Journal of Animal Research (Iranian Journal of Biology)

Study of Ephestia kuehniella (Lepidoptera: Pyralidae) Chromosome in Pachytene Stage with Squash Method

Document Type : Short Paper

Authors

1 Department of Plant Protection, College of Agriculture and Natural Resources, University of Tehran, Karaj, I.R. of Iran.

2 Genetics and Genetics Resources, Research Department, Seed and Plant Improvement Institute, Agricultural Research, Education and Extention Organization (AREEO), Karaj, I.R. of Iran.

Abstract

Meiosis is one of the main phenomena in the life cycle of insect, which causes creation of haploid gametes, and normal happening of this division is the basic condition to survive the generation of a species. In this study, the chromosomal complex of Ephestia kuehniella Zeller (Lepidoptera: Pyralidae) in both spermatocytes and and oocytes on prophase stage was evaluated by using squash method and contrast phase microscope. The population was a stored population (more than 30 generations) in the biosystematics lab of the University of Tehran, Karaj. In both sex, the pachytene nucleus had a chromosomal complex of 30 bivalent (2n= 60). The results showed that the behavior of chromosomes in the observed cells was normal. The population showed a normal meiosis and it seems that spermatids were fertile. In other words, in the individuals of the population, the formation of bivalent which go toward polar during anaphase, occurred normally.

Keywords

Main Subjects

مقاله کوتاه

مطالعه کروموزوم­های Ephestia kuehniella Zeller (Lepidoptera: Pyralidae) در مرحله پاکیتن با روش اسکواش

فاطمه فارسی1، جاماسب نوذری1* و عیسی ظریفی آناخاتون2

1 ایران، تهران، دانشگاه تهران، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، گروه گیاه‌پزشکی، بخش حشره­شناسی

2 ایران، کرج، بخش تحقیقات ژنتیک و بانک ژن گیاهی ملی ایران

تاریخ دریافت: 30/02/1398          تاریخ پذیرش: 06/02/1399

چکیده

میوز یکی از پدیده­های اساسی در روند زندگی حشرات است که موجب ایجاد گامت­های هاپلوئید می­گردد و انجام نرمال این تقسیم شرط پایه برای ادامه نسل یک‌گونه است. در پژوهش حاضر، مجموعه کروموزومی شب­پره بید آرد Ephestia kuehniella Zeller (Lepidoptera: Pyralidae) در هر دو جنس نر (اسپرماتوسیت) و ماده (اووسیت) در مرحله پروفاز به روش اسکواش با استفاده از میکروسکوپ فاز کنتراست مورد ارزیابی قرارگرفت. جمعیت مورد مطالعه مربوط به همسانه پایه نگهداری شده (بیش از 30 نسل) در آزمایشگاه بیوسیستماتیک دانشگاه تهران، کرج بود. در هر دو جنس، گستره هسته پاکیتن دارای مجموعه کروموزومی از 30 بیوالنت (2n= 60) بود. نتایج نشان داد که رفتار کروموزوم­ها در سلولهای مشاهده شده، به شکل نرمال بوده است. افراد این جمعیت، میوز کاملاً نرمالی را نشان دادند و به نظر می­رسید اسپرماتیدها بارور باشند. به بیان دیگر در افراد این جمعیت، تشکیل بیوالنت­ها طبیعی رخ می­داد که در آنافاز به قطبین حرکت می­کردند.

واژه‌های کلیدی: بیوالنت، گستره پاکیتن، E. kuehniella، میوز، اسکواش.

* نویسنده مسئول ، تلفن: 09123603743، پست الکترونیکی: nozari@ut.ac.ir

مقدمه

 

