نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه شهید باهنر کرمان

چکیده

متیونین یک اسید آمینه ضروری گوگرددار است که به صورت گسترده برای تشکیل غضروف لازم می باشد اما اثرات نامطلوب آن را در اتیولوژی بیماری های استخوانی مانند دیسکندروپلاژی تیبیا و تاثیر آن بر ماتریکس ارگانیک استخوان نباید نادیده گرفت. در این مطالعه اثر هیستومورفومتری و هیستولوژی متیونین بر روی استخوان تیبیای جنین مرغ به عنوان یک مدل حیوانی بررسی گردیده است.
30 عدد تخم مرغ نطفه دار هم وزن نژاد گوشتی سویه راس 308، به گروه های کنترل، و تیمارهای دریافت کننده 30 و 50 میلی گرم متیونین تقسیم شدند. روز چهارم انکوباسیون، گروه شاهد، نیم میلی لیتر PBS استریل از طریق سوراخ ایجاد شده در انتهای پهن دریافت کرد. گروه های تیمار نیز نیم میلی لیتر محلول PBS که به ترتیب دارای 30 و 50 میلی گرم متیونین بود، دریافت نمودند. روز هیجده انکوباسیون، نمونه از مقطع عرضی وسط استخوان تیبیا اخذ گردید و ضخامت کورتکس و قطر و نیز نسبت کورتکس به قطر و همچنین تعداد و اندازه سلول های استئوبلاست، استئوسیت و استئوکلاست اندازه گیری شد.
نتایج نشان داد متیونین افزوده شده به کیسه زرده جنین، سبب کاهش تشکیل استخوان و کاهش روند رسوب کلسیم در ماتریکس استخوان جنین گردید. همچنین بر تعداد و اندازه استئوبلاست و استئوسیت ها اثر منفی داشت که برخلاف اثر این آمینو اسید بر استئوکلاست ها بود.
در مجموع استفاده از متیونین تنها به عنوان یک مکمل غذایی سبب بروز استئو آرتریت می گردد. توصیه می گردد این آمینو اسید همراه با مکمل های آنتی اکسیدان مانند ویتامین C مصرف گردد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Histomorphometric effect of methionine on tibia in the chicken embryo as an animal model

نویسنده [English]

  • Mohammad Naser Nazem

Sha

چکیده [English]

Methionine is an essential sulfur-containing amino acid that is widely required for cartilage formation. Its undesirable effects should not be ignored on the etiology of bone diseases such as tibial dischondroplasia and bone organic matrix. In this study the histopathologic and histomorphometrical effects of methionine was evaluated on tibia in chicken embryo as an animal model. 30 fertilized eggs of the same weight (50±0.4 gr) Ross 308 broiler strains were divided into the control and treatment groups. On the day of 4 of incubation, controls received 0/5 ml of sterile PBS through the hole created at the wide end while, treatment groups were injected by 0/5ml of PBS solution which respectively had 30 and 50 mg methionine. On the day of 18, Eighteen, samples were taken from cross section of the mid of the tibia. Thickness of the cortex, diameter and cortex to diameter ratio, numbers and size of osteoblasts, osteocytes and osteoclasts were assessment histomorphometriacl.
Results showed that yolk sac injected methionine in chicken embryos, decreased bone formation and reduce the calcium sediment in the bone matrix. Also it caused to decrease the osteoblasts and osteocytes in number and measures that was against its effects on osteoclasts.
In conclusion, methionine–alone administration led to the osteoarthritis. It is hypothesized that methionine used with antioxidant supplements such as vitamin C.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Methionine
  • Bone Cortex
  • Bone Cells
  • Chicken Embryos
  • Animal Model

ارزیابی هیستومورفومتریک تأثیر متیونین بر استخوان تیبیا در جنین جوجه به عنوان یک مدل حیوانی

محمدناصر ناظم1*، رضا خیراندیش2، هادی توکلی3 و مجید اسداله زاده1

1 کرمان، دانشگاه شهید باهنر کرمان، دانشکده دامپزشکی، بخش علوم تشریح 

2 کرمان، دانشگاه شهید باهنر کرمان، دانشکده دامپزشکی، بخش پاتوبیولوژی

3 کرمان، دانشگاه شهید باهنر کرمان، دانشکده دامپزشکی، بخش پرورش و بیماری های طیور

تاریخ دریافت: 12/8/94                تاریخ پذیرش: 18/12/94

چکیده

متیونین یک اسید آمینه ضروری گوگرددار است که به صورت گسترده برای تشکیل غضروف لازم می­باشد، اما اثرات نامطلوب آن را در اتیولوژی بیماری­های استخوانی مانند دیسکندروپلاژی تیبیا و تأثیر آن بر ماتریکس ارگانیک استخوان را نباید نادیده گرفت. در این مطالعه اثر هیستومورفومتری و هیستوپاتولوژی متیونین بر استخوان تیبیای جنین مرغ به عنوان یک مدل حیوانی بررسی گردیده است. 30 عدد تخم­مرغ نطفه­دار هم‌وزن (0.04±50) نژاد گوشتی سویه رأس 308، به‌طور مساوی به گروه­های کنترل، و تیمارهای دریافت‌کننده 30 و 50 میلی­گرم متیونین تقسیم شدند. روز چهارم انکوباسیون، گروه شاهد، نیم میلی‌لیتر PBS استریل از طریق سوراخ ایجادشده در انتهای پهن دریافت کرد. گروه‌های تیمار نیز نیم میلی‌لیتر محلول PBS که به ترتیب دارای 30 و 50 میلی‌گرم متیونین بود، دریافت نمودند. روز هیجده انکوباسیون، نمونه از مقطع عرضی وسط استخوان تیبیا اخذ گردید و ضخامت کورتکس و قطر و نیز نسبت کورتکس به قطر و همچنین تعداد و اندازه سلول‌های استئوبلاست، استئوسیت و استئوکلاست اندازه‌گیری شد. نتایج نشان دادمتیونین افزوده‌شده به کیسه زرده جنین، سبب کاهش تشکیل استخوان و کاهش روند رسوب کلسیم در ماتریکس استخوان جنین گردیده بود. همچنین بر تعداد و اندازه استئوبلاست و استئوسیت ها اثر منفی داشت که برخلاف اثر این آمینواسید بر استئوکلاست ها بود. درمجموعاستفاده از متیونین تنها به‌عنوان یک مکمل غذایی سبب بروز استئوآرتریت می‌گردد. توصیه می‌گردد این آمینواسید همراه با مکمل‌های آنتی‌اکسیدان مانند ویتامین C مصرف گردد.  

واژه‌های کلیدی: متیونین، کورتکس استخوان، سلول‌های استخوانی، جنین مرغ، مدل حیوانی

* نویسنده مسئول، تلفن: 03433257447 ، پست الکترونیکی: nnazem@uk.ac.ir

مقدمه

 

سیستم اسکلتی، بافت پویایی است که برای دو وظیفه مهم تکامل‌یافته است. ارائه چهارچوبی ساختاری برای حرکت و دیگری مخزن متابولیک برای هموستاز مواد معدنی و تعادل اسید و باز (26). کلاژن نوع I که 90% ماتریکس آلی استخوان است، به‌عنوان پروتئین غالب ساخته‌شده توسط استئوبلاست­ها به‌حساب می‌آید (44). پروتئین و اسیدهای آمینه از اجزای ضروری رشد و بقا در دوره جنینی می‌باشند. متیونین یک اسیدآمینه ضروری گوگرددار است که به‌صورت گسترده برای تشکیل غضروف لازم بوده و می‌تواند مانع استئوپروز گردد (42). علی رغم نقش­های اساسی متیونین، نتایج برخی مطالعات نشان می‌دهد که اسیدهای آمینه گوگردی می‌توانند متابولیسم ماتریکس ارگانیک استخوان را متأثر کنند. نتیجه این مطالعات عنوان کرده که اسیدهای آمینه گوگردی ممکن است در اتیولوژی دیسکندروپلازی تیبیا نقش داشته باشند (12). در مطالعه­ای تغذیه با مقادیر بالای اسیدآمینه­های گوگردی سبب کاهش قابل‌توجه در وزن استخوان ران و کاهش تراکم آن در رادیوگراف‌ها گشته است (43). نتایج مطالعات فرانکل (12) مشابه نتایج لوهاکر (22) نشان می­دهد زیادی متیونین در متابولیسم ماتریکس استخوان اثر منفی دارد. هرچند برخی مطالعات نه‌تنها اثر منفی این اسیدآمینه را قبول ندارند بلکه برای این اسیدآمینه، نقش مثبت در استحکام بخشیدن به استخوان قائل هستند (27).

