Document Type : Research Paper
Abstract
Background and objectives: Liver failure and cholestasis are associated with progressive brain edema (astrocyte swelling), which underlies hepatic encephalopathy (HE). Aquaporin4 (AQP4) is the main water channel in the brain that has important role in water transport across blood- brain- barrier. It has been proved that intracranial pressure and also expression of AQP4 increase in brain edema. The aim of this study was to determine whether edema of cholestasis is associated with the brain aquaporin-4 (AQP4). Data assessedby analysis of variance (ANOVA) followed by post-hoc Tukey test. Methods: Male wistar rats (n = 30)were divided into three groups as control (nosurgery), sham (surgery without bile duct ligated) and cholestatic (surgery with bile duct ligated, BDL).After 2 weeks, expression of AQP4 in control, sham, and experimental groups were tested by immunohistochemistry. Results: AQP4 expression was significantly increased in BDL (p <0.05), but not control and sham groups(P<0.05). Increased brain water was observed in cholestasis compared to sham and control rats(P<0.05).Conclusion: These results indicate that increased AQP4 levels in choroid plexus in response to brain injury are likely critical to the development of brain oedema in cholestasis.
Keywords
Main Subjects
تأثیر کلستاز بر آکواپورین4 در شبکه کوروئید مغز موش صحرایی نر نژاد ویستار
شهربانو عریان1، محمد نبیونی2 و دلارام اسلیمی اصفهانی1*
1 تهران، دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی، گروه علوم جانوری
2 تهران، دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی، گروه علوم سلولی و مولکولی
تاریخ دریافت: 8/6/95 تاریخ پذیرش: 3/9/95
چکیده
نقص کبدی و کلستاز باعث هپاتیک آنسفالوپاتی و ادم مغزی پیشرفته میشود. آکواپورین 4 کانال اصلی انتقال آب در مغز است که نقش مهمی در انتقال آب از سد خونی- مغزی به عهده دارد. مشاهدهشده که فشار درون جمجمه و همچنین بیان آکواپورین 4 در هنگام ادم مغزی افزایش مییابد. هدف این مطالعه بررسی اثرکلستاز برفرایند ادم مغزی و نقش کانال آکواپورین 4 در این فراینداست. موشهای نر نژاد ویستار (30 عدد) به سه گروه کنترل (بدون جراحی)، شم (جراحی بدون بستن مجرای صفراوی) و کلستاتیک (بستن مجرای صفراوی) تقسیم شدند. بعد از دو هفته مقدار آکواپورین 4 در تمامی گروهها توسط روش ایمونوهیستوشیمی موردبررسی قرارگرفت. دادهها توسط واریانس یکطرفه با استفاده از نرمافزار SPSSتجزیه و تحلیل شدند. مقدار آکواپورین 4 در گروه کلستاتیک نسبت به گروههای کنترل و شم افزایش معنیدار نشان داد (05/0>P). افزایش آب مغز نیز در گروه کلستاتیک نسبت به گروههای کنترل و شم مشاهده شد (05/0>P). نتایج نشاندهنده افزایش مقدار آکواپورین 4 در شبکه کوروئید در پاسخ به آسیب مغزی است که احتمالاً در ادم مغزی در هنگام کلستاز نقش دارد.
