Document Type : Research Paper
Authors
Abstract
Population structure of Epinephelus coioides (Hamilton, 1822), Orange-spotted grouper, was studied based on six polymorphic microsatellite loci in the Persian Gulf waters. 3-5 gr of each individual’s soft tissue were prepared through 120 hunted individuals of 4 sampling stations. DNA extraction was performed using a standard ammonium/acetate method. Quantification and quality control of DNA were done using spectrophotometery method and 1% agarose gel electrophoresis. DNA fragments was amplified via PCR and the products were run on polyacrylamide gel. Staining of the gels was performed through silver nitrate. Statistical analysis represented mean of genetic parameters include real and effective alleles, observed and expected heterozygosity for over loci in all populations, 5.458, 3.793, 0.500 and 0.649 respectively. The AMOVA test showed maximum rate of Fst (0.086) and minimum rate of Nm (2.652) between Khuzestan and Bushehr populations; Also minimum rate of Fst (0.034) and maximum rate of Nm (7.070) were between Dayyer and Bandar-Abbas populations. Khuzestan was the ultimate population and results were showed an intermediate separation from other studied populations; thereby separated fisheries management is recommended.
Keywords
مطالعه ساختار جمعیتی هامور معمولی Epinephelus coioides (Hamilton, 1822) با استفاده از نشانگرهای ریزماهواره در خلیج فارس
حامد قناعتیان1، محمد علی سالاری علی آبادی1*، مهدی محمدی2، حسین ذوالقرنین1 و سید احمد قاسمی2
1خرمشهر، دانشگاه علوم و فنون دریایی خرمشهر، دانشکده علوم دریایی و اقیانوسی، گروه بیولوژی دریا
2بوشهر، دانشگاه خلیج فارس بوشهر، مرکز مطالعات و پژوهشهای خلیج فارس، گروه بیوتکنولوژی دریا
تاریخ دریافت: 28/8/90 تاریخ پذیرش: 23/5/91
چکیده
ساختار جمعیتی Epinephelus coioides، هامور معمولی، در خلیج فارس از نظر 6 جایگاه ریزماهواره پلی مورف مورد بررسی قرار گرفت. 5-3 گرم از بافت نرم هر کدام از 120 نمونه صید شده از 4 ایستگاه تهیه گردید. استخراج DNA با استفاده از روش استاندارد استات آمونیوم انجام وکمیت و کیفیت آن با روشهای اسپکتروفتومتری و الکتروفورز بر روی ژل آگارز 1 درصد بررسی شد. قطعات DNA در دستگاه PCR تکثیر شده سپس بر روی ژل پلی اکریلامید رانده شد و رنگ آمیزی با کمک نیترات نقره صورت گرفت. میانگین پارامترهای ژنتیکی شامل آللهای واقعی و موثر برای تمامی لوکوسها و جمعیتها، بترتیب 458/5 و 793/3، همچنین هتروزیگوسیتی مشاهده شده و قابل انتظار بترتیب 500/0 و 649/0 میباشد. آزمون AMOVA بیشترین میزان Fst، (086/0) و کمترین میزان جریان ژنی (652/2=Nm) را بین دو جمعیت خوزستان و بوشهر، کمترین میزان Fst، (034/0) و بیشترین میزان جریان ژنی (070/7=Nm) را بین دو جمعیت دیر و بندرعباس نشان داد. جمعیت خوزستان جدایی نسبی را در قیاس با سایر جمعیتهای مورد مطالعه نشان میدهد، بنابر این اعمال مدیریت شیلاتی جداگانه توصیه میگردد.
واژه های کلیدی: ساختار جمعیتی، تنوع ژنتیکی، ریزماهواره، خلیج فارس، هامور معمولی
* نویسنده مسئول، تلفن: 09133555872، پست الکترونیکی: salari@kmsu.ac.ir
مقدمه
خلیج فارس در بر دارنده مجموعهای متنوع و بی نظیر از حیات وحش است. این پهنه آبی منحصر به فرد از آبهای بین المللی جدا بوده و تنها از طریق باریکه هرمز به آبهای آزاد مرتبط است. خلیج فارس زیستگاهی مناسب برای بسیاری از گونههای گیاهی و جانوری محسوب میشود. برخی از این گونهها در معرض خطر انقراض و یا تهدید جدی اکولوژیک قرار گرفته اند (3). هامور معمولی (Epinephelus coioides, Hamilton, 1822) از جمله با ارزش ترین و اقتصادیترین ماهیان خلیج فارس محسوب میشود. تاکنون هیچ مطالعهای پیرامون تنوع ژنتیکی و ساختار جمعیتی این گونه در خلیج فارس صورت نگرفته است، بنابراین مطالعه حاضر میتواند پاسخگوی سوالات بسیاری پیرامون خصوصیات جمعیتی این گونه با ارزش و اقتصادی در خلیج فارس باشد.
