نوع مقاله : مقاله پژوهشی
عنوان مقاله English
نویسندگان English
This study aimed to investigate the protective effects of diets supplemented with different levels of Zenyang (Trachyspermum ammi L.) on growth and immune response, Common carp (Cyprinus carpio) fry and resistance to copper exposure. The fish (9.98 ± 0.46 g) were fed diets containing 0.5, 1 and 1.5 % of Zenyang per 1 kg of basic food for 60 days. Expriments were done in Gonbad Kavous University druring 2023 years. Afetr feeding, Fish were exposed to sulphate copper (CuSO4, 5H2O) stress (0.1 mg/l) for 96h. Behaviours and clinical signs of fish were recorded during the experiment. Samples were cut from kidney, liver and gill of moribund and fresh dead fish for histopathological signs. The highest final weight (FW) and the lowest Food conversion ratio (FCR) were obtained in fish fed with diets containing Zenyang. At the end of the feeding period, Serum total immunoglobulin levels and lysozyme and complement (ACH50) activities were significantly higher in the 1% group than in the control group. After stress, all fed groups with Zenyang supplements had higher lysozyme and complement (ACH50) activities, compared to the control group. After stress, the highest levels of stress indicators (cortisol and golocus) were observed in the control group. Histopathologic results showed hyperplasia, edema, expansion of secondary lamella, epithelial cells necrosis of gill were most lesions. Altogether, our results show that dietary inclusion of Zenyang can be used for growth, as is a sustainable strategy in redused of effects of copper exposure in common carp fish.
کلیدواژهها English
کارآیی عصاره هیدروالکلی زنیان(Trachyspermum ammi) بر میزان ایمنی و مقاومت ماهی کپورمعمولی (Cyprinus carpio) در مواجهه با سولفات مس
ابوالفضل پیکارپرسان 1، محمد فرهنگی1*، حسین آدینه 1، محمد مازندرانی 2 و مریم علیزاده 3
1 ایران، گرگان، دانشگاه گنبد کاووس، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، گروه شیلات
2 ایران، گرگان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی، دانشکده شیلات و محیط زیست، گروه شیلات
3 ایران، گرگان، دانشگاه منابع طبیعی و علوم کشاورزی، دانش آموخته دکتری بوم شناسی آبزیان
تاریخ دریافت: 14/01/1402 تاریخ پذیرش: 11/06/1402
چکیده
زنیان گیاهی است که جهت تقویت رشد و سیستم ایمنی موجودات (منجلمه ماهی و انسان) کاربرد دارد. این مطالعه با هدف بررسی اثرات حفاظتی رژیمهای غذایی حاوی سطوح مختلف زنیان بر رشد و پاسخ ایمنی بچه ماهی کپور معمولی (Cyprinus carpio) در مواجهه با سولفات مس (CuSO4, 5H2O) انجام شد. ماهیها (46/0± 89/9 گرم) با جیرههای حاوی 5/0، 1 و 5/1 درصد زنیان به ازای هر کیلوگرم غذای پایه به مدت 60 روز تغذیه شدند. آزمایشات در بازه زمانی 1401 در دانشگاه گنبدکاووس صورت گرفت. پس از تغذیه، ماهیان تحت استرس سم سولفات مس بهمدت 96 ساعت قرارگرفتند (1/0 میلی گرم در لیتر). در طول آزمایش، علائم رفتاری و کلینیکی ماهیان ثبت گردید. بهمنظور بررسیهای آسیبشناسی، از بافتهای کلیه، کبد و آبشش ماهیان در حال مرگ و تازه تلف شده نمونهبرداری صورت گرفت. بیشترین وزن نهایی و کمترین ضریب تبدیل غذایی در ماهیان تغذیه شده با جیره حاوی زنیان بدست آمد (50/0>P). در پایان دوره تغذیه، سطح ایمونوگلوبولین کل سرم و فعالیت لیزوزیم و کمپلمان (ACH50) در تیمار حاوی یک درصد زنیان به طور قابل توجهی بیشتر از گروه شاهد بود (50/0>P). پس از استرس، تمام گروههای تغذیه شده با مکمل زنیان، بیشترین سطح شاخصهای استرس (کورتیزول و گلوکز) در گروه شاهد مشاهده شد. بررسی مقاطع بافت آبشش نشان داد، بیشترین ضایعات شامل ادم، هایپرپلازی، چسبندگی لاملاهای ثانویه و نکروز سلولهای پوششی آبشش بود. در مجموع، نتایج ما نشان میدهد که افزودن مکمل زنیان در رژیم غذایی میتواند ضمن بهبود عملکرد رشد، بهعنوان یک استراتژی دفاعی در کاهش اثرات سمیت مس در بچه ماهی کپور معمولی مورد استفاده قرار گیرد.