واژههای کلیدی: کلستاز، آکواپورین 4، آنسفالوپاتی کبدی، شبکه کوروئید
* نویسنده مسئول، تلفن: 02188848940 ، پست الکترونیکی: eslimi@khu.ac.ir
مقدمه
تعادل آب یکی از مکانیسمهای بنیادی برای هومئوستاز در بدن است و آکواپورینها نقش مهمی در این زمینه ایفا میکنند (23). یکی از اعضاء این خانواده آکواپورین 4 است. این آکواپورین بهویژه در مغز بیشتر در غشای سلولهای آستروسیت و اپاندیمال، شبکه کوروئید، نواحی اسموسنسوری هیپوتالاموس و حاشیه پارانشیم مغزی مشاهده میشود. شبکه کوروئید همراه با سلولهای اپاندیمال وآستروسیتها در تبادل آب و تولید مایع مغزی- نخاعی دارای نقشاند (5و21). مشخصشدهآکواپورین 4 در سیتوپلاسم سلولهای اپیتلیال شبکه کوروئید وجود دارد. اما در مورد سلولهای اپاندیمال در غشاء قاعدهایی- جانبی مشاهده میشود. تحقیقات نشان میدهد آکواپورین 4 در ایجاد سد خونی- مغزی و چرخش مایع مغزی- نخاعی، همچنین در ایجاد اختلالات مربوط به مایع مغزی- نخاعی، ادم و هیدروسفالی نقش مهمی بر عهده دارد (5، 18،21 و23). علاوه بر این در مهاجرت سلولهای گلیال، بازجذب و رهایی پتاسیم بهوسیله آستروسیتها همچنین در آسیبشناسی ادم مغزی، حمله ناگهانی و تومورها نقش دارد (3). تنظیم طولانی مدتبیان آکواپورین 4 توسط هیپوکسی، تغییرات اسمولاریته، تولید آمونیاک و فاکتورهای رونویسی انجام میشود و تنظیم کوتاه مدت بیان با واسطه که اکثریت آنها با -G پروتئین جفت میشوند ، صورت میگیرد (9).
سندروم کلستاز ازنظر فیزیولوژیک به توقف یا کاهش جریان صفرا اطلاق میشود که میتواند به دلیل اختلال در تشکیل صفرا توسط هپاتوسیتها و سلولهای مجاری و یا به دلیل انسداد مجاری صفراوی و جریان ناقص صفرا ایجاد شود (25). این سندروم باعث تجمع صفرا در داخل خون و کاهش ترشح صفرا به داخل روده شده که درنهایت باعث ایجاد بیماری سیستمیک میشود. کلستاز باعث تجمع بیلیروبین، اسیدها و نمکهای صفراوی و کلسترول در خون میشود که در حالت عادی به درون صفرا ترشح میشوند. همچنین موجب افزایش تولید پروستاگلاندینها، نیتریک اکساید و اوپیوئیدهای درونزاد، اندوتوکسمی، هایپرآمونیا و ایجاد تغییرات عروقی میگردد (4،10، 11و22). کلستاز را اغلب میتوان از طریق بررسی سطح آنزیمهای کبدی شامل افزایش قابلتوجه در آلکالین فسفاتاز (ALP)، گاما گلوتامیل ترانس پپتیداز GGT))، آمینوترانسفرازهای آلانینو آسپارتات (ALT و AST)و بیلی روبین سرم تشخیص داد.
مطالعات نشان دادهاند که بیماریهای کبدی میتوانند بر عملکرد مغز تأثیر بگذارند. هپاتیک انسفالوپاتی (انسفالوپاتی کبدی) یک سندروم عصبی- روانیاست که در بیماریهای کبدی و کلستاتیک دیدهشده است و باعث تغییر در عملکرد و متابولیسم مغز و نیز تغییرات مورفولوژیک در این بیماران میگردد. این سندرم شامل اختلالات عصبی گستردهای بوده (8)، همچنین همراه با تورم آستروسیتها و ادم مغزی میباشد.گزارش شده است که در افراد بیمار، پیشرفت بیماری و ادم ممکن است در نهایت منجر به کاهش هوشیاری و کما شود (19).
تحقیقات نشان داده است که ادم مغزی به دو صورت وازوژنیک و سیتوتوکسیک وجود دارد. در ادم وازوژنیک که خارج سلولی است سد خونی- مغزی و اتصالات پیوسته سلولهای آندوتلیال دچار آسیب شده و مایع از عروق خونی نشت می کند. این مایع و پروتئینها به فضای خارج سلولی نفوذ میکنند. در ادم سیتوتوکسیک سد خونی- مغزی بدون تغییر باقی میماند اما اختلال در متابولیسم سلولی باعث اختلال در عملکرد پمپ سدیم- پتاسیم موجود در میشود که به احتباس سدیم و آب در آستروسیتها و ورم آنها منتهی میگردد (14و20). آنسفالوپاتی کبدی میتواند باعث ایجاد هر دو نوع ادم شود (8). مشخصشده که آکواپورین 4 در تشکیل ادمهای وازوژنیک و سیتوتوکسیک دارای نقش است (26).
