اثر پپتید زیست فعال مشتق از ماهی ساردین بر لوله‌های اسپرم­ساز متعاقب القاء تنش حرارتی در موش صحرایی نر بالغ

مهسا ولی زاده ^1*، وحید نجاتی¹، علی شالیزار جلالی²، ابراهیم حسین نجدگرامی¹ و غلامرضا نجفی²

¹ ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده علوم، گروه زیست­شناسی

² ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده دامپزشکی

تاریخ دریافت: 21/8/1399            تاریخ پذیرش: 9/9/1399

چکیده

آسیب ناشی از تنش حرارتی در بیضه­ها یکی از علل ناباروری در مردان و اغلب پستانداران محسوب می­شود. پپتیدهای زیست فعال فعالیت ضد اکسایشی قوی در برابر رادیکال­های آزاد و گونه­های اکسیژن فعال دارند. در این مطالعه، 42 سر موش صحرایی نر بالغ به‌صورت تصادفی به6 گروه 7تایی شامل: گروه اول: شاهد (دمای 22 درجه سانتی­گراد)، گروه دوم: پپتید زیست فعال (10 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن به‌صورت خوراکی، روزانه)، گروه سوم: تحت شوک حرارتی 43 درجه­سانتی­گراد، گروه‌های چهارم، پنجم و ششم تحت شوک حرارتی­43 درجه سانتی­گراد به همراه تیمار با پپتید زیست فعال با دوز 5، 10 و 20 میلی­گرم بر کیلوگرم وزن بدن به‌صورت خوراکی تقسیم شدند. بعد از اتمام دوره تیمار( 45روز)، بافت بیضه به‌منظور بررسی­های بافت­شناسی و بیوشیمیایی جداسازی شد. آسیب‌شناسی بافتی، تخریب بافتی گسترده­ای را به دنبال القاء تنش حرارتی در بافت بیضه نشان داد. تنش حرارتی سبب افزایش معنی­دار نیتریک اکساید گردید (05/0P<). در موش­های تحت تنش حرارتی درمان شده با پپتید زیست فعال دوز 5 و 10 میلی­گرم بر کیلوگرم بهبودی مشاهده نشد. تیمار حیوانات با دوز 20 میلی­گرم بر کیلوگرم آثار مثبتی بر اسپرماتوژنز و ساختار لوله­های اسپرم­ساز نشان داد. نتایج بررسی میزان نیتریک اکساید،کاهش این فاکتور بیوشیمی را به دنبال تیمار با پپتید با دوز 20 میلی­گرم بر کیلوگرم نشان داد (05/0P<). نتایج حاصل از این مطالعه آثار آنتی­اکسیدانتی پپتید زیست فعال مشتق از ماهی ساردین را در شاخص­های بافتی و بیوشیمی بافت بیضه نشان داد.

واژه‌های کلیدی: تنش حرارتی، تنش اکسیداتیو، آنتی‌اکسیدانت، دستگاه تولیدمثلی نر،موش صحرایی

* نویسنده مسئول، تلفن: مهسا ولی زاده، 09033736645، پست الکترونیکی: mahsa_valizadeh20@yahoo.com

مقدمه

به‌طورکلی، ناباروری در 15 درصد زوجین مشاهده می‌شود که در این میان باتوجه به نقش 40 درصدی ناشی از اختلالات مردان، اهمیت بررسی، شناسایی و اصلاح این اختلالات برای کمک به زوجین نابارور امری ضروری به نظر می‌رسد (33). در این راستا، امروزه مشخص شده است که بسیاری از عوامل ازجمله تنش اکسیداتیو (39)، تنش حرارتی (43) و تنش نیتروزاتیو (32) می‌توانند منجر به ناباروری در مردان شوند. باتوجه به این‌که در زندگی امروزه بسیاری از عوامل داخلی و خارجی می‌توانند موجب افزایش دمای بافت بیضه شده و روند اسپرماتوژنز طبیعی را برهم بزنند، تنش حرارتی به‌عنوان یکی از مشکلات اصلی در باروری مردان مطرح‌شده و تلاش برای اصلاح آن همچنان ادامه دارد (16). اخیراً یک مطالعه اپیدمیولوژیک نشان داده است که دمای زیاد محیط اثرات مخربی بر بافت بیضه داشته و منجر به آپوپتوز سلول‌های جنسی ‌می­شود (19). گرما علاوه بر اثرات منفی مختلف بر بافت بیضه، میزان رادیکال‌های آزاد اکسیژن را نیز افزایش می‌دهد (47). تنش حرارتی و به دنبال آن القاء تنش اکسیداتیو در بافت بیضه و رابطه نزدیک بین این دو عامل در مطالعات مختلف بیان شده است (31) که در این راستا، مکانیسم‌های مختلفی برای مقابله با آسیب‌های ناشی از تنش گرمایی بر باروری مردان مورد استفاده قرارگرفته است. براساس گزارشات اخیر، اثرات مضر تنش حرارتی می‌تواند بصورت عمده ناشی از افزایش گونه های فعال اکسیژن (ROS) باشد که این گونه‌های فعال اکسیژن خود باعث پراکسیداسیون لیپیدی، دناچوره شدن پروتئین‌ها و آسیب DNA می‌شوند (12و 24).

نیتریک اکساید (NO) به‌عنوان مولکولی با فعالیت بالا، قابل‌انتشار و ناپایدار شناخته شده است که در رده­های سلولی مختلف تولید شده و عملکردهای مختلفی را بر عهده دارد. در همین راستا نشان داده‌اند که این ماده بر فعالیت دستگاه­های مختلف بدن ازجمله سیستم­های تولیدمثلی نر و ماده تأثیر گذاشته و همچنین نقش آن در آپوپتوز سلول­های زایا در بیضه به­خصوص در اسپرماتوسیت­های اولیه به اثبات رسیده است (52).

شواهد زیادی نشان می­دهد که NO در مقادیر کم در انواع فرایندهای تولیدمثل مردان مانند اسپرماتوژنز، اسپرمیوژنز، حرکت، متابولیسم و ظرفیت اسپرم دخیل است (32) این در حالی است که همبستگی منفی بین سطح NO و تحرک اسپرم، مورفولوژی آن و قطعه‌قطعه شدن DNA گزارش شده است (44).

