مطالعه تأثیر آنتی‌بیوتیک افلوکساسین بر قطر لوله‌های اسپرماتوژنز در رت نر بالغ و اثر درمانی ژله رویال (شاه انگبین) برآن 

سیران حسامی^* و وحید نجاتی

ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده علوم پایه، گروه زیست‌شناسی

تاریخ دریافت: 10/2/94                تاریخ پذیرش: 17/8/94 

چکیده

افلوکساسین از آنتی‌بیوتیک‌های خانواده فلوروکینولونی می­باشد که روی بیماریهای عفونی دستگاه اداراری– تناسلی اثر می‌کند. ژله رویال توسط غدد هیپوفارنژیال زنبور کارگر ترشح می‌شود و با تأثیر بر تولیدمثل، تمایلات جنسی را افزایش می‌دهد. با توجه به اینکه آنتی‌بیوتیک‌ها در کاهش باروری نقش دارند و یکی از عوامل ناباروری محسوب می‌شوند هدف از تحقیق حاضر بررسی تأثیر آنتی‌بیوتیک افلوکساسین بر قطر لوله‌های منی­ساز در بیضه و اثر درمانی ژله رویال بر آن می‌باشد که طی آن از 32 رت نر بالغ استفاده شد. رتها به 4 گروه تقسیم شدند گروه‌های تحت مطالعه در مقایسه با گروه کنترل (گروه1) از افلوکساسین استفاده کردند. به هر سه گروه تحت مطالعه در سیکل 14 روزه افلوکساسین با دوز 200 میلی‌گرمی به مقدار 3/0 سی‌سی داده شد گروه 2 (دارو) بعد از اتمام سیکل 14 روزه آسان­کشی شدند و گروه 3 نیز بعد از اتمام سیکل 14 روزه دارو، بمدت 14 روز دیگر در شرایط بدون دارو قرارگرفتند (28 روز). گروه4 نیز با اتمام سیکل 14 روزه دارو، بمدت 14روز دیگر تحت درمان با ژله رویال قرارگرفتند (28 روز). سپس گروه 4و3 بعد از اتمام سیکل دارو و درمان آسان­کشی شدند و بافت بیضه آنها استخراج گردید. مقاطع بافتی با هماتوکسیلین – ائوزین (H & E) رنگ‌آمیزی شدند. این تحقیق نشان داد که افلوکساسین قطر لوله‌ها را به‌طور معنی‌داری نسبت به گروه کنترل کاهش داده است اما ژله رویال اثر درمانی القا کرده است.

واژه­های کلیدی: افلوکساسین، رت نر بالغ، لوله‌های اسپرماتوژنز، بیضه، ژله رویال

* نویسنده مسئول، تلفن: 09184496046 ، پست الکترونیکی: sairan_hesami63@yahoo.com

مقدمه

ناباروری به‌صورت رخ ندادن حاملگی بدنبال یکسال نزدیکی جنسی محافظت نشده تعریف می‌شود (18) که عواملی از قبیل آلودگی‌های شغلی (فلزات سرب- کادمیوم- جیوه، حلال‌های شیمیایی)، موارد مصرفی (سیگار، الکل، قهوه، دارو و...)، افزودنی‌های خوراکی، اختلالات روانی (استرس و افسردگی و اضطراب و...) اختلالات نورولوژیک (ضایعات نخاعی– مغزی)، اختلالات هورمونی (دیابت شیرین، درمان با استروژن)، اختلالات شریانی، بیماریهای جسمی (کلیوی، انفارکتوس، نارسایی قلبی) عوامل اصلی در ایجاد ناباروری است (2، 3 و 10). نقش عملکرد اسپرم و بافت بیضه یکی از بزرگترین عوامل دخیل در ناباروری مردان است که اختلال در عملکرد اسپرم از شاخص‌های مهم و عمده در ناباروری مردان می‌باشد (16، 17 و 18).

