Document Type : Research Paper
Authors
1 Department of Marine Biology, Faculty of Natural Resources & Marine Science, Tarbiat Modares University, Nur, Iran
2 Department of Marine Biology, Marine Science and Natural Resource Faculty, Tarbiat Modares University
3 Department of Marine Biology, Faculty of Natural Resources and Marine Science, Tarbiat Modares University, Nur, Iran
Abstract
Gastropods are the largest group of molluscs, with the highest abundance and habitats diversity. The species diversity of true limpets (Nacellidae) in Hormuz Island was investigated by collecting 121 specimens belonging to this family from two stations in the intertidal zone in fall and winter 2016 and 2017. Morphological studies were carried out on the basis of shell morphological characteristics, foot color, radula structure. Besides, the molecular study was also performed using the cytochrome oxidase c subunit 1 (CO1) of the mitochondrial gene. The results of morphological studies indicate that all the specimens, despite having different phenotypes and differences in pattern and color of the shell traits, belonged to Cellana karachiensis which was also confirmed by the molecular finding. Therefore, the results of this study show various phenotypes for C. karachiensis, which also cast doubt on the taxonomic value for identification of this family, based on the color pattern, shell and radula traits.
Keywords
Main Subjects
شناسایی گونههای خانواده Nacellidae Thiele, 1891 در جزیره هرمز (خلیجفارس)
زهرا میسوری، مهدی قدرتی شجاعیوجعفر سیفآبادی*
ایران، نور، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده منابع طبیعی و علوم دریایی، گروه زیستشناسی دریا
تاریخ دریافت: 12/9/1398 تاریخ پذیرش: 21/4/1399
چکیده
شکمپایان با بیشترین فراوانی و تنوع زیستگاهی، بزرگترین رده از شاخه نرمتنان هستند. تنوع گونهای لیمپتهای حقیقی (خانواده Nacellidae) در جزیره هرمز با جمعآوری ۱۲۱ نمونه از اعضای این خانواده از دو ایستگاه در نواحی جذرومدی و در دو فصل پاییز و زمستان سالهای 1395 و 1396 بررسی شد. مطالعات ریختشناختی بر اساس صفات ریختی پوسته، پا و ساختار رادولا بر روی نمونهها انجام شد و همچنین مطالعه مولکولی با استفاده از دادههای ژن میتوکندریایی سیتوکروم اکسیداز c زیرواحد ۱ (CO1) صورت گرفت. نتایج مطالعات ریختشناختی نشان داد که تمامی نمونههای جمعآوری شده با وجود دارا بودن فنوتیپهای متفاوت و تفاوت از نظر صفات طرح و رنگ پوسته، متعلق به گونه Cellana karachiensisمیباشند. نتایج مطالعه مولکولی بر روی 6 نمونه نیز این یافته را مورد تایید قرارداد. ازاین رو نتایج این مطالعه، علاوه بر نشان دادن تنوع فنوتیپی بالا برای گونه C. karachiensis، ارزش آرایهشناختی صفات طرح و رنگ پوسته را در شناسایی گونههای این خانواده مورد سوال قرارداد.
واژههای کلیدی: شکمپایان کشککی، خارهچسب، سوهانک، جزیره هرمز
* نویسنده مسئول، تلفن: 01144998163 ، پست الکترونیکی: seyfabadi@modares.ac.ir
مقدمه
شکمپایان با بیشترین فراوانی و تنوع زیستگاهی، بزرگترین رده از شاخه نرمتنان و یکی از گروههای مهم کفزی در مناطق ساحلی محسوب میشوند (۳۴و ۵۱). حفره دهانی در سیستم گوارشی شکمپایان از عناصر گسسته متعدد و مرتبطی تشکیل شده است (۴۸) که رادولا اصلیترین اندام تغذیهای محسوب میشود (۹). ساختار رادولا در مطالعات آرایهشناختی و تبارزادی اهمیت بالایی را دارا میباشد (۸). چندریختی گونهای در شکمپایان با صفات ریختی رادولا بهتر از صفات پوسته و پا نشان داده میشود (۳۶)، و مقایسه ساختار رادولا بیانگر اختصاصی بودن آن برای هریک از گونهها میباشد (۲۵و ۲۹).
ویژگیهای رادولا در سطوح خانواده، جنس، شباهتها و در سطح گونه، تفاوتهای پایدار را نشان میدهند. شباهتها و تفاوتها بهترتیب در سطح وسیعی برای طبقهبندی شکمپایان بهکار گرفته شدهاند. در تجزیه و تحلیلهای پیشین از شکمپایان جلوآبشش، به جز ریختشناسی رادولا، بعضی صفات دیگر مانند ساختار میکروسکوپی پوسته، دستگاه گوارش، سیستم عصبی، اندام تولیدمثل و ساختار اسپرم را مناسب اهداف طبقهبندی نشان دادهاند (21، 22، 31 و 26). همچنین، میتوان از تنوع در توالی DNA برای شناسایی و حل ابهام در طبقهبندیهای جانوری و گونههای جدید استفاده کرد (35و 19). توالی ژن CO1 میتوکندری جهت تمایز جانوران از یکدیگر کارایی داشته و میتواند بهشکل ابزاری جهانشمول بهعنوان بارکد شناسایی گونه بهکار آید (18). این تکنیک جهت تمایز در میان گونههای نزدیک بههم در شاخههای مختلف جانوری مناسب میباشد (55و 30).