هدف از این مطالعه، بررسی اثر متیونین بر هیستومورفومتری و هیستولوژی استخوان تیبیای جنین جوجه گوشتی بوده است. نتایج این مطالعه با توجه به آنکه جنین جوجه یکی از مدل‌های آزمایشگاهی جانوری مناسب است که توسط محققین رشته‌های مختلف مورد استفاده قرار می‌گیرد و از طرفی مراحل طبیعی تکوین اسکلت جنین جوجه نه‌تنها در مطالعات جنین‌شناسی تجربی و تراتولوژیک به‌عنوان کنترل استفاده دارد، بلکه جهت مقایسه در بدشکلی‌های اسکلتی حاصل از موتانت­ها نیز استفاده می‌شود (23) قابل‌تعمیم به انسان می‌باشد.

مواد و روشها 

کلیه مراحل انجام این مطالعه، مطابق دستورالعمل رعایت حقوق حیوانات دانشکده دامپزشکی دانشگاه شهید باهنر کرمان صورت پذیرفته است. 30 عدد تخم‌مرغ نطفه‌دار هم‌وزن (0.04±50) نژاد گوشتی سویه رأس 308 از کارخانه جوجه‌کشی مرغ ماهان به‌طور تصادفی به 3 گروه مساوی تقسیم و همزمان باهم وارد دستگاه جوجه‌کشی (بلدرچین دماوند، PLC_DQSH, V:4، ایران) گردیدند.

تهیه محلول تزریقی: در این مطالعه، دی- ال متیونین به‌صورت پودر کریستالی به رنگ سفید متمایل به زرد با خلوص 99% (شرکت ایونیک دگوسا، آلمان) استفاده گردید. پس‌ازآنکه میزان متیونین هر گروه در PBS استریل ریخته شد و حدود 10 دقیقه در بن ماری 37 درجه قرارگرفت، با عبور از فیلتر22/0 میکرون، استریل گردید.

روش انجام آزمایش: در روز چهار دوره انکوباسیون، ابتدا نطفه‌دار بودن توسط چراغ کندل تأیید، سپس انتهای پهن تخم‌مرغ با الکل اتانول 70% ضدعفونی و با استفاده از سوراخ‌کن، در پوسته تخم‌مرغ سوراخ ایجاد شد (39). در ادامه، مطابق با روش‌های استاندارد، با استفاده از سرنگ یک میلی‌لیتری با سرسوزن درجه 22، پس‌ازآنکه نیدل حدود 2.5 سانتی‌متر وارد تخم‌مرغ شد، تزریقات به داخل کیسه زرده صورت گرفت. براساس مطالعات انجام‌شده، بهترین محل برای تزریق اسیدآمینه در این روز، کیسه‌ی زرده می‌باشد (34). گروه شاهد، نیم میلی‌لیتر PBS استریل از طریق سوراخ ایجادشده دریافت کرد. گروه‌های تیمار نیز نیم میلی‌لیتر محلول PBS که به ترتیب دارای 30 و 50 میلی‌گرم متیونین بود از طریق سوراخ ایجادشده دریافت نمودند. لازم به ذکر است در آزمایشات مقدماتی چنین نتیجه‌گیری شد که دوز بالاتر از 50 میلی‌گرم، توکسیک بوده و سبب مرگ درصد بالایی از جنین‌ها می‌گردد. از سوی دیگر دوزهای کمتر از 30 میلی‌گرم نیز تفاوت معناداری با یافته‌های گروه کنترل نداشتند و بنابراین انتخاب نگردیدند. سپس سوراخ ایجادشده، بوسیله­ی پارافین مذاب، مسدود و تخم‌مرغ‌ها به ماشین جوجه‌کشی (دمای 37.7 درجه سانتی­گراد، رطوبت نسبی 60%) برگردانده شدند که مطابق مطالعات سایر محققین می‌باشد (34).

در روز هیجده انکوباسیون، تخم‌مرغ‌ها از دستگاه خارج‌شده و با قراردادن آنها روی یخ به مدت 20 دقیقه جنین به روش انسانی کشته شد. سپس جنین‌ها از داخل تخم‌مرغ‌ها خارج و استخوان تیبیای سمت چپ با استفاده از اسکالپل، به‌صورت عرضی از وسط، نصف گردید. از نمونه‌ها پس از طی مراحل فیکساسیون توسط دستگاه اتوتکنیکون، بلوک‌های پارافینی تهیه گردید. در ادامه با استفاده از برش‌هایی باضخامت 3 میکرون و رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین– ائوزین، میانگین ضخامت کورتکس و قطر در محور جانبی – میانی (Lateromedial) و نیز نسبت مجموع دو کورتکس داخلی و خارجی به قطر با استفاده از لنز دیجیتال (Dino-eye, AM-7023, 5Mp, Taiwan) و بزرگنمایی 100 برابر، اندازه‌گیری شد. همچنین پس از رنگ‌آمیزی تری کروم به‌منظور تشخیص قطعی کلاژن تیغه‌های استخوانی، میانگین ضخامت آنها با بزرگنمایی400 برابر در گروه‌های مختلف اندازه‌گیری گردید. بدین منظور در هر نمونه، ضخامت 20 تیغه اندازه‌گیری و میانگین کل داده‌های هر گروه، محاسبه گردید.

از سوی دیگر روند آهکی‌شدن رشته‌های کلاژن در مقطع عرضی بارنگ آمیزی وان کوسا که برای تشخیص کلسیم در بافت‌ها به کار می‌رود، بررسی گردید.همچنین با استفاده از رنگ­آمیزی آلکالین فسفاتاز و هماتوکسیلین- ائوزین، تعداد استئوسیت، استئوبلاست و استئوکلاست­های موجود شمارش و ابعاد آنها توسط لنز دیجیتال اندازه‌گیری شد (1،2). برای شمارش سلول­ها، با استفاده از بزرگنمایی400 برابر، تعداد 10 شان بصورت تصادفی در وسط مقطع عرضی هر نمونه استخوانی انتخاب و تعداد سه نوع سلول استئوبلاست، استئوسیت و استئوکلاست به تفکیک شمارش شد. همچنین با استفاده از بزرگنمایی 1000 برابر، بیشترین طول 10 عدد از هر سه نوع سلول فوق، در وسط بافت استخوان، اندازه­گیری گردید. برای اندازه­گیری ابعاد استئوسیت­ها، بیشترین طول لاکونا اندازه­گیری شد. 

تجزیه‌وتحلیل آماری: جهت تجزیه‌وتحلیل آماری، از نرم‌افزار SPSS (16 Chicago. USA) و آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه (One way analysis of variance(ANOVA)) استفاده گردید. همچنین از آزمون چند دامنه‌ای توکی جهت تعیین معناداری اختلاف بین گروه‌های آزمایشی، استفاده شد. در مطالعه حاضر (0.05P<) معنی‌دار تلقی شده است.

نتایج 

ارزیابی هیستومتری، هیستومورفومتری و هیستوپاتولوژی تیغه­ها و دیواره‌های استخوان: در گروه کنترل، تیغه­ها به‌خوبی شکل‌گرفته بودند. یافته­های میکروسکوپیک، بیانگر شکل­گیری گسترده و یکنواخت تیغه و کورتکس در این گروه بود (شکل1). در این گروه، ضخامت تیغه در وسط استخوان به ترتیب 0.0009±0.029 و 0.15±2.51 و قطر استخوان، 0.48±3.44 میلی‌متر بود. بر این اساس نسبت کورتکس به قطر (C/D)، 0.009±0.73 بدست آمد (جدول 1).