هامور معمولی در لیست قرمز IUCN بعنوان گونه تقریباً تهدید شده قرار گرفته است. این گونه متعلق به خانواده Serranidae بوده و بهمراه دیگر اعضای جنس Epinephelus نقش مهمی در فعالیتهای جهانی آبزی پروری ایفا میکند (4). زیستگاه طبیعی این گونه، جنگل های مانگرو نواحی گرمسیری و نیمه گرمسیری، آبسنگهای ساحلی گل آلود، بسترهای آبی زیر جزر و مدی، آبسنگهای مرجانی، مصبها و لاگونهاست (6).
نشانگرهای DNA انقلابی در مطالعه ویژگیهای جمعیتی آبزیان بوجود آورده است (12). توالیهای DNA یا ژنها که میتوانند جهت شناسایی افراد یا گونهها استفاده شوند، نشانگرهای ژنتیکیاند. این نشانگرها باید براحتی قابل شناسایی، متعلق به جایگاه خاصی از ژنوم و دارای پلی مورفیسم بالا باشند (14). ریزماهواره ها (میکروستلایتها) یا توالیهای ساده تکرار شونده (SSRs)، توالیهای تکراری 6-1 جفت باز از DNA میباشند. تنوع بالای ریز ماهوارهها بدلیل میزان بالای جهش در مقایسه با سایر نقاطDNA است. کاربرد و تفسیر نتایج نسبتاً ساده، تشخیص پلی مورفیسم بالا، فراوانی زیاد در ژنوم یوکاریوتها، هم بارز بودن و تبعیت از توالی های ساده مندلی و در نتیجه امکان تشخیص افراد هتروزیگوت، امکان استفاده از آغازگرهای ریز ماهوارهای یک گونه در گونههای نزدیک و سیستم چند آللی از ویژگیهای بارز این نشانگر است (22 و 23).
اطلاعات بدست آمده به کمک نشانگرهای مولکولی، درک بهتر از تنوع ژنتیکی گونههای دریایی نظیر هامور معمولی را هموار کرده، همچنین اطلاعات پیرامون فاصله ژنتیکی جمعیتها که در مدیریت شیلاتی و آبزی پروری حائز اهمیت است، فراهم مینماید. هدف از انجام این تحقیق ارائه اطلاعات بیشتر در مورد ساختار ژنتیکی جمعیتهای گونه هامور معمولی و تعیین تنوع ژنتیکی و شناسایی اختلافات ژنتیکی احتمالی موجود در بین جمعیتهای خوزستان، بوشهر، دیر و بندرعباس میباشد.
مواد و روشها
این پژوهش در آبهای سواحل شمالی خلیج فارس صورت گرفت و برای پوشش کامل منطقه دو ایستگاه در منتهی الیه شرقی و غربی و دو ایستگاه در مناطق میانی بطوری که از فاصله جغرافیایی مناسبی برخوردار باشند در نظر گرفته شد (شکل 1). پس از مشخص کردن ایستگاههای مناسب، 5-3 گرم از بافت نرم هر کدام از 120 نمونه صید شده هامور معمولی (هر ایستگاه 30 نمونه) تهیه گردید. نمونههای تهیه شده از 4 ایستگاه (خوزستان، بوشهر، دیر و بندرعباس) در اتانول خالص (96 درصد) فیکس شده، به آزمایشگاه بیوتکنولوژی مرکز مطالعات و پژوهشهای خلیج فارس انتقال یافت. نمونهبرداری طی ماههای خرداد و تیر 1389 صورت گرفت.
