خط­شناسه گذاری DNA و بررسی تنوع­گونه­ای کرم­های کم­تار رودخانه جاجرود

زرانگیس نهاوندی، اصغر عبدلی^*، فراهم احمدزاده و محمد جاویدکار

ایران، تهران، دانشگاه شهید بهشتی، پژوهشکده علوم محیطی، گروه تنوع زیستی و مدیریت اکوسیستم­ها

تاریخ دریافت: 14/5/1398            تاریخ پذیرش: 10/6/1399

چکیده

کم­تاران به طورکلی به عنوان یک گروه شناخته‌شده از بی­مهرگان خاک با پراکنش جهانی، از دو نقطه نظر زیست‌محیطی و تاکسونومیکی مورد توجه قرار­گرفته­اند. دراین پژوهش تنوع­گونه­ای کرم­های کم­تار از هفت ایستگاه رودخانه­ی جاجرود در فصول پاییز و زمستان مورد بررسی قرارگرفت. نمونه­ها با استفاده از روش ضربه و با کمک الک با چشمی ریزصید (۵۰۰ میکرون) جمع‌آوری شدند. امروزه استفاده از روش­های نوین از جمله نشانگر­های ژنتیکی، شناخت دقیق­تری از گونه­ها ارائه می­دهند. به منظور ارزیابی تنوع و شناسایی گونه­ها، از روش مولکولی خط­شناسه گذاری DNA توسط ناحیه ژن میتوکندریایی سیتوکروم c اکسیداز زیرواحد یک (COI) و کلیدهای شناسایی مرفولوژیک استفاده شد. در طی مطالعه، پنج گونه از خانواده­ی Lumbricidae و Naididae مربوط به سه جنس Eiseniella، Eisenia و Tubifex شناسایی شد. نمونه­های شناسایی‌شده عبارتند از Tubifex tubifex،Tubifex sp.،Eiseniella tetraedra، Eisenia fetida و Eisenia sp.. نتایج نشان داد گونه
E. tetraedra فراوان‌ترین گونه است که چهار دودمان مجزا را شامل می­شود.

واژه­های کلیدی: خط­شناسه گذاری DNA، تنوع­گونه­ای، کم­تاران، رودخانه جاجرود

* نویسنده مسئول، تلفن: 09123977258، پست الکترونیکی: A_Abdoli@sbu.ac.ir

مقدمه

در مناطق خشک و نیمه‌خشک ایران، رودخانه­های آب شیرین از مهم­ترین اکوسیستم­های آبی هستند که از نظر تنوع زیستی و تأمین آب آشامیدنی مورد توجه قرارگرفته‍اند (۲ و ۲1). رودخانه­ی جاجرود یکی از رودخانه­های مهم حوضه­های آب شیرین کشور است که به علت وجود پارک­های ملی سرخه­حصار و خجیر در داخل منطقه حفاظت‌شده‌ی جاجرود از اهمیت ویژه­ای برخوردار است (3). این رودخانه با دارا بودن شیب زیاد، بستر سنگلاخی و انجام عمل خودپالایی کامل، اکوسیستمی مناسب برای موجودات آبزی (4) و یکی از منابع تأمین‌کننده‌ی بخش عمده­ی آب شرب شهر تهران محسوب می­شود که انواع متنوعی از آبزیان با ارزش را در خود جای داده است (۱). اغلب فراوان­ترین کفزیان با توزیع جهانی در اکوسیستم­های آب شیرین، کم­تاران (Oligochaeta) هستند (۱4). چندین خانواده از کرم­های کم­تار موجود است که ساکن محیط­های دریایی و یا آب شیرین هستند. کرم­های آب شیرین در طیف وسیعی از زیستگاه­ها مانند چشمه­ها، آب­های زیرزمینی، رودخانه­ها، خورها، استخرهای کوچک موقتی تا اعماق زیاد دریاچه­های بزرگ زندگی می­کنند (38). آن­ها در ساختار رسوبات اکوسیستم آب شیرین و در چرخه­ی غذایی نقش مهمی ایفا می­کنند و انواع مختلف موجودات مانند باکتری­ها، قارچ­ها، گیاهان و حیوانات دیگر را در این چرخه به هم متصل می­کنند (36). فعالیت آن‌ها، افزایش معدنی کردن مواد آلی، فعالیت میکروبی و هوادهی رسوبات را به دنبال دارد (۳2). همچنین جذب اکسیژن و نیترات‌زدایی به هنگام فراوانی بالای این موجودات، افزایش می­یابد (۴2) و درنهایت نقش مهمی در حفظ کیفیت و حاصلخیزی خاک ایفا می‌کنند (۵0). بعضی از کفزیان برای ارزیابی کیفیت اکوسیستم­های آبی کاربرد دارند که کم­تاران آبزی به‌عنوان شاخص­های زیستی بسیار عالی از تغییرات محیطی محسوب می­شوند (10).