واژه های کلیدی: زنیان، ایمنی، سولفات مس، هیپرپلازی، کورتیزول، ماهی کپور معمولی
* نویسنده مسئول، پست الکترونیکی: s.farhangi@yahoo.com
مقدمه
ماهی کپورمعمولی (Common Carp) با نام علمی Cyprinus Capio متعلق به خانواده کپور ماهیان است. در ایران این ماهی با روش متراکم به صورت تک گونه در استخرهای بتنی و فایبرگلاس و چند گونهایی در استخرهای خاکی همراه با کپور ماهیان چینی پرورش داده می شود. این گونه به مقاومت در برابر تنشهای محیطی از سهولت زیادی جهت پرورش نسبت به سایر ماهیان برخوردار است. مقاومسازی و تقویت آبزیان در برابر استرسهای محیطی یکی از اهداف مهم صنعت آبزیان است که با افزودن محرکهای ایمنی در جیره غذایی تحقق مییابد. از اینرو برای بهبود رشد و تقویت سلامت آبزیان و همچنین افزایش دوره بازماندگی آبزی در پرورش آبزیان و به لحاظ مدیریت بهینه میتوان از محرکهای ایمنی استفاده نمود (8). استفاده از گیاهان دارویی در جیره غذایی آبزیان بهمنظور بهبود رشد، تقویت سیستم ایمنی و وضعیت آنتیاکسیدانی ماهی در برابر انواع استرسهای محیطی مورد توجه بسیاری از محققین قرارگرفته است (30، 34و 53). یکی از انواع موثر گیاهان دارویی گیاه زنیان است. گیاه زنیان با نام علمی (Trachys permum) از تیره چتریان (Apiaceae) است که در کشورهای هند، ایران و مصر به صورت طبیعی میروید. زنیان گیاهی است، یک ساله که قسمت مورد استفاده آن، بهدلیل ماده موثره آن (تیمول) در طب سنتی و صنعت دام، طیور و آبزیان بهعنوان ضدتهوع، ضدنفخ، مقوی معده، کاهش دهنده کلسترل خون و تسکین دهنده اسپاسم به کار میرود (4و 18). در خصوص استفاده از زنیان در تغذیه ماهی و سایر موجودات (5، 11، 16، 17، 22، 40و 45). اثرات سمیت مس در ماهی (9، 13، 15) و در معرض قرارگیری آبزیان با سموم کشاورزی و نقش تقویتی مکملهای غذایی در بهبود اثرات ناشی از سمیت (1، 14و 46) مطالعاتی صورت گرفته است که هرکدام به موضوع مشخصی اشاره دارد، لکن اثرات مقاومسازی و ایمنی زنیان در مواجهه با سموم بهوِیژه سولفاتمس مطالعهای یافت نشده است. از آنجا که مطالعات خونشناسی و بافتشناسی اطلاعات مفیدی را در رابطه با سلامت ماهی ارایه میدهد و با توجه به نتایج مثبت استفاده از مکملهای گیاهی در جیره غذایی آبزیان بهخصوص گیاه زنیان، سبب شد تا در مطالعه فوق، به ارزیابی گیاه زنیان بر میزان افزایش مقاومت ماهی کپور معمولی (Cyprinus carpio) درمواجهه با سولفات مس از طریق بررسی تغییرات شاخصهای خونی و ضایعات ایجاد شده در اندامهای هدف (آبشش، کبد و کلیه) پرداخته شود.
مواد و روشها
تهیه ماهی و شرایط آزمایشگاه: 200 قطعه ماهی کپورمعمولی با میانگین وزنی 46/0± 89/9 گرم از مرکز تولید و پرورش ماهیان گرمابی استان گلستان (سد وشمگیر) تهیه و به آزمایشگاه آبزیپروری دانشگاه گنبدکاووس منتقل شدند. ماهیان بهمدت 10 روز با شرایط محیط سازگار شدند. تعداد 15 قطعه در مخازن 35 لیتری با آب کلرزدایی شده و دمای بین 22 تا 24 درجه سانتیگراد و دوره نوری 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی جایابی شدند.
عملکرد رشد و تغذیه: پایان دوره آزمایش (8 هفته) و بهمنظور بررسی عملکرد جیرههای آزمایشی حاوی مکمل زنیان بر رشد ماهی، پارامترهای افزایش وزن بدن(WG)، افزایش طولبدن (FL)، ضریب تبدیلغذایی (FCR) ، شاخص وضعیت (CF)، نرخ رشد ویژه (SGR)، کارآیی تبدیلغذایی (FCE)، نسبت کارآییپروتین (PER)، و درصد بازماندگی (SR) براساس فرمولهای ارایه شده توسط واحدی و همکاران (19) اندازهگیری شدند:
SGR% = [LnWt2– LnWt1 / t2–t1] ×100
FCR = g dry feed eaten / g live weight gain
FCE% = [g live weight gain / g Dry feed eaten] ×100
PER = g live weight gain / g protein intake
WG (g) = Wf-Wi; Wf and Wi are final and initial body weights
Survival rate = (final number of fish / initial number of fish) × 100
گیاه زنیان: گیاه زنیان از عطاری تهیه و عصاره هیدروالکی از آنها تهیه شد. بدین منظور زنیان در مخلوط آب مقطر و اتانول 96 درصد به نسبت 20 به 80 مخلوط و بهمدت 72 ساعت بر روی دستگاه شیکر قرار داده شده و سپس محتویات با عبور از کاغذ صافی در دستگاه روتاری در دمای حدود 40 درجه سانتیگراد تغلیظ شدند. عصاره تهیه شده در ظروف شیشهای تیره رنگ تا زمان استفاده در یخچال با دمای 4- درجهسانتیگراد نگهداری شدند. مهمترین ترکیبات موجود در گیاه زنیان مورد مطالعه تیمول، سیمن، آلفا پینن، دی پینن، گاماترپنین، بتاپینن، میرسن و کارواکرول میباشد، که به دلیل ساختار فنولی میتوانند جایگزین موثری برای آنتی اکسیدانهای سنتزی باشند (24).
تیمارهای آزمایشی: ماهیان در طول دوره آزمایش از غذای آغازین (SFC) شرکت فرادانه حاوی پروتئین خام 41-38 درصد، چربی خام 8-4 درصد، فیبرخام 6-3 درصد، خاکستر 11-7 درصد، رطوبت 11-5 درصد و فسفر 5/1-1 درصد با قطر 2 میلیمتر بهمدت 60 روز بهمیزان 3 درصد وزن بدن در در 3 وعده (صبح، ظهر و عصر) تغذیه شدند. ابتدا غذای ماهی کپور با آسیاب پودر شده و سپس برای 4 تیمار آزمایشی (هریک با 3 تکرار) بطور مجزا مقادیر 0، 5/0، 1 و 5/1 درصد عصاره زنیان بترتیب TA0 (گروه شاهد بدون هیچگونه افزودن عصاره)، TA0.5، TA1 و TA1.5 افزوده شد. برای تثبیت عصاره به غذا از محلول ژلاتین 5 درصد استفاده شد (38).