شکل1. موقعیت ایستگاه های نمونه برداری، ایستگاه1: خوزستان (خور موسی و هندیجان)، ایستگاه2: بوشهر، ایستگاه3: دیر و ایستگاه4: بندرعباس
استخراج DNA با استفاده از روش استاندارد استات آمونیوم انجام و کمیت و کیفیت آن با روشهای اسپکتروفتومتری و الکتروفورز بر روی ژل آگارز 1 درصد بررسی شد. قطعات مورد نظر DNA توسط واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) و به کمک 6 آغازگر (پرایمر) ریز ماهواره تکثیر شد. بدلیل این که آغازگر اختصاصی برای این گونه طراحی نشده از آغازگرهای گونههای نزدیک استفاده گردید (جدول 1). پنج جفت آغازگر مربوط به گونه E. mera شامل Em-01، Em-03، Em-08 (17)، Em-07 و Em-10 (25) و یک جفت آغازگر دیگر مربوط به گونه E. quernus شامل CA-7 بودند (21). پرایمرهای ذکر شده با سفارش به شرکت بین المللی Metabion در آلمان تهیه شد.
جدول1- خصوصیات آغازگرها
جایگاه ریزماهواره |
توالی آغازگر |
(ᶿ/˚c)دمای اتصال |
Em-01 |
F: 5’ –TATCTGGCAGAGGTTTTATT- 3’ R: 5’ –TTGGTTCTTATTGTTACTTT- 3’ |
49 |
Em-03 |
F: 5’ –AATACGGACACACGCACA- 3’ R: 5’ –GAACACGACCCCTGCTAA- 3’ |
55 |
Em-07 |
F: 5’ –ACTCTGCTCCCGCTTTGCTT- 3’ R: 5’ –TCTGTTTTGTCTCGCTTTTG- 3’ |
58 |
Em-08 |
F: 5’ –CCCCCTCTATCTCTCCAC- 3’ R: 5’ –CAAATAAGGCACGCTCTC- 3’ |
55 |
Em-10 |
F: 5’ –AAGACAAATAAATGCAGA- 3’ R: 5’ –ACCACAGGGGACTAAAGA- 3’ |
50 |
CA-7 |
F: 5’ –CACAGTGAAATACTCATAAGTGATG- 3’ R: 5’ –CAAGATGCCTGGGTATTTTTGG- 3’ |
40 |
جهت جداسازی بهتر محصولات PCR، از الکتروفورز بر روی ژل پلی اکریلامید استفاده گردید. الکتروفورز عمودی برای هر ژل پلی اکریلامید با جریان 150 ولت به مدت 3 ساعت انجام شد. در نهایت ژل از صفحات شیشهای جدا شده، رنگ آمیزی توسط نیترات نقره انجام گردید (22). پس از عکس برداری از ژل ها، از نرم افزار LabImage 1D 2006 ver. 3.3.3 برای امتیاز دهی به باندها و محاسبه وزن مولکولی آنها، و از نرم افزار GeneAlex جهت آنالیزهای آماری (محاسبه تعداد آللهای واقعی و مؤثر، هتروزیگوسیتی مشاهده شده و مورد انتظار، Fst و جریان ژنی، فاصله و شباهت ژنتیکی) استفاده گردید (20). در نهایت دندروگرام فاصله ژنتیکی بر اساس معیار Nei (16) با استفاده از نرم افزار TFPGA ver. 1.3 رسم گردید (13).
نتایج
بررسی تیزی و شفافیت باندهای DNA بر روی ژل آگارز 1% به کمک UV transilluminator همچنین بررسی کمیت آنها بوسیله دستگاه اسپکتروفتومتری، نشان داد کیفیت و کمیت DNA استخراجی مناسب بوده و میزان OD260/OD280، عموماً بین 8/1 تا 2 است. آنالیزهای آماری نشان داد میانگین آللهای واقعی برای تمامی لوکوس ها و در هر جمعیت بین 667/4 (خوزستان) و 333/6 (بندرعباس) بوده و میانگین آللهای مؤثر برای تمامی لوکوس ها و در هر جمعیت بین 621/3 (دیر) و 559/4 (بندرعباس) میباشد. میزان هتروزیگوسیتی مشاهده شده بین 493/0 (دیر) و 513/. (خوزستان) و میانگین هتروزیگوسیتی مشاهده شده برای تمامی لوکوسها و جمعیتها، 500/0 نشان داده شد. بالاترین میزان شاخص شانون برای جمعیت بندرعباس (352/1) و پایینترین میزان برای جمعیت خوزستان (222/1) بدست آمد (جدول 2).