تقریباً ۱۱۰۰ گونه از گونه­های شناخته‌شده زیررده­ی کم­تاران (بیش از ۵۰۰۰ گونه)، در آب­های شیرین زندگی می­کنند (۳0) که تاکنون تنها ۲۶ گونه­ی آبزی در آب‌های داخلی ایران فقط براساس ریخت­شناختی ثبت شده‌اند (5،21،22،38). باتوجه به ویژگی­های جغرافیای کشور ایران مانند بزرگی منطقه، مناطق کوهستانی و همچنین ویژگی­های منحصربه‌فرد شبکه هیدرولوژیکی، به ‌احتمال زیاد گونه­های بسیاری از ایران هنوز گزارش نشده‌اند (۲2).

امروزه خط­شناسه گذاری DNA به‌عنوان یک روش مولکولی جهت شناسایی گونه­ها و ارزیابی تنوع زیستی به کار برده می­شود و توانسته تا حدودی مشکلات تاکسونومی کلاسیک را برطرف کند (16 و 44). هدف از این مطالعه بررسی تنوع گونه‌ای و ژنتیکی کم­تاران رودخانه­ی جاجرود بااستفاده از روش خط شناسه گذاری DNA است.

مواد و روشها

نمونه­برداری در فصل­های پاییز (آبان ماه) و زمستان (اسفند ­ماه) در هفت ایستگاه از حاشیه تا وسط بستر رودخانه­ی جاجرود انجام شد (شکل۱). نوع بستر در ایستگاه­ها به طور غالب قلوه‌سنگی و عمق نمونه­برداری بسته به رودخانه و ایستگاه از حدود 30 تا 100 سانتیمتر متفاوت بود. مختصات جغرافیایی ایستگاه­های نمونه­برداری به وسیله­ی GPS (Garmin eTrex Legend) ثبت شد (جدول۱).

شکل ۱- نقشه­ ایستگاه‌های مورد مطالعه در رودخانه جاجرود با استفاده از نرم­افزار ArcGIS

(عبارتند از آبنیک، آبنیک پایین، شمشک، فشم، آهار، حاجی‌آباد، سعیدآباد)

جدول ۱- مشخصات ایستگاه­های نمونه‌برداری از رودخانه جاجرود

نمونه­ها با استفاده از روش ضربه و با کمک الک با چشمی ریزصید (۵۰۰ میکرون) جمع‌آوری و در لوله­های حاوی الکل ۹۶% قرار داده شدند. الکل هر نمونه جهت ماندگاری و کیفیت بهتر نمونه، ۳ تا ۴ بار در طول روز اول با همان درصد الکل تعویض شد. سپس، نمونه­ها به آزمایشگاه مولکولی دانشگاه شهید بهشتی منتقل و در دمای °20- سانتی‌گراد نگهداری شدند.

استخراج DNA و واکنش زنجیره­ای پلی­مراز (PCR): نمونه­ها براساس کلیدهای شناسایی برینکهرست (1986، 1971)، پیندر (2010) و جابلونسکا و پسیک (2014) شناخته و کدگذاری شدند (12،13،25،37). این مرحله قبل از انجام استخراج در آزمایشگاه تنوع زیستی با استریومیکروسکوپ با بزرگنمایی ۵ (شرکت
Nisho Optical، ژاپن ) انجام شد.

برش کوچکی از قسمت انتهایی بدن نمونه‌ها تهیه و از پروتکل Gentra (شرکت Qiagen، امریکا) برای استخراج DNA استفاده شد (۴1). در این مطالعه از ژن میتوکندریایی سیتوکروم c اکسیداز زیرواحد یک (COI) استفاده شد. واکنش­های زنجیره­ای پلی­مراز مطابق با جدول ۲، انجام شد (۲1 و 47). بعد از انجام PCR، محصولات هدف تکثیرشده (جدول3) برای توالی­یابی به شرکت ماکروژن کره­جنوبی فرستاده شدند (29).