 

جدول 1- ارزیابی هیستومتری تیغه، کورتکس و قطر استخوان تیبیای جنین جوجه *و**

نسبت کورتکس به قطر 

قطر 

ضخامت کورتکس 

ضخامت تیغه 

 

0.009±0.73

a0.48±3.44

a0.15±2.51

a0.0009±0.029

گروه کنترل 

0.02±0.59

b0.3±3.15

a0.18±1.91

b0.0006±0.026

گروه دریافت‌کننده 30 میلی‌گرم متیونین 

0.02±0.57

b0.16±2.52

b0.1±1.49

b0.0009±0.027

گروه دریافت‌کننده 50 میلی‌گرم متیونین 

* اندازه‌ها بر اساس میلی‌متر است.        **حروف نامشابه در هر ستون، نشان‌دهنده اختلاف معنادار است (0.05P<).

 

در رنگ‌آمیزی وان­کوسا، رسوب کلسیم در ماتریکس زمینه­ای به‌صورت سیاه‌رنگ به‌خوبی مشهود بود (شکل2). در رنگ‌آمیزی تری کروم، تشکیل و رسوب کلاژن نوع I در ماتریکس خارج سلولی به‌صورت آبی تیره مشاهده شد. همان­طور که در تصاویر مشخص است و در جدول 1 نیز آمده، تیغه­ها از ضخامت قابل‌توجهی برخوردار بودند (شکل 3).

 

 


جدول 2- ارزیابی هیستومتری تعداد و طول سلول‌های اصلی استخوان **

 

طول سلول*

 

تعداد سلول

 

 

 

 

استئوکلاست

استئوسیت

استئوبلاست

نسبت استئوکلاست به مجموع استئوبلاست و استئوسیت

استئوکلاست

استئوسیت

استئوبلاست

 

 

 

a1.64±14

a0.45±7

a0.0±5

0.09

0.03±0.35

0.28±4

0.21±4

گروه کنترل

 

a0.0±16

b0.58±4.8

b0.32±4

0.1

0.05±0.42

0.13±4.33

0.28±4.08

گروه دریافت‌کننده 30 میلی‌گرم متیونین

b1.57±27.2

b0.28±5.2

b0.13±4.2

0.13

0.02±0.5

0.24±3.75

0.15±3.75

گروه دریافت‌کننده 50 میلی‌گرم متیونین

* اندازه‌ها بر اساس میکرومتر است.       **حروف نامشابه در هر ستون، نشان‌دهنده اختلاف معنادار است (0.05P<).

 

                                   

 


شکل 1- ارزیابی هیستولوژی استخوان تیبیا. شکل‌گیری استخوان و تشکیل ترابکول ها در گروه کنترل (A) کامل‌تر از گروه‌های دریافت‌کننده 30 میلی‌گرم (B) و 50 میلی‌گرم (C) متیونین بود. به ضخامت کورتکس در بین گروه‌ها دقت شود بطوری که کمترین ضخامت کورتکس، مربوط به شکل C می‌باشد. (رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین – ائوزین، بزرگنمایی 100 برابر)

 

در گروه دریافت‌کننده 30 میلی‌گرم متیونین، تیغه‌های استخوانی، بسیار نازک بود که نشان از اختلال در روند رسوب کلاژن نوع I در ماتریکس داشت. از طرف دیگر قطر کورتکس به‌شدت کاهش‌یافته و بسیاری از تیغه­ها حین برش به علت عدم استحکام، متلاشی‌شده بودند که نشانگر سستی بافت استخوان بود (شکلهای1،3،2). در این گروه، ضخامت تیغه و کورتکس در وسط استخوان به ترتیب 0.0006±0.026 و 0.18±1.91 و قطر استخوان، 0.3±3.15 میلی‌متر بود. بدین ترتیب نسبت کورتکس به قطر (C/D)، 0.02±0.59 بدست آمد (جدول 1). در رنگ‌آمیزی وان کوسا، واکنش ضعیفی از رنگ قهوه‌ای دیده  شد که نشان از رسوب کم کلاژن تیپ I داشت (شکل 2). در رنگ‌آمیزی تری کروم، عدم رنگ‌پذیری ماتریکس استخوان، بیانگر عدم رسوب کافی کلاژن در بافت زمینه­ای بود (شکل 3).


 

شکل 2- ارزیابی رسوب کلسیم. میزان رسوب کلسیم با توجه به همزمانی مواجهه نمونه‌ها با محلول رنگ‌آمیزی، در گروه کنترل (A)، دریافت‌کننده 30 میلی‌گرم متیونین (B) و دریافت‌کننده 50 میلی‌گرم متیونین، به ترتیب روند کاهشی دارد. به کاهش حضور تیغه‌های استخوانی و ضخامت آنها از شکل A به C دقت شود. (رنگ‌آمیزی وان کوسا، بزرگنمایی 400 برابر)

 

شکل 3- ارزیابی میزان رسوب کلاژن در ماتریکس استخوانی. همانطور که در گروه کنترل (A) دیده می‌شود، میزان تشکیل تیغه‌ها و ضخامت آنها نسبت به گروه‌های دریافت‌کننده 30 میلی‌گرم متیونین (B) و 50 میلی‌گرم متیونین (C) بسیار بیشتر است. در تصویر A (گروه کنترل)، پیوستگی تیغه‌ها بیشتر از اشکال B و C می‌باشد. در شکل C، ضخامت و از هم گسستگی تیغه‌ها، بسیار بیشتر از شکل B است. (رنگ‌آمیزی تری کروم ماسون، بزرگنمایی 400 برابر)

 

در گروه دریافت‌کننده 50 میلی‌گرم متیونین همانند گروه قبل، فقط در ناحیه کورتکس، مقداری از تیغه­های نازک استخوانی وجود داشت و در قسمت­های دیگر اثری از تشکیل تیغه مشاهده نشد (شکل 1). در این گروه ضخامت تیغه و کورتکس در وسط استخوان به ترتیب 0.0009±0.027 و 0.1±1.49 و قطر استخوان، 0.16±2.52 میلی‌متر بود. بدین ترتیب نسبت کورتکس به قطر (C/D)، 0.02±0.57 به دست آمد (جدول 1). در رنگ‌آمیزی وان کوسا، واکنش ضعیفی از رنگ قهوه‌ای دیده می‌شد که حکایت از رسوب کم کلسیم تیپ I داشت (شکل 2). در رنگ‌آمیزی تری کروم، عدم رنگ‌پذیری ماتریکس استخوان، بیانگر عدم رسوب کافی کلاژن در بافت زمینه­ای بود (شکل 3).

براساس نتایج فوق و همان­طور که در جدول 1 آمده، ضخامت تیغه­ها بین گروه‌های کنترل و تیمار، اختلاف معناداری نداشت (0.05P>).

ضخامت کورتکس در گروه تیمار دریافت‌کننده 50 میلی­گرم متیونین، کمتر از گروه دریافت­کننده 30 میلی­گرم متیونین بود اما اختلاف معناداری نداشت (0.05P>) درحالی‌که هر دو گروه تیمار کورتکسشان بطور معناداری کمتر از گروه کنترل بود (0.05P< ).

قطر استخوان در گروه دریافت کننده 50 میلی­گرم متیونین نسبت به گروه­های کنترل و دریافت کننده 30 میلی‌گرم متیونین کاهش معناداری داشت (0.05P<) درحالی‌که بین گروه دریافت‌کننده 30 میلی­گرم متیونین و گروه کنترل اختلاف معناداری دیده نشد (0.05P>). این در حالی است که گروه‌های دریافت­کننده متیونین، با افزایش میزان متیونین نسبت به هم و نیز نسبت به گروه کنترل، کاهش قطر داشتند.

نسبت کورتکس به قطر، بین گروه­های دریافت­کننده 30 و 50 میلی­گرم متیونین اختلاف معنی‌دار نداشت درحالی‌که هر دو گروه نسبت به گروه کنترل کاهش معنی­داری را نشان می­دادند (0.05P<).

