فعالیتحفاظت کبدی اسانس زیره سیاه (L.Carum carvi) بر مسمومیت القایی نانو ذرات اکسید آهن در رت­های نژاد ویستار

ابوالفضل دادخواه^1*، فائزه فاطمی²، محمدرضا محمدی ملایری³، فاطمه ترابی⁴، مصطفی سربازی³ وسالومه دینی^5،6

¹ ایران،قم، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد قم،دانشکده پزشکی، گروه پزشکی

² ایران، تهران، پژوهشگاه علوم و فنون هسته‌ای، پژوهشکده مواد و سوخت هسته‌ای

³ایران، گرمسار، دانشگاه آزاد اسلامی واحد گرمسار، دانشکده دامپزشکی، گروه پاتوبیولوژی

⁴ ایران، قم، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد قم، دانشکده پزشکی، گروه فیزیولوژی

⁵ایران، کرج، دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرج، باشگاه پژوهشگران و نخبگان جوان

⁶ چین، هوانگجو، دانشگاه ژجیانگ، مرکز تحقیق و طراحی تکنولوژی غذایی ژجیانگ

تاریخ دریافت: 25/4/97                تاریخ پذیرش: 20/9/97

چکیده

بررسی توان محافظت کبدی اسانس زیره سیاه در برابر آسیب کبدی القاشده توسط نانو ذرات اکسید آهن در رت­های نژاد ویستار طراحی‌شده است. دراین مطالعه تجربی از 20 سر رت نژاد ویستار استفاده شد که به‌طور تصادفی به چهار گروه تقسیم شدند. گروه شاهد، محلول DMSO، گروه تیمار نشده، نانو ذرات اکسید آهن (Fe₂O₃)، گروه پیش درمانی، نانو ذرات اکسید آهن به همراه اسانس زیره سیاه در دو دُز متفاوت 100 و 200 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن (E.O100 و E.O200) دریافت کردند. 72 ساعت پس از تزریق، بافت کبد و خون رت­ها جدا گردید. آسیب‌های کبدی توسط شاخص‌های بیوشیمیایی همچون گلوتاتیون (GSH)، پراکسیداسیون لیپیدها (LP) و میزان آنتی‌اکسیدان کل پلاسما توسط تست FRAP و همچنین فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز (SOD و CAT اندازه‌گیری شدند. بررسی‌های آسیب‌شناسی نیز جهت ارزیابی درجات مختلف آسیب کبد انجام شد. تزریق نانو ذرات اکسید آهن، سطوح FRAP و GSH را به‌صورت معنی‌داری کاهش داده ولی میزان LP را به‌طور قابل‌توجهی افزایش داده است. در مقابل، پیش درمانی رت­ها با اسانس زیره سیاه، سطوح تغییریافته GSH و LP را به‌صورت معنی‌داری تا حد طبیعی بهبود داده است. همچنین نتایج پاتولوژی، کاهش میزان نکروز سلول‌های کبدی را نشان داده است. اسانس زیره سیاه، کبد را در برابر آسیب اکسیداتیو القاء شده توسط نانو ذرات اکسید آهن محافظت می‌نماید و این تأثیر محافظتی با خواص آنتی‌اکسیدانی اسانس ارتباط دارد.

واژه­های کلیدی: زیره سیاه، نانو ذرات اکسید آهن، مسمومیت کبدی محافظت کبدی، رت

* نویسنده مسئول، تلفن: 09122490620، پست الکترونیکی: Dadkhah_bio@yahoo.com

مقدمه

کبد بزرگترین اندام در بدن، وظیفه بسیاری از عملکردهای متابولیکی بدن که شامل تجزیه مواد سمی و زائد و دفع مواد مضر از بدن می‌باشد، را بر عهده دارد (3 و 28). این عضو، در ایجاد تعادل در بدن نقش حیاتی ایفا می‌کند، به‌طوری که تنظیم مواد لازم در تأمین انرژی و تغذیه بافت­ها همچون لیپیدها، پروتئین‌ها و کربوهیدرات‌ها را بر عهده دارد و هنگام ایجاد اختلال در بدن، آنزیم‌های بیوشیمیایی موجود در سلول‌های کبدی تغییر می‌کنند (12).

