Document Type : Research Paper
Author
Abstract
The aim of this research was to study the potency of Alginate biopolymer as a microenvironment for differentiation of human adipose tissue derived mesenchymal stem cells (hAMSCs) to chondrocytes. For this purpose, human adipose tissue was prepared from health voluntary donors with liposuction and digested by collagenase type ׀. The mesenchymal stem cells cultured in alginate beads in presence of TGF-β1 and ascorbic acid. Alcian blue staining was done to show the differentiation of mesenchymal stem cell to chondrocytes. RT-PCR was done for the evaluation of collagen type II gene expression as a chondrocytic molecular marker. Immuno-cytochemical staining of isolated cells by anti human Vimentin antibody indicated to more than 95% of positive cells as hAMSCs. After induction of chondrogenic differentiation in alginate beads, alcian blue staining showed expression of sulphated proteoglycans in chondrocytes. Positive stained cells in controls and alginate beaded cultured cells indicated to (36.5% ± 0.7 and 56.5 ± 4.9 at day 3) and ( 83% ± 2.8 and 93 ± 2.8 at day 14) respectively. RT-PCR results indicated to the expression of collagen type II in alginate bead cultured cells and the comparison of results by controls indicated to significant increased expression in alginate bead cultured cells. (43% ± 4.5 and 70 ± 5 at day 3) and ( 54% ± 2.8 and 77 ± 1.4 at day 14) respectively. In conclusion, our result indicated and supported the using of alginate beads as 3 dimentional culture system in tissue engineering for chondrogenic culture system.
Keywords
زیست پلیمرآلژینات بعنوان بستر سه بعدی جهت کشت و تمایز سلولهای بنیادین مزانشیمی بافت چربی انسان به سلولهای کندروسیت غضروف
عبدالخالق دیزجی*، لعیا هدایی و زهرا سهیلا سهیلی
تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، علوم پایه، گروه بیوشیمی
تاریخ دریافت: 20/1/92 تاریخ پذیرش: 12/6/92
چکیده
هدف از مطالعه حاضر بررسی توانایی زیست پلیمر آلژینات به عنوان بستری برای تمایز سلولهای مزانشیمی بافت چربی انسانی به سلولهای کندروسیت میباشد. بدین منظور سلولهای بنیادی مزانشیمی از بافت چربی انسانی افراد سالم توسط کلاژناز نوع I جداسازی و کشت داده شدند. سپس این سلولها در بستر آلژینات با استفاده از اسید اسکوربیک و TGF-β1 به کندروسیت تمایز داده شدند. توانایی بستر آلژینات در تولید سلولهای کندروسیت براساس بیان مارکرهای مولکولی مانند کلاژن نوع II به روشRT-PCR و همچنین بیان پروتئوگلیکانهای سولفاته به روش رنگ آمیزیAlcian Blue انجام گرفت. رنگ آمیزی ایمونوشیمی با آنتی بادی بر علیه Vimentin نشانگر بالای 95% از سلولهای بنیادین مزانشیمی بود. در رنگآمیزی Alcian Blue درصد سلولهای رنگ شده در سلولهای کنترل و سلولهای کشت داده شده در بستر آلژینات به ترتیب در روز سوم (4.9 ± 56.5 و 0.7 ± 36.5 %) و در روز چهاردهم (2.8 ± 93 و 2.8 ± 83 %) بود. این یافتهها و نسبتها در روزهای سوم و پنجم از نظر آماری اختلاف معنیدار با هم داشتند. درصد بیان کلاژن نوع II سلولهای کنترل و سلولهای کشت داده شده در بستر آلژینات به ترتیب در روز سوم (5 ± 70 و 4.5 ± 43 %) و در روز چهاردهم (1.4 ± 77 و 2.8 ± 54 %) نسبت به بیان ژنGAPDH می باشد. بطور کلی نتایج حاصل کاربری سیستم آلژینات را در مهندسی بافت برای تولید کندروسیت پیشنهاد میکند.