به دلیل اینکه در هنگام کلستاز ادم مغزی مشاهده میشود (24) و آکواپورین 4 در ایجاد ادم دارای نقش است، در این تحقیق به بررسی تغییرات آکواپورین 4 در شبکه کوروئید بدنبال القای انسداد مجاری صفراوی پرداخته شد.
مواد و روشها
شرایط نگهداری حیوانات: این مطالعه در آزمایشگاه فیزیولوژی جانوری دانشکده علوم زیستی دانشگاه خوارزمی تهران انجام شد. در این مطالعه از موشهای صحرایی نر نژاد ویستار در محدوده وزنی 200 تا 250 گرم استفاده شد. حیوانات در شرایط محیطی (2 ±22 درجه سانتیگراد) و تنظیم نور بهصورت دورههای 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی نگهداری شدند. کلیه حیوانات دسترسی آزادانه به آب آشامیدنی و غذای مخصوص حیوانات آزمایشگاهی داشتند. تمام آزمایشات براساس موازین اخلاقی رفتار با حیوانات انجام شد که به تأیید کمیته اخلاقی دانشکده علوم زیستی دانشکده خوارزمی رسیده است.
گروههای مورد آزمایش و جراحی کلستاز: موشهای مورد آزمایش بهطور تصادفی به سه گروه شامل کنترل (بدون جراحی)، شم (جراحی بدون انسداد مجرای صفراوی) و کلستاتیک (جراحی همراه با انسداد مجرای صفراوی) تقسیم شدند. در گروه شم، جراحی بدون بستن مجرای صفراوی انجام شد و در گروه کلستاز، حیوانات تحت عمل جراحی قرارگرفته صفراوی آنها بسته شد (BDL- Bile Duct Ligation). پس از بیهوش کردن حیوانات توسط تزریق درون صفاقی کتامین هیدروکلراید 10% (50 میلیگرم/کیلوگرم) و زایلزین دو درصد (4 میلیگرم/کیلوگرم)، موهای ناحیه میانی شکم کاملاً تراشیده شده واز الکل٧٠ درجه برای ضدعفونی پوست شکم استفاده شد. سپس توسط چاقوی جراحی یک شکاف طولی بهاندازه ٣سانتیمتر درخط میانی شکم ایجاد شده و در دو مرحله پوست و عضلات جدار شکم باز شد. پس از یافتن مجرا، پنسی زیر آن قرارداده شد و با استفاده از نخسیلک چهارصفر درد و نقطه جداگانه با فاصله از هم گرهزده شده و پسازآن مجرا بریده شد. سپس جدار شکم در دولایه عضله و پوست با نخ سیلک دوختهشده و بعد از اتمام عمل جراحی، یک میلیلیتر سالین نرمال داخل صفاق تزریق شد. بعد از پایان کار، محل جراحی با الکل یا بتادین کاملاً ضدعفونیگردید. دوروز بعداز انجام عمل جراحی تغییر رنگ ادرار حیوان و همچنین گوشهای آنها بهطرف زرد شدن، نشاندهنده موفقیت عمل جراحی کلستاز بود.
روش بررسی بافتی و ایمونوهیستوشیمی: پس از گذشت دو هفته از جراحی کلستاز، موشها توسط کلروفورم کشته و مغز آنها خارج شد. سپس در فرمالین10% تثبیت شدند. در مرحله بعد، نمونهها وارد روند آبگیری، شفافسازی، آغشتگی با پارافین و قالبگیری شدند. پس از تهیه مقاطع سریال 6 میکرونی به کمک میکروتوم، رنگآمیزی لامهای تهیه شده به روش هماتوکسیلین- ائوزین انجام شد و بررسیهای بافتی بهوسیله میکروسکوپ و گراتیگول انجام گرفت. برای شمارش سلولی از نرمافزار Image J استفاده شد (15).