در حالت فیزیولوژیک، سیستم آنتی­اکسیدانتی بدن با تکیه بر سد دفاعی آنتی­اکسیدانتی خارجی و داخلی با تنش اکسیداتیو و اثرات ROS مقابله می­کند، که آنتی‌اکسیدانت‌های داخلی بدن ازجمله سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز و همچنین آنتی‌اکسیدانت‌های آنزیمی بیرونی همانند توکوفرول و ویتامین C این نقش را ایفا می‌کنند (50). طبق گزارشات گذشته، ظرفیت تام آنتی­اکسیدانتی نقش مهمی در غیرفعال کردن ROS دارد و درمان‌های مختلف آنتی­اکسیدانتی برای اندام‌های مختلف ازجمله بیضه به کار می‌رود (14). علاوه بر این، عوامل آنتی­اکسیدانتی به‌عنوان روش‌های درمانی برای مقابله با نارسایی‌های تولیدمثل ناشی از تنش اکسیداتیو معرفی شده‌اند (10).

موجودات دریایی، تقریباً نیمی از کل تنوع زیستی دنیا را تشکیل داده و مخازن غنی از اجزای عملکردی ازجمله منبع غنی از پروتئین برای تولید پپتیدهای زیست فعال هستند (22). ماهی­ها به‌عنوان منبعی از اسیدهای چرب غیراشباع، پلی­ساکاریدها، آنتی­اکسیدانت­ها و پپتیدهای زیست فعال شناخته ‌شده‌اند (37). پپتیدهای زیست فعال همانند تری پپتیدهای به دست آمده از پروتئین­های ماهی ساردین (11)، مواد ارگانیک تشکیل شده از اسیدهای آمینه هستند که با پیوند کووالانسی (پیوندهای آمیدی یا پپتیدی) به هم متصل می­شوند و به‌عنوان قطعاتی از پروتئین­های خاص، تأثیر مثبتی بر عملکرد و شرایط بدن دارند (27). چرا که این مواد فعالیت هورمونی و دارویی از خود نشان می­دهند و براساس نحوه عملکرد خود می­توانند به‌عنوان ضد میکروب، ضد ترومبوتیک، ضد فشارخون، مواد افیونی، تعدیل کننده سیستم ایمنی بدن و آنتی‌اکسیدانت طبقه‌بندی شوند (9و 41). پپتیدهای زیست فعال، فعالیت ضد اکسایشی قوی در برابر رادیکال­های آزاد و سایر گونه­های اکسیژن فعال دارند. مکانیسمی که پپتیدها از طریق آن اثرات ضد اکسایشی خود را ایفا می­کنند به‌طور کامل آشکار نشده است هرچند تحقیقات مختلف نشان می­دهد که پپتیدها و پروتئین­های هیدرولیز شده با حذف رادیکال­های آزاد و شلاته کردن یون­های فلزی از اکسیداسیون آنزیمی و غیرآنزیمی ممانعت می­کنند (13و 51). پتانسیل آنتی­اکسیدانتی هیدرولیزهای پروتئینی بستگی به ترکیب آمینواسیدها و شکسته شدن ساختار سوم پروتئین­های والد به کمک آنزیم­های هیدرولیزی دارد که منجر به افزایش دسترسی به آمینواسیدهای با فعالیت آنتی­اکسیدانتی می­شود. بعضی از این ترکیبات، فعالیت فوق­العاده­ای را در پاکسازی رادیکال­های آزاد و غیرفعال کردن یون سوپراکسید دارا می­باشند که نشان دهنده فعالیت آنتی­اکسیدانتی بالای این پپتیدها می­باشد (18).

باتوجه به اثرات بالقوه و متعدد پپتید زیست فعال مشتق از ماهی ساردین به‌ویژه اثرات آنتی­اکسیدانتی آن، در مطالعه حاضر از این ماده جهت مقابله با اثرات زیان­بار ناشی از تنش حرارتی استفاده گردید. در این راستا، بافت بیضه­ی موش‌های صحرایی پس از پروسه القا تنش حرارتی و درمان با پپتید زیست فعال، ازنظر تغییرات لوله­های اسپرم­ساز و بیوشیمیایی مورد ارزیابی قرارگرفت.