تقریباً نیمی از علل ناباروری زوج‌ها به علت کاهش کیفیت اسپرم و ناباروری در مردان است و عفونت دستگاه ادراری– تناسلی حدود 15 درصد دیگر را به خود اختصاص داده است (22). در بررسی علل ناباروری عفونتها از جایگاه ویژه‌ای برخوردارند این عوامل قادرند با درگیری مستقیم بخش‌های مختلف دستگاه تناسلی بر عملکرد و توانایی این دستگاه تأثیر گذاشته و مانع باروری و یا ادامه موفق باروری می‌شوند. 20 درصد از افراد مؤنث و 1 درصد از افراد مذکر به یکی از بیماریهای دستگاه ادراری - تناسلی مبتلا می‌شوند (2 و 19). بیماریهای عفونی مخصوصاً بیماریهای دستگاه ادراری تناسلی یکی از مهمترین عوامل تهدیدکننده زندگی افراد بالغ بشمار می‌رود و جهت درمان این بیماریها و عفونت ناشی از باکتری‌های گرم منفی از آنتی‌بیوتیک‌های خانواده فلوروکینولون­ها استفاده می‌شود (12 و 16). آنتی‌بیوتیک‌های وسیع الطیفی از خانواده فلوروکینولون­ها به نام افلوکساسین (با دوز 200 میلی‌گرم، 300 میلی‌گرم، 400 میلی‌گرم) در درمان عفونت‌های دستگاه ادراری– تناسلی مورد استفاده قرار می‌گیرند (6). گاهی این آنتی‌بیوتیک‌ها به همراه بعضی داروها از جمله استرپتومایسین، داکسی سایکلین جهت درمان عوامل پاتوژن به مصرف می‌رسد. این داروها دارای اثر باکتریسیدی هستند و ساخت DNAی باکتری را مختل می‌کند همچنین به آنزیم DNA ژیر از باکتری گرم منفی و توپوایزامراز باکتری گرم مثبت متصل می‌گردند و مانع از همانندسازی و رونویسی DNAی باکتری می‌گردند این آنتی‌بیوتیک‌ها بعنوان جایگزین سفالوسپورینهای نسل سوم کاربرد درمانی دارند (4 و 12). مصرف هرآنتی­بیوتیک میتوند عوارضی را بدنبال داشته باشد حتی اگر به روش صحیح و به مقدار توصیه‌شده مصرف شود همچنین می‌تواند هرکدام از قسمت‌های بدن را درگیر کند و با علائم اصلی بیماری اشتباه گرفته شود علت این عوارض می‌تواند مکانیسم‌های ایمونولوژیک و غیرایمونولوژیک باشد تظاهرات بالینی عوارض آنتی‌بیوتیک بستگی به نوع آن، مقدار آن و چگونگی پاسخ میزبان دارد به‌طورکلی هرچقدر نسل آنها جلوتر می‌رود عوارض جانبی آنها بیشتر می‌شود. امروزه آنتی‌بیوتیک‌ها کاربرد وسیعی در کنترل عفونت دارند و به‌عنوان پیشگیری قبل از تماس و پیشگیری بعد از تماس و درمان عفونت‌ها مصرف می‌شوند (1، 9 و 17) فلوروکینولون‌ها معمولاً به‌خوبی تحمل می‌شوند و عوارض جانبی آن از خفیف تا متوسط است. تهوع، استفراغ، اسهال، سردرد، بی­خوابی از عوارض جانبی عمومی آنها هستند که معمولاً مشابه سایر آنتی بیوتیک هاست. در صورت مصرف همزمان فلوروکینولون‌ها با سفالوسپورین‌ها یا ماکرولیدها عوارض بیشتری از خود نشان می‌دهند اما با پنی­سیلین، وانکومایسین، کلیندامایسین و سولفونامید‌ها کمتر است مصرف همزمان فلوروکینولون‌ها با کورتیکواستروئیدها خطر پارگی تاندون، آشیل و تشنج را افزایش می‌دهد. این خطر در افراد مسن بالای ۶۰ سال بیشتر است لذا باید با احتیاط مصرف شود. کاهش پتاسیم و افزایش فاصله QT قلب در بعضی از انواع فلوروکینولون‌ها وجود دارد (1، 22 و 23). ژله رویال یکی از محصولات کندوی عسل است که پس از مصرف به‌زودی جذب خون می‌شود و به سلول‌های خاکستری مغز می‌رسد (13 و 15). این ژل ماده ایست خمیری شکل، لیمویی رنگ با طعم ترش و گس که از 1جفت غده مغزی زنبورهای کارگر پرستار به نام هیپوفارنژیال در سنین 2-12 روزگی ترشح می‌شود این ماده با عسل ترکیب‌شده و عسل را رقیق می‌کند و تجزیه شیمیایی این ژل نشان می‌دهد که این ماده دارای 66درصد آب، 15درصد کربوهیدرات، 13درصد پروتئین، 5 درصد چربی و 1 درصد مواد معدنی می‌باشد (11 و 19). ژله رویال غذای اصلی ملکه است که با مصرف آن وزن تخم‌هایش 60 درصد سنگین‌تر و حجم آن 40 درصد بزرگتر و عمر آن 50 برابر زنبورهای معمولی است پس به باروری افراد کمک می‌کند (3، 19 و 20). همچنین این ژل دارای ترکیب کامل و بسیار غنی است که دارای انواع اسیدآمینه و اسیدچرب مهم می‌باشد، همچنین دارای انواع استرول و ترکیبات کلسترول از جمله استیل کولین است. این ماده تولیدمثل زنان و مردان را تحریک می‌کند و تمایلات جنسی را زیاد می‌کند و پیشگیری بسیاری از بیماریهای عفونی می‌باشد بنابراین برای افرادی که از ناتوانی جنسی رنج می‌برند بسیار مفید است (11، 20 و 21).