برای آنالیز ایمونوهیستوشیمی، پس از پارافینزدایی و آبدهی برشها، برشهای بافتی بهمنظور بازیابی آنتیژنی، در بافر سیترات10میلی مولار با 6pH= به مدت 20 دقیقه در دمای 90 درجه سانتیگراد قرارگرفتند. حذف مکانهای اتصال غیراختصاصی آنتیبادی اولیه با قراردادن برشها در آلبوین سرم گاوی (سیگما) 4% در PBS برای یک ساعت در دمای معمولی اتاق انجام شد. سپس برشها با آنتیبادی پلیکلونال آکواپورین 4 (Abcam) به مدت 24 ساعت در چهار درجه سانتیگراد در اتاق مرطوب و در کنترل منفی، برشها فقط بامحلول 4 درصد PBS-BSA انکوبه شدند. پس از شستشو در PBS مهار فعالیت پراکسیداز سلولی با قراردادن لامها در محلول هیدروژن پراکسیداز 3/0 درصد در متانول به مدت ده دقیقه انجام شد. سپس لامها شسته و با آنتیبادی ثانویه برای آکواپورین 4 (Abcam) به مدت یک ساعت در دمای معمولی اتاق مرطوب انکوبه شد آشکارسازی با استفاده از نشانگر دی آمینوبنزیدین (DAB) با استفاده از کیت ضمیمه ایمونوهیستوشیمی (Laboratories, Inc., Montgomery, Tx)، با ایجاد رسوب قهوهای انجام گرفت. سپس آنالیز برشها با میکروسکوپ نوری (Ziess آلمان) انجام شد.
روش و ابزار تجزیهوتحلیل اطلاعات: محاسبات با استفاده از روش آنالیز واریانس یکطرفه برای مقایسه گروهها توسط نرمافزار SPSSنسخه 19 (IBM) انجام شد. برای مقایسههای زوجی از آزمون تعقیبیTukey استفاده شد.از لحاظ آماری P-Value کمتر از 05/0 معنیدارفرض شد.
نتایج
دو هفته پس از جراحی انسداد مجرای صفراوی، حیوانات علائم کلستاز ازجمله خارش و زرد شدن برخی از نواحی بدن مانند گوشها و ناحیه اطراف چشمها را نشان دادند. همچنین افزایش معنیدار میزان آنزیمهای ALT،AST، ALP، GGT، بیلیروبین کل و بیلیروبین مستقیم خون حیوانات سیزده روز پس ازکلستاز نسبت به گروههای شم مشاهده شد (001/0>P). جدول1 نشاندهنده اثر کلستاز بر میزان تغییرات آنزیمهای کبدی سیزده روز پس از کلستاز میباشد. دادههای کمی حاصل از اندازهگیری وزنتر سه گروه کنترل، شم وکلستاز که در جدول 2 آورده شده است، نشاندهنده افزایش وزن تر در نمونههای کلستاتیک در مقایسه با نمونههای کنترل و شم میباشد (05/0>P) .
جدول 1- اثر کلستاز بر میزان تغییرات آنزیمهای کبدی سیزده روز پس از کلستاز (001/0>P).
نمونه |
کنترل |
کلستاتیک*** |
ALT(IU/L) |
8/3± 9/33 |
6/10± 9/131 |
AST(IU/L) |
8/2± 1/36 |
9/9± 3/110 |
ALP(IU/L) |
7/8± 6/363 |
8/16± 9/655 |
GGT (IU/L) |
2/0± 5/4 |
6/1±9/22 |
Total bilirobin(mg/dl) |
7/1± 6/5 |
1/11± 6/58 |
Direct bilirobin(mg/dl) |
1/1± 9/2 |
9/7± 9/32 |
مشاهدات میکروسکوپی شبکه کوروئید رنگآمیزی شده توسط هماتوکسیلین- ائوزین نشاندهنده ایجاد آسیب در شبکه کوروئید میباشد (شکل 1). در نمونه کنترل و شم سلولهای اپیتلیال دارای ظاهری سلامت هستند. در نمونه کلساتیکاز هم گسیختگی بافت و چروکیدگی سلول مشاهده میشود.
نتایج حاصل از تأثیرکلستاز بر بیان پروتئین AQP4 در شبکه کوروئید در شکل 2 نشان دادهشده است. این تصاویر که با استفاده از نرمافزار Image J کمی شده، نشاندهنده افزایش میزان پروتئین AQP4 در نمونههای کلستاتیک در مقایسه با نمونههای کنترل و شم میباشد (01/0>P) .
جدول2- میانگین وزن ترگروههای کنترل، شم و کلستاز (05/0>P).