واژههای کلیدی: سلول مزانشیمی بافت چربی انسانی، داربست آلژینات، تمایز به کندروسیت
* نویسنده مسئول، تلفن: 02144787377، پست الکترونیکی: deezagi@nigeb.ac.ir
مقدمه
هدف اصلی در مهندسی بافت بازسازی و یا تولید بافت یا اندام سالم برای جایگزینی بافتهای ناسالم و یا ترمیم بافت های آسیب دیده یک بیمار میباشد. ظرفیت محدود سلولهای بالغ یک بافت از نظر تقسیم سلولی و تکثیر و تمایز آنها به سلولهای تمایز یافته و بخصوص عدم رگزایی کافی این سلولها در محیط آزمایشگاهی از محدودیت کاربردی آنها در مهندسی بافت میباشد. سه جز اصلی شکلگیری یک بافت در مهندسی بافت نوع سلول، داربست و فاکتورهای رشد مورد استفاده میباشند (12). لذا مهندسی بافت شامل جداسازی سلولهای ویژه و خاص از منبع سلولی مناسب، رشد و تکثیر آنها در داربستهای سه بعدی تحت شرایط کشت سلولی مناسب در محیط In vitro و در نهایت قرار دادن این مجموعه در محل مناسب در بدن بیمار و هدایت تشکیل بافت جدید در میان داربست میباشد. استفاده از منبع سلولی مناسب به ویژه سلولهای بدست آمده از فرد بیمار تا حدود زیادی موجب کاهش مشکلات مربوط به سیستم ایمنی میگردد (20). با معرفی و شناخت پتانسیل سلولهای بنیادی در دو دهه گذشته این سلولها جایگاه ویژهای را در مهندسی بافت پیدا کرده اند. سلولهای بنیادی سلولهایی تمایز نیافته میباشند که توسط دو خصوصیت خود نوسازی (Self-renewal) و توانایی تولید انواع مختلف سلولهای اختصاصی و اجدادی مشخص میشوند. در استفاده از این سلولها در مهندسی بافت در جهت افزایش بازدهی، محققین با دیدگاههای مختلف عوامل متفاوتی را بررسی میکنند. از مهمترین آنها میتوان به بررسی پتانسیل سلولهای بنیادی از منابع مختلف بافتی، عوامل و فاکتورهای مؤثر در رشد، عوامل القا کننده تمایز و همچنین عوامل ایجاد کننده بستر و Microenvironment و... اشاره کرد. از میان سلولهای بنیادی فرد بالغ، سلولهای بنیادی مزانشیمی منابع مناسبی برای مهندسی بافت میباشند (23). این سلولها براحتی از بافتهای گوناگون نظیر مغز استخوان، بافت چربی و ... جداسازی و بدون از دست دادن ظرفیت و توانایی خود نوسازی خود در محیطin vitro کشت داده میشوند و در نهایت توانایی تمایز به سلولهایی نظیر کندروسیتها، آدیپوسیتها و... را دارند (17). سلولهای بنیادی مزانشیمال جمعیتی از سلولهای بنیادین سوماتیک چند توانه میباشند که تاکنون در بافتهایی نظیر: مغز استخوان، ماهیچه اسکلتی، مغز، بافتچربی، خون بندناف، خون محیطی و بافتهای پیوندی پوستی شناسایی شدهاند. سلولهای مزانشیمی، برای مارکرهای سطحی شامل105, 106 and 166) CD (29, 44, 73, 90, مثبت بوده و فاقد مارکرهای سطحی هماتوپوئتیک و HLA-DR میباشند (3). این سلولها صرفنظر از منبع مربوط به آن، در پارهای از خصوصیات نظیر: توانایی تکثیر و خود نوسازی طولانی مدت تحت شرایط کنترل شده کشت سلول، مرفولوژی دوکی شکل- فیبروبلاست مانند و پتانسیل تمایز به دودمان مزودرمی و حتی غیر مزودرمی، مشترک میباشند (19). سلولهای مزانشیمی، پتانسیل تمایز به سلولهای مزودرم