مواد و روشها

برای انجام این تحقیق، 42 سر موش صحرایی نر بالغ (20 180  گرم) از خانه حیوانات دانشکده علوم دانشگاه ارومیه تهیه شد. به‌منظور سازگاری حیوانات با شرایط محیطی، حیوانات در شرایط غذایی بدون محدودیت، تحت چرخه 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی و در دمای محیط 22 درجه سانتی­گراد به مدت 14 روز قرارگرفتند. پپتید زیست فعال بکار برده شده در این مطالعه از تخمیر ماهی ساردین (Sardinella sp.) در کنار نمک تهیه گردید. به‌منظور استخراج پپتید مورد نظر، محلول تخمیر شده به‌وسیله یک دستگاه خشک­کن انجمادی خشک گردید و با همزن الکتریکی، 1 قسمت پودر خشک‌شده با 5 قسمت آب مقطر در دمای 30 درجه سانتی‌گراد به مدت 1.5 ساعت در حمام آبی مخلوط شدند. سپس، مخلوط به دست آمده با دورg 10000 به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانترفیوژ گردید و محلول رویی به‌منظور به دست آوردن عصاره پپتیدی شفاف به‌وسیله کاغذ واتمن فیلتر شد. در انتهای کار، عصاره پپتیدی به‌وسیله خشک­کن انجمادی خشک گردیده و در دمای 18- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. برای ایجاد شوک حرارتی، در طول دوره تیمار (45 روز)، یک‌سوم قسمت تحتانی بدن در حمام آب گرم به مدت 20 دقیقه قرارگرفت. موش­ها به‌صورت تصادفی به 6 گروه 7 تایی تقسیم شدند. گروه اول به‌عنوان گروه شاهد روزانه 20 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 22 درجه سانتی­گراد قرارگرفت، در حالی‌که گروه دوم، گروه پپتید زیست فعال، روزانه 10 میلی­گرم بر کیلوگرم پپتید زیست فعال به‌صورت گاواژ دریافت کرد (3). گروه سوم، گروه تحت شوک حرارتی 43 درجه سانتی­گراد روزانه به مدت 20 دقیقه در حمام آب گرم قرارگرفت. گروه چهارم، پنجم و ششم نیز یک ساعت بعد از القاء شوک حرارتی ( 43 درجه سانتی­گراد به مدت 20 دقیقه در حمام آب گرم)، به ترتیب پپتید زیست فعال با دوز 5 میلی­گرم بر کیلوگرم، 10 میلی­گرم بر کیلوگرم و 20 میلی­گرم بر کیلوگرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن به‌صورت خوراکی( گاواژ) دریافت کردند. بعد از اتمام دوره تیمار 45 روزه، حیوانات به‌منظور بررسی میزان وزن بدن توزین شدند. موش­ها با زایلازین به میزان 10 میلی­گرم به ازای هر کیلوگرم و کتامین به میزان 100 میلی­گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن بیهوش و سپس با جابجایی مهره­های گردنی کشته شدند. برای انجام بررسی‌های بافتی و بیوشیمیایی، بیضه­ها از بدن حیوانات جداسازی شده و بعد از وزن­کشی بیضه­ها، بیضه چپ برای تهیه مقاطع بافت‌شناسی به فرمالین 10 درصد و بیضه راست جهت اندازه­گیری میزان NO بافتی، به فریزر 70- درجه سانتی‌گراد انتقال یافت. متعاقب 72 ساعت، بیضه‌های فیکس شده، پاساژ روتین بافتی شده و قالب‌های پارافینه از آنها تهیه شد. در ادامه، برای بررسی­های بافتی، مقاطعی باضخامت 5 میکرون از قالب‌های پارافینه تهیه و از رنگ­آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) برای رنگ‌آمیزی مقاطع بافتی استفاده شد. به‌منظور ارزیابی قطر لوله­های اسپرم­ساز و ضخامت اپیتلیوم زایا بافت بیضه، 90 لوله اسپرم­ساز به‌صورت تصادفی انتخاب شدند و قطر کوچک و قطر بزرگ لوله­ها با استفاده از عدسی مدرج چشمی اندازه­گیری شد. پس از اندازه­گیری، عدد حاصل در ضریب مخصوص که برای هر عدسی شیئی متفاوت است ضرب شد و اندازه نهایی برحسب میکرومتر محاسبه گردید. در ادامه، به‌منظور تعیین ضریب تمایز لوله­ای (TDI) درصد لوله­های اسپرم­سازی که بیشتر از سه رده­ی سلولی اسپرماتوژنز تمایز یافته از سلول­های اسپرماتوگونی و سایر سلول­های رده اسپرماتوژنز داشتند به‌عنوان لوله‌های TDI مثبت، محاسبه گردید (8). همچنین، درصد لوله­های اسپرم­سازمثبت (SPI) که در یک مرحله و در حال اسپرمیوژنز(مرحله 7 و 8 اسپرماتوژنز) بودند، ارزیابی گردید (25). در ادامه، به‌منظور محاسبه ضریب سلول سرتولی (SCI)، نسبت تعداد سلول­های زایا به تعداد سلول­های سرتولی مشخص گردید (36). به‌منظور محاسبه ضریب میوزی (MI) نسبت تعداد اسپرماتیدهای گرد به اسپرماتوسیت­های اولیه مشخص گردید (46).

سلول­های لیدیگ در بافت بینابینی و به‌صورت گروهی دیده می­شود. همچنین دارای هسته گرد و با موقعیت مرکزی به همراه یک یا دو هستک می­باشند. برای شمارش این سلول­ها از عدسی مشبک چشمی استفاده شد و تعداد سلول­های لیدیگ در یک میلی­متر از بافت همبند بینابینی بیضه شمارش شد (49). برای ارزیابی بلوغ اسپرماتوژنز از مقایسه جانسن استفاده شد. بدین منظور از مقطع عرضی، 90 لوله اسپرم­ساز در هر نمونه استفاده شد و به هر لوله براساس فراسنجه­های زیر نمره 1 تا 10 تعلق گرفت.

جدول 1- ارزیابی بلوغ اسپرماتوژنز با استفاده از ضریب جانسن

روش­های مختلفی برای اندازه­گیری نیتریک اکساید (NO) در سیستم­های بیولوژیکی طراحی شده است که یکی از روش­ها شامل استفاده از واکنش دیونیزه کردن و تشخیص با اسپکتوفتومتری است که نیتریت تولید شده توسط اکسیداسیون NO تحت شرایط فیزیولوژیکی را می­سنجد. برای اندازه­گیری NO از کیت سنجش نیتریک اکساید (Navand salamat,Urmia,Iran) استفاده شد. مقایسه تمامی داده­ها در بین گروه­ها توسط نرم­افزار (SPSS (Version 24.00، آزمون ANOVAی یک­طرفه و سپس آزمون Duncan صورت پذیرفت. تمامی داده­ها براساس میانگین  انحراف معیار بیان گردید و مقدار 05/0P< معنی­دار در نظر گرفته شد.