جدول ۲- چرخه حرارتی PCR انجام شده برای کم­تاران

جدول ۳- مشخصات مواد مورد نیاز برای انجام PCR

آنالیز­های ژنتیکی: درمجموع ۱۸۰ نمونه جمع‌آوری شد و ۴۰ توالی (از هرایستگاه ۲ تا ۱۲ فرد) انتخاب شد. توالی­ها با نرم‌افزار Geneious v.11.1.4 (25) ویرایش شدند و سپس با استفاده از الگوریتم Blastn مربوط به Genbank از همساختی و تعلق توالی­ها به کرم­های کم­تار اطمینان حاصل شد. هم­ردیف­سازی با الگوریتم MAFFT انجام شد (۲4). مجموعه داده­ها به طور میانگین ۶۳۳ جفت باز طول داشت. توالی­ها سپس به صورت چشمی کنترل شدند تا از عدم خطاهای نرم‌افزاری در هم­ردیف­سازی اطمینان حاصل شود.

از یک گونه­ پرتارHermodice carunculata (Pallas, 1766)  برای ریشه‌دار کردن درخت‌های فیلوژنتیکی استفاده شد (Accession Number: KF878476.1). جهت تعیین بهترین مدل جایگزینی نوکلئوتیدی برای تفسیر و آنالیز داده­ها از نرم‌افزار Modeltest v.3.7 استفاده شد (39). طبق این آزمون، مدل نوکلئوتیدی TVM + G + I برای تحلیل‌های فیلوژنتیکی انتخاب شد.

آنالیز درخت بیشینه­ی احتمال (Maximum Likelihood) با استفاده از نرم‌افزار v.1.6.1 IQ TREE با Bootstrap 1000 انجام شد (۳3). برای ویرایش درخت­های ژنتیکی از نرم‌افزار FigTree v.1.4.3 استفاده شد (۴3). برای آنالیز شبکه هاپلوتایپی و مشاهدات روابط هاپلوتایپی گونه­های این مطالعه و همچنین توالی‌های گونه­های موجود در بانک ژن از سایر نقاط جهان شامل آمریکا، فرانسه، آلمان، روسیه، انگلستان و نروژ (جدول ۴) برای ژن میتوکندریایی COI از نرم‌افزارHaplotype viewer (www.cibiv.at/~greg/haploviewer) براساس Median joining استفاده شد (46). فواصل ژنتیکی (P-distance) میان افراد مورد مطالعه در درون و بین گونه برای ژن میتوکندریایی COI با استفاده از نرم‌افزار v.10.0.1 MEGA-X محاسبه شد (27). به منظور بررسی شاخص‌های تنوع­ژنتیکی (تنوع هاپلوتایپ و تنوع نوکلئوتیدی) از نرم‌افزار DnaSP v.6.11 استفاده شد (45).

نتایج

تنوع کم­تاران در رودخانه جاجرود: براساس درخت بیشینه احتمال، میزان Bootstrap برای گره‌ها عمدتاً بالای ۹۰ درصد بود. پنج گونه از سه جنس Eiseniella، Eisenia و Tubifex شناسایی شد و سه کلاد مجزا از هم را تشکیل دادند. کلاد اول، Eiseniella tetraedra با تشکیل یک گروه هم نیا (BP=98) چهار دودمان (Lineage) مجزا را شامل شد که دودمان B و C با یکدیگر تشکیل رابطه­ی خواهری (BP=96) دادند. کلاد دوم شامل Eisenia fetida و Eisenia sp. (BP=98) و کلاد سوم Tubifex tubifex و Tubifex sp. را شامل شد (BP=100) (شکل ۲).

شکل ۲- درخت بیشینه احتمال با استفاده از ژن میتوکندریایی COI. مناسب­ترین مدل تکاملی نوکلئوتیدی برای این داده‌های ژنیTVM + G + I محاسبه شد. درخت با استفاده از گونه­ی ­ carunculata (Pallas, 1766) Hermodice ریشه‌دار شد. آزمون نسبت تقریبی احتمال برای هر شاخه و همچنین میزان Bootstrap برای هرگره به ترتیب روی هر شاخه با دو مقدار مشخص شده است (SH-aLRT support (%) / ultrafast bootstrap support (%) values). دودمان­های E. tetraedra براساس رنگ خاص خود تفکیک‌شده‌اند (آبی: دودمان B، بنفش: دودمان C، زرد: دودمان A، سبز: دودمان D)