احشایی، اﺳﺗﺌوبلاست، آدیپوسیت، کندروسیت و مایوسیت، را دارا میباشند. همچنین مطالعات اخیر نشان دادهاند که در ریز محیط مناسب، سلولهای مزانشیمی میتوانند به کاردیومیوسیت و یا حتی سلولهایی از مشتقات غیر مزودرمی نظیر هپاتوسیتها و نورونها، تمایز یابند. تمامی خصوصیات ذکر شده، سلولهای بنیادی مزانشیمال را تبدیل به منبع سلولی مناسبی جهت کاربرد در مهندسی بافت و سلول درمانی ساخته است (8). مشخص شده است که سلولهای بنیادین مزانشیمی بدست آمده از بافت چربی ADMSCs)) و مغز استخوان BDMSCs)) هیچ یک از آنتی ژنهای تحریکی نظیر آنتیژنهای نوع دوHLA و همچنین مولکولهای هم- تحریکی نظیر (۸٠CD و ۸۵ (CDرا یا بیان نمیکنند و یا در سطح بسیار ناچیزی بیان میکنند و به طور کلی این سلولها ذاتاً ایمنوژنیک نبوده و استفاده از این سلولها در مهندسی بافت دارای اثرات تعدیل کنندگی سیستم ایمنی نیز میباشد (5). از دیگر مسائل مطرح در مهندسی بافت تهیه و آماده سازی داربستهای طبیعی و سنتتیک به عنوان بستر و ماتریکسی برای تکثیر و تمایز سلولها در محیط in vitro میباشد (9). پلیمرهای سنتزی (مانند آلژینات) که تحت شرایط کنترل شده تولید میشوند میتوانند برای مهندسی بافت مفید باشند. در رابطه با پلیمرهای سنتزی ویژگیهایی نظیر خواص مکانیکی، هندسه، شیمی سطح، تعداد منافذ و... باید در نظر گرفته شود (16). تاکنون مطالعات و تحقیقات زیادی در رابطه با بکارگیری سلولهای بنیادی و تمایز آنها به بافتهایی نظیر بافت استخوان، غضروف و... صورت گرفته است. از جمله میتوان تمایز سلولهای بنیادی بدست آمده از مغز استخوان با استفاده از داربستهای هیبریدی بتا-تری کلسیم فسفات-آلژینات-ژلاتین، تمایز سلولهای مزانشیمی بدست آمده از مغز استخوان به سلولهای کندروسیت در بستری از آلژینات را ذکر کرد (4، 10، 14 و 18). با توجه به موارد ذکر شده هدف از مطالعه حاضر بررسی توانایی آلژینات به عنوان ماتریکسی برای سلولهای مزانشیمی بدست آمده از بافت چربی انسانی در تمایز این سلولها به سلولهای کندروسیت میباشد.
مواد و روشها
جداسازی سلولهای مزانشیمی: بافت چربی زیر جلدی انسانی از طریق آسپیراسیون بافت چربی زیر جلدی از افراد سالم با رضایت بیماران توسط جراح تهیه شد. لیپوآسپیره حاصل به دفعات توسط بافر شستشو دهنده (Hanks Balanced Salt Sigma, St.Louis, MO, USA) Solution (HBSS) حاوی 200mg استرپتومایسین (Fluka, Switzerland) و 120mg پنیسیلین Fulka, Switzerland)) شستشو داده شد. سپس عمل هضم بافت توسط0.25mg/ml کلاژناز نوعI (200unit/mg) (شرکت Calbiochem) در محلول HBSS به مدت ٢ ساعت در°C ۳۷ صورت گرفت سپس سلول های آدیپوسیت شناور از طریق سانتریفوژ از سلولهای بنیادی ته نشین شده جداسازی شدند.
شمارش سلولی و تعیین درصد سلولهای زنده: در تمام مراحل کار برای شمارش سلولی از رنگ متیلن بلو و... برای تعیین درصد سلولهای زنده از روش رنگآمیزی تریپان بلو استفاده شد، تعداد کل سلولی و درصد سلولهای زنده با استفاده از لام نئوبار (Hemocytometer) در زیر میکروسکوپ نوری شمارش شد.