آزمون مواجهه با سولفاتمس: پایان دوره آزمایش و بهمنظور بررسی میزان مقاومت ماهی کپورمعمولی در مواجهه با سولفاتمس، ماهیان (15 قطعه در هر تیمار) به مدت 96 ساعت تحت غلظت 1/0 میلیگرم سولفاتمس قرارگرفتند. غلظت موردنظر براساس حداقل غلظت موثر (LOEC, Lowest Observed Effect Concentration) که برابر LC10, 96h از سولفاتمس است بهدست آمده است و آن غلظتی است که در آن هیچگونه تلفاتی مشاهده نمیشود (13). آزمایشها با استفاده از روش آبساکن (Water Static Method) و براساس دستورالعمل استاندارد O.E.C.D. صورت گرفت (52). برای تعیین غلظتهای سولفاتمس، پس از تعیین حجم آب به ازای واحد حجمی، سولفاتمس توزین و به آب اضافه گردید. برای حل کردن سولفاتمس در آب حوضچه، ابتدا آنرا در بشر حل و سپس محلول حاصله به آب اضافه گردید تا محلول یکنواختی بدست آید (13). تظاهرات ماهی در معرض سولفاتمس درطول آزمایشات ثبت گردید. درصد تلفات و علایم مسمومیت ثبت گردید. شرایط آزمایش از نظر دما و pHبرای تمام نمونهها در طول آزمایش ثابت درنظر گرفته شد. در این مرحله غذادهی قطع شده بود. پس از انجام آزمون سمیت و بهمنظور بررسی ضایعات ناشی از سمیتمس بر بافتهای ماهی، از هر تیمار و بهصورت تصادفی 3 نمونه ماهی صید و در محلول فرمالین 10 درصد قرار داده شدند تا به آزمایشگاه پاتوبیولوژی انتقال و مقاطع بافتی به روش مرسوم تهیه شود. در نهایت مطالعات بافتی به کمک کلیدهای شناسایی و میکروسکوپ نوری صورت گرفت (48).
بررسی ایمنی موکوس: بعد از 96 ساعت استرس با سولفاتمس، بهمنظور بررسی شاخصهای ایمنی ماهیان کپور تغذیه شده با زنیان، جمعآوری مستقیم موکوس بر اساس روش Guardiola و همکاران (32) انجام شد. بدین منظور از هر تکرار حدود 7 الی 8 ماهی بهطور تصادفی صید و در زمان کمتر از 2 دقیقه با ماساژ سطح بدن ماهی، موکوسگیری انجام شد. دراین روش سرعت نمونهبرداری و عدم آسیب به پوست و اندامهای داخلی حائز اهمیت است. سپس نمونهها در میکروتیوپ 2 میلیلیتری ذخیرهسازی و برای سنجش ایمنی موکوس در دمای 80- درجه سانتیگراد تحت فریزر در آزمایشگاه مرکزی دانشگاه گنبدکاووس نگهداری شدند. نهایتاً موکوس توسط دستگاه سانتریفیوژ بهمدت 10 دقیقه با دور 3000 در دمای 4 درجهسانتیگراد انجام شد. فعالیت پروتئازی موکوس براساس روش هیدرولیز آزوکازئین ارائه شده توسط Palaksha و همکاران (43)، آنزیم لیزوزیم به روش کدورتسنجی با استفاده از دستگاه اسپکتوفتومتر (51)، ایمنوگلبولینکل (IgM) به روش ارائه شده توسط Siwicki وAnderson (50)، فعالیت آنزیم فسفاتاز قلیایی توسط کیت تجاری شرکت پارسآزمون و با استفاده از دستگاه اسپکتوفتومتر اندازهگیری شد (48).
آسیبشناسی بافتی: پایان دوره استرس با سم مس تعداد 9 قطعه ماهی از هر تیمار (3 ماهی از هر تکرار) بهطور تصادفی صید و بعد از جداسازی آبشش در فرمالین 10 درصد فیکس شد. نمونهها بعد از سه بار شستشو در محلول سرم فیزیولوژی در فرمالین ۱۰ درصد قرار گرفته و جهت انجام مراحل معمول پایدارسازی و مقطعگیری به آزمایشگاه بافتشناسی منتقل گردید. مقاطع تهیه شده در مرحله بعد جهت مطالعه بافتشناسی مورد رنگآمیزیهای معمول هماتوکسیلین و ائوزین گرفتند (27). در روش رنگآمیزی هماتوکسیلین و ائوزین به ترتیب خارج کردن پارافین موجود در مقاطع و آبدهی آنها، قرار دادن اسلایدها در رنگ هماتوکسیلین به مدت ده دقیقه، گذراندن از آب مقطر و متعاقباً قرار دادن در محلول اسیدهیدروکلریک ۱ درصد و اتانول ۷۰ درصد به مدت ۵ تا ۱۰ دقیقه، شستشو با جریان ملایم آب به مدت ۵ تا ۱۰ دقیقه، قرار دادن در ظرف ائوزین به مدت یک دقیقه، عملیات آبگیری، شفافسازی و چسباندن انجام گرفت (27).
آنالیز آماری: ابتدا نرمال بودن دادهها توسط آزمونهای Shapiro-Wilk مورد بررسی قرارگرفت. از آزمون تجزیه واریانس یکطرفه (One-Way ANOVA) برای مقایسه آماری تیمارها و از روش دانکن برای بررسی وجود یا عدم وجود اختلاف معنیدار بین میانگینها تیمارهای مختلف آزمایشی استفاده شدند (24). در آزمون های آماری سطح معنی دار 05/0 در نظر گرفته شد (05/0P<). برای آنالیز دادهها از نرم افزار Excel و محیط نرم افزار SPSS استفاده شد.
نتایج
نتایج حاصل از فاکتورهای رشد و تغذیهای: نتایج عملکرد رشد و تغذیه ماهی کپورمعمولی تغذیه شده با سطوح مختلف عصاره زنیان در جدول 1 ارائه شده است. ماهی کپور با وزن اولیه 46/0± 89/9 گرم در تیمارهای مختلف آزمایشی بطور تصادفی توزیع شدند. پایان دوره تغذیه، بیشترین وزن نهایی و ضریب چاقی در تیمار TA1 بدست آمد که با با تیمار شاهد اختلاف آماری معنیداری داشت (05/0> P). درصد افزایش وزن و نرخ رشد ویژه بین تیمارهای مختلف تغذیهای تفاوت آماری نداشت (05/0< P). ضریب تبدیل غذایی در تیمار شاهد در مقایسه با دیگر تیمارهای تغذیهای افزایش معنیدار آماری داشت (05/0> P). کارایی تبدیل غذا و کارایی تبدیل پروتئین بطور معنیداری در تیمارهای تغذیهای با عصاره زنیان در مقایسه با شاهد افزایش آماری داشت (05/0> P).