ارزیابی هیستومتری اندازه سلول‌های سه‌گانه ماتریکس استخوان: نتایج به‌دست‌آمده نشان داد که اندازه استئوبلاست­ها در گروه کنترل، دریافت­کننده­ی 30 و 50 میلی­گرم متیونین به ترتیب 0.0±5، 0.32±4 و 0.13±4.2 میکرومتر بود. اندازه این سلول‌ها در گروه کنترل به‌طور معناداری بزرگتر از گروه­های تیمار دریافت­کننده­ی متیونین بود (0.05P<) درحالی‌که گروه‌های تیمار دریافت‌کننده‌ی متیونین اختلاف معناداری نداشتند (0.05P>)(جدول 2).

نتایج بدست آمده نشان داد که اندازه­ی استئوسیت­ها در گروه‌های کنترل، دریافت­کننده­ی 30 و 50 میلی­گرم متیونین به ترتیب 0.45±7، 0.58±4.8 و 0.28±5.2 میکرومتر بود. نتایج نشان داد که اندازه استئوسیت در گروه کنترل به‌طور معناداری بیش از دو گروه دیگر بوده (0.05P<) درحالی‌که گروه­های دریافت­کننده­ی 30 و 50 میلی­گرم متیونین، فاقد اختلاف معنادار بودند (0.05P>)(جدول 2(.

در گروه‌های کنترل، دریافت­کننده­ی 30 و 50 میلی­گرم متیونین، اندازه استئوکلاست­ها به ترتیب 1.64±16، 0.0±14 و 1.57±27.2 میکرومتر بود. نتایج نشان داد که اندازه استئوکلاست­ها در گروه دریافت­کننده­ی 50 میلی­گرم متیونین به‌طور معناداری بیش از دو گروه دیگر بود (0.05P<) درحالی‌که اندازه استئوکلاست­ها بین گروه کنترل و دریافت­کننده­ی 30 میلی­گرم متیونین اختلاف معناداری با یکدیگر نداشتند (0.05P>).

ارزیابی هیستومتری تعداد سلول‌های سه‌گانه ماتریکس استخوان: نتایج حاصل از شمارش استئوبلاست­ها در گروه­های کنترل، دریافت­کننده­ی 30 و 50 میلی­گرم متیونین نشان داد که تعداد استئوبلاست­ها به ترتیب 0.91±4، 0.58±4.08 و 0.75±3.75 بود. شایان ذکر است که تعداد استئوبلاست­ها بین گروه­های مختلف فاقد اختلاف معنادار بودند (0.05P>)(جدول 2).

شمارش استئوسیت­ها در گروه­های کنترل، دریافت‌کننده‌ی 30 و 50 میلی­گرم متیونین، تعداد این سلول­ها را به ترتیب 0.48±4، 0.53±4.33 و 0.63±3.75 نشان می­داد که هیچ اختلاف معناداری با یکدیگر نداشتند (0.05P>). تعداد استئوسیت­ها در گروه دریافت­کننده­ی 50 میلی­گرم متیونین نسبت به گروه دریافت­کننده­ی 30 میلی­گرم متیونین کمتر بود اما اختلاف معناداری نداشت (0.05P>).

نتایج حاصل از شمارش تعداد استئوکلاست­ها در گروه­های کنترل، دریافت­کننده­ی 30 و 50 میلی­گرم متیونین به ترتیب 0.03±0.35، 0.05±0.4 و 0.02±0.5 بود. براساس نتایج به‌دست‌آمده هرچند تعداد استئوکلاست­ها در گروه دریافت­کننده­ی 50 میلی­گرم متیونین بیشتر از سایر گروه­ها بود اما هیچ اختلاف معناداری بین گروه­های مختلف دیده نشد (0.05P>) (جدول 2).

براساس نتایج بدست آمده نسبت استئوکلاست به مجموع استئوسیت و استئوبلاست در گروه‌های کنترل، دریافت‌کننده 30 و 50 میلی‌گرم متیونین به ترتیب 0.09، 0.1 و 0.13 بدست آمد که بیانگر روند افزایشی نسبت استئوکلاست­ها به مجموع دیگر سلول­های استخوانی به دنبال مصرف متیونین بود (جدول 2).

بحث

مورفومتری استخوان در بررسی اختلالات متابولیکی، ارزیابی بیوپسی استخوان و درمان آن کاربرد دارد. در این مطالعه با ارزیابی بافت استخوان از طریق ضخامت کورتکس و تیغه که بیانگر میزان رسوب کلاژن می­باشد و از طرفی ارزیابی میزان کلسیم ماتریکس که بیانگر روند مینراله شدن استخوان است، به بررسی اثرات متیونین بر استخوان تیبیای جنین پرداخته شده است.

مطالعات مختلفی تشکیل استخوان‌های پرنده را مورد بررسی قرار داده‌اند که با توجه به اهمیت سیستم حرکتی، برخی مطالعات، بر شکل‌گیری استخوان‌های بال و پا در دوران جنینی انواع پرنده ازجمله جنین مرغ پرداخته‌اند (1). همچنین برخی مطالعات، به بررسی فاکتورهای بیوشیمیایی مرتبط با بافت استخوانی متمرکز شده و تغییرات آن را در سنین متفاوت بررسی کرده‌اند (2). پاره‌ای از مطالعات نیز به بررسی مواد غذایی بر اسکلت پرندگان متمرکزشده‌اند. نتایج برخی مطالعات نشان می­دهد که اسیدهای آمینه گوگردی می­توانند متابولیسم ماتریکس ارگانیک استخوان را متأثر سازند. نتیجه این مطالعات عنوان کرده که اسیدهای آمینه گوگردی ممکن است در اتیولوژی دیسکندروپلازی تیبیا نقش داشته باشند (12). نتایج مطالعات فرانکل (12) مشابه نتایج لوهاکر (22) و وایتینگ و دراپر (43) و نیز نتایج حاصل از مطالعه ما، نشان می­دهد زیادی متیونین در متابولیسم ماتریکس استخوان اثر منفی دارد با این تفاوت که ما در مطالعه خود، اثر متیونین را بر سیستم اسکلتی جنین و با توجه به یافته‌های هیستومورفومتری تیغه‌ها و تعداد سلول‌ها بررسی نموده­ایم.

برخلاف یافته‌های ما و برخی محققین (11،22،43)، نتایج برخی مطالعات نشان داده که گرچه بعید است متیونین بتواند اثر مثبتی در تمایز استئوبلاست داشته باشد، اما می‌تواند از آثار نامطلوب ناشی از عوامل التهابی جلوگیری و درنتیجه در شرایط پاتولوژیک، از استخوان حفاظت کند. مطالعه­ای بالینی که توسط پرنوو و همکاران (2010) صورت گرفته، نشان داده که نگهداری صحیح نسبت آمینواسید ضروری و غیرضروری برای حفظ تراکم استخوان حیاتی است. بنابر اعتقاد این محققین، تغذیه مناسب با غذاهای حاوی متیونین در مقدار و اندازه کافی هیچ­گاه اثر بدی روی سلامت استخوان نخواهد داشت و حتی در مقابل رشد استئوپروزیس، به‌عنوان یک ممانعت کننده عمل می­کند. این محققین عنوان کرده­اند که متیونین دارای اثر مهاری بر تبدیل سلول­های تک‌هسته‌ای به استئوکلاست ­است که از طریق کاهش سیگنالینگ ژن مربوطه (TLR4 / MyD88 / NF-κB) اثر می­نماید. محققین در این مطالعه از متیونین به‌عنوان یک عامل درمانی جدید که می‌تواند علیه اختلالات استخوانی مفید باشد یادکرده‌اند (36،42). هرچند این نتایج، برخلاف نتایج ما و بسیاری از محققین است اما باید این نکته را در نظر داشت که در مطالعه پرنو و همکاران (2010)، نسبت بالانس شده آمینواسیدها در تغذیه لحاظ گردیده (36) اما در مطالعه ما، صرفاً متیونین و آن‌هم در مقادیر متفاوت و از طرفی در جنین که در حال رشد و نمو می­باشد ارزیابی‌شده است.