شناسایی لیمپتها در مناطق مختلف مورد توجه بوده (41و 45) و در برخی مقالات از رادولا بهعنوان یک صفت آرایهشناختی مهم و همچنین تفکیک گونهها در کنار تأیید مولکولی استفاده شده است (۳۶، 49، 54 و 56).
تاکنون اطلاعات اندکی در رابطه با شناسایی لیمپتها در خلیجفارس و دریای عمان وجود دارد (1، 5و 11). همچنین در ایران، استفاده از ساختار رادولا در تفکیک شکمپایان در چند سال اخیر مورد توجه قرارگرفته است (3، 4و 10). لذا باتوجه به کمبود اطلاعات پیرامون لیمپتها در خلیجفارس و دریای عمان و همچنین وجود شواهدی مبنی بر وجود چندین گونه لیمپت حقیقی در این مناطق، پژوهش حاضر بهمنظور بررسی گونههای موجود از جمعیتهای لیمپتهای حقیقی (زیررده Patellogastropoda) در جزیره هرمز با هدف تفکیک گونهای براساس صفات ریختی پوسته، پا، رادولا و همچنین مطالعات مولکولی با استفاده از دادههای ژن میتوکندریایی CO1 انجام شده است.
مواد و روشها
نمونهبرداری: پس از بررسیهای اولیه میدانی در مناطق جزرومدی جزیره هرمز (46/56 شرقی و 06/27 شمالی)، دو ایستگاه تجمع لیمپتهای حقیقی (زیررده Patellogastropoda) برای جمعآوری انتخاب و موقعیت جغرافیایی آنها ثبت گردید (شکل 1، جدول 1). نمونهبرداری در زمستان 95، 96 و پاییز 96، در زمان حداکثر جزر انجام شد.
شکل 1- جزیره هرمز و ایستگاههای نمونهبرداری. ایستگاه 1 (مرکز تحقیقات محیطزیست)، ایستگاه 2 (خاک سرخ)
جدول 1- مشخصات ایستگاههای نمونهبرداری در جزیره هرمز
ایستگاه |
نام ایستگاه |
مختصات جغرافیایی |
توصیف ایستگاه و بستر |
1 |
ایستگاه تحقیقات محیط زیست |
E ً46 ´29 ˚56 N "37 ´02 ˚27 |
- منطقه بالای جزر و مدی، صخرهای صیقلی - میان جزر و مدی، صخرهای - ماسهای با پوشش جلبکی روی صخرهها - ناحیه پایین جزر و مدی، سنگی - ماسهای |
2 |
خاک سرخ |
E "32 ´27 ˚56 N "01 ´02 ˚27 |
- منطقه بالای جزر و مدی، صخرهای صیقلی - میان جزر و مدی سنگی، صخرهای - ماسهای با پوشش جلبکی پراکنده - ناحیه پایین جزر و مدی، سنگی - ماسهای - فراوانی املاح معدنی در آب بهدلیل وجود معدن خاک سرخ |
مطالعات ریختشناختی: در اولین گام، با استفاده از کلید شناسایی موجود (۴۴) و سایت معتبر WoRMS، نمونههای دارای ویژگیهای ریختی یکسان، براساس شکل پوسته و رنگ پا در گروههای جداگانه قرارداده شدند. در گام بعدی، صفات ریختی لیمپتها ثبت گردید، سپس نمونهها در الکل ۷۰ درصد برای بررسی ساختار رادولا و الکل ۹۶ درصد برای مطالعات مولکولی تثبیت (۲۰) و به آزمایشگاه علوم دریایی منتقل شدند. سپس، اندام رادولا با دقت از بخش دهانی نمونههای لیمپت جداسازی و جهت زدودگی از بافتهای اضافی، به مدت حداقل یک دقیقه در محلول رقیق هیپوکلرید سدیم با نسبت 9:1 (آب ژاول: آب مقطر) قرارداده شد (13و 24). سپس با آب مقطر شستشو داده شد و تا زمان عکسبرداری در الکل 70 درصد نگهداری گردید. در نهایت، رادولاهای فیکس شده به آزمایشگاه میکروسکوپ الکترونی دانشگاه تربیت مدرس منتقل و بهوسیله دستگاه پوششدهندهبا لایه نازکی از طلا پوشش شدند و با میکروسکوپ الکترونی SEM (مدل XL 30 فیلیپس) از آنها عکس گرفته شد. عکسبرداری از قسمت میانی رادولا با دو تکرار انجام گردید.