راسته بالپولکداران با حدوداً 160000گونه توصیف شده، تقریباً به‌عنوان یکی از بزرگترین تاکسون‏های حیوانی است (14و 17). گونه­های راسته بالپولکداران در جنبه­های متعددی با سایر راسته­های حشرات تفاوت دارند که ازجمله دلایل آن وجود دو نوع اسپرم، اووژنز آکیاسماتیک و هتروگامت بودن ماده­هاست (6). میوز در نر و ماده­های بالپولکداران در مقایسه با سایر راسته­های حشرات با دو پدیده متمایز می­گردد. نخست آنکه تفاوت اصلی و پایه در رخدادهای میوز در اعضای این راسته ناشی از آن است که در ماده­ها میوز آکیاسماتیک و در نرها میوز کیاسماتیک است (9 و 10). مطالعات سیتوژنتیک تقسیم سلولی میوز آکیاسماتیک ماده در یازده خانواده از بالپولکداران گزارش شده است که بسیار نزدیک به راسته Trichoptera بوده است (1). در بین این یازده خانواده، خانواده Pyralidae با دو گونه Ectomylios ceratoriae توسط موراگ و همکاران (1982) و Ephestia kuehniella توسط تراث (1977) مورد ارزیابی قرارگرفته است (3 و 12). دیگر آنکه، تفاوت بیشتر ناشی از این واقعیت است که در ماده­ها طی اووژنز دو نوع سلول شامل اووسیت و سلولهای پرستار، در حال رشد و نمو هستند و این در حالی است که در جنس نر همه اسپرماتوسیت­ها در مراحل یکسانی از رویدادهای میوزی قرار دارند (9). در بسیاری از گونه­های بالپولکداران کروموزوم­های جنسی Z و W در طی متافاز میتوز غیرقابل تشخیص هستند که این امر به علت اندازه مشابه این کروموزوم­ها با اتوزوم­ها و نیز ساختار هولوکینتیک آن­ها می­باشد، با این حال، در طی مرحله پاکیتن میوز ماده، می‌توان این کروموزوم­ها را تشخیص داد و به بررسی آن­ها پرداخت (18). در اعضای راسته بالپولکداران، کروموزوم­های W و Z اغلب غیرهمولوگ و با اندازه­های متفاوت هستند (10).

Ephestia kuehniella شب­پره بید آرد، به‌عنوان مدل شناخته شده­ای برای مطالعه بسیاری از مشکلات در فنوژنتیک، ژنتیک بیوشیمیایی، بیولوژی مقایسه­ای و سیتوژنتیک استفاده می­شود (7). ماده­های بید آرد ناهمگون جنس هستند که وضعیت عمومی در گونه­های راسته بالپولکداران می­باشد (9). کروموزوم­های جنسی بید آرد هم W و Z است که به نظر می­رسد غیرهمولوگ باشند (9). در یک هسته پاکیتن در جنس ماده بید آرد، مجموعه کروموزومی شامل 30 بیوالنت است که 29تای آن را همولوگ­های اتوزوم و یکی را کروموزوم Z و W تشکیل می­دهند در حالی که در جنس نر 30 بیوالنت مشابه است (9). در جنس نر بیوالنت جنسی(ZZ) به دلیل همولوژی جفت­ها و فقدان هر نوع مارکر مرفولوژیکی دیگر، قابل تشخیص نیست (9). اگرچه اطلاعات سیتولوژیکی E. kuehniella در دنیا موجود است ولی پژوهش­های کاریولوژیکی این گونه مهم در ایران، صورت نگرفته است. طی مطالعات کروموزومی می­توان وضعیت سیستماتیک و نیز تکاملی یک موجود را شناسایی و پیگیری نمود (13و 7). اختلاف در پارامترهای کروموزومی جمعیت­های مختلف یک‌گونه در گستره طبیعی در بسیاری از موجودات، امری مشهود است (4، 5 و 15). بر همین اساس، مطالعات کاریولوژیکی حشرات علاوه بر کاربردی که در زمینه سیستماتیک دارد، می­تواند در زمینه دستکاری‍های کروموزومی و اصلاح ژنتیکی نیز، مفید باشد. با توجه به اهمیت بید آرد، هدف از مطالعه حاضر، ارزیابی کروموزوم­های این گونه مهم در شرایط جغرافیایی ایران ضمن اعمال تغییراتی در تکنیک­ سیتوژنتیک استاندارد بود.

مواد و روشها

به ‌منظور ارزیابی سیتوژنتیک از جمعیت
Ephestia kuehniella، همسانه پایه نگهداری شده در آزمایشگاه بیوسیستماتیک دانشگاه تهران، کرج استفاده شد. حشرات بر روی بستر پرورش، شامل 75 درصد آرد گندم، 25 درصد سبوس گندم به همراه 2 درصد مخمر در انکوباتور 25±1 درجه سلسیوس، رطوبت نسبی 5±75 درصد و دوره نوری 16:8 ساعت روشنایی: تاریکی پرورش داده شدند.