کشت سلولهای مزانشیمی: سلولهای حاصل در فلاسکهای کشت سلول cm275 و در محیط کشت سلولیDulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco, Grand Island, NY), FBS (Fetal Bovine Serum), %20، 200 mg استرپتومایسین و 120 mg پنی سیلین، به تعداد تقریبیcm2/5000 cell کشت داده شدند. محیط کشت هر ۳ روز یکبار تعویض شد. پس از پر شدن فلاسکها توسط سلولهای اولیه، سلولها با استفاده از ٢۵/٠ % تریپسین-EDTA 1mM جداسازی شده و به مدت ٢ هفته در محیط یک بعدی کشت داده شدند. پس از ٤-۳ پاساژ سلولها در محیط سه بعدی آلژینات کشت و به سلولهای کندروسیت تمایز داده شدند.
شناسایی و تعیین خصوصیات سلولهای مزانشیمی جداسازی شده به روش ایمونو سیتوشیمیImmuno cyto chemistry : پس از تهیه لام از سلولهای جداسازی شده توسط دستگاه سیتوسانتریفوژ Cell Spin(Tharmac) (دور rpm١۵٠٠ به مدت ١۵ دقیقه)، سلولها ابتدا توسط متانول در دمای C°١٠ به مدت ۵ دقیقه تثبیت شدند. سپس نمونهها با محلول بلوکه کننده (محلول بافر فسفات سالینPBST حاوی١٠% سرم موشی) به مدت ٢٠ دقیقه، به منظور مهار اتصالهای غیر اختصاصی آنتیبادی انکوبه شدند. پس از پایان ٢٠ دقیقه شستشو با PBST انجام گرفت. سپس آنتیبادی اولیهMonoclonal Mouse Anti-human vimentin (DAKO) با غلظت µg/ml٢ در محلول PBST حاوی ۵/١% سرم موشی اضافه و به مدت ١ ساعت در دمای اتاق انکوبه شد. بعد از سه بار شستشو با محلول PBST نمونهها توسط آنتیبادی ثانویه Goat Anti Mouse IgG Peroxidase conjugated (شرکتCalbiochem) با غلظت µg/ml١ در محلول PBST به مدت ٤۵ دقیقه در دمای اتاق انکوبه شدند. لامها بعد از سه بار شستشو با PBST با سوبسترای دی آمینو بنزیدین DAB انکوبه شده و بعد از شستشو جهت میانکنش اختصاصی مورد بررسی قرار گرفتند.
لامهای تهیه شده در زیر میکروسکوپ بررسی و در هر لام ٢٠٠ سلول جهت شناسایی درصد سلولهای رنگ شده و رنگ نشده شمارش گردید.
تهیه بستر و مهرههای آلژینات: تهیه بستر سه بعدی و مهرههای آلژینات برای کشت سلولهای مزانشیمی براساس روش کار Buccoو همکارانش انجام گرفت. روش کار بطور خلاصه به شرح زیر است. مهرههای آلژینات از طریق مخلوط سازی 2 الی 3 میلیون سلول بصورت سوسپانسیون سلولی (١٠٦×3-2 سلول در هر ml1) با ml۳ آلژینات4% استریل (low-Viscosity Alginic) acid, Sigma, St.Louis, MO, USA تهیه شدند. سوسپانسیون حاصل به سرنگcc ١٠ استریل انتقال داده شد و از میان سوزن ٢١ درجه به روش قطرهای بیان شدند. سپس عمل ژلاسیون مهرهها به طور آنی در ml۵ محلولCaCl2 mM١٠٢ در پلیت -Well6 (٢٠مهره در هر خانه، هر مهره به طور تقریبی شامل١٠٤ ×۵) صورت گرفت. سپس مهرهها به مدت ١۵ دقیقه به منظور ژلاسیون بیشتر در داخل محلولCaCl2 قرارگرفتند. پس از آن مهرهها سه بار توسط Nacl mM ١۵/٠ و یکبار توسط DMEM-HG (DMEM-high glucose) شستشو داده شدند. مهرهها سپس به مدت ١٤ روز در محیط تمایزی شامل DMEM-HG، مکمل Roche,) , ITS+) Transferrin- Selenium ×insulin-١، TGF- ß1(Roche) ng/ml ١٠ و μg ۵٠ آسکوربیک اسید کشت داده شدند. محیط ذکر شده هر سه روز یکبار تعویض شد.