جدول ۴- مشخصات توالی مولکولی نمونه‌های کرم‌های کم تار رودخانه جاجرود و توالی­های گرفته‌شده از بانک ژن (ENG: انگلستان، GER: آلمان، USA: آمریکا، FRC: فرانسه، RUS: روسیه، NWR: نروژ). توالی­ها از ردیف ۱تا ۴۰ متعلق به رودخانه­ی ­جاجرود و از ردیف ۴۱ تا ۵۲ متعلق به سایر نقاط جهان است

فاصله ژنتیکی: میانگین فاصله­ی ژنتیکی بین‌گونه‌ای
(p-distance) بین 2/18-1/25 % است. تغییرات فاصله­ی ژنتیکی درون­گونه­ای بین دودمان­های E. tetraedra (دودمان­های A، B، C و D) به‌صورت تقریبی بین 2-10 % محاسبه شد (جدول ۵).

جدول ۵- فاصله ژنتیکی تصحیح‌نشده براساس ژن COI بین گروه­های مختلف گونه­ای کرم­های کم­تار رودخانه جاجرود

(A، B، C و D دودمان­های گونه­ی E. tetraedra هستند)

شبکه هاپلوتایپی برای گونه­ی E. tetraedra در ایران و نقاط مختلف جهان: شبکه هاپلوتایپی درمجموع هشت هاپلوتایپ را تشکیل داد که دودمان A یک هاپلوتایپ، دودمان B یک هاپلوتایپ، دودمان C دو هاپلوتایپ و دودمان D چهار هاپلوتایپ را شامل شد. دودمان D بیشترین فراوانی (۴۰ درصد) را نشان داد. هاپلوتایپ دودمان A با آمریکا، انگلستان و آلمان، هاپلوتایپ دودمان B با آمریکا و فرانسه، هاپلوتایپ­های دودمان C با آمریکا، روسیه و آلمان و هاپلوتایپ­های دودمان D با آمریکا، انگلستان و نروژ تشکیل هاپلوتایپ­های مشترک دادند (شکل ۳).

شکل ۳- شبکه هاپلوتایپ ترسیم‌شده بین هاپلوتایپ­های موجود دودمان­های این مطالعه و توالی­های گرفته‌شده از بانک ژن برای گونه­ی E. tetraedra براساس ژن میتوکندریایی COI. گره­های آبی جهش­ها هستند که با عدد (1) نشان داده شد. هر ایستگاه و کشور بر اساس رنگ خاص خود تفکیک شده­اند. (آبنیک:ABN، آبنیک­پایین:ABL، حاجی­آباد:HAJ، آهار:AHR، شمشک:SHM، فشم:FSH، سعیدآباد:SAI، آلمان:GER، آمریکا:USA، فرانسه:FRC، روسیه:RUS، نروژ:NWR، انگلستان:ENG)

بررسی ساختار جمعیتی- تنوع ژنتیکی E. tetraedra: مطابق جدول ۶، بیشترین تنوع هاپلوتایپی و بیشترین تنوع نوکلئوتیدی در ایستگاه شمشک (به ترتیب ۱ و ۰۰۶۲/۰) و کم­ترین تنوع هاپلوتایپی در ایستگاه سعیدآباد (۲۵/۰) و کم­ترین تنوع نوکلئوتیدی در ایستگاه­های حاجی‌آباد و سعیدآباد (به ترتیب ۰۱۲/۰ و ۰۰۱۵/۰) محاسبه شد. همچنین مقدار تنوع نوکلئوتیدی کم به­دست آمد. به‌طورکلی مقدار تنوع هاپلوتایپی و نوکلئوتیدی دودمان­های E. tetraedra در ایستگاه­های بالا­دست و میان­دست رودخانه بالاتر از پایین­دست رودخانه محاسبه شد.

جدول ۶- شاخص­های تنوع هاپلوتایپ (h) و نوکلئوتید (π) گونه­ی E. tetraedra در هر ایستگاه

فراوانی کم­تاران در هر ایستگاه نمونه‌برداری: بیشترین درصد فراوانی گونه در تمامی ایستگاه‌ها برای
E. tetraedra ثبت گردید (87%). فراوانی گونه­های
E. fetida، Eisenia sp.، Tubifex sp. و T. tubifex بین 2-5 درصد محاسبه شدند (شکل ۴).