آهن یکی از فراوان‌ترین فلزات موجود در بدن است. این عنصر به‌عنوان جزئی از میوگلوبین، هموگلوبین، کاتالاز، سیتوکروم، پراکسیداز، گزانتین اکسیداز و آلفا گلیسرو فسفو هیدروژناز شناخته شده است. فعال شدن آهن فرو با پراکسید هیدروژن یا پراکسیدهای لیپیدی منجر به تولید آهن فریک،OH  و رادیکال بسیار فعال هیدروکسیل یا رادیکال‌های لیپیدی می‌گردد. این رادیکال‌ها منجر به صدمه به غشای لیپیدی اسیدنوکلئیک و پروتئین‌ها می‌شود (19). از طرف دیگر، آهن آزاد به دلیل توانایی اکسیدکنندگی بالا و همچنین توانایی تولید رادیکال‌های آزاد با غشای پروتئین‌ها، پیوند محکمی تشکیل داده که در طولانی‌مدت، تجمع یافته و به سلول‌ها آسیب می‌رساند. هنگامی‌که ذخایر آهن بیش‌ازحد باشد منجر به آسیب اکسیداتیو کبدی می‌شود. مصرف بیش‌ازحد آهن به‌عنوان یک عنصر سمی می‌تواند باعث اختلالات مختلفی در ارتباط با استرس اکسیداتیو و ضعف سیستم ایمنی بدن شود (14و 27). نانو ذرات آهن در حوزه پزشکی، برای درمان سرطان، تحویل دارو، عکس‌برداری پزشکی و تشخیص بیماری‌ها کاربرد فراوانی دارد (2). هرچقدر ذرات کوچک‌تر باشند نسبت سطح به حجم آن بیشتر شده و درنتیجه واکنش‌های بیوشیمیایی و بیولوژیکی آن بیشتر می‌شود (15). واکنش‌های بیوشیمیایی بیشتر نانو مواد منجر به افزایش تولید رادیکال‌های آزاد ازجمله رادیکال‌های واکنش‌گر اکسیژن (ROS) می‌شود. این رادیکال‌های آزاد به غشای سلول آسیب رسانده و با افزایش اکسیداسیون لیپیدها و شاخص‌های استرس اکسیداتیو منجر به التهاب بافت و مرگ سلول‌ها می‌شوند (9، 20). همچنین نانو ذرات اکسید آهن می‌توانند فعالیت آنزیم‌های کبدی را افزایش داده و منجر به ایجاد التهاب و تغییرات بافتی در کبد شوند (23).

امروزه علاقه‌مندی محققین در پیدا کردن گیاهان حاوی ترکیبات آنتی‌اکسیدانی مؤثر در برابر آسیب کبدی ناشی از سموم و داروها رو به فزونی است. مهمترین مزیت این ترکیبات طبیعی، حداقل عوارض جانبی آن در مقایسه با داروهای شیمیایی رایج در بازار می‌باشد. زیره سیاه بانام علمیL.)  Carum carvi) گیاهی چندساله از خانواده چتریان (Apiaceae)، بومی آسیای غربی، اروپا و شمال آفریقا می‌باشد (30). زیره سیاه علاوه بر اینکه یکی از قدیمی‌ترین ادویه‌جات جهان به شمار می‌آید، به‌طور گسترده در طب سنتی به‌عنوان بادشکن، قاعده­آور، ازدیاد کننده شیرمادر و نیرودهنده استفاده می‌شود (10و 17). خواص فارماکولوژیکی همچون ضد میکروبی، آنتی‌اکسیدانی، ضد اسپاسمی و ضد سرطانی این گیاه ثابت‌شده است (1). مطالعه پیشین ما نشان داده است که اسانس این گیاه حاوی ترکیبات اصلیγ-terpinene, γ-terpinene-7-al  وp-cymene  است و دارای خواص ضدمیکروبی و آنتی‌اکسیدانی چشمگیری بوده که قابل‌مقایسه با آنتی‌اکسیدان و آنتی‌بیوتیک‌های استاندارد می باشد (11). همچنین، خاصیت محافظت کبدی اسانس و عصاره این گیاه در شرایط سپسیس و in vivo، ثابت شده است (7). مطالعه‌ای نشان داد که اسانس زیره سیاه دارای خواص آنتی‌اکسیدانی قابل‌توجهی می­باشد و می‌توان به‌عنوان آنتی‌اکسیدان طبیعی در کاهش سطح استرس اکسیداتیو و افزایش سطح فاکتورهای آنتی‌اکسیدانی به کار گرفته شود (29).