مطالعات مولکولی: استخراج DNA نمونههای مورد بررسی با روش فنل–کلروفرم (۵۲) انجام شد. کمیّت DNA ژنومی با استفاده از دستگاه نانودراپ با جذب اشعه ماوراء بنفش مشخص گردید. مقدار پرتو ماوراء بنفش جذب شده بهوسیله محلول DNA در طول موج 260 و 280 نانومتر اندازهگیری شد. برای یک نمونه DNA خالص، نسبت جذب در 260 نانومتر به 280 نانومتر برابر با 2-8/1 میباشد. نسبت کمتر از 8/1 نشان دهنده آلودگی با پروتئین و فنل و بالاتر از 2 آلودگی با RNA است (۵۷). پس از اندازهگیری کمیّت DNA با نانودراپ، کیفیت نمونهها با استفاده از ژل آگارز ۱ درصد و رنگآمیزی با DNA safe stain تعیین شد. مقدار۱ میکرولیتر DNA استخراجی را داخل چاهک ژل آگارز ۱ درصد بارگیری کرده و پس از انجام الکتروفورز و حرکت DNA در ژل، ژل را به درون دستگاه UV-doc منتقل و عکسبرداری انجام شد.
جهت تکثیر ژن میتوکندریایی CO1، از پرایمرهای(5´-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3´) LCO1490 و HC02198 (5´-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3´) (۱۲) استفاده شد. برای تکثیر این جایگاهها طی واکنش PCR با حجم نهایی ۵۰ میکرولیتر شامل: ۵ میکرولیتر بافر PCR 1x، ۴ میکرولیتر منیزیم کلراید، ۴ میکرولیتر dNTP mix، ۵/۲ میکرولیتر پرایمر رفت و ۵/۲ میکرولیتر پرایمر برگشت، ۱ میکرولیتر آنزیم Taq پلیمراز، ۱ میکرولیترDNA الگو و ۳۰ میکرولیتر آب مقطر استفاده گردید. برنامه دمایی بهکار رفته برای واکنش PCR: واسرشتهسازی در دمایC ◦ 95 بهمدت ۵ دقیقه، مرحله دوم شامل ۳۵ چرخه بهترتیب واسرشتهسازی در دمایC ◦ 95 بهمدت ۴۰ ثانیه، همسرشتهسازی بهمدت ۴۰ ثانیه در دمای C◦56 و مرحله بسط بهمدت ۲ دقیقه در دمایC ◦ 72 و در نهایت مرحله بسط نهایی در دمایC ◦ 72 بهمدت ۵ دقیقه انجام شد. محصول PCR بهدست آمده برای بررسی الگوی باندی و ارزیابی نتایج، در ژل آگاروز یک درصد با ولتاژ 70 ولت بهمدت ۴۵ دقیقه الکتروفورز شدند. در نهایت با استفاده از دستگاه UV-doc تصاویر مربوطه تهیه گردید.
برای تعیین توالی قطعات تکثیر شده، محصول PCR بر روی ژل آگاروز ۱درصد بارگذاری گردید و پس از استخراج باند مدنظر از ژل (۴۷) به شرکت ماکروژن کره جنوبی ارسال شد. در ادامه ۶ توالی بهدست آمده پس از مشاهده با استفاده از نرمافزار Chromas 2.1 (۳۲) اصلاح و مورد تایید قرارگرفت. همچنین علاوه بر توالیهای به دست آمده در این مطالعه، ۵۵ توالی دیگر نیز از بانک ژن، جهت انجام تحلیلهای تبارزادی دراین مطالعه مورداستفاده قرارگرفتند (جدول ۲). در ادامه توالیها توسط الگوریتم CLUSTAL W (۵۳)، در نرم افزار BioEdit 7.0.5(۱۶) همتراز شدند. سپس در نرم افزار MEGA X(۲۸) برای عدم وجود کدون پایانی کنترل شدند. بهترین مدل تکاملی با استفاده از نرمافزار Modeltest3.7 (۴۳) انتخاب شد. فاصله ژنتیکی بین نمونههای بررسی شده در نرمافزارMEGA X (۲۸) پس از انتخاب مدل تکاملی مناسب محاسبه گردید. درخت بیشینه درستنمایی (MaximumLikelihood) بااستفاده از نرمافزار RaxmlGUI 1.3 (۵۰) رسم شد. استحکام گرهها در درخت بیشینه درستنمایی با ۱۰۰۰ تکرار bootstrap بهدست آمد. دراین درخت، مقادیر bootstrap بالای ۷۰ درصد بهعنوان مقادیر مناسب در نظر گرفته میشوند. همچنین درخت تبارزادی Bayesian بااستفاده از نرمافزار MrBayes 3.2.6 (۴۶) با روش(MCMC) Markov Chain Monte Carlo ترسیم شده و چهار زنجیره بهطور همزمان برای ۱۰ میلیون نسل راه اندازی شدند. در درخت Bayesian مقادیر احتمال پسین بالای 99 درصد، خیلی خوب و مقادیر بین ۹۰ تا ۹۵ درصد بهعنوان مقادیر خوب در نظر گرفته میشوند.