جدول 1- عملکرد رشد و تغذیه ماهی کپور معمولی تغذیه شده با سطوح مختلف عصاره زنیان
|
|
تیمارهای آزمایشی (درصد به ازای کیلوگرم غذایی پایه) |
|
||
|
|
شاهد |
TA 0.5 |
TA1 |
TA1.5 |
|
وزن اولیه (گرم) |
41/0± 72/9 |
50/0± 80/9 |
55/0± 13/10 |
38/0± 93/9 |
|
وزن نهایی (گرم) |
b76/0± 33/17 |
ab09/1± 49/18 |
a99/0± 71/18 |
ab76/0± 03/18 |
|
افزایش وزن (گرم) |
05/1± 61/7 |
86/0± 69/8 |
73/0± 57/8 |
48/0± 10/8 |
|
درصد افزایش وزن |
62/13± 66/78 |
06/9± 73/88 |
10/8± 71/84 |
18/4± 55/81 |
|
نرخ رشد ویژه (درصد/روز) |
12/0± 96/0 |
07/0± 05/1 |
07/0± 02/1 |
03/0± 99/0 |
|
ضریب چاقی (%) |
b03/0± 26/1 |
ab01/0± 29/1 |
a05/0± 31/1 |
ab02/0± 25/1 |
|
ضریب تبدیل غذایی |
a30/0± 26/2 |
b17/0± 85/1 |
b15/0± 75/1 |
b11/0± 98/1 |
|
کارایی تبدیل غذا |
b18/6± 77/44 |
a38/5± 31/54 |
a87/4± 16/57 |
ab02/3± 63/50 |
|
کارایی تبدیل پروتئین |
b03/0± 25/0 |
a02/0± 28/0 |
a02/0± 28/0 |
a 01/0± 27/0 |
حروف نامشابه در هر ردیف نشان از اختلاف آماری معنیدار است (05/0P<)
نتایج حاصل از شاخص ایمنی ماهی در مواجهه با سولفاتمس: پاسخ ایمنی ماهی کپور معمولی مقاومسازی شده با عصاره زنیان در برابر استرس سولفاتمس (CuSO4) در شکل 1 آمده است. همانطوریکه در شکل دیده میشود، فعالیت لیزوزیم و کمپلمان 50 در تیمار TA1 افزایش معنیدار آماری در مقایسه با دیگر تیمارهای آزمایشی داشت (05/0 > P). مقدار پروتئین و پروتئاز در تیمارهای آزمایشی در مقایسه با تیمار شاهد افزایش معنیدار آماری داشت (05/0 > P). براساس نتایج بدست آمده بیشترین میزان پروتئاز در تیمار حاوی 5/0 درصد زنیان بدست آمد که با سایر تیمارها اختلاف معنی داری را نشان داد (05/0>P). تیمارهای حاوی 1 و 5/1 درصد زنیان اختلاف معنیداری را در مقدار پروتئاز نشان ندادند (05/0 < P).
شکل 1- پاسخ ایمنی ماهی کپور معمولی تغذیه شده با سطوح مختلف عصاره زنیان درمواجه با سولفاتمس (CuSO4). حروف نامشابه در هر ستون نشان از اختلاف آماری معنیدار است (05/0P<)
نتایج حاصل از شاخصهای استرسی ماهی در مواجهه با سولفاتمس: شاخصهای استرس (کلوگز و کورتیزول) در شکل 2 آورده شده است. بیشترین مقدار غلظت گلوکز و کورتیزول در تیمار شاهد بدست آمد درحالیکه مقادیر این فاکتورها در تیمارهای آزمایشی کاهش معنیدار آماری داشت (05/0 >P). غلظت گلوکز و کورتیزول در تیمارهای شاهد بیشترین میزان را داشتند که از نظر آماری معنی دار بود (05/0 >P). کمترین میزان گلوکز و کورتیزول به ترتیب مربوط به تیمارهای حاوی 1و 5/0 درصد زنیان بودند. غلظت گلوکز و کورتیزول در تیمارهای TA1 و TA1.5 از نظر آماری اختلاف معنیداری را نشان ندادند (05/0 < P)، هرچند که با شاهد اختلاف معنیداری داشتند (05/0>P).
شکل 2- شاخصهای استرس ماهی کپورمعمولی تغذیه شده با سطوح مختلف عصاره زنیان درمواجه با سولفاتمس (CuSO4). حروف نامشابه در هر ستون نشان از اختلاف آماری معنیدار است (05/0P<)
نتایج حاصل از مطالعات بافتشناسی: پس از در معرض قرارگیری ماهیان تغذیه شده با مکمل زنیان با سولفاتمس به مدت 96 ساعت، در تمامی تیمارهای آزمایشی علائم مسمومیت ناشی از سم مس به صورت خونریزی، پرخونی (آبشش و کلیه)، چماغی شدن راس رشتههای آبششی، ادم (آبشش) ظاهر شدند (شکلهای3 الی 5). گرچه مطالعه حاضر نشان داد که تمامی ظایعات ناشی از مسمومیت در تمامی تیمارها مشاهده شده است، با این حال در تیمارهای آزمایشی تغذیه شده با زنیان ضایعات رخ داده شده به نسبت گروه شاهد از شدت کمتری برخوردار بوده است (جدول 2). عمده ضایعات دیده شده در اندام کلیه ماهی نیز به شکل تخریب مجاری کلیوی، اتساع کپسول بومن و به میزان زیاد سلولهای آماسی مشاهده شد. در کبدماهیان، تجمع و نفوذ سلولهای آماسی دیده شد.