با صنعتی شدن نانوتکنولوژی، در معرض قرارگیری عموم با نانو ذرات در آینده نزدیک غیرقابل اجتناب می باشد، لذا بررسی اثرات دزهای مختلف این نانو ذرات و اثرات آن‌ها بر سلامتی حائز اهمیت است. بافت کبد نقش مهمی در سوخت‌وساز، متابولیسم و دفع مواد زائد دارد. اما کبد در معرض قرارگیری دزهای بالای نانو ذرات آهن، آسیب‌پذیر شناخته‌شده است. بنابراین، می‌توان از آن به کمک آنتی‌اکسیدان‌های طبیعی موجود در گیاهان دارویی مانند زیره سیاه تا حدود زیادی محافظت کرد. دراین راستا، این مطالعه تا جایی که ما بررسی کردیم برای اولین بار، تأثیر محافظتی اسانس حاصل از دانه‌های زیره سیاه در جلوگیری از آسیب کبدی ناشی از نانو ذرات اکسید آهن را به کمک شاخص­های بیوشیمیایی استاندارد نظیر گلوتاتیون (GSH)، لیپید پر اکسیداسیون (LP)، آنتی‌اکسیدان کل (FRAP) و همچنین آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی سوپر اکسید دیسموتاز (SOD) و کاتالاز (CAT) و نیز یافته‌های آسیب‌شناسی، موردمطالعه قرارداده است.

مواد و روشها

تهیهاسانسزیره سیاه: اسانس زیره سیاه به‌وسیله دستگاه کلونجر استخراج شد. در این روش، 50 گرم از دانه‌های پودر شده با افزودن 700 میلی‌لیتر آب مقطر به مدت 90 دقیقه در یک بالن یک لیتری جوشانده شد. حیوانات آزمایشگاهی دراین مطالعه 20 سر رت نر نژاد ویستار (3 تا 4 ماهه) با میانگین وزن 150 گرم با رعایت کلیه ملاحظات اخلاقی استفاده شد.

این کمیته اخلاق مبتنی بر اعلامیه انجمن پزشکی جهانی هلسینکی (تصویب‌شده توسط هیجدمین مجمع پزشکی جهانی، هلسینک، فنلاند، ژوئن 1964) بود. حیوانات از موسسه پاستور ایران خریداری شده و در اتاق حیوانات در قفسه‌های مخصوص نگهداری شده و دسترسی آزاد به غذا و آب آشامیدنی از طریق بطری داشتند، که تحت تأثیر 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی قرار گرفتند.

