immunity. Landes Bioscience and Springer+Business Media. McGraw−Hill, PP: 260-274.

14- Smith, L.C., Rast, J.P., Brockton, V., Terwilliger, D.P., Nair, S.N., Buckley, K.M., and Majeske, A.J., 2006. The sea urchin immune system. Invertebrate Survival Journal, 3, PP: 25-39.

15- Stabili, L., Pagliara, P., Metrangolo, M., and Canicatti, C., 1992. Comparative aspects of echinoidea cytolysins: The cytolytic activity of Spherechinus Granularis (echinoidea) coelomic fluid. Comparative Biochemistry and Physiology. A,101, PP: 553-556.

16- Stabili, L., Pagliara, P., and Roch, P.h., 1996. Antibacterial activity in the coelomocytes of the sea urchin Paracentrotus lividus. Comparative Biochemistry and Physiology. B,113, PP: 639-644.

17- Zhou, D.Y., Qin, L., Zhu, B.W., Wang, X.D., Tan, H., Yang, J.F., Li, D.M., Dong, X.P., Wu, H.T., Sun, L.M., Li, X.L., and Murata, Y., 2011. Extraction and antioxidant property of polyhydroxylated naphthoquinone pigments from spines of purple sea urchin Strongylocentrotus nudus. Food Chemistry, 129, PP: 1591–1597.