جدول ۲- توالی های گرفته شده از بانک ژنی NCBI جهت انجام تحلیل های تبارزادی
کد دسترسی ژن CO1 |
گونه |
نمونه |
کد دسترسی ژن CO1 |
گونه |
نمونه |
کد دسترسی ژن CO1 |
گونه |
نمونه |
GQ455962 |
C. radians |
39 |
KX453282 |
C. rota |
20 |
AB238547 |
C. karachiensis |
1 |
GQ455963 |
C. radians |
40 |
KX453283 |
C. rota |
21 |
AB433634 |
C. karachiensis |
2 |
AB433648 |
C. stellifera |
41 |
AB238550 |
C. pricei |
22 |
LCO60523 |
C. karachiensis |
3 |
AB238544 |
C. denticulata |
42 |
AB238561 |
C. solida |
23 |
LCO60524 |
C. karachiensis |
4 |
GQ455938 |
C. denticulata |
43 |
GQ455974 |
C. solida |
24 |
LCO60525 |
C. karachiensis |
5 |
GQ455939 |
C. denticulata |
44 |
FJ515970 |
C. tramoserica |
25 |
LCO60526 |
C. karachiensis |
6 |
AB433649 |
C. strigilis |
45 |
FJ515971 |
C. tramoserica |
26 |
KP698009 |
C. karachiensis |
7 |
KY353129 |
C. strigilis |
46 |
FJ515972 |
C. tramoserica |
27 |
KP698010 |
C. karachiensis |
8 |
KY353130 |
C. strigilis |
47 |
FJ515973 |
C. tramoserica |
28 |
KP698011 |
C. karachiensis |
9 |
KY353131 |
C. strigilis |
48 |
FJ515974 |
C. tramoserica |
29 |
KP698012 |
C. karachiensis |
10 |
KY353132 |
C. strigilis |
49 |
AB238563 |
C. tramoserica |
30 |
KP698013 |
C. karachiensis |
11 |
KY353133 |
C. strigilis |
50 |
AB238545 |
C. flava |
31 |
KP698014 |
C. karachiensis |
12 |
HQ880555 |
N. deaurata |
51 |
KY353124 |
C. ardosiaea |
32 |
KP698015 |
C. karachiensis |
13 |
KX898056 |
Nacella sp. |
52 |
KY353125 |
C. ardosiaea |
33 |
KF840075 |
C. karachiensis |
14 |
GU901248 |
N.clypeater |
53 |
KY353126 |
C. ardosiaea |
34 |
KF840076 |
C. karachiensis |
15 |
KF261314 |
N. concinna |
54 |
KY353127 |
C. ardosiaea |
35 |
KF840077 |
C. karachiensis |
16 |
GU901220 |
N. macquriensis |
55 |
KY353128 |
C. ardosiaea |
36 |
KX453279 |
C. rota |
17 |
|
|
|
AB238551 |
C. radians |
37 |
KX453280 |
C. rota |
18 |
|
|
|
GQ455961 |
C. radians |
38 |
KX453281 |
C. rota |
19 |
نتایج
ریخت شناختی: درمجموع تعداد ۱۲۱ نمونه شکمپای حقیقی (زیررده Patellogastropoda) از دو ایستگاه در جزیره هرمز، طی سه مرحله زمانی، جمعآوری شد. نمونهها براساس شکل پوسته، رنگ پا و با استفاده از کلید شناسایی موجود بررسی شدند و کلیه نمونهها متعلق به گونه Cellana karachiensis از خانواده Nacellidae شناسایی شدند. اطلاعات مربوط به ۶ فنوتیپ مشاهده شده از این گونه در جدول ۳ و شکل ۲ آورده شده است.
گونه |
Cellana karachiensis |
||
سطح بیرونی صدف |
|||
S71 |
S75 |
S77 |
|
M2 |
M19 |
M73 |
|
سطح داخلی صدف |
|||
سطح شکمی |
|||
شکل ۲- تصاویر رنگ سطح بیرونی صدف، سطح داخلی صدف و سطح شکمی در گونه Cellana karachiensis
جدول 3- جایگاه گونه و مشخصات ریختی آن
اسم گونه |
Cellana karachiensis(Winckworth, 1930) |
اسم فارسی |
حلزون گنبدی صاف |
راسته |
Archaeogastropoda |
خانواده |
Nacellidae |
اندازه |
40-23 میلیمتر |
رنگ پوسته |
کرم، قهوهای روشن و تیره |
رنگ پا |
سبز مایل به طوسی |
مشخصات نمونه |
پوسته تخم مرغی شکل، دارای خطوط شعاعی برجسته و محکم. نوارهای عرضی قهوهای تیره در سطح خارجی. سطح درونی نقرهای و اثر ماهیچهای قهوهای نعل اسبی شکل دارد. . طرح رنگ صدف در نمونههای جوانتر به صورت لکههای پراکنده قهوایی– قرمز در یک زمینه زرد رنگ ظاهر میشود. |
پراکندگی و رفتار |
بستر سنگی و صخرهای صیقلی در ناحیه میانی و پایین جزرومدی، گیاهخوار، فراوان |
ساختار رادولا گونه C. karachiensis:رادولای این گونه دارای ساختار Docoglossan یا Stereoglossan بوده که ابتداییترین ساختار و بدون تغییر از اجداد اولیه را نشان میدهد. دراین نوع رادولا، هرردیف دارای یک دندان مرکزی و معمولا کوچک است که در برخی گونهها ممکن است وجود نداشته باشد. ۱ تا ۳ دندان جانبی و دندان حاشیهای قلابی شکل دارد. هردو دندان جانبی و حاشیهای معمولا کوتاه و محکم هستند و ساختاری سفت و سخت دارند. فرمول این ساختار به صورت «3 + D(Dominant) + 2 + R(Rachis) + 2 + D + 3» یا «3 + D + 2 + 0 + 2 + D + 3» است. تصویر رادولای گونه بررسی شده با بزرگنمایی ۲۰۰ میکرومتر در شکل ۳ آورده شده است.