جدول 2- عمده ضایعات ایجاد شده در ماهیان تغذیه شده با زنیان در مواجهه با سولفاتمس بعد از 96 ساعت
الف- آبشش
|
تیمارهای آزمایشی (برحسب درصد به ازای کیلوگرم وزن غذا) |
ادم |
خونریزی |
پرخونی |
اتساع لاملاهای ثانویه |
نکروز سلولهای پوششی آبشش |
هیپرپلازی
|
|
TA0 |
++ |
++ |
++ |
+++ |
++ |
+++ |
|
TA0.5 |
++ |
++ |
++ |
+++ |
++ |
+++ |
|
TA1 |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
|
TA1.5 |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
ب- کلیه
|
تیمارهای آزمایشی (برحسب درصد به ازای کیلوگرم وزن غذا) |
نکروز لوله های کلیوی |
خونریزی |
پرخونی |
نفوذ سلولهای آماسی |
|
TA0 |
+ |
+ |
+ |
++ |
|
TA0.5 |
+ |
+ |
+ |
++ |
|
TA1 |
- |
- |
- |
+ |
|
TA1.5 |
- |
- |
- |
+ |
ج- کبد
|
تیمارهای آزمایشی (برحسب درصد به ازای کیلوگرم وزن غذا) |
نکروز سلولهای کبدی |
خونریزی |
پرخونی |
نفوذ سلولهای آماسی |
|
TA0 |
- |
- |
+ |
++ |
|
TA0.5 |
- |
- |
|
+ |
|
TA1 |
- |
- |
- |
+ |
|
TA1.5 |
- |
- |
- |
+ |
بدون علائم مسمومیت(-)، بالای 20 درصد ضایعه (+)، 60-20 درصد ضایعه (++)، بالای 60 درصد ضایعه (+++)
شکل3- مقطع بافتی تهیه شده از آبشش درمعرض سولفاتمس (رنگآمیزی، هماتوکسیلین – ائوزین، بزرگنمایی 400)
A1: آبشش گروه شاهد تغذیه شده با جیره پایه، نوک پیکانها پرخونی لاملاهای ثانویه (a) ، ادم و جداشدگی اپیتلیوم پوششی لاملاهای ثانویه (b) ، هایپرپلازی قاعده لاملاهای ثانویه (c)، A4: آبشش تیمار TA1.5 تغذیه شده با زنیان، نوک پیکانها پرخونی لاملاهای ثانویه (a)، ادم و جداشدگی اپیتلیوم پوششی لاملاهای ثانویه (b)، هایپرپلازی قاعده لاملاهای ثانویه (c)
شکل 4- مقطع بافتی تهیه شده از کلیه ماهی درمعرض سولفاتمس، (رنگآمیزی، هماتوکسیلین – ائوزین، بزرگنمایی 400)
B1: کلیه شاهد (تغذیه شده با جیره پایه)، نوک پیکانها مجاری کلیوی نرمال (a) تجمع ملانوماکروفاژها (b)، را نشان میدهد
B3: کلیه تیمار TA1 تغذیه شده با زنیان، نوک پیکانها توبولهای کلیوی نرمال (a) تجمع ملانوماکروفاژها (b) ،
شکل 5- مقطع بافتی تهیه شده از کبد ماهی درمعرض سولفاتمس، (رنگآمیزی، هماتوکسیلین – ائوزین، بزرگنمایی 400)
C1: کبد ماهیان شاهد تغذیه شده با جیره پایه، نوک پیکانها هپاتوسیتهای نرمال (a) سیاهرگ مرکزی (b)، را نشان میدهد
C2: کبد ماهیان تیمار P2 تغذیه شده با زنیان، نوک پیکانها هپاتوسیتهای نرمال (a) سیاهرگ مرکزی (b)، را نشان میدهد.
بحث و نتیجه گیری
امروزه کم وبیش ثابت شده است که استفاده از مکملهای غذایی نقش موثری در بهبود عملکرد رشد و کاهش تلفات در دوره پرورش دارد (8، 19و 28). مطالعات Gibson و Roberfroid (29) ثابت کرده است که استفاده از باکتریهای لاکتوباسیلوس و بیفیدوباکترها، از طریق تخمیر و استفاده از ترکیبات سلولزی، سبب بهبود تعادل میکروبی دستگاه گوارش و متعاقب آن عملکرد بهتر رشد میشود. آنچه مشخص است، تحریک سیستم ایمنی توسط برخی گیاهان و ترکیبات آنها موجب گردیده است تا جهت بهره گیری از این ویژگیها در آبزیپروری مورد استفاده قرار گیرند. سهولت دسترسی، قیمت مناسب، قابلیت سازگاری با ساز و کار فیزیولوژیک بدن جانوران و فعالیت در برابر طیف وسیعی از عوامل بیماری زا بر مزیت استفاده از گیاهان و ترکیبات محرک ایمنی آنها می افزاید (11). زنیان از جمله این گیاهان دارویی است. براساس نتایج حاضر، زنیان قادر بود، افزایش معنیداری را در فاکتورهای رشد و تغذیهای ایجاد کند (جدول 1) (05/0>P). مطالعه فوق نشان داد که افزایش وزن در گروههای تغذیه شده با جیره حاوی زنیان نسبت به گروه شاهد بیشتر بود (05/0 > P)، هرچند در تیمارهای حاوی مقادیر مختلف زنیان اختلاف معنیداری دیده نشد(05/0P>). در واقع بدان معنی است، با وجود عملکرد مثبت زنیان بر رشد و تغذیه، میزان استفاده از آن چندان تفاوتی نداشته است و شاید لازم باشد تا از مقادیر بیشتر زنیان استفاده گردد. بهرحال، گزارش عملکرد مثبت مکملهای گیاهی توسط محققان مختلف، با مطالعه حاضر همخوانی دارد. نادریفارسانی و همکاران (17) به مطالعه تأثیر عصاره الکلی گیاه زنیان (Trachyspermum ammi L) بر عملکرد رشد، فراسنجههای خونی و ایمنی ماهی قزلآلای رنگینکمان (Oncorhynchus mykiss) پرداختند. آنها بیان کردند، در گروه ماهیانی که 5/2 درصد عصاره زنیان دریافت کرده بودند، شاخصهای رشد مانند افزایش وزن، نرخ رشدویژه، وزن نهایی و شاخص وضعیت نسبت به گروه شاهد به طور معنیداری بالاتر بود (۰/۰۵>P). بنظر میرسد، افزودنیهای