تیمار حیوانات و نمونه‌گیری: حیوانات به‌طور تصادفی به چهار گروه تقسیم شدند. گروه شاهد، حیوانات روزانه به مدت سه روز، نرمال سالین (حلال نانو ذرات اکسید آهن) به همراه DMSO (حلال اسانس) را به‌صورت تزریق درون صفاقی (i.p) دریافت کردند. گروه تیمار نشده، 200 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن نانو ذرات اکسید آهن (Fe₂O₃) به همراه سالین (حلال نانو ذرات اکسید آهن) را روزانه به مدت 3 روز به‌صورت تزریق درون صفاقی دریافت کردند. گروه پیش درمانی، نانو ذرات اکسید آهن به همراه اسانس زیره سیاه در دو دُز متفاوت 100 (E.O100) و 200 (E.O200) میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن حل‌شده در DMSO را روزانه به مدت 3 روز به‌صورت تزریق درون صفاقی دریافت کردند. در روز سوم پس از تزریق (72 ساعت بعد از تزریق)، حیوانات توسط دی اتیل اتر بیهوش شده و از قلب آنها توسط سرنگ هپارینه، خونگیری انجام شد و به مدت 10 دقیقه با دور 3000 سانتریفوژ گردیده و پلاسما بدست آمد. همچنین، مقداری بافت کبد رت­ها نیز به‌منظور بررسی‌های پاتولوژیکی و تست‌های بیوشیمیایی برداشته شد.

آزمایشات بیوشیمیایی: ابتدا از بافت کبد هموژن 20 درصد وزنی/حجمی در بافر فسفات سرد (100 mM, pH=7.0) تهیه شد.

تعیین میزانLP : بخشی از بافت کبد برای اندازه‌گیری سطح مواد واکنش‌دهنده تیوباربیتوریک اسید (TBARS) به‌عنوان شاخص پر اکسیداسیون لیپید در بافر فسفات (100 mM, pH=7.0) هموژنیزه شد. غلظت TBARS با استفاده از اسپکتروفتومتری با استفاده از واکنش TBA بر اساس روش گزارش‌شده توسط بوج و آست در سال 1987انجام شد (5).

تعیین غلظت GSH: گلوتاتیون بااستفاده از معرف Ellman’s  و بر اساس روش لیندزی و سلداک (1986) در هموژن بافت کبد اندازه‌گیری شد. دراین روش، گلوتاتیون با ترکیبی به نام دی تیو نیترو بنزوئیک اسید (DTNB) کمپلکسی را تشکیل می‌دهد که طول‌موج آن توسط دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد. درنهایت، میزان گلوتاتیون به کمک منحنی استاندارد محاسبه شد (25).

تعیین ظرفیت آنتی‌اکسیدانی کل پلاسما )آزمون(FRAP: اندازه‌گیری ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام پلاسما با استفاده از روش FRAP که توسط بنزی و استرین در سال 1996 معرفی گردیده است، انجام شد. اساس این روش، توانایی سرم در احیای یون‌های فریک ⁺³Fe به فرو ⁺²Fe در حضور معرفTPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine) می­باشد. میزان قدرت احیاکنندگی سرم، با کمک منحنی استاندارد جذب در مقابل غلظت محلول ⁺²Fe، توسط دستگاه اسپکتروفتومتری محاسبه می‌شود.

تعیین فعالیت آنزیم‌هایSODو CAT: فعالیت‌های آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان SOD و CAT در کبد با استفاده از کیت‌های تجاری  (Abcam, Inc., USA)براساس دستورالعمل‌های شرکت، برآورد شد.