آماده­سازی کروموزوم­های پاکیتن (Pachytene Chromosomes): به‌منظور بررسی گستره هسته­های پاکیتن از روش تراث (1976) با اندکی تغییرات استفاده شد. در آماده­سازی­های سیتوژنتیکی از مرحله لارو سن آخر بید آرد استفاده شد. برای تهیه نمونه­های کروموزومی، گنادهای لاروی در محلول فیزیولوژیک (NaCl 0.9% + KCl 0.042% + CaCl2 0.025%  در آب مقطر) با استفاده از سوزن­های ظریف حشره­شناسی جداسازی شد. سپس تثبیت نمونه­ها در محلول کارنوی- 1 (استیک اسید گلاسیال، الکل اتیلیک مطلق، 1: 3 سه حجم اتانول به یک حجم اسید) به مدت 30 دقیقه انجام گرفت.

پس از تثبیت، نمونه‌ها در قطره­ای از اسید استیک 45 درصد (حجمی/ حجمی) به کمک سوزن­های حشره­شناسی بر روی لام شیشه­ای تمیز باز شد و به منظور پخش بهتر سلول­ها، اسلایدها روی صفحه حرارتی 45 درجه سانتی‌گراد (Ika- C- Mag Hs7, Germany) قرار داده شدند. کلیه گستره­های آماده­سازی شده با استفاده از استواورسئین 2 درصد (شماره کاتالوگ 7505- Merck) رنگ­آمیزی شدند و با میکروسکوپ فاز کنتراست با بزرگنمایی 200- 400 X بررسی شدند. تصویربرداری­ها  بااستفاده از میکروسکوپ Zeiss Axiophot مجهز به دوربینThe Euromex HD-Ultra camera VC 3036  انجام شدند.

نتایج

در این پژوهش، تمامی مراحل میوز طبیعی در شب­پره بید

آرد مشاهده و ثبت شد. مجموعه پاکیتن در جنس نر بید آرد شامل 30 بیوالنت بود (شکل 1). در بررسی حاضر نیز تفکیک کروموزوم جنسی از سایرین مقدور نبود. در آماده­سازی اسکواش اسپرماتوسیت­های پاکیتن در بید آرد، توده بیوالنتها بدون هیچ‌گونه ویژگی مرفولوژیکی مشخص مشاهده شدند (شکل 1 وa2 ). در هسته پاکیتن جنس ماده بید آرد مجموعه کاملی از 30 بیوالنت قابل رؤیت بود (شکلb2).

 

 

شکل 1- A) متافاز (بیوالنت) میوز I. اسپرماتوسیت با 30 bivalents، (<-) نمای جانبی، B) سیست حاوی اسپرماتوسیت در متافاز I. Scale bar= 2µm

 

شکل 2- A) چهار اسپرماتیدهاپلوئید و آنافاز میوزI، B) متافاز میوزI. جنس ماده. Scale bar= 2µm

 

 

شکل 3- مجموعه synaptonemal بیوالنت از یک هسته پاکیتن ماده. فلش سیاه رنگ: عنصر موازی. فلش قرمز رنگ: عنصر مرکزیScale bar= 2µm

بحث و نتیجه‌گیری

ویژگی­های کروموزومی بیانگر اطلاعات ژنتیکی است به

نحوی که تفاوت­های پارامترهای کروموزومی می­تواند عامل مهمی در مطالعه تکامل یک‌گونه باشد. جمعیت­های یک‌گونه، هریک سازش ویژه­ای را در محیطی که در آن حضور دارند، نشان می­دهند. این سازش در سطح ژنوم نیز مطرح است. مطالعات مقایسه­ای پیرامون پارامترهای کروموزومی طی تقسیمات میتوز و میوز در برخی گروه­های حیوانی، تفاوت­هایی را نمودار ساخته است که اغلب با روند گونه­زایی نیز مرتبط بوده­اند (14).