نتایج

بررسی­های میانگین وزن بدن حیوانات در پایان مطالعه تفاوت معنی­داری را در هیچ­یک از گروه­ها نشان نمی­داد. این در حالی است که میانگین وزن بیضه، پس از اتمام تیمار در گروه تحت تنش حرارتی43 درجه سانتی­گراد نسبت به گروه کنترل (01/0P<) و پپتید زیست فعال (05/0P<) نشان دهنده کاهش معنی­داری بود (جدول 1). گروه­های دریافت­کننده پپتیدزیست­فعال با دوز 5 و 10 میلی­گرم بر کیلوگرم به همراه تنش حرارتی43 درجه سانتی­گراد در مقایسه با گروه تنش حرارتی، اختلاف معنی­داری (05/0P<) در وزن بیضه نداشتند اما نسبت به گروه کنترل کاهش معنی­دار (05/0P<) را نشان دادند. در گروه 43 درجه سانتی­گراد به همراه پپتید زیست فعال با دوز 20 میلی­گرم بر کیلوگرم، وزن بیضه افزایش معنی­داری (05/0P<) نسبت به گروه تنش حرارتی 43 درجه سانتی­گراد و همچنین گروه کنترل داشت. نتایج حاصل از بررسی نسبت وزن بیضه بر کل وزن بدن، حاکی از کاهش معنادار (01/0P<) در گروه‌­ تنش حرارتی 43 درجه سانتی­گراد در مقایسه با گروه‌ کنترل است. گروه­های تحت تنش حرارتی 43 درجه سانتی­گراد+ دریافت‌کننده پپتید زیست فعال 5 و 10 میلی‌گرم بر کیلوگرم نیز کاهش معنی­دار (05/0P<) را نسبت به گروه کنترل نشان می­دهند. این در حالی است که، گروه تنش حرارتی 43 درجه سانتی­گراد+ دوز 20 میلی‌گرم بر کیلوگرم پپتید زیست فعال توانست افزایش معنی­داری (05/0P<) را در مقایسه با گروه‌ تنش حرارتی ایجاد نماید. این گروه نیز نسبت به گروه کنترل اختلاف معنی­داری را نشان داد (05/0P<) (جدول 1).

جدول2- تأثیر استرس حرارتی و پپتید زیست فعال بر وزن بدن و بیضه. مقدار به‌صورت میانگین  انحراف معیار بیان شده است. حروف نامشابه بیانگر اختلاف معنی­دار در سطح (05/0P<) بین گروه­های مختلف است.

(وزن بدن) BW: Body Weight                (وزن بیضه) TW: Testis Weight

بررسی­های بافت بیضه نشان داد که ساختار لوله­های اسپرم­ساز و اپیتلیوم زایا در گروه­های کنترل دارای ساختار طبیعی است. در گروه پپتید زیست فعال نیز آسیب جزئی نسبت به گروه کنترل مشاهده شد. در بیضه­ی موش­های گروه تحت تنش حرارتی 43 درجه سانتی­گراد، گروه­های تنش حرارتی + پپتید با دوز 5 و 10 میلی­گرم بر کیلوگرم، افزایش لوله­های اسپرم­ساز آتروفی شده، کاهش ارتفاع اپیتلیوم زایا، واکوئوله شدن لوله­ها، التهاب تونیکا آلبوژینه­آ، پرخونی عروق و ادم بافتی مشاهده گردید. کاهش ارتفاع اپیتلیوم زایا در گروه پپتید زیست فعال با دوز 10 میلی­گرم بر کیلوگرم نیز دیده شد. در گروه­های دریافت کننده پپتید زیست فعال دوز 5 و 10 میلی­گرم بر کیلوگرم تحت تنش حرارتی به دلیل آسیب شدید بافتی، تغییر بارزی در جهت بهبودی دیده نشد. اما گروه تیمار شده با پپتید زیست فعال با دوز 20 میلی­گرم بر کیلوگرم بعد از القای تنش حرارتی بهبودی معنی­داری (05/0P<) را نسبت به گروه تنش حرارتی 43 درجه سانتی­گراد نشان می‌دهد (شکل1).

در همین راستا، ارزیابی­های مورفومتریک اثبات کرد که قطر لوله­های اسپرم­ساز و ضخامت اپیتلیوم زایا در گروه­ تنش حرارتی 43 درجه سانتی­گراد و دو گروه 43 درجه سانتی­گراد + پپتید زیست فعال با دو دوز 5 و 10 میلی­گرم بر کیلوگرم کاهش معنی­داری (05/0P<) نسبت به گروه کنترل دارند. گروه تنش حرارتی 43 درجه سانتی­گراد درمان شده با پپتید زیست فعال با دوز 20 میلی‌گرم بر کیلوگرم افزایش معنی­داری (05/0P<) در مقایسه با گروه تنش حرارتی 43 درجه سانتی­گراد دارد. اختلاف بین گروه 43 درجه سانتی­گراد + پپتید زیست فعال 20 میلی­گرم بر کیلوگرم نسبت به گروه کنترل نیز معنی­دار  (05/0P<) بوده است. بررسی ضخامت اپیتلیوم در گروه پپتید زیست فعال نیز نسبت به گروه کنترل اختلاف معنی­داری را نشان می دهد (05/0P<) (جدول 2).

شکل1- مقطع عرضی بافت بیضه در موش صحرایی نر. (رنگ­آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین).گروه کنترل: ساختار طبیعی بافت بیضه را نشان می­دهد، همچنین قطر لوله­های اسپرم­ساز، ضخامت اپیتلیوم زایا و مقدار بافت همبند بینابینی طبیعی است. گروه پپتید( 10 میلی­گرم بر کیلوگرم وزن بدن): .Aضخامت اپیتلیوم زایا کاهش را نشان می­دهد. گروه­های 43 درجه سانتی­گراد، 43 درجه سانتی‌گراد+ پپتید با دوز 5 و 10 میلی­گرم بر کیلوگرم : .Bلوله­های اسپرم­ساز آتروفی شده، .Cکاهش ارتفاع اپیتلیوم زایا، .Dواکوئوله شدن لوله­ها، .Eادم بافتی در این سه گروه مشاهده می­شود. گروه 43 درجه سانتی­گراد+ پپتید با دوز 20 میلی‌گرم بر کیلوگرم: ساختار بافتی طبیعی می­باشد. ادم بینابینی کاهش‌یافته، فرایند اسپرماتوژنز نیز به حالت طبیعی بازگشته است.                                            P.SPI: Positive SPI, N.SPI: Negative SPI, P.TDI: Positive TDI, N.TDI: Negative TDI

جدول3- تأثیر استرس حرارتی و پپتید زیست فعال بر پارامترهای مورفومتریک در موش صحرایی نر بالغ.مقدار به‌صورت میانگین  انحراف معیار بیان شده است. حروف نامشابه بیانگر اختلاف معنی­دار در سطح (05/0P<) بین گروه­های مختلف است