مجاز(مکملهای غذایی) با بهبود فلور میکروبی روده و کاهش رقابت برای موادغذایی بین میزبان و میکروارگانیسمهای روده، سبب افزایش وزن بدن و بهبود ضریب تبدیلغذایی میشود (49). شاید دلیل عملکرد مثبت زنیان در بهبود فاکتورهای رشد و تغذیه نیز همان باشد، ضمن آنکه مطالعات عملکرد مثبت زنیان را بر رشد نتیجهای از ماده موثره آن (تیمول) میداند. تیمول ضدتهوع، ضذباکتری، ضدنفخ، مقوی معده، کاهش دهنده کلسترل خون و تسکین دهنده اسپاسم می باشد به همین خاطر میتواند سبب بهبود رشد وتغذیه گردد (4و 18). عزیزخانی و توریان (10) اثرات اسانس زنیان ( Carum copticum) را بر رشد و بیان ژنی آنتروتوکسینهای A وC باکتری Staphylococcus aureus در سوریمی ماهی کیلکا (Clupeonella cultriventris caspia) بررسی کردند و بیان کردند، حداقل غلظت بازدارنده رشد و حداکثر غلظت قابل تحمل برای باکتری در محیط کشت مایع بهترتیب معادل 6/0 و 15/0 درصد بود. آنها همچنین بیان کردند، بیشترین تأثیر بازدارندگی در برابر بیان ژن انتروتوکسینها در غلظت 1 درصد اسانس بود. همچنین تأثیر بازدارندگی غلظتهای مختلف اسانس بر بیان ژنی آنتروتوکسین C بیشتر از آنتروتوکسین A بود. بهطور کلی نتایج آنها نشان دهنده علمکرد مثبت اسانس زنیان در کاهش سرعت رشد باکتری Staphylococcus aureus و کاهش تولید آنتروتوکسینهای ناشی از آن در سوریمی ماهی کیلکا بوده است (49). در سیستمهای پرورشی، یکی از راهکارهای افزایش رشد و بازده محصول، کاهش استرس میباشد. این امر، میزان مقاومت ماهی را در برابر انواع بیماریها نیز افزایش میدهد. با وجود اثربخشی مکملهای گیاهی در افزایش رشد و تغذیه ماهی، و همچنین بهبود سیستم ایمنی، عملکرد واقعی آنها در مواجهه با تنشهای محیطی بهویژه سموم فلزی کمتر مورد توجه بوده است. پایان دوره تغذیه ماهی و مواجهه شدن ماهی با سولفاتمس افزایش در سطح کورتیزول و گلوکز موکوس در تیمار شاهد دیده شد، این درحالی است که ماهیان تغذیه شده با زنیان با کاهش سطح کورتیزول همراه بودند که با گروه شاهد تفاوت معنیداری داشتند. کمترین سطح گلوگز و کورتیزول مترشحه بهترتیب مربوط به تیمار 1 و 5/0 درصد از زنیان بود که اختلاف معنیداری با شاهد و دیگر تیمارها داشتند (05/0 >P). طبیعتاً در معرض قرارگیری ماهیان بعد از یک دوره تغذیه با زنیان، سبب استرس در ماهیان شده است که افزایش میزان گلوکز و کورتیزول موید این امراست، بااین وجود کاهش سطوح گلوکز و کورتیزول نسبت به گروه شاهد، عملکرد مثبت زنیان را در مواجهه با استرس سولفاتمس بخوبی نشان میدهد. در مطالعهای که توسط بیرامی و همکاران (2) پس از یک دوره تغذیه ماهی کلمهخزری (Rutilus caspius) با پودر زنجبیل(Zingiber officinale) صورت گرفت، غلظت آلکالین فسفاتاز بطور معنیداری در تیمار شاهد افزایش داشت. در عین حال، پس از در معرض قرارگیری با استرس شوری، غلظت این آنزیم در تیمار شاهد به بیشترین حد و در تیمار Z20 (20گرم زنجبیل در کیلوگرم غذا) به کمترین حد خود رسید. این امر اثربخشی مکملهای غذایی مورد استفاده را بر کاهش سطح استرس ماهیان بیان میکند (10). بطورکلی استرسهای محیطی موجب مجموعهای از پاسخ های فیزیولوژیکی می شود که باتوجه به میزان آن فعالیتهای حیاتی موجود (از جمله رشد، تولیدمثل، ایمنی و بازماندگی) را تحت تأثیر قرار میدهد (7). بررسی فاکتورهای ایمنی میتواند میزان استرس وارده را نشان دهد. یکی از مهمترین فاکتورهای سرمی خون مرتبط با ایمنی غیراختصاصی ماهی بررسی فعالیت لیزوزیم است که در درک بهتر وضعیت ایمنی میتواند به ما کمک شایانی نماید، چرا که افزایش لیزوزیم در بدن نشان از عملکرد مناسب سیستم ایمنی ماهی است (24). نتایج مطالعه حاضر نشان داد که استفاده از زنیان باعث افزایش میزان فعالیت آنزیم لیزوزیم در بچه ماهیان کپور شد، با این حال بیشترین میزان بدست آمده در تیمار 1درصد زنیان به ازای هر کیلوگرم غذا و کمترین میزان در گروه شاهد بود. براساس دادههای محققین، افزایش میزان فعالیت آنزیم لیزوزیم و پروتئین کمپلمان سرم نشان دهنده، تقویت سیستم ایمنی ماهی میباشد و این افزایش را میتوان احتمالاً نتیجه قدرت تحریکپذیری مواد مؤثره موجود در مکمل های گیاهی دانست (6). جعفریان و همکاران (3) با بررسی کارایی استفاده از پریبیوتیک سانیار در محیط بایوفالک بر عملکـرد تولید، ترکیبات نیتروژنی آب، فراسنجههای خونشناسی و سوخت و ساز ماهی کپورمعمولی نشان دادند، استفاده از مکمل غذایی سانیار ضمن بهبود فاکتورهای رشد و تغذیهای ماهی، توانسته است اثر معنیداری بر شاخصهای خونی ماهی