* در مقایسه با گروه کنترل و À در مقایسه با گروه شم
گروه |
میانگین وزن تر مغز |
کنترل |
3/1± 1/76 |
شم |
1/1± 3/76 |
کلستاز |
À*6/2± 7/78 |
بحث
مشاهده شده که در اختلالات کبدی و هپاتیک آنسفالوپاتی فشار درون جمجمه افزایش و ادم ایجاد میشود (17) و به دنبال آن تغییراتی در بیان آکواپورین 4 مشاهده میگردد که به نظر میرسد در ادم مغزی دارای نقش است (16).
نتایج این مطالعه نشان داد که با بستن مجرای صفراوی و ایجاد کلستاز، میزان آکواپورین 4 در شبکه کوروئید افزایشیافته است (20). همچنین دادههای کمی حاصل از اندازهگیری وزن تر مغز موشها، نشاندهنده افزایش درصد وزنتر در نمونههایکلستاتیک در مقایسه با نمونههای کنترل و شم بود که احتمالاً به دلیل وجود اِدم میباشد. از آنجائیکه یکی از مدلها که برای بررسی انواع اختلالات کبدی استفاده میشود بستن مجرای صفراویی است بنابراین نتایج بهدستآمده از این تحقیق را میتوان به اینگونه مطالعات نیز تعمیم داد (1و2).
بیان آکواپورین 4 در پاهای انتهاییآستروسیتها باعث همگن شدن آنها و یکپارچگی سد خونی- مغزی میشود (18). آکواپورین 4 دارای نقش بالقوه در ادمهای سیتوتوکسیک و وازوژنیک میباشد که در نهایت با افزایش فشار درون جمجمه باعث کما (Coma) میشوند (8). مشاهده شده که بیان آکواپورین-4 در آستروسیتها نقش مهمی در اِدم مغز پس از ایسکمی (خفگی/ هیپودیپسی، سکته مغزی) ضربه مغزی (کوفتگی، جراحت قشرمغز) تومورها، التهابات (مننژیتها)، اختلالات متابولیکی (مسمومیت آب/هیپوناترمی) و افزایش آمونیاک ایفا می کند (12). عملاً آکواپورین 4 در کنترل ورود و خروج آب به پارانشیم مغزی نقش داشته و وظیفه مهمی را در ایسکمی مغزی به عهده دارد.
B |
C |
A |
شکل 1- شبکه کوروئید. اسلاید Aمربوط به نمونه کنترل. اسلاید B مربوط به نمونه شم و اسلاید C مربوط به نمونه کلستاز.(رنگآمیزی H&E- ×400). مقایسه اسلایدها نشاندهنده ایجاد آسیب در شبکه کوروئید و ازهمگسیختگی بافتی میباشد.سلولهای چروکیده با فلش مشخصشدهاند.
C |
A |
D |
C |
B |
شکل 2- برش کرونال از مغز رت بالغ نر در ناحیه شبکه کوروئید با بزرگنمایی ×400. اسلاید Aمربوط به نمونه کنترل. اسلاید B مربوط به نمونه شم و اسلاید C مربوط به نمونه کلستاز و نمودار D اطلاعات کمی شده توسط نرمافزار Image Jمیباشند(روش ایمونوهیستوشیمی). مقایسه این اسلایدها بیانگر افزایش میزان تراکم آکواپورین-4 در نمونه کلستاز پس از دو هفته است (نسبت به گروه شم و کنترل (001/0>P)).
تحقیقات نشان داده که 24 ساعت پس از ایسکمی موضعی میزان آکواپورین 4 کاهش مییابد در حالیکه میزان آب افزایش مییابد. علاوه بر این نشان داده شده که میزان آکواپورین 4 در یک و 48 ساعت پس از ایسکمی افزایش مییابد که مرتبط با اوج تجمع آب مغز میباشد (13).
علاوه بر این نشان داده که آکواپورین 4 نقش مهمی در هومئوستاز یونی از طریق تسهیل انتشار آببازی میکند. در برخی مطالعات دیگر mRNA آکواپورین 4 در هنگام ادم مغزی افزایش مییابد و گسستگی سد خونی- مغزی باعث القاء بیان mRNA آکواپورین 4 در آستروسیتها میشود (8 و18).