در بررسی ضریب تمایز لوله­ای مثبت، کاهش معنی­داری (05/0P<) در تعداد لوله‌های با ضریب تمایزی مثبت در گروه‌های تنش حرارتی 43 درجه سانتی­گراد، 43 درجه سانتی­گراد+ پپتید زیست فعال با دوز 5 و 10 میلی­گرم بر کیلوگرم در مقایسه با گروه کنترل مشاهده شد. بررسی‌ها نشان داد که اختلاف معنی­داری بین گروه‌های 43 درجه سانتی­گراد + پپتید زیست فعال با دوز 5 و 10میلی­گرم بر کیلوگرم با گروه تحت تنش 43درجه سانتی­گراد وجود ندارد. اما اختلاف معنی­داری (05/0P<) بین دو گروه 43 درجه سانتی­گراد و 43 درجه سانتی­گراد + پپتید زیست فعال با دوز 20 میلی­گرم بر کیلوگرم دیده می­شود. مابین دو گروه تنش حرارتی 43 درجه سانتی­گراد+ پپتید زیست فعال با دوز 20 میلی­گرم بر کیلوگرم با گروه کنترل نیز اختلاف معنی­داری (05/0P<) مشاهده می­شود( شکل2). یافته­ها نشان داد که تنش حرارتی سبب افزایش درصد لوله­هایی با ضریب اسپرمیوژنز منفی و کاهش درصد لوله­هایی با ضریب مثبت گردیده است. نتایج حاصل نشان داد که ضریب اسپرمیوژنز در گروه­های 43 درجه سانتی­گراد، 43 درجه سانتی­گراد دریافت کننده پپتید زیست فعال با دو دوز 5 و 10 میلی­گرم بر کیلوگرم کاهش معنی­داری (05/0P<) را نسبت به گروه کنترل دارند. این در حالی است که، گروه‌های 43 درجه سانتی­گراد + پپتید زیست فعال با دوز 5 و 10 میلی‌گرم بر کیلوگرم اختلاف معنی­دار نسبت به گروه تنش حرارتی 43 درجه را نشان نمی­دهد. اما گروه 43 درجه سانتی­گراد تیمار شده با پپتید زیست فعال با دوز 20 میلی­گرم بر کیلوگرم افزایش معنی­داری (05/0P<) را نسبت به گروه تحت تنش 43 درجه سانتی­گراد نشان می­دهد، همچنین این گروه اختلاف معنی­داری را نسبت به گروه کنترل نشان می­دهد (05/0P<) (شکل2). ضریب سلول سرتولی در گروه­های تنش حرارتی43 درجه سانتی­گراد، 43 درجه سانتی­گراد+ پپتید زیست فعال با دو دوز 5 و 10 میلی­گرم بر کیلوگرم کاهش معنی­داری (05/0P<) در مقایسه با گروه کنترل نشان می­دهند. در گروه‌های 43 درجه سانتی­گراد + پپتید زیست فعال با دوز 5 و 10 اختلاف معنی­داری (05/0P<) در ضریب سلول سرتولی نسبت به گروه تنش حرارتی مشاهده نشده است. در گروه 43 درجه سانتی­گراد+ پپتید زیست فعال با دوز 20 میلی­گرم بر کیلوگرم افزایش معنی­داری (05/0P<) در ضریب سلول سرتولی نسبت به گروه تنش حرارتی مشاهده شد. این گروه اختلاف معنی­داری را نسبت به گروه کنترل نیز نشان می­دهد (05/0P<) (شکل2). نتایج حاصل از بررسی ضریب میوزی نشان می­دهد که تنش حرارتی سبب کاهش معنی­دار (05/0P<) ضریب میوزی در گروه­های تحت تنش حرارتی 43 درجه سانتی­گراد، 43 درجه سانتی­گراد تیمار شده با پپتید زیست فعال با دو دوز 5 و 10 میلی­گرم بر کیلوگرم نسبت به گروه کنترل‌شده است. مابین گروه­های پپتید زیست فعال با دوز 5 و 10 میلی­گرم بر کیلوگرم با گروه تنش حرارتی 43 درجه سانتی­گراد اختلاف معنی­داری (05/0P<) مشاهده نگردید. گروه 43 درجه سانتی­گراد+ پپتید زیست فعال با دوز 20 میلی­گرم بر کیلوگرم افزایش معنی­داری (05/0P<) را نسبت به گروه 43 درجه سانتی­گراد نشان می­داد. گروه 43 درجه سانتی­گراد تیمار شده با پپتید با دوز 20 میلی­گرم بر کیلوگرم اختلاف معنی­داری (05/0P<) را نسبت به گروه کنترل نشان می‌دهد (شکل2).

شکل 2- تأثیر استرس حرارتی و پپتید زیست فعال بر فعالیت­های اسپرماتوژنز

TDI: ضریب تمایز لوله­ای، SPI: ضریب اسپرمیوژنز، SCI: ضریب سلول سرتولی،MI: ضریب میوزی

مقدار به‌صورت میانگین  انحراف معیار بیان شده است. حروف نامشابه بیانگر اختلاف معنی­دار در سطح (05/0P<) بین گروه­های مختلف است.