 ازآنجایی‌که با توجه به جستجوهای انجام‌شده تاکنون مطالعاتی در خصوص اثر آنتی بیوتیک افلوکساسین بر قطر لوله‌های اسپرماتوژنز صورت نگرفته است، انجام این مطالعه جهت بررسی اثرات احتمالی این آنتی‌بیوتیک بر قطر لوله‌های اسپرماتوژنز است که این شاخص می‌تواند به نوبه خود بر میزان باروری تأثیر بگذارد. همچنین در آخر اثرات درمانی ژله رویال بر قطر لوله‌ها مورد بررسی قرارگرفته است.

مواد و روشها

جهت این تحقیق از 32 سر رت نر بالغ نژاد ویستار که در محدوده‌ی وزنی 20± 200 گرم بودند و در درجه حرارت 24 درجه سانتی­گراد و رطوبت 30-40 درجه سانتی­گراد و 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی نگهداری شدند. این حیوانات در قفسه‌های فلزی قرارداشتند و فقط از آب شهری و پلیت تغذیه شدند.

تحقیق حاضر در سال 1389 در دانشکده علوم دانشگاه ارومیه انجام‌گرفته است.

گروه‌بندی حیوانات: 32 رت نر بالغ حدوداً 6 هفته‌ای در 4 گروه 8 تایی قرارگرفتند که یک گروه به‌عنوان گروه کنترل (1) فقط آب و تیمار قرارگرفتند. آنتی‌بیوتیک افلوکساسین با دوز 200میلی‌گرمی به‌صورت محلول در آب آشامیدنی به مقدار 3/0 سی­سی به طریق گاواژ و به‌صورت خوراکی در سیکل 14 روزه به موشها داده شد (طرز تهیه: افلوکساسین با دوز 200 میلی‌گرمی که به‌صورت قرص روکش‌دار بود ابتدا به پودر تبدیل شد بعد به‌وسیله همزن آزمایشگاهی با 10 سی‌سی آب مقطر به حالت محلول درآمد سپس محلول سفیدرنگی بدست آمد). گروه دارو (2) بعد از اتمام سیکل 14 روزه­دار و آسان­کشی شدند. در گروه 3، حیوانات با اتمام سیکل 14 روزه دارو، بمدت 14 روز دیگر در وضعیت بدون دارو قرارگرفتند (28 روز) سرانجام با اتمام سیکل 28 روزه، آسان­کشی شدند. گروه درمان (4) با اتمام سیکل 14 روزه دارو، بمدت 14 روز دیگر تحت درمان با ژله رویال قرارگرفتند (28روز)، ژله رویال با دوز 10 گرمی در 40 سی‌سی آب مقطر حل گردید و به‌صورت محلول در آب آشامیدنی، به مقدار 3/0 سی‌سی از طریق گاواژ به‌صورت خوراکی به موشها داده شد این مقدار براساس تحقیقات پژوهشی صورت گرفته درگذشته انتخاب‌شده است. سپس حیوانات با اتمام سیکل 28 روزه دارو و درمان آسان­کشی شدند. به طوریکه ابتدا آنها را توسط کلروفرم بیهوش کرده و با تشریح در ناحیه شکم، بافت بیضه به‌طور کامل استخراج گردید و جهت مطالعات بافتی در یورین باتلهای 50 حاوی فرمالین 10 درصد تثبیت گردید. بافت بیضه پس از مقطع گیری و رنگ‌آمیزی با هماتوکسیلین / ائوزین جهت مطالعه قطر لوله‌های اسپرماتوژنز مورد بررسی قرارگرفت. در رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین ائوزین، لام­های رنگ‌آمیزی شده بافت بیضه با کمک عدسی چشمی مدرج فاکتورهای اسپرمی از جمله قطر لوله­های اسپرماتوژنز تخمین زده شدند.