مطالعات مولکولی: میزان جذب در طول موج ۲۶۰نانومتر، بیانگر مقادیر بیشتر از 7/1 و کمتر از 1/2 بود. نتیجه تکثیر ژن میتوکندریایی CO1، اندازه قطعه مورد انتظار حدود 700 جفت بازی را نشان داد (شکل 4).
نتیجه توالییابی ژن CO1 به روش Sanger، خوانش 551 جفت باز قابل اعتماد بود. کد دسترسی نمونههای بررسی شده در بانک ژنوم جهانی NCBI در جدول ۴ آورده شده است.
شکل ۳- تصویر میکروسکوپی SEM از رادولای گونه C. karachiensis
شکل ۴- طول قطعات تکثیر شده در واکنش PCR بر روی ژل آگارز ۱ درصد (M: Molecular Marker)
نتایج براساس هر دو درخت تبارزادی بیشینه درستنمایی و بیزین نشان میدهد که نمونههای 1، 3، 5، 6، 7 و 8 متعلق به گونه C. karachiensis از خانواده Nacellidae میباشند. براساس هر دو درخت، نمونههای مذکور متعلق به کلاد C. karachiensis و کلاد خواهری گونهC. rotaمیباشند. جایگاه آرایهشناختی نمونههای مورد مطالعه و تعلق آنها به کلاد ذکر شده، با مقادیر bootstrap و احتمال پسین بالایی، بهترتیب در هر دو درخت بیشینه درستنمایی و Bayesian حمایت میشود.
جدول ۴ -کد دسترسی ژن CO1 نمونههای مورد بررسی ثبت شده در بانک ژنی NCBI
کد دسترسی ژن CO1 |
محل نمونهبرداری |
گونه |
نمونه |
MH795133 |
جزیره هرمز |
Cellana karachiensis |
1 |
MH795134 |
جزیره هرمز |
Cellana karachiensis |
3 |
MH795136 |
جزیره هرمز |
Cellana karachiensis |
5 |
MH795137 |
جزیره هرمز |
Cellana karachiensis |
6 |
MH795138 |
جزیره هرمز |
Cellana karachiensis |
7 |
MH795139 |
جزیره هرمز |
Cellana karachiensis |
8 |
محاسبه فواصل ژنتیکی براساس مدل K2P نشان میدهد فاصله ژنتیکی در میان نمونههای مورد مطالعه برابر با صفر و همچنین فاصله ژنتیکی بین نمونههای مورد مطالعه و گونه C. karachiensis برابر با 1/0 درصد میباشد. همچنین میزان فاصله ژنتیکی بین نمونههای مورد مطالعه با C. rota و همچنین گونه C. karachiensis با C. rota، برابر با 4/10 درصد است که این میزان کمتر از اختلاف ژنتیکی این گونه با دیگرگونهها میباشد. نمونههای مربوط به ایران بیشترین فاصله ژنتیکی را نیز با گونه C. ardosiaea (3/20 درصد) دارا میباشند (جدول 6). اسامی نمونههای ایران در درخت تبارزادی بهترتیب زیر میباشد (جدول 5).
بحث
مطالعات ریخت شناختی: براساس نتایج این پژوهش، از
مجموع 121 نمونه لیمپت حقیقی در 6 فنوتیپ، تنها یک گونه C. karachiensis از خانواده Nacellidae شناسایی شد.