نتایج حاصل از شمارش سلول­های زایا نشان داد که میانگین تعداد سلول­های اسپرماتوگونی، اسپرماتوسیت اولیه و اسپرماتید در یک میلی‌متر مربع در گروه­های 43 درجه سانتی­گراد و 43 درجه سانتی­گراد دریافت کننده پپتید زیست فعال با دو دوز 5 و 10 میلی­گرم بر کیلوگرم کاهش معنی­داری (05/0P<) را در مقایسه با گروه کنترل داشتند. بررسی رده­های سلولی گروه پپتید زیست فعال با دوز 20 میلی­گرم بر کیلوگرم افزایش معنی­داری (05/0P<) را نسبت به گروه‌ تنش حرارتی نشان داد. مابین گروه 43درجه سانتی­گراد+ پپتید 20 میلی­گرم بر کیلوگرم با گروه کنترل نیز اختلاف معنی­داری مشاهده شد (05/0P<). همچنین، میانگین تعداد سلول­های سرتولی در یک میلی‌متر مربع در گروه­ تنش حرارتی 43 درجه سانتی­گراد و گروه­های تحت تنش 43 درجه سانتی­گراد دریافت کننده پپتید زیست فعال با دو دوز 5 و 10 میلی­گرم بر کیلوگرم نسبت به گروه کنترل کاهش معنی­داری (05/0P<) را نشان داد. این در حالی است که در گروه تنش حرارتی + پپتید زیست فعال با دوز 20 میلی­گرم بر کیلوگرم نسبت به گروه 43 درجه سانتی­گراد اختلاف مشاهده می­شود اما این اختلاف معنی­دار نیست. گروه تحت تنش 43 درجه تیمار شده با پپتید 20 میلی­گرم بر کیلوگرم نسبت به گروه کنترل اختلاف معنی‌دار را نشان می­دهد (05/0P<). در بررسی میانگین تعداد سلول­های لیدیگ در گروه 43 درجه سانتی­گراد و گروه‌های تحت تنش حرارتی + پپتید زیست فعال با دوز 5 و 10 میلی­گرم بر کیلوگرم نسبت به گروه کنترل کاهش معنی­دار (05/0P<) مشاهده گردید. گروه 43 درجه سانتی­گراد+ پپتید زیست فعال با دوز 20 میلی­گرم بر کیلوگرم افزایش معنی­داری (05/0P<) نسبت به گروه تنش حرارتی نشان می­دهد. اختلاف معنی­داری (05/0P<) بین دو گروه تنش حرارتی 43 + پپتید زیست فعال با دوز 20 میلی­گرم بر کیلوگرم و کنترل نیز وجود دارد ( جدول3).

جدول4- مقایسه میانگین تعداد سلول­های اسپرماتوژنیک، سرتولی و لیدیگ در گروه­های مختلف آزمایشی

مقدار به‌صورت میانگین  انحراف معیار بیان شده است. حروف نامشابه بیانگر اختلاف معنی­دار در سطح (05/0P<) بین گروه­های مختلف است

نتایج مربوط به ارزیابی بلوغ اسپرماتوژنز با استفاده از شاخص جانسن مشخص نمود که در گروه تنش حرارتی 43 درجه سانتی­گراد و گروه­های تنش حرارتی 43 درجه سانتی­گراد + پپتید زیست فعال با دوز 5 و 10 میلی­گرم بر کیلوگرم کاهش معنی­دار (05/0P<) در شاخص جانسن نسبت به گروه کنترل وجود دارد. در گروه تنش حرارتی + پپتید زیست فعال با دوز 20 میلی­گرم بر کیلوگرم، افزایش معنی­داری در (05/0P<) بهبود اسپرماتوژنز در مقایسه با گروه تنش حرارتی مشاهده گردید. اختلاف معنی‌دار (05/0P<) مابین دو گروه کنترل و تنش حرارتی 43 درجه درمان شده با دوز 20 میلی­گرم بر کیلوگرم نیز مشاهده شد (شکل3).

شکل3- تأثیر استرس حرارتی و پپتید زیست فعال بر شاخص جانسن

مقدار به‌صورت میانگین  انحراف معیار بیان شده است. حروف نامشابه بیانگر اختلاف معنی­دار در سطح (05/0P<) بین گروه­های مختلف است.

بررسی بیوشیمیایی مربوط به سنتز نیتریک اکساید (NO) به دنبال القای تنش حرارتی نشان داد که حرارت 43 درجه سانتی­گراد سبب افزایش معنی­دار (05/0P<) سنتز نیتریک اکساید در مقایسه با گروه کنترل می­شود. این کاهش معنی­دار (05/0P<) در دو گروه تحت تنش حرارتی 43 درجه سانتی­گراد درمان شده با پپتید با دو دوز 5 و 10 میلی­گرم بر کیلوگرم نیز نسبت به گروه کنترل مشاهده می­شود. تیمار با پپتید زیست فعال با دوز 5 و 10 میلی­گرم بر کیلوگرم بعد از القای تنش حرارتی 43 درجه سانتی­گراد، اختلاف معنی­داری (05/0P<) را نسبت به گروه 43 درجه سانتی­گراد نشان نمی­داد. درحالی‌که در گروه 43 درجه سانتی­گراد+ پپتید زیست فعال با دوز 20 میلی­گرم بر کیلوگرم کاهش معنی­دار (05/0P<) در مقایسه با گروه تنش حرارتی مشاهده گردید. بین دو گروه تنش حرارتی 43 درجه سانتی­گراد درمان شده با پپتید با دوز 20 میلی­گرم بر کیلوگرم و گروه کنترل نیز اختلاف معنی­داری (05/0P<) مشاهده شد (شکل4).

شکل4- تأثیر استرس حرارتی و پپتید زیست فعال بر میزان نیتریک

اکساید در موش صحرایی نر

مقدار به‌صورت میانگین  انحراف معیار بیان شده است. حروف نامشابه بیانگر اختلاف معنی­دار در سطح (05/0P<) بین گروه­های مختلف است

بحث و نتیجه‌گیری

دراین مطالعه کاهش چشمگیر وزن بیضه به دنبال القاء یک دوره 45 روزه تنش حرارتی در مقایسه با گروه کنترل مشاهده شد. این کاهش وزن و حجم بیضه به دلیل آپوپتوز در سلول­های جنسی حساس به دما با فعالیت میوزی بالا (31)، تنش اکسیداتیو و فعال شدن کاسپاز3 (عامل آپوپتوز)(29) اتفاق می­افتد و این کاهش معنی­دار وزن با مطالعات قبلی تأثیر تنش حرارتی در انسان و حیوانات در یک‌سو قرار دارد (20، 23، 26و 28). درمان با کورکومین (30) و ویتامین E (42) به‌عنوان آنتی­اکسیدانت موجب افزایش وزن بیضه و درنتیجه بیانگر نقش درمانی این دو ماده آنتی­اکسیدانت در مقابله با تنش حرارتی بوده است. در مطالعه حاضر استفاده از پپتید زیست فعال نیز به‌عنوان ماده­ای با خاصیت آنتی­اکسیدانتی، افزایش معنی­دار در وزن بیضه را در گروه دریافت کننده این ماده با دوز 20 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن نشان داد. در حالی‌که تیمار حیوانات با دو دوز 5 و 10 میلی‌گرم بر کیلوگرم پپتید زیست فعال تأثیر مثبتی در جهت بهبودی نشان نداد. استفاده مستمر از پپتید زیست فعال استرس ریداکتیو را به دنبال دارد یکی از علل مشاهده آسیب در گروه پپتید زیست فعال است.