اهمیت گونه E. kuehniella نه تنها به‌عنوان مدلی در مطالعات سیتوژنتیک بلکه با توجه به امکان پرورش انبوه آن، این حشره به عنوان یک میزبان واسط بالقوه برای تولید عوامل کنترل بیولوژیک نیز مطرح است (2). به نظر می‍رسد تعداد کروموزومی در بید آرد ثابت بوده و این گونه توانایی خاص را در ثابت نگاه داشتن تعداد کروموزوم­هایش داراست. نتایج پژوهش حاضر با یافته توتوآ و همکاران (2001) که 30 بیوالنت را در هر دو جنس نر و ماده بید آرد مشاهده کرده بودند، مطابقت داشت. تکنیک تراث (1977) که برای مشاهده هسته­های پاکیتن استفاده شد، عمدتاً برای تشخیص بیوالنت­های کروموزوم­های جنسی در تعداد زیادی از بالپولکداران مورد استفاده قرارگرفته است (11). تمرکز در این تکنیک بر موضوع هتروکروماتیک بودن کروموزومW استوار شده است (16). در ارزیابی هسته­های پاکیتن جنس ماده در Ectomyelois ceratoniae(Lep.: Pyralidae) زمانی که از اسکواش برای مشاهده توده بیوالنت استفاده شد، ویژگی مرفولوژیکی معینی قابل تشخیص نبود به همین دلیل بیان نمودند که به منظور مطالعه ساختار پاکیتن تنها روش­های سیتوژنتیک مولکولی ازجمله CGH و GISH قادر به تشخیص بیوالنت WZ خواهد بود (11).

باتوجه به رشد کامل تخمدان در لاروهای سن آخر جنس ماده بید آرد، این بافت به منظور بررسی گستره­های پاکیتن مناسب است. در طی اووژنز، هشت سلول تخم
(germ cell) درون یک خوشه به هم متصل بوده که به‌طور موازی تا مرحله پاکیتن رشد می­کنند. پس از مرحله پاکیتن از این مجموعه، هفت سلول به سلول­های پرستار تبدیل می­شوند و تنها یک تخمک (اووسیت) در هر خوشه، میوز را تکمیل می­نماید (10). مجموعه سیتاپتونمال اووسیت با کوتاه شدن بیووالنت­ها به‌صورت تغییریافته، مشاهده می­شوند و تا متافاز اول باقی می­مانند. اعتقاد براین است که این مجموعه سیناپتونمال تغییریافته به عنوان جایگزین کیاسما عمل می­نماید (10). همانطور که در مطالعات پیشین تأکید شده بود (9)، در هسته پاکیتن، سانترومر محل مشخصی ندارد و ما نیز نتوانستیم سانترومری را در تصاویر گرفته شده، بیابیم. از 30 بیوالنت گسترش یافته، 29 عدد را اتوزوم­های همولوگ به خود اختصاص داده­اند و تنها یکی، کروموزوم جنسی Z و W است. عمدتاً هسته­های پاکیتن شامل بیوالنت­های اتوزومی جفت شده با مجموعه­های سیناپتونمال (Synaptonemal Complex :SC) هستند که متشکل از دو عدد عنصر جانبی موازی (Lateral element LEs): با طول­های برابرند که توسط حلقه­های کروماتینی عمدتاً یکنواخت (Central Element) محصور شده­اند. در برخی از گسترش­ها، در فضای بین دو عنصر جانبی، عنصر مرکزی (Central Element) قابل رؤیت است (8 و 9).

نتایج بررسی­های میکروسکوپی در مطالعه حاضر نشان داد که خصوصیات کروموزوم­ها در گستره پاکیتن در هر دو جنس نر و ماده E. kuehniella ایران با جمعیت مطالعه شده دیگر، مشابه است. عدم وجود ناهنجاری­های گوناگون طی مراحل مختلف میوز، می­تواند حاکی از روندی فعال در تکامل جمعیت­های این گونه باشد.