جدول 5- نام و کد نمونههای ایران
نمونه |
اسم گونه |
کد |
1 |
Cellana karachiensis |
S73 |
3 |
Cellana karachiensis |
S75 |
7 |
Cellana karachiensis |
M19 |
5 |
Cellana karachiensis |
M2 |
8 |
Cellana karachiensis |
S77 |
6 |
Cellana karachiensis |
S71 |
خانواده این گونه در اطلس نرمتنان خلیجفارس (۲) به اشتباه Patellidae ذکر شده است. مقایسه ریختی نمونهها براساس صفات شکل پوسته، رنگ پا و ساختار رادولا نشان داد که کلیه نمونهها متعلق به گونه C. karachiensisمیباشند. تنها تفاوت در بین این نمونهها مربوط به طرح و رنگ پوسته بود. از این رو بهنظر میرسد با توجه به این که افراد متعلق به یک گونه طرح و رنگ پوسته متفاوتی را نشان میدهند، این صفات فاقد اعتبار آرایهشناختی در شناسایی گونهها باشند، اما باتوجه به این که در این مطالعه تمامی نمونهها متعلق به یک گونه بودند، لازم است اعتبار آرایهشناختی این صفات بااستفاده از تعداد نمونههای بیشتر متعلق به گونههای متفاوت و در محدوده جغرافیایی وسیعتر نیز مورد بررسی قراربگیرد.
شکل ۵- درخت تبارزادیBayesian براساس دادههای ژن میتوکندریایی CO1، اعداد روی هر شاخه بیانگر مقادیر احتمال پسین میباشند
جدول ۶- فاصله ژنتیکی حاصل از توالیهای ژن CO1 بین نمونههای مورد مطالعه با گونههای مختلف
13 |
12 |
11 |
10 |
9 |
8 |
7 |
6 |
5 |
4 |
3 |
2 |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
1/0 |
C. karachiensis |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
1/0 |
نمونههای 1، 3، 5، 6، 7 و 8 |
2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
4/10 |
4/10 |
C. rota |
3 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
- |
2/14 |
15 |
15 |
C. pricei |
4 |
|
|
|
|
|
|
|
|
2/0 |
1/16 |
1/17 |
3/15 |
4/15 |
C. solida |
5 |
|
|
|
|
|
|
|
0 |
1/10 |
2/18 |
6/18 |
3/16 |
3/16 |
C. tramoserica |
6 |
|
|
|
|
|
|
- |
1/11 |
9/10 |
17 |
6/15 |
5/14 |
4/14 |
C. testudinaria |
7 |
|
|
|
|
|
- |
9/14 |
6/16 |
2/16 |
5/16 |
3/16 |
3/17 |
3/17 |
C. flava |
8 |
|
|
|
|
1 |
6 |
7/15 |
5/16 |
6/15 |
16 |
9/15 |
3/20 |
2/20 |
C. ardosiaea |
9 |
|
|
|
9/0 |
6/8 |
5/18 |
4/15 |
3/15 |
5/16 |
2/18 |
1/18 |
5/18 |
4/18 |
C. radians |
10 |
|
|
- |
1/10 |
9/9 |
2/10 |
2/18 |
9/18 |
3/17 |
8/17 |
6/16 |
9/17 |
9/17 |
C. stellifera |
11 |
|
1/0 |
2/17 |
5/17 |
6/15 |
9/15 |
16 |
1/14 |
5/18 |
6/18 |
5/18 |
4/18 |
4/18 |
C. strigilis |
12 |
7/0 |
3 |
1/16 |
7/16 |
2/14 |
4/15 |
4/15 |
7/14 |
3/17 |
3/19 |
5/17 |
1/18 |
18 |
C. denticulata |
13 |
* اعداد برجسته شده در قطر ماتریس فاصله درون گونهای را نشان میدهند
شکل ۶- درخت تبارزادی بیشینه درستنمایی بر اساس دادههای ژن میتوکندریایی CO1، اعداد روی هر شاخه بیانگر مقادیر bootstrap میباشند
بهرهبرداری از منابع تغذیهای مشخص توسط جانوران در هریک از محیطها منجر به تکامل ساختارها و مکانیسمهای تغذیهای مختلف، از جمله رادولا شده است. باتوجه به رژیم غذایی و نیاز جانور، ساختار رادولا در شکمپایان نیز متفاوت بوده و ابعاد و اشکال مختلف دندانهای رادولا عملکرد خاص خود را دارند. مطالعات اولیه پیرامون رادولا نیز بیانگر این است که ساختار رادولا حتی در گونههای مختلف یک جنس نیز دارای تفاوت است و بنابراین میتواند در تفکیک گونههای یک جنس مورد استفاده قراربگیرد (25و 33) و ازاین رو در مطالعات آرایهشناختی و تبارزادی از اهمیت بالایی برخوردار است (8). از طرف دیگر برخی از مطالعات نیز به شکلپذیری اندام رادولا و تشکیل دندانهای مشابه در گونههای یک جنس که از شرایط تغذیهای یکسانی برخوردار بودند، اشاره کردهاند (42).
دراین پژوهش، بررسی 30 قطعه عکس از ساختار رادولای C. karachiensis بهوسیله میکروسکوپ SEM در مقیاسهای 200 و 500 میکرومتر نشان دهنده جایگاه مشخص دندانها و ابعاد آنها میباشد. ولی تنوع رادولا در گونههای یک جنس در فراساختارهایی همچون ابعاد مختلف دندانها قراردارد که بررسی آنها نیاز به عکسهایی با وضوح بالا دارد و توصیه میشود دندانهای مرکزی، کناری و حاشیهای جهت اندازهگیری دقیقتر، قبل از عکسبرداری از یکدیگر جدا شده و با انجام محاسبات آماری به بیان دقیق تفاوت میان آنها پرداخته شود (17، 23و 36).