بررسی میزان انحراف از تعادل هاردی-واینبرگ به کمک آزمون مربع کای (05/0>P) نشان داد همه جمعیتها در تمامی لوکوسها به استثنای جمعیت خوزستان در لوکوس Em-10 خارج از تعادل هاردی-واینبرگ هستند. بیشترین میزان Fst و کمترین میزان جریان ژنی بر اساس آزمون AMOVA در سطح خطای 1%، بترتیب 086/0 و 625/2 بین جمعیتهای خوزستان و بوشهر، همچنین کمترین میزان Fst و بیشترین میزان جریان ژنی بترتیب 034/0 و 070/7 بین جمعیتهای دیر و بندرعباس گزارش شد (جدول 3).
جدول2- میانگین پارامترهای ژنتیکی برای تمامی لوکوس ها در هر جمعیت
جمعیت |
N |
Na |
Ne |
I |
Ho |
He |
F |
خوزستان |
000/30 |
667/4 |
271/3 |
222/1 |
513/0 |
655/0 |
267/0 |
بوشهر |
000/30 |
833/5 |
721/3 |
275/1 |
494/0 |
635/0 |
335/0 |
دیر |
000/30 |
000/5 |
621/3 |
269/1 |
493/0 |
645/0 |
368/0 |
بندرعباس |
000/30 |
333/6 |
559/4 |
352/1 |
500/0 |
661/0 |
365/0 |
میانگین |
000/30 |
458/5 |
793/3 |
280/1 |
500/0 |
649/0 |
334/0 |
N = تعداد نمونهها، Na = تعداد آللهای واقعی، Ne = تعداد آللهای مؤثر، I = شاخص تنوع شانون، Ho = هتروزیگوسیتی
مشاهده شده، He = هتروزیگوسیتی مورد انتظار
جدول3- میزان جریان ژنی و Fst بین جمعیت های مناطق خوزستان، بوشهر، دیر و بندرعباس بر اساس آزمون AMOVA در سطح خطای 1% (مقادیر زیر خط قطری نشان دهنده مقدار Fst و مقادیر بالای خط قطری نشان دهنده میزان جریان ژنی می باشد).
مناطق |
خوزستان |
بوشهر |
دیر |
بندرعباس |
خوزستان |
*** |
652/2 |
294/5 |
508/3 |
بوشهر |
086/0 |
*** |
013/5 |
204/5 |
دیر |
045/0 |
048/0 |
*** |
070/7 |
بندرعباس |
067/0 |
046/0 |
034/0 |
*** |
ماتریکس جفت جمعیتی فاصله ژنتیکی بر اساس معیار Nei نیز بیشترین فاصله ژنتیکی را بین جمعیتهای بوشهر و خوزستان (226/0) و کمترین فاصله ژنتیکی را بین جمعیتهای دیر و بندرعباس (105/0) نشان داد (جدول4). دندوگرام فاصله ژنتیکی بر اساس معیار Nei با استفاده از نرمافزار TFPGA نیز این مسئله را نشان داد (شکل2).
جدول4- ماتریکس جفت جمعیتی فاصله ژنتیکی بر اساس معیار 1972 Nei,
جمعیت ها |
خوزستان |
بوشهر |
دیر |
بندرعباس |
خوزستان |
000/0 |
- |
- |
- |
بوشهر |
226/0 |
000/0 |
- |
- |
دیر |
169/0 |
134/0 |
000/0 |
- |
بندرعباس |
159/0 |
138/0 |
105/0 |
000/0 |
شکل2. دندوگرام فاصله ژنتیکی بر اساس معیار 1972 Nei, (1: خوزستان، 2: بوشهر، 3: دیر، 4: بندرعباس).
بحث و نتیجه گیری
تعداد افرادی که در هر نمونهبرداری انتخاب میشوند، نکته مهمی در مطالعه ژنتیک جمعیتها و ساختارشان است. در مطالعهای مشابه بر روی هامور معمولی در آبهای تایلند، محققان تعداد50-30 نمونه به ازای هر ایستگاه انتخاب کردند (4)، این تعداد در برخی پژوهشها کمتر (24) و در برخی دیگر بیشتر است (1، 2 و 11). بر اساس نظریه O’Connell تعداد 50 نمونه و شناسایی 10-5 آلل در کل برای مطالعه ساختار جمعیتها کافی است (19). بنابراین تعداد 30 نمونه صید شده از هر ایستگاه و در مجموع انتخاب 120 نمونه برای این مطالعه مناسب بوده است.