مطالعات هیستوپاتولوژی: پس از سه روز رت­ها­کشته‌شده و بافت کبد برای بررسی هیستوپاتولوژیک برداشته شد و در بافر فرمالین 10 درصد فیکس شدند. برش‌های نازکی به ضخامت 6-5 میکرون از بافت بلوک شده در پارافین تهیه و به روش هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) رنگ‌آمیزی می‌شوند، سپس لام­ها به‌منظور مقایسه تغییرات بافتی توسط میکروسکوپ نوری با مشخصات Olympus cx21 و دوربین Olympus e510 موردبررسی قرارگرفته و عکس‌برداری می‌شوند (18). در رنگ‌آمیزی آهن به روشLillie’s، نانوذره ما در تحقیق Fe₂O₃ بود. بنابراین آهن 3 ظرفیتی داشته که با با سه ظرف گزیلول پارافین زدایی کرده و با درجات الکل نزولی و آب مقطر آبدهی کردیم و برای رنگ‌آمیزی آهن فریک (Fe³⁺) برش‌ها را یک ساعت در محلول پتاسیم فروسیانید قرارداده و بعد برش‌ها را بخوبی در محلول آبی 1 درصد اسید استیک گلاسیال شستشو  دادیم و بعد برش‌ها را برای ده دقیقه در محلول  Basic Fuchsin  قرارداده و بعد در آب مقطر شستشو دادیم و با الکل‌های66 درصد و الکل مطلق آبگیری کرده و در گزیلول شفاف‌سازی کرده و بعد لامل روی آن قراردادیم، آهن به‌صورت آبی پروس تیره دیده شد.

تجزیه‌وتحلیل آماری: برای تجزیه‌وتحلیل داده‌ها از نرم‌افزار SPSS ویرایش 15 استفاده گردید. نتایج به‌دست‌آمده از این تحقیق توسط آزمون واریانس یک‌طرفه (One way-ANOVA) و به دنبال آن با استفاده از آزمون تعقیبی توکی مقایسه شدند. نتایج به‌صورت میانگین ± انحراف معیار گزارش‌شده و مقایسه میانگین داده‌ها (برای هر آزمون 3 تکرار در نظر گرفته شد) در سطح آماری 05/0P< معنی‌دار در نظر گرفته شد. 05/0 *P<بیانگر تفاوت معنی‌دار گروه کنترل شاهد نسبت به گروه تیمار نشده و05/0**P< بیانگر تفاوت معنی‌دار گروه تیمار نشده نسبت به گروه‌های پیش درمانی (اسانس زیره سیاه) می باشد.

نتایج

تأثیر اسانس زیره سیاه بر روی پارامترهای استرس اکسیداتیو / آنتی‌اکسیدانت (GSH،LP  و FRAP): نتایج اندازه‌گیری LP حاکی از آن است که تزریق نانو ذرات اکسید آهن با دُز 200 میلی‌گرم در کیلوگرم وزن بدن، 72 ساعت پس از تزریق، این شاخص از مقدار
n mol/mg protein 1.39±0.17 در گروه شاهد به 2.53±0.11 n mol/mg protein در گروه تیمار نشده افزایش یافت (05/0P<). اما، میزان آن به‌طور قابل‌توجهی (05/0P<) با مصرف اسانس زیره سیاه در دو گروه E.O100 (1.60±0.19 n mol/mg protein) و E.O200 (1.52±0.13 n mol/mg protein) کاهش معنی‌داری پیدا کرد (جدول 1). تزریق نانو ذرات اکسید آهن پس از سه روز، باعث کاهش قابل توجه میزان گلوتاتیون کبدی از (460.4±13.03 n mol/mg protein) در گروه شاهد به (342.4±19.2 n mol/mg protein) شده است. درحالی‌که در گروه‌های پیش درمانی با اسانس زیره سیاه در دو گروه E.O100 (423±23.16 n mol/mg protein) و E.O200 (428±25.28 n mol/mg protein) میزان GSH افزایش چشمگیری (05/0P<) پیداکرده است (جدول 1). تیمار رت ها با 200 میلی‌گرم در کیلوگرم وزن بدن نانو ذرات اکسید آهن منجر به کاهش معنی‌دار ظرفیت آنتی‌اکسیدانی کل پلاسما از 631.60±40.37μmol/L به
 μmol/L 436.40±17.45، پس از سه روز شد (05/0P<). اما این پارامتر پس از پیش درمانی با اسانس زیره سیاه در دو دُز 100 و 200 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن تأثیری در میزان فعالیت آنتی‌اکسیدانی پلاسما نداشته است (05/0P>) (جدول 1).