داشته باشد (6). Rezaei و همکاران (44) عملکرد پودرسیر را بر فاکتورهای ایمنی و آنزیمهای گوارشی لابستر (Postantacus leptodactylus) مورد بررسی قرار دادند. آنها بیان کردند، افزودن 2 درصد پودر سیر به جیره لابستر سبب افزایش معنیداری فاکتورهای رشد و ایمنی آن میشود. آنها همچنین عملکرد مثبت سیر را در بهبود سیستم ایمنی و آنتی اکسیدانی ثابت کرده و نشان دادند، با افزایش غلظت مکمل گیاهی سیر به جیره میزان لیزوزیم نیز به همان نسبت افزایش مییابد (3). نادریفارسانی و همکاران (17) در تحقیقات خود نشان دادند، عصاره زنیان فعالیت لیزوزیم و کمپلمان را بهطور معنیداری بهبود میبخشد و از این طریق باعث تقویت سیستم ایمنی ماهی شده است (17). در مطالعه حاضر، پس از در معرض قرارگیری ماهیان تغذیه شده با زنیان با سولفاتمس، کاهش سطح ایمنی (لیزوزیم، کمپلمان 50 و پروتیئنکل) و افزایش فاکتورهای استرس (گلوکز و کوزتیزول) دیده شد. این امر موید عملکرد یک فاکتور استرسزا همچون مس است. نتایج فوق با مطالعه Kreutz و همکاران (38) همخوانی دارد. آنها اثرات علفکش گلایفوزیت را بر روی گربه ماهی نقرهای (Rhamdia quelen) بررسی کرده و نشان دادند، حضور 10 درصد دوز کشنده (96 ساعته) سم گلایفوزیت در محیط آزمایش سبب کاهش معنیدار مقدار فعالیت لیزوزیم شده است (46). با وجود تغییرات صورت گرفته در تیمارهای مورد آزمایش، شدت تغییرات در تیمارهای مختلف زنیان از شرایط بهتری برخوردار بودند، بطوریکه کاهش سطوح لیزوزیم و کمپلمان 50 در تیمارهای حاوی زنیان بهمراتب کمتر از شاهد بود. این امر بیانگر مثبت مکمل گیاهی زنیان در افزایش سطح ایمنی ماهی در مواجهه با شرایط استرسزا است. نتایج حاضر با مطالعات بدست آمده در خصوص استفاده از انواع مکملهای گیاهی و عملکردشان در بهبود سیستم ایمنی همخوانی دارد. ایری و همکاران (1) تأثیر سطوح مختلف پریبیوتیک همزاد قارچ صدفی بر شاخصهای ایمنی موکوس ماهی تیلاپیا نیل (Oreochromis niloticus) در مواجهه با سم کلرپیریفوس در شرایط آزمایشگاهی را بررسی کردند. آنها بیان کردند، میزان فسفاتاز قلیایی، آنزیم لیزوزیم و پروتئین محلول موکوس در اثر تیمارهای تغذیه شده با پریبیوتیک و با افزایش غلظت پریبیوتیک، به طور معنیداری (05/0< P) افزایش داشت (1). Komar (37) اثرات حفاظتی پریبیوتیک بر حشرهکش فیپرونیل را در ماهی کپورمعمولی (Cyprinus carpio) بررسی کرد. براساس نتیجه فوق، افزودن پریبیوتیک علاوه بر تغییرات معنیداری در شاخصهای تغذیهای، استرس ناشی از مواجهه با حشرهکش کاهش معنیداری داشت (37). Farhangi و همکاران (28) به بررسی اثرات تغذیهای عصاره سیر در مقاومت ماهی قزلآلای رنگینکمان در مواجهه با استرس سولفاتمس پرداختند. آنها بیان کردند، جیره حاوی عصاره سیر توانست سبب بهبود سطوح لیزویم و کمپلمان 50 در مواجهه با استرس سولفاتمس شود (28). Raissy و همکاران (45) به بررسی اثرات سینرژتیک سه گیاه دارویی Mentha longifolia، Trachyspermum copticum و Thymus carmanicus بر رشد، بهرهگیری تغذیه و ژن کاربردی ایمنی در ماهی قزلآلای رنگینکمان بیان کردند که ترکیب مخلوط یک درصد مکملهای گیاهی مورد استفاده بهترین عملکرد را در رشد و پاسخ ایمنی ماهی دارد (45).Ali و همکاران (22) اثرات ویتامین E ، سلنیوم و گیاهان دارویی ماشروم و زنیان را بر رشد و فعالیت لیزوزوم در ماهی قزلآلای رنگینکمان مورد ارزیابی قرار دادند. آنها بیان کردند سطوح یک درصد مکملهای ویتامینه و گیاهان دارویی ماشروم و زنیان بهترین عملکرد را در رشد و فعالیت لیزوزیم داشتند. بهعبارت دیگر زنیان توانست ایمنی غیراختصاصی ماهی را بهبود ببخشد (22). بطورکلی مکملهای گیاهی دارای اثرات تحریک ایمنی میباشند. در واقع باعث تقویت تولید آنتیبادی در ماهی شده و از این طریق مقاومت و ایمنی ماهیان در مواجهه با استرسهای محیطی افزایش مییابد (22). آزمونهای سمیت روشی است که حساسیت ارگانیزمها را به یک سم خاص نشان میدهد و از این طریق به ما کمک میکند تا حدقابل قبول ماده سمی در محیط تعیین شود. در واقع بهعنوان یک شاخص مناسب جهت بررسی اثرات کوتاه مدت آلایندهها و همچنین یک مقایسه ساده بین مقدار اثرات مختلف آلایندهها بر ماهی و میزان حساسیت ماهی استفاده میشود (41). در مطالعه حاضر علائم مسمومیت با مس در ماهیان گروه شاهد (بدون افزودن زنیان) به شکل خونریزی، پرخونی (آبشش و کلیه)، چماغی شدن راس رشتههای آبششی، ادم (آبشش) ظاهر شدند، که با یافته های بدست آمده توسط سایر محقیقن در مواجهه با سولفات مس مطابقت دارد (25و 28). آبشش