1- Bedo, D. G., 1984. Karyotypic and chromosome banding studies of the potato tuber moth, Phthorimaea operculella (Zeller) (Lepidoptera, Gelechiidae), Canadian Journal of Genetics and Cytology, 26(2), PP: 141–145.
2- Farsi, F., Fotouhi, K., Nozari, J., Goldansaz, S. H., and Hoseini Naveh, V., 2019. Effect of different ligth diets on the morphometric changes of the testicles and bursa copulatrix of Ephesta kuehniella (Lepidoptera: Pyralidae). Journal of Animal Research, 4(32), PP: 362- 375.
3- Fisk, J. H., 1989. Karyotype and achiasmatic female meiosis in Helicoverpa armigera (Hübner) and H. punctigera (Wallengren)(Lepidoptera: Noctuidae). Genome, 32(6), PP: 967–971.
4- Karahan, A., and Feregene, S., 2010. Cytogenetic analysis of Garra variabilis (Heckel, 1843) (Pisces, Cyprinidae) from Savur Stream (Mardin), Turkey. Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 10(4), PP: 483-489.
5- Khalilaria, A., and Colak, E., 2014. Morphology and Karyology of Microtus socialis in new distributed location of East Azerbaijan province. Journal of Animal Research, 3(27), PP: 348- 359.
6- Kumari, U., and Gautam, D. C., 2014. Chromosome studies on moths from Himachal Pradesh.  Cytology and Genetic, 15, PP: 9–14.
7- Marec, F., and Shvedov, A. N., 1990. Yellow eye, a new pigment mutation in Ephestia kuehniella Zeller (Lepidoptera: Pyralidae). Hereditas, 113(2), PP: 97-100.
8- Marec, F., and Traut, W., 1993. Synaptonemal complexes in female and male meiotic prophase of Ephestia kuehniella (Lepidoptera). Heredity, 71(4), PP: 394- 404.
9- Marec, F., and Traut, W., 1994. Sex chromosome pairing and sex chromatin bodies in W-Z translocation strains of. Genome, 37(Tazima 1964), PP: 426–435.
10- Marec, F., Tothová, A., Sahara, K., and Traut, W., 2001. Meiotic pairing of sex chromosome fragments and its relation to atypical transmission of a sex-linked marker in Ephestia kuehniella (Insecta: Lepidoptera). Heredity, 87(6), PP: 659- 671.
11- Mediouni, J., Fuková, I., Frydrychová, R., Dhouibi, M. H., and Marec, F., 2004. Karyotype, sex chromatin and sex chromosome differentiation in the carob moth, Ectomyelois ceratoniae (Lepidoptera: Pyralidae). Caryologia, 57(2), PP: 184-194.
12- Morag, D., Friedländer, M., and Raveh, D., 1982. Synaptonemal complexes, telomeric nucleoli and the karyosphere in achiasmatic oocyte meiosis of the carob moth, Chromosoma, 87(3), PP: 293–302.
13-  Netto, M. R. D. C.B., Pauls, E., and de Mello Affonso, P. R. A., 2007. a standard protocol for obtaining fish chromosomes under post- mortem conditions. Micron, 38(3), PP: 214- 217.
14- Powell, J. A.,:2003. Lepidoptera (Moths, Butterflies). Encyclopedia of Insects. Edited by: Resh VH, CArdé RG. Academic Press, Burlington MA, USA, 631-663, 1266p.
15- Sichova, J., Voleníková, A., Dincă, V., Nguyen, P., Vila, R., Sahara, K., and Marec, F., 2015. Dynamic karyotype evolution and unique sex determination systems in Leptidea wood white butterflies. BMC 15(1), PP: 1- 16.
16- Traut, W., 1977. A study of recombination, formation of chiasmata and synaptonemal complexes in female and male meiosis of Ephestia kuehniella (Lepidoptera), Genetica, 47(2), PP: 135-142.
17- Van Nieukerken, E. J., Kaila, L., Kitching, I. J., Kristensen, N. P., Lees, D. C., Minet, J., Mitter, C., Mutanen, M., Regier, J. C., Simonsen, T. J., and Wahlberg, N., 2011. Order Lepidoptera Linnaeus, 1758. Zootaxa, 3148, PP: 212-221.
18- Zrzavá, M., Hladová, I., Dalíková, M., Šíchová, J., Õunap, E., Kubíčková, S., and Marec, F., 2018. Sex Chromosomes of the Iconic Moth Abraxas grossulariata (Lepidoptera, Geometridae) and Its Congener A. sylvata, Genes, 9(6), 279 p.
Journal of Animal Research (Iranian Journal of Biology)
Volume 33, Issue 3
September 2020
Pages 257-262
  • Receive Date: 20 May 2019
  • Revise Date: 27 December 2019
  • Accept Date: 25 April 2020