خواص مکانیکی دندانها بیشتر تحت تاثیر اندازه، شکل، مواد تشکیل دهنده، خواص مواد غذایی و فعل و انفعالات میان دندانها در طول تغذیه میباشد که تعیین کننده نیاز هرگونه به رادولای خاص میباشد. نوع رادولا بهعنوان یک ابزار تغذیهای مهم شناخته شده است. شکل دندانها و برآمدگیهای آن در ساختارهای مختلف رادولا نشان دهنده عملکرد متفاوت آن در گروههای مختلف با رژیم غذایی متفاوت میباشد که میتواند باعث ایجاد قابلیتها و محدودیتهای تغذیهای در شکمپایان شده و به تفسیر چگونگی تعامل گونههایی با رژیم غذایی مشابه بدون رقابت برای حذف یکدیگر کمک کند. نوع رادولا و تعداد دندانهای آن نشان دهنده تکامل در تغذیه شکمپایان از گیاهخواری به گوشتخواری است. بهطور کلی شکمپایان جهت تراشیدن جلبک به دندانهای بسیار و گوشتخواران به دندانهای کمتر، بهخصوص دندانهای جانبی و حاشیهای نیاز دارند. گونه C. karachiensis گیاهخوار بوده و دارای دندانهای بسیاری است که عموما جهت تراش اجتماعات جلبکی بر روی صخرههای صیقلی نواحی جزر و مدی بهکار گرفته میشوند.
مطالعات مولکولی: خانواده Nacellidae شامل گونههای گرمسیری (Cellana)، سردسیری (Nacella) و احتمالاً گونه اندمیک استرالیا (Naccula) است. گونههای Cellana در حال حاضر بهطور گستردهای در غرب حوضه آرام-هند توزیع شده و بیشترین تنوع را در استرالیا نشان میدهد. Naccula به استرالیای جنوبی محدود میشود. تنها بررسیهای تبارزادی این خانواده مربوط به مطالعه (۴۴) میباشد. باتوجه به آخرین گزارشات، Nacella شامل ۱۵ گونه است در حالی که Cellana شامل ۳۷ گونه و زیرگونه میباشد.
مطالعات تبارزادی انجام شده بر روی 5 گونه از جنس Cellana با استفاده از دادههای دو ژن 12S rRNA و 16S rRNA (۲۷و ۳۷) و همچنین مطالعه تبارزادی صورت گرفته بر روی ۱۸ گونه از این جنس با استفاده از دادههای دو ژن مذکور و همچنین ژن CO1 (۳۸)، نشان میدهد که گونههای نیوزلند و استرالیا، گروه اصلی در جنس Cellana بودند. این مساله با تجزیه و تحلیل ۲۳ نمونه از این گونهها و بااستفاده از ژنهای CO1 و هیستونی هسته H3 نیز پشتیبانی شد (۳۹). مطالعات مولکولی در جنس Cellana اخیرا توسط چند محقق منتشر شده است (6، 7، 15و 40). جهت مطالعه منشا تمامی گونهها و همچنین زیرگونههای شناخته شده Cellanaدر نیوزلند، ژنهای 12S rRNA و 16S rRna مورد بررسی قرار داده شد (۱۴).
مطالعه حاضر با استفاده از دادههای ژن میتوکندریاییCO1 نشان داد که نمونههای 1، 3، 5، 6، 7و 8 متعلق به گونه C. karachiensisمیباشند. براساس هر دو درخت تبارزادی بیشینه درستنمایی و Bayesian در این مطالعه، نمونههای مذکور متعلق به کلاد C. karachiensis و کلاد خواهری گونهC. rotaمیباشند (شکلهای 5و 6). کلاد شامل هر دو گونه C. karachiensis و C. rota، کلاد خواهری گونه C. pricei میباشد. نتایج این مطالعه نشان میدهد آرایش هر دو درخت Bayesian و بیشینه درست نمایی، تا حد بسیار زیادی با هم مطابقت دارد، ولی تفاوتهایی نیز بین آرایش مربوط به هر دو درخت تبارزادی مشاهده میشود. مهمترین تفاوت مشاهده شده مربوط به جایگاه آرایهشناختی کلاد شامل سه گونه C. solida، C. tramoserica و C. testudinaria میباشد. براساس درخت Bayesian کلاد شامل سه گونه ذکر شده، کلاد خواهری سه گونه C. karachiensis، C. rota و C. pricei میباشد ولی این جایگاه از حمایت بالایی برخوردار نیست. بر اساس درخت بیشینه درستنمایی کلاد مذکور، کلاد خواهری گونههای C. flava، C. ardosiaea، C. radians،C. stellifera، C.strigilis و C. denticulata میباشد، ولی این جایگاه نیز از حمایت پایینی برخوردار است. در کل موقعیت آرایهشناختی این کلاد مورد سوال است و احتمال میرود با استفاده از دادههای مولکولی بیشتر، مانند دادههای ژن هستهای و نیز سایر دادههای ژن میتوکندری، جایگاه آرایهشناختی این کلاد بهتر مشخص شود. تفاوت دیگر در بین دو درخت تبارزادی، مربوط به کلاد شامل دو گونهC.strigilis و C. denticulata می باشد. در درخت Bayesian این دو گونه، دو کلاد مجزا را تشکیل میدهند، ولی در درخت بیشینه درستنمایی، هرچند در بین این دو گونه واگرایی ژنتیکی مشاهده میشود، ولی هر دو گونه درون یک کلاد قرار میگیرند. باتوجه به روابط تبارزادی این دو گونه و همچنین فاصله ژنتیکی پایین بین این دو گونه (جدول ۶)، این احتمال میرود که این دو گونه به تازگی از یکدیگر اشتقاق یافته باشند و هنوز در مراحل اولیه انشعاب باشند. براساس هر دو درخت تبارزادی جایگاه کلاد مربوط به این دو گونه، به عنوان کلاد خواهری گونههای C. flava، C. ardosiaea، C. radians، C. stelliferaمیباشد. استفاده از دادههای مولکولی بیشتر می تواند روابط تبارزادی این دو گونه را نیز بهتر مشخص کند.