تکیه بر مطالعات پیشین نشان می‌دهد که، بافت بیضه یک سیستم بیولوژی متأثر از دما است که به دنبال افزایش دما تغییرات مورفولوژی و مولکولی زیادی در سلول‌های جنسی آن اتفاق می‌افتد که باعث اختلال روند اسپرماتوژنز و درنتیجه آزواسپرمی می­شود (15). همچنین، اخیراً یک مطالعه پژوهشی نشان داده است که بافت بیضه در بین حیوانات مختلف و سویه­های متنوع یک‌گونه ازنظر حساسیت به دما، تفاوت‌های قابل‌توجهی دارد که به نظر می­رسد به دلیل اختلاف در توانایی حیوانات در حفظ دمای بیضه و اختلاف در حساسیت سلول­های زایا در گونه­های مختلف نسبت به تنش حرارتی باشد (42). بعلاوه، در مطالعات دیگر نشان داده شده است که بیشترین اثرات تنش حرارتی در اسپرماتوسیت­های اولیه در مرحله پاکی­تن (4) و اسپرماتید­های گرد اتفاق می‌افتد (42) که در صورت افزایش تنش سایر سلول­ها نیز مستعد مرگ هستند (29). با افزایش درجه حرارت، علاوه بر اسپرماتوسیت، اسپرماتید و اسپرم، اسپرماتوگونی­ها( مقاوم­ترین رده سلولی) نیز تحت تأثیر قرار می­گیرند (42). در مطالعه حاضر، القاء استرس حرارتی 43 درجه سانتی­گراد به مدت 45 روز، موجب کاهش جمعیت سلولی اسپرماتوگونی به‌صورت فعال و غیرفعال در اپیتلیوم لوله­های منی ساز شد. بعلاوه، اکثر لوله­ها به‌شدت آسیب دیده و تنها تعداد کمی از سلول­های بنیادی باقی‌مانده بود. در همین راستا، کانتر و همکاران نشان داده‌اند که احتمالاً بیشتر سلول­های مرده در تنش حرارتی از طریق فاگوسیتوز توسط سلول­های سرتولی از بین می‌روند (23). در مطالعه‌ای دیگر نشان داده شده است که کاهش چشمگیر در تعداد سلول­های رده اسپرماتوژنیک وابسته به دما بوده و با افزایش دما تا 43 درجه سانتی­گراد، آتروفی اپیتلیوم جنسی، توقف کامل اسپرماتوژنز و از بین رفتن کامل اسپرماتید و اسپرم دیده می­شود (17). با بررسی مورفولوژی لوله‌های اسپرم‌ساز دراین مطالعه، تشکیل واکوئل‌ها در لوله‌های اسپرم‌ساز، سلول‌های جنسی با هسته پیکنوزه (40)، تخریب پل‌های سیتوپلاسمی بین سینسشیوم‌ها و در نتیجه تخریب سلول‌های سالم کناری (40) آسیب به بافت بینابینی لوله‌های اسپرم‌ساز (42)، بی‌نظمی و سستی سلول‌های اسپرماتوژنیک، کاهش سلول‌های سرتولی و سلول‌های لیدیگ (30)، خالی شدن لوله‌های اسپرم‌زا از انواع سلول و ناپدید شدن اسپرماتوسیت‌ها، اسپرماتید‌ها (30)، توقف کامل اسپرماتوژنز (28) دیده شد. پژوهش حاضر هم­راستا با مطالعات پیشین نشانگر کاهش قابل‌توجه قطر لوله­ها، کاهش ضخامت اپیتلیوم زایا در لوله­های اسپرم­ساز بیضه است (23).  