جدول 1- تأثیر اسانس زیره سیاه بر روی پارامترهای استرس اکسیداتیو/ آنتی‌اکسیدان (GSH،LP  و FRAP)

 :NCگرو شاهد،  :Cگروه تیمار نشده، E.O100: گروه پیش‌درمان شده با اسانس زیره سیاه با دزmg/kg b.w  100 و E.O200: اسانس زیره سیاه با دُز mg/kg b.w 200. 05/0^*P< تفاوت معنی‌دار گروه شاهد (C) نسبت به گروه تیمار نشده (NC) و 05/0P<^** تفاوت معنی‌دار گروه تیمار نشده (NC) نسبت به گروه‌های پیش درمانی (E.O100 و E.O200) را نشان می‌دهد

تأثیر اسانس زیره سیاه بر روی آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان SOD و CAT: براساس داده‌های جدول  2، فعالیت آنزیم‌های SOD و CAT تحت تأثیر نانو ذرات اکسید آهن قرار نگرفت. همچنین تیمار پیش درمانی حیوانات با اسانس زیره سیاه در دو گروه E.O100 و E.O200 منجر به ایجاد تغییر در سطح این دو آنزیم نشده است (05/0P>) (جدول 2).

جدول 2- تأثیر اسانس زیره سیاه بر روی فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی SOD و CAT

:NCگرو شاهد،  :Cگروه تیمار نشده، E.O100: گروه پیش‌درمان شده با اسانس زیره سیاه با دزmg/kg b.w  100 و ^* E.O200: اسانس زیره سیاه با دزmg/kg b.w  200. 05/0P<^* تفاوت معنی‌دار گروه شاهد (C) نسبت به گروه تیمار نشده (NC) و 05/0P<^** تفاوت معنی‌دار گروه تیمار نشده (NC) نسبت به گروه‌های پیش درمانی (E.O100 و E.O200) را نشان می‌دهد

مطالعه هیستوپاتولوژی: تصاویری از مقاطع بافتی رنگ‌آمیزی شده به روش H&E در شکل‌های زیر ارائه‌شده است. نتایج بررسی‌های بافت‌شناسی نشان دادند که کبد حیوانات گروه شاهد طبیعی بوده و تخریب واکوئل، آسیب هپاتوسلولار و هیچ نکروزی به چشم نخورد و ساختار هسته، سیتوپلاسم، هپاتوسیت­ها و همچنین، بافت پارانشیم و لوبول­ها در بافت کبد نرمال است (شکل 1، A1 وA2). درعین‌حال، چنانچه تصاویر نشان می‌دهند، دریافت 200 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن نانو ذرات اکسید آهن، القای نکروز گسترده هپاتوسلولار و تخریب واکوئل­ها را موجب شده است (شکل 1،B1  وB2). درحالی‌که تصاویر گروه‌های پیش درمانی با اسانس زیره سیاه E.O100 و E.O200، ناحیه نکروز کوچک‌تر شده را نشان داده و نیز از آسیب هپاتوسلولار در این ناحیه تا حدی کاسته شده است، ولی تخریب واکوئل ها همچنان مشهود است (شکل 1، C1 وC2) (شکل 1،  D1وD2)

بحث

در مطالعه حاضر اثر سمیت نانو ذرات اکسید آهن به علت کاربرد زیاد آن در صنایع مختلف بررسی‌شده است. سم‌زدایی مواد سمی یکی از اعمال مهم کبد است و آسیب این عضو منجر به ضررهای جبران‌ناپذیری در بدن می‌شود.

شکل1- اثر اسانس زیره سیاه در دو دُز 100 و 200 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن بر روی تغییرات پاتولوژی بافت کبد بعد از 72 ساعت از تزریق نانو ذرات اکسید آهن. A: گروه شاهد،. B: گروه تیمار نشده،(B B2 C: گروه پیش درمانی با اسانس زیره با دُز 100 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن (E.O100   D: گروه پیش درمانی با اسانس زیره با دُز 200 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن (E.O200)