تشکیل بافت استخوانی از منظر مولکولی نیز قابل ارزیابی است. با توجه به آن­که استئوبلاست­ها عامل ترشح کلاژن در استئوئید استخوان هستند، پروتئین­های دخیل در فعالیت آنها، عاملی مهم در روند رشد و نمو استخوان می­باشند. براین اساس مشخص‌شده کهFGF، IGF-1 و مسیر سیگنالینگ Wnt در تمایز استئوبلاست­ها نقش دارند. این در حالی است که IGF-1 و FGF بر یکدیگر نقش کنترلی داشته و IGF-1 از ازدیاد FGF ممانعت می­کند. پروتئین دیگر در این مجموعه، ERK I/II است که برای ترشح و فعالیت FGF لازم بوده و لذا این پروتئین نیز در تمایز استئوبلاستی نقش دارد. FGF برای فعالیت خود به پروتئین دیگری بنام AKT هم نیازمند است. نقش اصلی AKT، بقای استئوبلاست­هاست (37). همان­طور که از یافته‌های مطالعات برمی‌آید، پروتئین FGF یک پروتئین راهبردی در فعالیت استئوبلاست­ها بوده و به‌عنوان تنها عامل ترشح‌کننده کلاژن در استخوان می­باشد و هر عاملی که در روند تولید و ترشح مجموعه پروتئین­های فوق اثر بگذارد، عملاً بر بافت استخوان در حال تشکیل اثر گذاشته است. مشخص‌شده که افزایش یا بیان تنظیم‌نشدهFGF ، منجر به نقص در پیدایش استخوان می‌گردد (35،25). نشان داده‌شده که سیگنالینگ FGF، دارای اثر متفاوتی بر استئوبلاست بالغ و نابالغ است، به‌گونه‌ای که اثر تکثیری در سلول­های تمایزیافته از دست می­رود (24،10). در استئوبلاست­های در حال تمایزی که به‌صورت پیوسته در مواجهه باFGF هستند، آپوپتوزیز افزایش‌یافته و تمایز آنها متوقف می­گردد (37،24،10). با توجه به اثرات اثبات‌شده متیونین برافزایش FGF، به نظر می­رسد اثر متیونین بر استئوبلاست­های استخوان جنین از این طریق امکان‌پذیر باشد. براین اساس و با توجه به آن­که افزایش FGF سبب آپوپتوزیز و ممانعت از تمایز استئوبلاست­ها می­گردد (37،24)، کاهش توده استخوانی در گروه­های دریافت­کننده متیونین و نیز نسبت معکوس تشکیل استخوان با افزایش میزان متیونین که در مطالعه ما دیده شد، توجیه‌پذیر می­باشد.

اسکومال و همکاران (2005) گزارش کردند سلول­های التهابی فعال در محل التهاب، منجر به تولید استئوپروتگرین شده و مقدار آن­ها را نسبت به گروه کنترل افزایش می­دهد. حتی استئوپروتگرین نیز اثر فیدبک مثبت بر روی این سلول­های التهابی دارد. به نظر می­رسد که استئوپروتگرین، نقش محافظتی مؤثری در برابر پیشرفت ضایعات استخوانی و پوکی استخوان در بیماران مبتلا به آرتریت روماتوئید داشته باشد. استئوپروتگرین توسط سلول­های دندریتیک و لنفوسیت­های B ترشح می‌شود. افزایش استئوپروتگرین که به نظر می­رسد نقش محافظتی در برابر پیشرفت ضایعات استخوانی داشته باشد باعث بهبود غضروف و استخوان می‌گردد (38). با توجه به یافته‌های مطالعه ما، در گروه­های دریافت­کننده متیونین که تخریب استخوانی دیده شده، این فرضیه قابل‌طرح است که متیونین با مهار استئوپروتگرین، سبب تکثیر استئوکلاست­ها گشته باشد. همچنین با توجه به بزرگتر بودن استئوکلاست­های گروه­های دریافت‌کننده متیونین نسبت به گروه کنترل، چنین به نظر می­رسد که متیونین سبب فعال‌تر شدن استئوکلاست­ها از طریق فیوژن آنها نیز گشته باشد که می­تواند به‌عنوان افزایش فعالیت آنها نیز تلقی گردد. در مطالعه­ی حاضر با توجه به افزایش معنادار اندازه استئوکلاست­ها در گروه دریافت‌کننده 50 میلی‌گرم متیونین و با توجه به شکل تخریب‌شده تیغه­های استخوانی، می­توان این پیشنهاد را داد که تخریب استخوان با دوز بالای متیونین به علت فعالسازی سیگنال­های پاراکرینی و اندوکرینی بوده و فعالیت جذبی استئوکلاست­ها را افزایش داده است.

باتوجه به مطالب فوق و نیز نتایج به‌دست‌آمده در این مطالعه که میزان کلاژن ماتریکس گروه­های دریافت‌کننده متیونین به‌خصوص در دوزهای بالا کاهش‌یافته بود به نظر می­رسد متیونینی که در اختیار سلول قرار می­گیرد بواسطه آثار توکسیک ناشی از متابولیسمش به هموسیستئین که در ادامه اشاره شده است و یا از طریق اثر بر ژن­ها و پروتئین­های فوق، در فعالیت استئوبلاست­های ماتریکس اثر کرده و در روند تشکیل یا رسوب کلاژن و یا هر دو اختلال ایجاد نموده است.

یافته‌های مطالعه حاضر، اختلال در چهار عامل کلاژن، کلسیم، اسیدیته و میزان هموسیستئین خون را به عنوان عوامل احتمالی مؤثر بر تغییرات بافت استخوانی، پیشنهاد می‌دهد.

متیونین در تشکیل کلاژن، مهم و ضروری است (41). کلاژن نوع I که 90% ماتریکس آلی استخوان است (28)، توسط استئوبلاست­ها طی فرایندی چندمرحله‌ای ترشح می­گردد (29،6،5) و شبکه آندوپلاسمی خشن در سنتز و پردازش آن به ساختار سه‌بعدی که دارای فعالیت فیزیولوژیک است، نقش ایفا می­کند (30،21). طیف گسترده­ای از دیافیز ناهمگن در اسکلت انسان به­واسطه اختلال در زنجیره‌های کلاژن ایجاد می­شود که ممکن است به­واسطه بیان نامناسب ژن پردازشگر کلاژن باشد (29،6،5)که به ژن­ها و شبکه­های مولکولی تنظیم‌کننده فعالیت استئوبلاستی و نتیجتاً تشکیل استخوان مربوط می­شود (40). بر این اساس و با توجه به نتایج حاصل از مطالعه حاضر به­نظر می­رسد (به‌عنوان یک فرضیه) متیونین بتواند بر ژن­ها و شبکه‌های مولکولی مؤثر بر فعالیت استئوبلاستی و یا ژن­های پردازشگر کلاژن اثر بگذارد. مطالعات مختلفی اثر متیونین را بر ساختار کلاژن بررسی کرده‌اند. در مطالعه­ای که اثر مقادیر متفاوت متیونین جیره بر سنتز کلاژن پوست بررسی گردیده، نشان داده‌شده که میزان کل پروتئین کلاژن پوست افزایش‌یافته اما میزان کلاژن رسوبی موجود در لایه­های پوست کاهش نشان داده است. به‌بیان‌دیگر چنین به نظر می­رسد که متیونین اضافی باعث تأثیر یا تغییر منفی در مقدار کل کلاژن نشده و حتی میزان آن را افزایش داده اما باعث تغییر در طبیعت کلاژن گشته (تشکیل کراس لینک‌ها) و ماهیت ساختاری کلاژن را دگرگون ساخته است (41). برخلاف نتایج محققین فوق، اثر تقویت‌کننده متیونین برافزایش قطر دستجات کلاژن پوست بز کرکی و نوزاد شیرخوار آن اثبات گردیده است. البته در مطالعه‌ای که بر روی پوست بز کرکی راینی انجام‌شده (33)، جیره بالانس شده نبوده و احتمال کمبود این اسیدآمینه در جیره وجود داشته است که به دنبال مصرف متیونین، کمبود آن رفع گردیده است (33). بر اساس مطالعه تیموری و همکاران (2016)، متیونین تزریقی به رت سبب کاهش ضخامت کلاژن­های ماتریکس گشته که در حضور ویتامین C به‌شدت سبب افزایش قطر این دستجات شده است. یافته­های این مطالعه نشان داده که متیونین سبب تحریک سنتز کلاژن گشته اما توانایی رسوب آن را نداشته است (32). چنین نتایجی در مطالعه برفه­ای و همکاران (2015) در رابطه با جنین مرغ نیز دیده‌شده است (31). بر همین اساس، عوامل تغذیه‌ای مختلفی ازجمله کمبود ویتامینB6 ، مس، فلوراید و تغذیه با چربی بالا در تشکیل کراس لینک رشته­های کلاژن نقش دارند (41). برخلاف نتایج ما و مطالعات فوق، نشان داده‌شده که سنتز کلاژن در میکروآلوئول­های دندان بالغین، در مواجهه با مقادیر نرمال متیونین افزایش می­یابد (27). نتایج مطالعه ما نیز که به بررسی استخوان در جنین پرداخته، هم‌راستا با محققینی است که اثر متیونین را بر آلوئول­های دندانی نوزادان رت، منفی دانسته‌اند (27). ازآنجاکه سنتز کلاژن ارتباطی نزدیک با رشد و تمایز تازه متولدین دارد (41) و همان­طور که قبلاً هم اشاره شد، اثر متیونین بر استئوبلاست بالغ و نابالغ متفاوت است و در استئوبلاست نابالغ منجر به کاهش فعالیت و حتی مرگ سلولی می­گردد (37)، بنابراین به نظر می­رسد اثرات منفی متیونین در بافت­های در حال شکل­گیری و در نوزادان و نابالغین، بیش از بالغین باشد. این نتایج در مطالعه ما نیز کاملاً قابل استناد می­باشند چراکه تعداد استئوبلاست­ها و استئوسیت­ها و نیز اندازه آنها کاهش‌یافته که در راستای منابع فوق است.