مشاهده شده که حذف AQP4موجب وخیمتر شدن اِدم مغز وازوژنیک ناشی از نشت مایع میشود و در اِدم سیتوتوکسیک حذف AQP4 باعث کاهش سرعت جریان خروجی آب از مغز میشود. همچنین بیان بیشازحد AQP4در موشهای تراریخته منجر بهشدت یافتن تورم سیتوتوکسیک مغز میگردد. در موشهای دچار ادم سیتوتوکسیک حذف AQP4 منجر به کاهش میزان آب ورودی به مغز و در نتیجه کاهش اثرات مخرب ادم مغزی میشود (12).
یک مطالعه نشان داد که بقاء پس از مسمومیت حاد آب و شوک ایسکمی در مدل موشهای فاقد آکواپورین 4 کاهش یافت که با کاهش نفوذ آب از سد خونی- مغزی و کاهش جریان آب به پارانشیم مغزی همراه بود. در مطالعه دیگر نشان داده شد که در مدل موشهای فاقد آکواپورین 4 تورم مغزی بیشتری نسبت به موشهای دستنخورده پس از ایجاد آسیبهای مغزی مشاهده شد (14). یک مطالعه نشان داد که در مراحل اولیه ادم، آکواپورین 4 افزایش نمییابد و حتی کاهش مییابد (20). این کاهش مانع جریان آب در مغز میشود و به این صورت مغز از خود محافظت میکند.
در هرحال به نظر میرسد تنظیم افزایشی آکواپورین 4 با ادم در ارتباط است ولی مشخص نیست که آیا افزایش آن باعث ادم میشود یا مکانیسمی برای جبران تداوم ادم است (7). در سیروز تنظیم مثبت آکواپورین4 همزمان با فعال شدن 38 P مپکایناز، پاسخ جبرانی به مهار تشکیل ادم میباشد (6).
محققان نشان دادند که افزایش بیان پروتئین آکواپورین 4 در موشهای صحرایی که مجرای صفراوی آنها بستهشده مشاهده شده است (4). همچنین احتمالاً آکواپورین 4 عامل پیشرفت ادم در هپامیک آنسفالوپاتی میباشد (18 و19). علاوه بر این اگر آکواپورین 4 عامل پیشرفت ادم بر طبق موقعیت غشائی در هپامیک آنسفالوپاتی باشد، این مسئله ممکن است به امکان ادم وازوژنیک در مغز باشد که به دنبال اختلالات کبدی ایجاد میشود زیرا تحقیقات نشان دادهاند که آکواپورین 4 نقش مهمی در کلیرانس ادم وازوژنیک بازی میکند که قابلمقایسه با یافتهها در افزایش بیان آکواپورین 4 در موشهای صحرایی که مجرای صفراوی آنها بستهشده، میباشد. اگرچه اینکه تغییرات بیان زمانی و فضایی آکواپورین 4 بهخصوص در اختلالات کبدی نیاز به مطالعات بیشتر دارد (7).
مطالعات نشان دادهاند که اندوتوکسینها در موشهای کلستاتیک میتوانند منجر به ایجاد کما و ادم شوند، محققان با تزریق لیپوپلی ساکارید (LPS) به موشهای کلستاتیک حالتهای قبل از کما و ادم سیتوتوکسیک را القا مینمایند. همچنین هایپرآمونیای ایجاد شده در هنگام کلستاز باعث افزایش آکواپورین 4 شده و میتواند به ادم مغزی منتهی شود (24).
نتایج این تحقیق نشان داد که با بستن مجرای صفراوی و ایجاد کلستاز، آسیب و ازهمگسیختگی بافتی در شبکه کوروئید مشاهده میشود و سلولها چروکیده شدهاند. همچنین بررسیها نشاندهنده افزایش میزان آکواپورین 4 در شبکه کوروئید میباشد. علاوه براین، دادههای کمی حاصل از اندازهگیری وزنتر مغز موشها، نشاندهنده افزایش درصد وزنتر در نمونههای کلستاتیک در مقایسه با نمونههای کنترل و شم بود.
در این مطالعه، مشاهده شد که با بستن مجرای صفراوی و ایجاد کلستاز، وزنتر مغز افزایشیافته است. علاوه براین میزان پروتئین آکواپورین 4 نیز در شبکه کوروئید افزایش نشان داد که احتمالاً به دلیل نقش 4AQP در ادم ایجاد شده در هپاتیک انسفالوپاتی میباشد.