شکل ۴- فراوانی کل گونه­های کرم کم­تار براساس درصد در ایستگاه­های نمونه‌برداری در رودخانه جاجرود

بحث و نتیجه‌گیری

مطالعات اندکی در خصوص تنوع­زیستی کرم­های کم­تار ایران صورت گرفته است و تحقیقات انجام­گرفته تنها بر اساس ریخت­شناختی گونه­ها را شناسایی کرده است: اولین اطلاعات از کم­تاران آب­های داخلی ایران، در سال 1920 با ثبت چهارگونه Chaetogaster diastrophus، Chaetogaster limnaei، Nais communis و Stylarialacustris گزارش شد (48). از سال 1996 پژوهش­های بیشتری در رابطه با کم­تاران آبزی انجام شد. برای اندازه­گیری فلزات سنگین در رسوبات سطحی در تالاب انزلی، بزرگ بی­مهرگان کفزی را به عنوان شاخص زیستی مورد سنجش قرار دادند و Tubifex tubifex در این تالاب شناسایی شد (40). در رودخانه­های جاجرود و برغان نمونه­هایی از بی­مهرگان کفزی جمع‌آوری شدند که Tubifex tubifex وEiseniella sp.  شناسایی شدند (18). با مطالعه­ی تنوع زیستی گونه­های بی­مهره کفزی در رودخانه ارس، چهار گونه از کم­تاران آبزی ثبت شدند که شامل سه گونه جدید Aulodrilus pigueti، Branchiura sowerbyi و Spirosperma ferox شدند (7). با بررسی بزرگ بی­مهرگان تالاب زرینه در جنوب دریاچه، تنها Branchiura sowerbyi و Limnodrilus hoffmeisteri گزارش شدند (6). در رودخانه جاجرود Ophidonais serpentina، گونه­ای جدید از کم­تاران آبزی نیز گزارش شد (8). ده گونه از کم­تاران طی مطالعه­ی بی­مهرگان رودخانه زرینه­رود ثبت شدند که چهار گونه جدید Limnodrilus udekemianus، Lumbriculus variegatus، Rhyacodrilus coccineus و Aulophorus furcatus را شامل شد (5). برای کاهش میزان لجن زباله­های زیستی تولیدشده در تأسیسات تصفیه فاضلاب در اهواز کرم­های آبزی به کار برده شدند که Lumbriculus variegatus شناسایی شد (9).

براساس چک‌لیست به‌روز شده کم­تاران آبزی ایران در سال 2014، علاوه بر ۱۴ گونه شناسایی‌شده از مطالعات قبل، پنج گونه جدید Dero dorsalis، Embolocephalus velutinus، Haplotaxis gordioides، Pristina breviseta و Psammoryctides albicola شناسایی و ثبت شدند (22). این چک‌لیست با مطالعه نمونه­ها در رسوبات کف و پوشش گیاهی آبزی در تالاب بین‌المللی انزلی با ثبت هفت گونه جدیدLimnodrilus claparedeianus، Potamothrix hammoniensis، Potamothrix bedoti، Nais pardalis، Dero digitata، Slavina appendiculata و Mesenchytraeus sp. به‌روز شد (35).