نظرات مختلفی در مورد اثر پروتئین براستخوان موجود است. پاره­ای از این مطالعات که نتایج مطالعه ما نیز همسوی با آنهاست، اثر منفی پروتئین جیره را بر استخوان عنوان کرده­اند. بر این اساس افزایش پروتئین جیره منجر به ترشح بیشتر کلسیم به ادرار می‌گردد (20). منبع کلسیم ترشحی دقیقاً مشخص نیست. یک نظریه این است که اخذ پروتئین زیاد به‌خصوص پروتئین حیوانی سبب ایجاد یک محیط اسیدی شده که عمدتاً به علت اسیدهای آمینه گوگردی پروتئین می­باشد. منبع اصلی بافری کردن اسیدیته خون، کربنات است که کلسیم خود را از سیستم اسکلتی تأمین می­کند. کلسیمی که به‌عنوان کربنات از سیستم اسکلتی برداشته‌شده از طریق ادرار از دست می­رود. نتیجه این عمل افزایش برداشت کلسیم از استخوان، کاهش مواد معدنی استخوان و نهایتاً افزایش احتمال شکستگی­هاست (9). این نظریه به‌واسطه مطالعات سلولی و حیوانی تأییدشده است (3،9). به‌طورکلی هایپرکلسی اوریا و شسته شدن کلسیم از استخوان به خارج، انحلال تدریجی مواد معدنی استخوان و از دست دادن آن از کلیه­ها در طول زمان، در استئوپروزیس نقش دارد. زمانی که منابع مشترک پروتئینی مورد آزمایش قرارگرفته هیپرکلسی ­اوری و بالانس منفی کلسیم مشاهده‌شده است (45). به همین خاطر منابع غذایی‌ای که دارای بی­کربنات، پتاسیم یا سیترات باشند به‌منظور کاهش باز جذب کلسیم از استخوان استفاده می­شوند (19،18). برخی محققین، کلسیم دفع شده در ادرار به دنبال مصرف پروتئین را دارای منشأ استخوانی نمی­دانند. برخلاف اثر زیان­بار مفروض برای پروتئین، این مطالعات نشان داده­اند که مصرف زیاد پروتئین در درازمدت باعث افزایش تراکم معدنی استخوان و کاهش بروز شکستگی می­گردد. این مطالعات، یک برنامه غذایی با پروتئین بالا و کلسیم کافی جهت جلوگیری از استئوپروزیس را دنبال کرده‌اند (7). اگرچه یافته­های این محققین در تضاد با نتایج مطالعه ما است اما باید دقت داشت که این مطالعات، مصرف پروتئین را همراه با کلسیم یا برخی مواد دیگر مثل ویتامینD  ارزیابی نموده­اند و اثر پروتئین یا اسیدآمینه را به‌تنهایی بررسی نکرده‌اند. مشاهده‌شده که موش­های مبتلا به کمبود پروتئین حامل آلفاتوکوفرول، دارای توده استخوانی بالا هستند که نتیجه کاهش باز جذب کلسیم از استخوان می­باشد. این نتایج نشان می­دهد که ویتامینE  سرمی، تعیین‌کننده توده استخوانی از طریق تنظیم فعالیت استئوکلاست می‌باشد (13). به­نظر می­رسد متیونین نیز مانند ویتامینE  با اثر بر فعالیت استئوکلاستی، سبب افزایش اندازه و نیز تعداد استئوکلاست­ها گردد که بیان­کننده اثر این اسید­آمینه بر فیوژن و نیز تکثیر آنهاست.

متیونین به‌عنوان یک آمینواسید ضروری، پیش­ساز هموسیستئین که محصول آخر چرخه متیونین می­باشد نیز هست. تخریب هموسیستئین سیتوتوکسیک با متیلاسیون دوباره و ترانس سولفوره شدن امکان­پذیر است و نیاز به فولات، ویتامینB6  و ویتامین B12 به‌عنوان کوآنزیم دارد (17). پس دریافت میتونین اضافی و کمبود ویتامینB ، توانایی افزایش غلظت سرمی هموسیستئین را دارد بطوری که ویتامین‌های گروهB ، هموسیستئین سرم را کاهش می­دهند (15). توجه به مطالب فوق نشان می­دهد هیپرهموسیستئینمیا اثرات منفی بر ترمیم شکستگی دارد. کمبود ویتامین‌هایB  و مشکلات کلیوی، بیشترین موارد معمول برای بروز غلظت بالای هموسیستئین خون در موارد کلینیکی می­باشد (17،16).

در مطالعات، ترمیم شکستگی استخوان در موش تغذیه‌شده با متیونین ارزیابی‌شده است بطوری که غلظت سرمی هموسیستئین بطور معنی­داری در گروه درمان با متیونین از گروه کنترل بالاتر بوده است و این حیوانات، سختی خمش قابل‌مقایسه‌ای را در استخوان ترمیم‌یافته نشان داده­اند (17،8). مطالعاتی نیز هستند که بیانگر عدم تأثیر متیونین و هموسیستئین زیاد بر روندترمیم استخوان می‌باشند. براساس نظریه­ای که هموسیستئین بر متابولیسم استخوان اثر منفی می­گذارد، مکانیسم­های زیادی مطرح‌شده است، مثلاً در سطح سلول، نشان داده‌شده که هموسیستئین، تحریک‌کننده تکثیر استئوکلاست و مانع فعالیت استئوبلاست است و بنابراین القاکننده عدم تعادل بین تشکیل و باز جذب استخوان می­باشد که با نتایج مطالعه ما نیز کاملاً هم­خوانی دارد (14). فرضیه­ای دیگر که استئوپنی و کاهش تشکیل استخوان به دنبال مصرف زیاد اسیدآمینه­های گوگردی را توجیه می­کند، واکنش بین هموسیستئین و گروه­های آلدهید کلاژن می­باشد که از ایجاد کراس لینک در بین رشته­ها ممانعت می­نماید (6 و 43). این فرضیه نیز کاملاً در راستای نتایج به‌دست‌آمده در مطالعه ما می­باشد. این فرضیه و نتایج، مشابه یافته­های تیموری و همکاران (1394)(32) و نیز برفه ای و همکاران(1394) (31) می‍باشد.