برای خصوصیات فیزیکی اجزای سلول و ارتباطات بافت‌ها، برش‌های مورد نظر باید مورد رنگ‌آمیزی قرارگیرند اما قبل از رنگ‌آمیزی باید پارافین از مقطع روی اسلاید برداشته شود برای این منظور و آب­دهی به بافت‌ها اسلایدها به ترتیب داخل محلول‌های ذیل عبور داده شد 1- محلول گزیلل І، 2- محلول گزیلل ІІ، 3- محلول گزیلل ІІІ، 4- الکل مطلق، 5- الکل 90 درصد، 6- الکل 80 درصد، 7- الکل 70 درصد قرارگیری در هرکدام از محلول‌های فوق به مدت 3 دقیقه است.

در رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین ائوزین لام­های آماده شده در مراحل فوق به ترتیب در محلول‌های ذیل قرار داده شدند. 1) محلول هماتوکسیلین هاریس 13-10 دقیقه، 2) شستشو در آب جاری، 3 ) محلول اسید الکل3 ثانیه، 4) شستشو در آب جاری، 5) محلول کربنات لیتیوم اشباع 5-3 دقیقه، 6) شستشو در آب جاری، 7) محلول ائوزین 7 دقیقه، 8) شستشو در آب جاری، 9) الکل 70 درصد 30-15 ثانیه، 10) الکل 80 درصد 45-30 ثانیه، 11) الکل 90 درصد 3 دقیقه، 12) الکل مطلق 3 دقیقه، 13) محلول گزیللІ 3 دقیقه، 14) محلول گزیلل ІІ 3 دقیقه، 15) محلول گزیلل ІІІ 3 دقیقه.

طرز تهیه اسید الکل (برای تهیه اسید الکل 100 میلی­لیتر الکل اتیلیک 70 درجه با 10 میلی‌لیتر اسیدکلریدریک غلیظ مخلوط شد).

طرز تهیه هماتوکسیلین هاریس (هماتوکسیلین 1گرم، الکل اتیلیک مطلق 20-10 میلی‌لیتر،آلوم آلومینیوم 20 گرم، آب مقطر 200 میلی‌لیتر، اکسید مرکوریک 5/0 گرم)

طرز تهیه رنگ ائوزین (1گرم ائوزین، 100 میلی‌لیتر آب مقطر، یک قطعه تیمول) : در این رنگ‌آمیزی هسته سلول‌ها به رنگ آبی تیره تا سیاه و سیتوپلاسم به رنگ صورتی مشاهده می‌شود. بعد از اتمام رنگ‌آمیزی، یک قطره از چسب انتانل را بر روی لامل می­گذاریم و سپس به آرامی لامل را روی لام حاوی نمونه می‌چسبانیم. اکنون لام برای مطالعه با میکروسکوپ نوری آماده است. با استفاده از این رنگ‌آمیزی فاکتورهای اسپرمی (قطر لوله‌های منی­ساز، ضخامت اپی­تلیوم لوله‌ها، ضخامت بافت پیوندی ما بین لوله‌ها، درصد تمایز لوله‌ای، درصد اسپرمیوژنز) محاسبه می‌شود که طی تحقیق حاضر قطر لوله‌های منی ساز مورد بررسی قرارگرفت.  

نتایج

قطر لوله‌های اسپرماتوژنز در رت­های گروه کنترل (A): درگروه کنترل قطر لوله ها طبیعی ونرمال می باشد (شکل1). اندازه گیری قطر لوله با عدسی چشمی مدرج صورت گرفته است که میانگین داده بدست آمده از آنالیز و تحلیل داده‌ها (2 ± 53/4) می‌باشد.

شکل1- مقطع عرضی از لوله‌های سمنی فر با بزرگنمایی 400 و رنگ‌آمیزی H & E  (گروه کنترل)  

اثر تزریق دارو بر قطر لوله‌های اسپرماتوژنز (B): همانطور که در شکلها دیده می شود قطر لوله در گروه کنترل (شکل 1) بیشتر از قطر در گروه دارو (شکل2) می‍باشد و نشان دهنده آنست که آنتی‌بیوتیک افلوکساسین قطر لوله های منی ساز را به‌طور معنی‌داری در مقایسه با گروه کنترل کاهش داده است. میانگین داده بدست آمده از آنالیز و تحلیل داده‌ها (2 ± 53/1) می‌باشد.