در مطالعه­ی حاضر برای اولین بار از روش مولکولی جهت بررسی تنوع­گونه­ای کم­تاران آبزی استفاده شد. باتوجه به شکل ۲، پنج گونه شناسایی شد. دوگونه آبزی از خانواده Naididae، T. tubifex و Tubifex sp. ثبت شد. نتایج مطالعات چنگ و جیمز (2011) نشان می­دهد که فاصله­ی ژنتیکی کمتر از ۹ درصد گونه­ مشابه و بالاتر از ۱۵ درصد دو گونه را مجزا می­کند (۱4). T. tubifex و Tubifex sp. با میانگین فاصله­ی ژنتیکی بالا (جدول ۵) و قرار گرفتن در کلاد مجزا با ساپورت بالا (شکل ۲) به احتمال زیاد، دو گونه­ مجزا از هم محسوب می­شوند. فقط T. tubifex در مطالعات گذشته نیز گزارش شد (5،18،34،40). از خانواده­ Lumbricidae، دو گونه­ احتمالاً خشکی­زی Eisenia sp. و E. fetida و چهار دودمان مجزا از گونه نیمه­آبزی
E. tetraedra ثبت شدند. گونه غیربومیE. fetida به صورت تصادفی در این مطالعه یافت شد که در سرتاسر جهان معرفی شده است. محدوده­ی اصلی آن آسیای مرکزی است، در­حالی­که محدوده­ی فعلی آن به اروپا، آمریکای شمالی، آمریکای جنوبی، آفریقا، آسیا و استرالیا گسترش یافته است (15،20،28). T. tubifex، Tubifex sp. و Eisenia sp. تنها در ایستگاه سعید­آباد، E. fetida به صورت تصادفی فقط در ایستگاه فشم و دودمان­های
E. tetraedra در هر هفت ایستگاه­ مشاهده شدند (جدول۴). با توجه به مطالعات یابلوسکا و پسیچ در سال 2014، کشور ایران با دارا بودن ویژگی­های جغرافیایی و هیدرولوژیکی منحصربه­فرد، تنوع­گونه­ای بالایی از کرم­های کم­تار در رودخانه انتظار می­رفت (۲2)، اما در مطالعه حاضر تنوع آن‌ها اندک بود. دراین مطالعه فراوان­ترین (۸۷%) نمونه­های به‌دست‌آمده متعلق به گونه­ E. tetraedra است (شکل۴) که چهار دودمان مجزا را تشکیل داد (شکل۲). E. tetraedra بومی مناطق غربی اروپا است که در حال حاضر عمدتاً در مناطق معتدل در هر دو نیمکره جهان گسترش یافته است و به اکثر نقاط جهان معرفی شده است (11 و 15). این گونه در مناطق غربی کالیفرنیا (49)، ژاپن (۱1)، استرالیا (۳1) و نیوزلند (26) به‌عنوان گونه غیربومی از خانواده­ Lumbricidae شناخته شده است. در ایران نیز در کوه­های البرز مرکزی در طول رودخانه­های هراز و چالوس، غرب استان مازندران، استان تهران، استان کهگیلویه و بویراحمد و همچنین در دو رودخانه­ی حفاظت‌شده‌ی کوهستان‌های البرز جنوبی (کرج و جاجرود) به ثبت رسیده است که زیستگاه­های مرطوب را ترجیح می­دهد، بنابراین در مناطق البرز و غرب مازندران به علت رطوبت و بارندگی بیشتر، توزیع گسترده­تری دارد (19،20،23،28). نتایج مطالعه مارتینسون و همکاران (2015) با نتایج مطالعه­ی حاضر مطابقت دارد.
E. tetraedra که منشأ اروپایی دارد، دودمان­های آن در استرالیا به‌عنوان گونه­ی غیربومی تنوع ژنتیکی درون­گونه­ای بالایی (بین 0- 5/%5) داشت. این گونه با نمونه­های دیگر از نقاط مختلف جهان (اروپا، آمریکای شمالی و مرکزی و آسیای شرق دور) هاپلوتایپ­های مشترک تشکیل داد (۳5). در مطالعه­ی حاضر نیز دودمان­های E. tetraedra هاپلوتایپ­های مشترک با سایر نقاط جهان تشکیل دادند (شکل۳) و تنوع درون‌گونه‌ای بین10-2% را در طول رودخانه جاجرود نشان دادند (جدول۵). جاویدکار و همکاران (2020) پژوهش مشابه و به‌طور هم‌زمان در رودخانه­های کرج و جاجرود انجام دادند که نتایج یکسانی با مطالعه­ی حاضر به دنبال داشت. E. tetraedra فراوان­ترین گونه با شش دودمان مجزا بود و دودمان­های آن با سایر نقاط جهان، تشکیل هاپلوتایپ­های مشترک دادند. همچنین عدم ساختار جمعیتی مشخص از احتمال معرفی شدن توسط انسان حمایت می‌کند و فراوانی گونه­های بومی را تحت تأثیر قرار داده است (۲3). عوامل مختلفی می­تواند فراوانی این گونه را تحت تأثیر قرار دهد. یکی از علل گسترش E. tetraedra در اکثر مناطق جهان، تولیدمثل بکرزا (Parthenogenetic) آن است که قادر است تعداد زیادی پیله (Cocoon) تولید کند. نتایج  دسوسا و همکاران (2017) نشان داد که دودمان­های این گونه­ تنوع ژنتیکی بالایی را در اسپانیا نشان دادند و ساختار جمعیتی مشخصی نداشتند که بیشترین تنوع دودمان­ها در میان­دست محاسبه شد (17). در مطالعه حاضر نیز نتایج مشابه بود و در میان­دست و بالادست، بیشترین تنوع را داشتند. تنوع پایین محاسبه­شده در پایین­دست، تأثیر فعالیت­های انسان و شرایط نامساعد بر تنوع ژنتیکی را نشان می­دهد (جدول۶). باتوجه به فراوانی بالای E. tetraedra در رودخانه جاجرود ارزیابی اثرات و شناخت خطرات بالقوه اکولوژیک و تهدیدات آن بسیار ضروری است.