همان طور که ذکر شد بدلیل طراحی نشدن پرایمر اختصاصی E. coioides، از پرایمرهای اختصاصی گونههای نزدیک یعنی E. mera و E. quernus استفاده شد. استفاده از پرایمر گونههای نزدیک در مطالعات ممکن است موجب بروز اشتباهاتی نظیر جهشهای نقطهای یا بروز آللهای نول شود (10). بنابراین این مسئله از محدودیتهای مطالعه حاضر و مطالعات مشابه بوده، لذا تلاش برای طراحی و ساخت آغازگرهای اختصاصی گونه مورد مطالعه توصیه میشود. آزمون مربع کای نشان داد تمامی جمعیتها در تمامی لوکوسها باستثنای یک مورد خارج از تعادل هاردی-واینبرگ هستند. جمعیتها احتمالاً بدلیل فراوانی هموزیگوتها، خارج از تعادل هاردی-واینبرگ هستند. درون آمیزی، در نتیجه جمعیت موثر کوچک و یا تعداد نامساوی والدین نر و ماده ممکن است دلایل انحراف از تعادل باشند (4، 8 و 26). حضور آللهای نول در برخی لوکوسها و جمعیتها میتواند از دیگر دلایل این امر محسوب شود (8 و 26). گاهی اوقات فراوانی هموزیگوتها و انحراف از تعادل ممکن است بدلیل حضور افراد کاملاً خویشاوند در نمونه باشد که نمیتوانند معرفی از کل جامعه باشند (15).
میزان هتروزیگوسیتی و تعداد آللهای مشاهده شده (333/6 – 667/4Na =؛ 513/0 – 493/0 Ho =) در هامور معمولی تقریباً با آنچه در دیگر گونههای epinephelin گزارش شده همخوانی دارد (17 و 21). از سوی دیگر با وجود اینکه لاروهای ماهی تقریباً ساکن هامور معمولی، پلاژیکاند و توانایی ذاتی پراکنش بالایی دارند، در مقایسه با ماهیان مهاجر نظیر yellowtail king fish با 729/0Ho= (18) و یا شیر ماهی با 988/0Ho= (3) هتروزیگوسیتی نسبتاً پایینی دارند.
ساختار جمعیتی هامور معمولی (54/0Fst =) در مقایسه با آنچه در ماهیان پلاژیک گزارش شده، yellowtail kingfish با 046/0 Fst = (18) و شیر ماهی با 031/0Fst = (3) و در مقایسه با گونههای کفزی نظیر vermillion snapper با 004/0 Fst = (5) و dusky grouper با 018/0 Fst = (7)، قویتر است. این ساختار جمعیتی قوی پیشنهاد میکند که جمعیت هامور ماهیان کوچک و قرنطینه است و دلبستگی به زیستگاه و حس قلمرو طلبی در نرها بالاست (4 و 9). چنین خصوصیاتی موجب تمایز جمعیتها میشود.
بطور کلی تمایز ژنتیکی در میان جمعیتهای مورد مطالعه پایین است و این مسئله میتواند موجب کاهش سازش پذیری این موجود در مقابل تغییرات محیطی شود. دندروگرام فاصله ژنتیکی چکیدهای از تمام پارامترها را نشان می دهد. طبق این نمودار دیر و بندرعباس نزدیکترین جمعیتها به هم بوده و خوزستان دورترین جمعیت از سایرین است. گرچه تمایز ژنتیکی بین جمعیتها کم است اما این واقعیت که جمعیت خوزستان نسبتاً از سایر جمعیتها جدا شده واضح و آشکار است. تخریب زیستگاه، بستر متفاوت، آلودگی محیط و فشارهای زیست محیطی بطور کلی، می توانند از دلایل عمده وقوع چنین پدیدهای باشند. از سوی دیگر بندرعباس متنوعترین جمعیت مورد مطالعه است. بنابراین اعمال مدیریت جداگانه بر این جوامع منطقی بنظر میرسد. ایجاد محدودیت های صیادی در دوره تخم ریزی، پایش اثرات طبیعی و فعالیتهای انسانی بر جوامع وحشی هامور معمولی فواید انکارناپذیری در بر خواهد داشت.