شکل2- مقطع عرضی از لوله‌های سمنی فر با بزرگنمایی 400 و رنگ‌آمیزی H & E  (گروه دارو

وضعیت قطر لوله‌های اسپرماتوژنز در شرایط بدون دارو بعد از سیکل دارویی(C): درگروه دو هفته بدون دارو (این گروه بعد از سیکل 14 روزه دارو، به مدت 2 هفته دیگر در وضعیت بدون آنتی‌بیوتیک قرارداده شد که نام‌گذاری برهمین اساس صورت گرفته است)، کاهش در قطر لوله‌ها و در نتیجه کاهش در باروری همچنان دیده می‌شود (شکل3)، این کاهش نسبت به گروه کنترل (شکل1) معنی‌دار است. میانگین داده بدست آمده از آنالیز و تحلیل داده‌ها (2± 90/1) می‌باشد.

شکل3- مقطع عرضی از لوله‌های سمنی فر با بزرگنمایی 400 و رنگ‌آمیزی H & E  (گروه 2هفته بدون دارو)

اثر ژله رویال بر قطر لوله‌های اسپرماتوژنز (D): در گروه دریافت کننده ژل رویال (گروه درمان)، کاهش قطر لوله های منی ساز برطرف شده و با نقش آنتی‌اکسیدانی ژله رویال، قطر لوله‌های منی­ساز افزایش معنی‌دار نسبت به گروه دارو (شکل2) و گروه دو هفته بدون دارو (شکل3) نشان داده است اما این افزایش (شکل4) نسبت به گروه کنترل (شکل1) معنی‌دار نمی‌باشد. بنابراین ژله رویال (شکل4) باعث بهبودی نسبی باروری و افزایش قطر لوله‌ها نسبت به گروه کنترل (شکل1) شده است اما به‌خوبی گروه کنترل نمی‌باشد. میانگین داده بدست آمده از آنالیز و تحلیل داده‌ها (2± 10/4) می‌باشد.

نتیجه‌گیری

اختلال در قطر لوله‌های سمنی فر یکی از عوامل ایجاد ناباروری در مردان می‌باشد که طی تحقیق حاضر آنتی‌بیوتیک افلوکساسین از خانواده فلوروکینولون­ها، در گروه (B) و (C) در قطر لوله‌ها کاهش معنی‌داری نسبت به گروه کنترل (A) ایجاد کرده است و درنهایت با القاء اثر درمانی ژله رویال در گروه (D)، قطر لوله‌ها نسبت به گروه‌های (B وC) به‌طور معنی‌دار افزایش‌یافته است که این افزایش به‌خوبی گروه کنترل نمی‌باشد. بنابراین ژله رویال در کاهش قطر لوله‌ها و در نهایت ناباروری، بهبودی نسبی حاصل کرده است.

شکل 4- مقطع عرضی از لوله‌های سمنی فر با بزرگنمایی 400 و رنگ‌آمیزی H & E  (گروه درمان)

آنالیز و تحلیل داده‌ها: طی این تحقیق محاسبه آماری با استفاده از نرم‌افزار Spssنسخه16  انجام شد و برای مقایسه میانگین بین گروهها از آنالیز واریانس یک‌طرفه و تست Tukey و همچنین برای رسم نمودار از Excel استفاده شد. (سطح احتمال 05/0 P< می‌باشد)

طی محاسبه آماری و آنالیز و تحلیل داده‌ها همچنین محاسبه میانگین داده‌ها نتیجه‌گیری شد که قطر لوله‌های اسپرماتوژنز در گروه دارو (2 ± 53/1) و گروه 2 هفته بدون دارو (2 ± 90/1) نسبت به گروه کنترل (2 ± 53/4) کاهش معنی‌دار داشته است اما در گروه درمان با ژله رویال (2± 10/4) افزایش معنی‌دار نسبت به گروه دارو (2 ±53 /1) و2 هفته بدون دارو (2 ± 90/1) داشته است. در حالیکه این افزایش (2 ± 10/4) نسبت به گروه کنترل (2 ± 53/4) معنی‌دار نمی‌باشد. اندازه‌گیری قطر لوله‌های اسپرماتوژنز با استفاده از عدسی چشمی مدرج صورت گرفته است و میانگین داده‌ها در سطح احتمال 005/0> P می‌باشد.

نمودار1 - بررسی قطر لوله‌های اسپرماتوژنز diameter of seminiferous tubules STD) ) در گروه‌های موردمطالعه در مقایسه با گروه کنترل

علامت * در نمودار بیانگر معنی‌دار بودنشان می‌باشد.