از طرفی، در مطالعه حاضر بررسی برش‌های بافتی نشان داد که تنش حرارتی به‌تنهایی موجب کاهش ضریب تمایز اسپرمیوژنز، میوزی، سلول‌های سرتولی و شاخص جانسن می‌شود. این در حالی است که پپتید زیست فعال با دوز 20 میلی­گرم بر کیلوگرم توانسته است به مقدار قابل‌توجهی از این روند تخریبی جلوگیری نماید. در همین راستا، نشان داده شده است که مواد با خاصیت آنتی‌اکسیدانتی توانایی بسیار زیادی برای مقابله با تنش اکسیداتیو ناشی از حرارت داشته و با جلوگیری از پراکسیداسیون لیپیدی، آسیب پروتئین‌ها و DNA در مقابل تنش حرارتی، سلول‌های جنسی و در رأس آن‌ها اسپرماتوگونی‌ها را حفظ می­کنند (38). باتوجه به اینکه، مطالعات پیشین خاصیت آنتی­اکسیدانتی پپتیدهای استخراج شده از پروتئین­های ماهی را اثبات می­کند (35)، پپتید زیست فعال استخراج شده از مارماهی با خاصیت آنتی­اکسیدانتی، می‌تواند از اثرات تخریبی رادیکال­های آزاد در بافت بیضه جلوگیری کند. از طرفی، باتوجه به اینکه دو دوز پایین تجویز شده اثرات مثبتی را در جهت بهبودی شاخص­های بافتی نشان ندادند، مقایسه دوزهای مختلف پپیتد زیست فعال مشتق از ماهی ساردین دراین مطالعه نشان دهنده اثرات مثبت دوز 20 میلی­گرم بر کیلوگرم این ماده به دلیل خاصیت آنتی­اکسیدانتی بالا بر آسیب­های ناشی از تنش حرارتی بافت بیضه است. تنش گرمایی با افزایش ROS و سرکوب بیان ژن­های در ارتباط با مکانیسم­های دفاعی در برابر آسیب DNA، باعث آسیب DNA در سلول­های جنسی می­شود. همچنین، نیتریک اکساید به‌عنوان یکی از رادیکال‌های آزاد به شمار می‌رود و از طرفی تنش حرارتی منجر به تنش اکسیداتیو شده و از طریق تولید رادیکال‌های آزاد همانند NO, O₂- و سایر گونه‌های فعال اکسیژن به سلول‌ها و بافت‌ها آسیب می‌رساند. آسیب DNA ناشی از تنش بر جنبه­های مختلف باروری تأثیر می­گذارد (26). افزایش میزان ROS عملکرد آنزیم­های آنتی­اکسیدانتی را مهار یا بیان این آنزیم­ها را کاهش می­دهد که ممکن است باعث افزایش تنش اکسیداتیو گردد (1، 2و 45). بررسی­های تنش حرارتی ناشی از واریکوسل افزایش چشمگیر پارامترهای تنش اکسیداتیو مانند ROS و پراکسیداسیون لیپیدی را نشان داده و در نتیجه بر باروری جنس نر تأثیر می­گذارد (5). در سلول­های جنسی نر، غشای پلاسمایی سرشار از اسیدهای چرب غیراشباع می­باشد که نسبت به ROS بسیار حساس هستند. MDA و NO محصولات حاصل از ROS هستند که برای بررسی میزان تنش اکسیداتیو بافت بیضه استفاده می­شوند. افزایش میزان NO باعث القاء آپوپتوز در سلول­های جنسی می­شود. بیان بیش­از اندازه NO و در نتیجه افزایش آپوپتوز به دنبال القاء کریپتورکیدیسم در آزمایشگاه در موش­های صحرایی مشاهده شد (48). اخیراً مشخص شده است که NO عملکردهای مختلفی را در سیستم تولیدمثلی جنس نر دارد. مکانیسم اصلی آسیب اسپرم ناشی از نیتریک اکساید، مهار تنفس میتوکندریایی و بیوسنتز DNA است. مقدار کم NO برای تحرک اسپرم و بقای آن ضرروی است. همچنین بر فعالیت اسپرم موش صحرایی نیز اثر می­گذارد. در مقابل، افزایش میزان NO، تنفس میتوکندریایی اسپرم را مختل کرده و مانع تحرک اسپرم می­شود. همچنین میزان کم NO درصد اسپرم­های ظرفیت­پذیر و واکنش آکروزومی را افزایش داده و به تلقیح اسپرم و تخمک کمک می­کند. اما اثرات مخرب NO نیز بر فعالیت اسپرم و فرایند لقاح به اثبات رسیده است (45). اثرات مضر NO توسط مولکول­های فعال بیولوژیکی تولید شده توسط واکنش NO با آنیون سوپراکسید و اسید پراکسی نیتروز ایجاد می­شود و این ترکیبات آسیب­های بافتی مختلفی را ایجاد می­کنند (7). NO جریان خون بیضه­ای را نیز کنترل می­کند. یکی از مکانیسم­های آپوپتوزی وابسته به NO از طریق ایجاد اختلال در جریان Bax/Bcl-2 در میتوکندری و فعال شدن مسیر مرگ سلولی مربوط به سیتوکروم c و در نتیجه آپوپتوز سلول­های زایا است (21). در این مطالعه نیز سنتز NO به دنبال القای تنش حرارتی به مدت 45 روز افزایش را نشان می­دهد. استفاده از پپتید زیست فعال استخراج شده از ماهی ساردین، به دنبال القاء تنش حرارتی کاهش نسبی سنتز NO را نشان می­دهد. علیرغم اینکه انتظار می­رود آنتی­اکسیدانت­ها از آسیب اکسیداتیو جلوگیری کرده یا آن را به­طور بالقوه کاهش دهند، مصرف کنترل نشده آنها می­تواند منجر به آسیب ­شود (47). علی‌رغم تأثیرات مثبت پپتیدهای زیست فعال در سطوح فیزیولوژیکی و سلامت بدن، اثرات منفی و مضر بالقوه­ی پپتیدهای زیست فعال همانند سمیت، آلرژی­زایی و جهش­زایی نیز به اثبات رسیده است (34). دراین پژوهش نیز استفاده مستمر پپتیدهای زیست فعال بر بافت بیضه اثر سوء نشان داده و منجر به آسیب به بافت بیضه و اختلال روند اسپرماتوژنز شده است. همچنین، بررسی‌های پیشین در مورد مصرف آنتی اکسیدانت‌ها به‌تنهایی در موش‌های صحرایی نشان داده است که وجود حد نرمالی از رادیکال‌های آزاد اکسیژن برای عملکرد مناسب این بافت ضروری می‌باشد. این در حالی است استفاده از آنتی‌اکسیدانت­ها در شرایط نرمال خود به‌تنهایی می‌تواند باعث بروز استرس ریداکیتو (Reductive Stress) شده و از عملکرد مناسب بافت بیضه جلوگیری نمایید (6و 38).

نتایج این پژوهش نشان داد که درمان موش­های تحت تنش حرارتی 43 درجه سانتی‌گراد به مدت 45 روز توسط پپتید زیست فعال با دوز 20 میلی‌گرم باعث بهبود آسیب بافت بیضه ناشی از تنش حرارتی می­شود که این اثرات مثبت به دلیل خواص آنتی اکسیدانتی پپتید زیست فعال و توانایی این ماده در از بین بردن رادیکال­های آزاد تشکیل شده به دنبال ایجاد تنش اکسیداتیو است. درنتیجه استفاده از پپتید زیست فعال به‌عنوان یک ماده درمانگر جهت بهبود شرایط ناشی از آسیب­های اکسیداتیو پیشنهاد می­شود. 

سپاسگزاری

از معاونت پژوهشی دانشگاه ارومیه برای تأمین  هزینه  این مطالعه تقدیر و تشکر می­شود.