اندام اصلی تنفس ماهیان میباشد. بنابراین وقتی به مدت طولانی در معرض آلایندههای محیطی قرار میگیرند، دچار تخریب و آشکاری عوارض مختلف میشوند. آسیبهای آبششی میتوانند به علت پاسخ عمومی به تحریکات یا برای سازش باشد که بر تبادلات گازی تأثیر میگذارد و در حالتهای شدیدتر منجر به چسبیدگی دوتیغه مجاور و مرگ ماهیان میشود. مسمومیت ناشی از فلزات سنگین مانند سولفاتمس ممکن است به علت ایجاد نقص در اعمال سلولی یا تداخل متقابل با ساختمانهای سلولی باشد (9). معمولاً سولفاتمس در مزارع برای کنترل بیماریها و کنترل حلزونها و جلبکها بکار میرود، هرچند غلظت استفاده شده در این خصوص برای ماهیان کشنده نیست، اما به این معنی نیست که در ماهیان ایجاد عارضه مسمومیت نکند. لذا استفاده از روشهایی که بتواند کمترین عارضه را ایجاد کند، میتواند بهترین شیوه مدیریت مزارع بحساب آید. دراین خصوص تغذیه با مکملهای گیاهی بهوِیژه زنیان میتواند موثر باشد. همانطوریکه مطالعه حاضر ثابت کرد، در تمامی گروههای مورد آزمایش علائم به میزان کم و بیش مشاهده گردید، بااین حال در تیمارهای تغذیه شده با مکمل زنیان، ضایعات از شدت کمتری (بهخصوص در کبد و کلیه) برخوردار بود. این امر موید عملکرد خوب زنیان در کاهش عوارض ناشی از مسمومیت با مس است. نتایج حاضر با مطالعات سایر محققین همخوانی دارد، به عنوان مثال قاسمی و همکاران (14) به بررسی اثرات تغذیهای زردچوبه بر کاهش آسیبهای کبدی و کلیوی ناشی از مواجهه با سولفاتمس در ماهی کپور پرداختند. آنها بیان کردند، استفاده از مقادیر 5/0 تا 2 درصد زردچوبه خوراکی در تغذیه ماهی، میتواند سبب کاهش محسوسی در بافت کبد در مواجهه با سولفاتمس شود (14). Mokhbatly و همکاران (42) اثرات حفاظتی مکمل Spirulina platensis و β-glucan (BG) را در مواجهه با سم کلرپیروفوس در گربهماهی آفریقایی (Clarias gariepinus) بررسی کرده و بیان کردند ماهیانی که در مواجهه با سم قرار داشتند از فاکتورهای رشد و تغذیه ای کمتری نسبت به گروه شاهد برخوردار بودند، ضمن آنکه گرچه فاکتورهای خونی ماهیان تغذیه شده با مکملهای مورد استفاده از وضعیت بهتری برخوردار بودند، لکن آن مکملها نتوانست ضایعات ناشی از مسمومیت با حشرهکش را از بین ببرد و ضایعات ایجاد شده در تمامی گروههای مورد آزمایش دیده شد (25). Abdoو همکاران (21) اثرات حفاظتی ویتامین C را در مواجهه با سم کلروپیروفوس در ماهی تیلاپیا بررسی کردند. آنها بیان کردند، اثرات وارده بر ساختار آبشش، روده و کبد در ماهیان تغذیه شده با ویتامین C از شرایط بهتری برخوردار بودند (52). Abdelkhalek و همکاران (20) با مطالعه سمیت دیازینون در ماهیان تیلاپیا تعذیه شده با مکمل غذایی Spiurolina platensis نشان دادند، اولا دیازینون سبب بروز ضایعات در آبشش و کبد ماهی و همچنین سبب تغییرات در سرم خونی ماهیان شده و ثانیا مکمل غذایی مورد استفاده توانست اثر محافظتی مناسبی در مواجهه با سم دیازینون در کاهش آنزیمهای استرسی و آنتی اکسیدانی داشته باشد (20). Ghafari Farsani و همکاران (30) نتایج مشابهای را با ویتامین E در مواجهه نانوذره روی بدست آورند (30). Ibrahim (34) با مطالعه سمیت نانوذره نقره در ماهیان تیلاپیا تغذیه شده با سلنیوم بیان کرد، گرچه نانوذره نقره اثرات منفی بر فاکتورهای بیوشیمیایی خون دارد، لکن ماهیان تغذیه شده با نانوذره سلنیوم اثرات معنیدار کمتری در مواجهه بر نانوذره نقره بر فاکتورهای بیوشیمیایی خون داشتند (30). درمطالعهای دیگر Hajirezaeeو همکاران (33) اثرات حفاظتی ویتامین C در ماهی کپور معمولی Cyprinus carpioدر مواجهه با نانوذره تیتانیوم بررسی شد و مشخص شد، ویتامینC ضمن کاهش آنزیمهای استرسی، بر میزان ضایعات وارد شده بر بافت کبد در مواجهه با سمیت نانوذره تیتانیوم نیز اثرات کاهشی مثبتی داشته است (33). در مجموع، نتایج ما نشان میدهد که افزودن مکمل زنیان در رژیم غذایی میتواند بهعنوان یک استراتژی دفاعی مورد استفاده قرار گیرد وضمن بهبود رشد وتغذیه ماهی، بسیاری از اثرات منفی قرارگرفتن در معرض انواع استرسهای محیطی بوِیژه سولفاتمس در بچه ماهی کپورمعمولی را کاهش دهد.
سپاسگزاری
این مقاله ماحصل پایان نامه دانشجویی کارشناسی ارشد دانشگاه گنبدکاوس می باشد. بدینوسیله نویسندگان مقاله از زحمات سرکار خانم دکتر قلیپور کنعانی، دکتر سید علی اکبر هدایتی که صمیمانه ما را در اجرای دقیق آزمایشات همراهی کردند نهایت سپاس و قدردانی را دارند.
مجله پژوهشهای جانوری (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)