محاسبه فواصل ژنتیکی حاصل از توالیهای ژن CO1، نشان میدهد که فاصله ژنتیکی در میان نمونههای مورد بررسی بین 1/0 تا 3/20 درصد متغیر میباشد. کمترین میزان فاصله ژنتیکی بین نمونههای مورد مطالعه و گونه C. karachiensis و بیشترین فاصله ژنتیکی نیز بین نمونههای مورد مطالعه و گونه C. ardosiaeaو پس از آن بین دو گونه C. karachiensisوC. ardosiaea (2/20 درصد) مشاهده میشود. تمامی نمونههای متعلق به گونه C. karachiensis، در محدوده جغرافیایی خلیج فارس، دریای عمان و سواحل غربی هند واقع در اقیانوس هند، پراکنش دارند. نمونههای مورد مطالعه از نظر جغرافیایی، فاصله کمتری را با نمونههای گونه C. karachiensis، در مقایسه با سایر گونههای این جنس دارا هستند. محدوده پراکنش جغرافیایی گونه C. karachiensis یک محدوده از سواحل به هم پیوسته است که نمونههای مورد مطالعه در نواحی میانی این محدوده جغرافیایی قرار میگیرند. احتمال میرود عامل زیست جغرافیایی پراکندگی در الگوی پراکنش این گونه نقش داشته است. گونه C. ardosiaeaدر سواحل جزایر کشور شیلی پراکنش دارد که با محدوده پراکنش گونه C. karachiensis فاصله جغرافیایی بسیار زیادی را دارا میباشد. این مساله میتواند احتمالاً بیانگر نقش فاصله جغرافیایی در ایجاد جدایی و واگرایی ژنتیکی باشد. باتوجه به این که غالباً گونههایی که فاصله ژنتیکی کمتری را دارا میباشند از نظر جغرافیایی نیز به یکدیگر نزدیکتر و گونههایی که فاصله ژنتیکی زیادی دارند، فاصله جغرافیایی زیادی را نیز دارا هستند. در تایید این موضوع می توان به دو گونه C.strigilis و C. denticulate اشاره کرد. این دو گونه هردو در سواحل کشور نیوزیلند پراکنش دارند و فاصله جغرافیایی کمی با یکدیگر دارند. فاصله ژنتیکی بین این دو گونه کمترین میزان فاصله ژنتیکی بین گونهای در این مطالعه و برابر با ۳ درصد میباشد. همچنین فاصله ژنتیکی بین دو گونهC.strigilisوC. denticulateبرابر با ۳ درصد میباشد که این نتیجه، نتایج درختهای تبارزادی مبنی بر روابط نزدیک بین این دو گونه را مورد تایید قرار میدهد. همچنین میزان فواصل ژنتیکی درون گونهای نیز بین صفر تا ۱ درصد متغیر میباشد که بیشترین میزان فاصله ژنتیکی درون گونهای مربوط به گونه C. ardosiaea میباشد (جدول ۶). محاسبه فواصل ژنتیکی درون گونهای برای برخی از گونهها به علت وجود تنها یک توالی از آن ها در بانک ژن مقدور نبود.
نتایج مطالعه مولکولی انجام شده براساس دادههای ژن CO1، با نتایج مطالعات ریختشناختی مطابقت نشان می دهد و تعلق نمونههای مورد مطالعه را به گونه C. karachiensisرا مورد تایید قرار میدهد. نتایج فوق بیانگر اهمیت انجام مطالعات دقیق بر روی شناسایی گونههای زیررده Patellogastropoda با استفاده از ابزارهای مختلف ریختی و و مولکولی همچون ساختار رادولا و توالی CO1 در کنار صفات ظاهری پوسته و پا میباشد.