تشکر و قدردانی
ضمن تشکر از اساتید و کارکنان مرکز مطالعات و پژوهشهای خلیج فارس و دانشگاه علوم و فنون دریایی خرمشهر، از زحمات بی شائبه مهندس مصطفی کامیاب که در تمامی مراحل این پژوهش همراه ما بودند همچنین مهندس محمد رضا صحرائیان، مهندس مجتبی نادری و مهندس صدرالدین مقدم که در مرحله نمونهبرداری ما را یاری نمودند قدردانی میگردد.
10. Jarne, P., and Lagoda, P. J. L., 1996. Microsatellites, from Molecules to Populations and Back. Trends in Ecology and Evolution, 11: 424-429.
11. Larsson, L. C., Liker, L., Palm, S., Andre, C., Carvalho, G. R., and Ryman, N., 2007. Concordance of Allozyme and Microsatellite Differentiation in a Marine Fish, but Evidence of Selection at a Microsatellite Locus. Molecular Ecology, 16: 1135–1147.
12. Liua, Z. J., and Cordes, J. F., 2004. DNA Marker Technologies and Their Applications in Aquaculture Genetics. Aquaculture, 238 (2004). 1 –37.
13. Miller, M. P., 1997. Tools for Population Genetic Analysis (TFPGA) version 1.3. A Window Program for the Analysis of Allozyme and Molecular Population Genetic Data.
14. Murgia, C., Pritchard, J. K., Kim, S. Y., Fassati, A., and Weiss, R. A., 2006. Clonal Origin and Evolution of a Transmissible Cancer. Cell, 126(3): 477-87.
15. Na-Nakorn, U., Kamonrat, W., and Ngamsiri, T., 2004. Genetic Diversity of Walking Catfish, Clarias macrocephalus, in Thailand and Evidence of Genetic Introgression from Introduced Farmed C. gariepinus. Aquaculture, 240: 145–163.
16. Nei, M., 1972. Genetic Distance Between Populations. American Naturalist, 106: 283-292.
17. Nugroho, E., Takagi, M., Sugama, K., and Taniguchi, N., 1998. Detection of GT Repeats Microsatellite Loci and Their Polymorphism for Grouper of the Genus Epinephelus. Fish Sci, 64: 836–837.
18. Nugroho, E., Ferrel, D. J., Smith, P., and Taniguchi, N., 2001. Genetic Divergence of Kingfish from Japan, Australia and New Zealand Inferred by Microsatellite DNA and Mitochondrial DNA Control Region Markers. Fish Sci, 67: 843–850.
19. O'connell, M., Skibinski, D. O. F., and Beardmore, J. A., 1997. Absence of Restriction Site Variation in the mtDNA and ND6 Gene of Atlantic Salmon Amplified by the Polymerase Chain Reaction. Fish Biology, 47: 910-913.
20. Peakall, M., and Smouse, A., 2005. Gene Alex 6: Genetic Analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research. The Australian national university, Canberra, Australia.
21. Rivera, M. A. J., Graham, G. C., and Roderick, G. K., 2003. Isolation and Characterization of Nine Microsatellite Loci from the Hawaiian Grouper Epinephelus quernus (Serranidae) for Population Genetic Analyses. Mar Biotechnol, 5: 126–129.
22. Salari Aliabadi, M. A., Rezvani Gilkolaei, S., Savari, A., Zolgharnian, H., and Nabavi, S. M. B., 2009. Population genetic structure of cobia (Rachycentron canadum) revealed by microsatellite DNA markers. Journal of Applied Biological Sciences, 3 (1): 96-100.
23. Schlottere, C., 2000. Evolutionary Dynamics of Microsatellite DNA. Springer-Verlag. London. U.K.
24. Shaowu, Y., Jingqiu, L., Hai Guohua, Ch., Ben, Zh., and Shu, Y., 2008. Genetic Polymorphism of Microsatellite DNA of Natural and Cultured Populations of Epinephelus malabaricus in the Sea Close to Hainan, China. Chin J Appl Environ Biol, 14 (2): 215-219.
25. Taniguchi, N., and Nugroho, E., 2000. Genetic Characteristics of Introduced Fishes and Study of Genetic Evaluation of Fish Genetics and Breeding. (Japan: Japan Seawater Fisheries Cultivation Association) (In Japanese). 141–188.
26. Valles-Jimenez, R., Cruz, P., and Perez-Enriquez, R., 2005. Population Genetic Structure of Pacific White Shrimp (Litopenaeus vannamei) from Mexico to Panama: Microsatellite DNA Variation. Marine Biotechnology, 6: 475–484.