پروتئین زیاد جیره سبب ایجاد محیط اسیدی می­شود که عمدتاً به علت اسید­های­آمینه گوگردی پروتئین است (9). مکانیسمی که طی آن اسیدیته خون منجر به پوکی استخوان گردد احتمالاً از راه فعال­سازی استئوکلاست­ها و از طریق انحلال فیزیکی شیمیایی استخوان ایجاد می­گردد (4). با توجه به افزایش اندازه استئوکلاست­های مطالعه حاضر، این نظریه نیز قابل‌قبول می‌باشد.

با توجه به نتایج بدست آمده تعداد استئوسیت­ها و استئوبلاست­ها در گروه­های مختلف اختلاف معناداری با یکدیگر نداشته‌اند (0.5>P) که بیانگر عدم تأثیر کشندگی و از بین برندگی قوی متیونین بر این دو سلول می­باشد. استئوبلاست­ها مسئول سنتز و ایجاد کلاژن ماتریکس استخوانی هستند (28). باتوجه به کاهش ضخامت تیغه­ها که به علت کاهش سنتز و یا رسوب کلاژن در استخوان می­باشد چنین به نظر می­رسد که فعالیت استئوبلاست­ها با افزایش میزان متیونین کاهش پیدا می­کند که این فرضیه با توجه به کاهش اندازه­ی استئوبلاست­ها که در مطالعه­ی حاضر به‌دست‌آمده مطابقت دارد. از طرفی تعداد استئوبلاست­ها نیز کاهش‌یافته بنابراین کاهش ضخامت تیغه­ها به علت کاهش فعالیت استئوبلاست­ها و تا حدودی کاهش تعداد آنها کاملاً قابل توجیه هست.

باتوجه به منابع موجود که رسوب کلسیم در ماتریکس استخوان را به استئوسیت­ها منسوب می­داند (5 و 28) و از طرفی با توجه به نتایج مطالعه حاضر که کاهش رسوب کلسیم را نشان داده چنین به نظر می­رسد که فعالیت استئوسیت­ها در این مطالعه، کاهش‌یافته باشد. این فرضیه زمانی تقویت می­شود که طبق نتایج به‌دست‌آمده (جدول 2) اندازه استئوسیت­ها به‌طور معناداری نسبت به گروه کنترل کاهش‌یافته‌اند. این نکته را نیز باید در نظر داشت که تعداد استئوسیت­ها در ماتریکس استخوانی (هرچند غیرمعنادار) کاهش‌یافته است. چنین به نظر می­رسد که متیونین به‌طور نامحسوسی بر میزان استئوسیت­ها اثر گذاشته است.

این فرضیه که متیونین بر تکثیر و ایجاد استئوسیت و استئوبلاست اثر بگذارد نیز قابل‌تأمل است. همان‌طور که در منابع آمده، استئوبلاست­های سازنده­ی استخوان از سلول­های پیش­ساز استخوان که در پریوستئوم و اندوستئوم هستند مشتق شده و تمام سطوح موجود در ماتریکس استخوان را می­پوشانند (28). با توجه به کاهش هرچند غیر معنادار استئوبلاست­ها این فرضیه نیز قابل‌تأمل هست که متیونین بر روند تمایز استئوبلاست­ها از سلول­های پیش ساز آنها اثر گذاشته باشد.

تعداد استئوکلاست­ها (هرچند به‌طور غیر معنادار) با افزایش میزان متیونین روندی افزایشی داشته که با توجه به کاهش قطر تیغه­ها و تخریب آنها در گروه­های دریافت­کننده­ی متیونین، امری طبیعی به نظر می­رسد. ازاین‌رو به‌صورت یک فرضیه می­توان تخریب تیغه­ها را به علت افزایش تعداد استئوکلاست­ها دانست که این فرضیه با توجه به افزایش تعداد (هرچند غیر معنادار) و ابعاد استئوکلاست­ها (که این مورد نیز غیرمعنادار بود) منطقی می­باشد. اگر طبق نتایج به‌دست‌آمده، اضمحلال استخوان به فرایندهایی مانند تغییراتpH  و برداشت مرتبط باشد، افزایش استئوکلاست­ها نیز که به‌منظور برداشت بقایای بافتی صورت پذیرفته، منطقی به نظر می­آید. البته نباید عدم تشکیل و همچنین وضعیت ضعیف بافت استخوانی ایجادشده را صرفاً به فعالیت استئوکلاست­ها مربوط دانست چراکه همان‌گونه که در نتایج آمده اندازه­ی استئوبلاست­ها و استئوسیت­ها همزمان با دریافت متیونین کاهش‌یافته که به‌نوعی بیانگر کاهش فعالیت آنها و نهایتاً کاهش فعالیت استخوان‌سازی هست، چراکه براساس منابع، تعداد و بقای این سلول­ها در ایجاد و بقای ماتریکس استخوانی نقش دارد (28).

باتوجه به نتایج به‌دست‌آمده نسبت استئوکلاست­ها به مجموع تعداد استئوسیت واستئوبلاست، با افزایش میزان متیونین روندی افزایشی یافته که بیانگر روند افزایشی تخریب استخوان و یا نیاز استخوان به برداشت بافت­های تخریب‌شده‌ی آن می­باشد.

در پایان از همکاری بخش نگهداری از حیوانات دانشکده دامپزشکی دانشگاه شهید باهنرکرمان و نیز معاونت پژوهشی این دانشگاه در تأمین هزینه‌های این مطالعه در قالب بودجه پژوهشی شماره 08/1393 تشکر به عمل می‌آید. 

  1. رنجبر، و.، وطنچیان، م.، محمدیان، ب.، و میاحی، م.، 1385. مطالعه زمانی تکوین اسکلت بال و پا در جنین جوجه به کمک تکنیک رنگ‌آمیزی دوگانه آلیزارین قرمز-آلسین آبی. مجله زیست‌شناسی ایران، 19(2)، صفحات 167-179.
  2. قاسمی، ح.، 1394. تأثیر جیره غذایی بر غلظت برخی متابولیت ها، آنزیم‌ها و الکترولیت‌های خون جوجه شترمرغ‌ها در دو سن متفاوت، مجله زیست‌شناسی ایران، 28(1)، صفحات 85-96.
    1. Arnett, T., 2003. Regulation of bone cell function by acid-base balance. Proc Nutr Soc. 62, PP: 511–20.
    2. Bonjour, J., 2005. Dietary protein, an essential nutrient for bone health. J Am Coll Nutr. 24, PP: 526S–36S.
    3. Byers, P., Cole, W., 2002. Osteogenesis imperfecta in connective tissue and its heritable disorders, Molecular, Genetical, and Medical Aspects. Second edition. P.M. Royce and B. Steinmann, editors. Wiley-Liss, Inc, New York. 2, PP: 385–430.
    4. Cabral, W., Chang, W., Barnes, A., Weis, M., Scott, M., Leikin, S., Makareeva, E., Kuznetsova, N., Rosenbaum, K., and Tifft, C., 2007. Prolyl 3-hydroxylase 1 deficiency causes a recessive metabolic bone disorder resembling lethal/severe osteogenesis imperfecta. Nat Genet. 39, PP: 359–365.
    5. Cao, J.J., and Nielsen, F.H., 2010. Acid diet (high-meat protein) effects on calcium metabolism and bone health. Clin Nutr Meta Care. 13(6), PP: 698–702.
    6. Claes, L., Schmalenbach, J., and Herrmann, M., 2009. Hyperhomocysteinemia is associated with impaired fracture healing in mice. Calcif Tissue Int. 85, PP: 17–21.
    7. Darling, A., Millward, D., Torgerson, D., Hewitt, C., and Lanham, N., 2009. Dietary protein and bone health: a systematic review and meta-analysis. Am J Clin Nutr. 90, PP: 1674–1692.
    8. Debiais, F., Hott, M., Graulet, A., and Marie, P., 1998. The effects of fibroblast growth factor-2 on human neonatal calvaria osteoblastic cells are differentiation stage specific. J Bone Miner Res. 13, PP: 645–654.
    9. Fini, M., Torricelli, P., Giavaresi, G., Carpi, A., Nicolini, A., and Giardino, R., 2001. Effect of L-lysine and L-arginine on primary osteoblast cultures from normal and osteopenic rats. Biomed Pharmacother. 55, PP: 213–220.
    10. Frankel, T., 1995. Sulfate incorporation into organic bone matrix of the tibiotarsus of broiler chicks is reduced by excess dietary methionine. Poult Sci. 74(3), PP: 510-516.
    11. Fujita, K., Iwasaki, M., Ochi, H., Fukuda, T., Ma, C., Miyamoto, T., Takitani, K., Negishi-Koga, T., Sunamura, S., Kodama, T., Takayanagi, H., Tamai, H., Kato, S., Arai, H., Shinomiya, K., Itoh, H., Okawa, A., and Takeda, S., 2012. Vitamin E decreases bone mass by stimulating osteoclast fusion. Nat Med. 18(9), PP: 1445.
    12. Herrmann, M., Schmidt, J., and Umskanaya, N., 2007. The role of hyperhomocysteinemia as well as folate, vitamin B (6) and B (12) deficiencis in osteoporosis: a systemic review. Clin chem lab med. 45, PP: 1621-32.
    13. Herrmann, W., Herrmann, M., and Obeid, R., 2007. Hyperhomocysteinaemia: a critical review of old and new aspects. Curr Drug Metab. 8, PP: 17–31.
    14. Herrmann, W., Schorr, H., and Bodis, M., 2000. Role of homocysteine, cystathionine and methylmalonic acid measurement for diagnosis of vitamin deficiency in high-aged subjects. Eur J Clin Invest. 30, PP: 1083–89.
    15. Holstein, J.H., Schmalenbach, J., Hermann, M., Wolfang, H., Pohleman, T., and Claes, L., 2012. Excess dietary methionine does not affect fracture healing in mice. Med Sci Monit. 18(12), PP: BR469-BR474.
    16. Jehle, S., Zanetti, A., Muser, J., Hulter, H., and Krap, R., 2006. Partial neutralization of the acidogenic Western diet with potassium citrate increases bone mass in postmenopausal women with osteopenia. J Am Soc Nephrol. 17, PP: 3213–22.
    17. Kerstetter, J., O'Brien, K., and Insogna, K., 2003. Dietary protein, calcium metabolism, and skeletal homeostasis revisited. Am J Clin Nutr. 78, PP: 584S–92S.
    18. Kerstetter, J., 2009. Dietary protein and bone: a new approach to an old question. Am Soc Nutr, PP: 1451-1452.
    19. Lamandé, S., and Bateman, J., 1999. Procollagen folding and assembly, the role of endoplasmic reticulum enzymes and molecular chaperones. Semin Cell Dev Biol. 10, PP: 455–464.
    20. Lohakare, J., Choi, J., Kim, J., Yong, J., Shim, Y., Hahn, T., and Chae, T., 2005. Effects of dietary combinations of vitamin A, E and methionine on growth performance, meat quality and immunity in commercial broilers. Asian-Aust J Anim Sci. 18(4), PP: 516-523.
    21. Männer, J., Seidl, W., Heinicke, F., and Hesse, H., 2003. Teratogenic effects of suramin on the chick embryo. Anat Embryol. 206(3), PP: 37- 229.
    22. Mansukhani, A., Bellosta, P., Sahni, M., and Basilico, C., 2000. Signaling by fibroblast growth factors (FGF) and fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2)-activating mutations blocks mineralization and induces apoptosis in osteoblasts. J Cell Biol. 149, PP: 1297–1308.
    23. Marie, P., Coffin, J., and Hurley, M., 2005. FGF and FGFR signaling in chondrodysplasias and craniosynostosis. J Cell Biochem. 96, PP: 888–896.
    24. Massey, L., 1998. Does excess dietary protein adversely affect bone? J Nutr. 128, PP: 1048–1050.
    25. McGrath, K.R., and Nakamoto, T., 1985. Orally administered methionine alters the growth of tooth germs in newborn rats. Ann Nutr Metab. 29.
    26. Mescher Anthony, L., 2013. Junqueira’s basic histology text and atlas. 13th edition, Mc Graw Hill, New York. PP: 364-384.
    27. Morello, R., Bertin, T., Chen, Y., Hicks, J., Tonachini, J., Monticone, M., Castagnola, P., Rauch, F., and Glorieux, R., 2006. CRTAP is required for prolyl 3- hydroxylation and mutations cause recessive osteogenesis imperfecta. Cell. 127, PP: 291–304.
    28. Myllyharju, J., and Kivirikko, K., 2004. Collagens, modifying enzymes and their mutations in humans, flies and worms. Trends  Genet. 20, PP: 33–43.
    29. Nazem, M.N., Tavakkoli, H., Sajjadian S.M., 2015. Histomorphometrical and histopathological assesment of in ovo methionine injection on the skin layers and its collagen bundles of chiken embryo. Anat. Sci. 12(3), PP: 115-120
    30. Nazem M.N., Teymouri M., and Jahantigh M., 2016. The histomorphometric and histopathologic effect of methionine on the epidermis and dermis layers of skin in rat. Comp Clin Pathol. 25, PP:699-704.
    31. Nazem, M.N., Rezaian, M., Adib Moradi, M., Asadi Fuzi, M., Kyaei, S.M.M., and Razavi Ebrahim, P., 2013.The effect of oral administration of coated methionine on the female goats and suckling kid’s hair follicles: A histomorphometrical approach. J Vet Res. 68(1), PP: 61-68.
    32. Ohta, Y., and Kidd, M.T., 2001. Optimum Site for In Ovo Amino Acid Injection in Broiler Breeder Eggs. Poultry Sci. 80, PP: 1425–1429.
    33. Ornitz, D., 2005. FGF signaling in the developing endochondral skeleton. Cyto Grow Fac Rev. 16, PP: 205–213.
    34. Pernow, Y., Thorén, M., Fernholm, R., Anderstam, B., and Hauge, E., 2010. Associations between amino acids and bone mineral density in men with idiopathic osteoporosis. Bone. 47, PP: 959–965.
    35. Raucci, A., Bellosta, P., Grassi, R., Basilico, C., and Mansukhani, A., 2008. Osteoblast proliferation or differentiation is regulated by relative strengths of opposing signaling pathways. J Cell Physiol. 215(2), PP: 442-51.
    36. Skoumal, M., Kolarz, G., Haberhauer, G., Woloszczuk, W., Hawa, G., and Klingler, A., 2005. Osteoprotegerin and the receptor activator of NF- Kappa B ligand in the serum and synovial fluid. A comparison of patients with longstanding rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Rheumatol Int. 26, PP: 63-69.
    37. Smirnov, A., Tako, E., Ferket, P.R., Uni, Z., 2006. Mucin gene expression and mucin content in the chicken intestinal goblet cells are affected by in ovo feeding of carbohydrates. Poult. Sci. 85, PP: 669-673.
    38. Sohaskey, M.L., Jiang, Y., Zhao, J.J., Mohr, A., Roemer, F., Harland, R.M., 2010. Osteopotentia regulates osteoblast maturation, bone formation, and skeletal integrity in mice. JCB Data Viewer, PP: 511-525.
    39. Taniguchi, K., Shoji, H., Solomonow, M., Yazdani, M., and Nakamoto, T., 1986. Effects of excess methionine on collagen metabolism: A Study on Newborn Rat Skin. Bioche Med Metab bio. 37, PP: 125-131.
    40. Vijiyan, V., Khandelwal, M., Manglani, K., Gupta, S., and Surolia, A., 2013. Methionine down-regulates TLR4/MyD88/NF-κB signalling in osteoclast precursors to reduce bone loss during osteoporosis. Brit Pharmacol. 10(19), PP: 156-158.
    41. Whiting S., Draper H., 1981. Effect of a chronic acid load as sulfate or sulfur amino acids on bone metabolism in adult rats. J Nutr. 111(10), PP: 1721-1726.
    42. Young, M., 2003. Bone matrix proteins: their function, regulation, and relationship to osteoporosis. Osteoporos Int. 29, PP: 232-234.
    43. Zamzam, K., Roughead, F., 2003. Is the interaction between dietary protein and calcium destructive or constructive for bone  American Society for Nutritional Sciences, J. Nutr, 133, PP: 866S–869S.