تهیه بلوک از مهرههای آلژینات حاوی سلولها و رنگآمیزیAlcian blue : مهرههای آلژینات حاوی سلولهای تیمار شده جمعآوری و به مدت 24 ساعت در پارافرمالدئید 4% در دمای °C ٤ تثبیت شدند. سپس سه بار توسط محلول بافرPBS شستشو و مراحل آبگیری توسط درجات صعودی الکل صورت گرفت. سپس عمل پارافینه کردن بر اساس روشهای پارافینه کردن استاندارد صورت گرفت. مهرههای پارافینه شده حاصل توسط دستگاه میکروتوم به ضخامتμm ۵ برش داده شدند و در نهایت برای شناسایی پروتئوگلیکانهای سولفاته توسط (, St.Louis, MO, USA Sigma)Alcian blue براساس روش کار Steedman رنگآمیزی شدند (21).
برای رنگآمیزی نمونهها در ابتدا عمل آبدهی به ترتیب با قرارگیری نمونههای پارافینه شده در Xylene در دو تکرار دقیقهای و سپس با قرارگیری در درجات نزولی الکل شامل الکلهای١٠٠، ٩٠ و٧٠ % و هر مرحله به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق، صورت پذیرفت. سپس برای رنگآمیزی، در ابتدا نمونهها و اسیداستیک ۳% هر کدام به مدت ۵ دقیقه، سپس به مدت ۳٠ دقیقه در رنگ Alcian blue و پس از شستشو با آب مقطر در رنگ Neutlar fast red به مدت١٠ دقیقه قرار گرفتند و در نهایت پس از شستشو با آب مقطر، لاملها با ریختن یک قطره چسب هیستوشیمی بر روی لامها قرار گرفتند. لامهای تهیه شده در زیر میکروسکوپ بررسی و در هر لام ٢٠٠ سلول جهت شناسایی سلولهای رنگ شده و رنگ نشده شمارش گردید.
استخراج RNA و انجام RT-PCR برای بیان ژن کلاژن نوع II: استخراج RNAکل به صورتهای مختلف انجام میشود. در این تحقیق استخراج RNA با استفاده از محلول RNX (شرکت سینا ژن) انجام گرفت. جهت خارج سازی سلولها از مهرههای آلژینات و در نهایت استخراج RNA کل، پس از خارج نمودن محیط کشت، مهرهها توسط محلول بافر PBS شستشو داده شدند و سپس محلول mM٤٠ EDTA به مدت ١۵ دقیقه جهت هضم آلژینات به پلیت اضافه گردید و در پایان با انجام سانتریفوژ (دور g٢٠٠٠، به مدت ۵ دقیقه در دمای ٤ درجه سانتیگراد) سلولها رسوب داده شده و آلژینات و EDTA از محیط حذف شدند. پس از جمعآوری و رسوبدهی سلولها، به ازای هر ١ میلیون سلول معادل ١ میلیلیتر محلول RNX به ویالهای مورد نظر افزوده گردید. سپس ویالها به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق قرار داده شدند. لیز بیشتر سلولها، توسط سرنگml ١ به همراه سرسرنگ درجه ٢٠ صورت گرفت. برای این منظور سوسپانسیون سلولی٢٠ مرتبه از داخل سرنگ عبور داده شد.
پس از تعیین غلظت RNAهای استخراج شده، از مقدار غلظت یکسان ng١۳٠٠ RNA، برای ساخت cDNA استفاده شد. ساخت cDNA طبق بروشور کیت Fermentase با اضافه کردن میزان RNAهای تعیین شده به مواد ارائه شده در کیت، به صورت یک مرحلهای در دستگاه PCR انجام گرفت.
پس از سنتز cDNA، واکنش PCR به منظور ردیابی بیان ژن کلاژن تیپ دو (به عنوان ژن اختصاصی سلولهای کندروسیت) و ژن GAPDH (به عنوانHousekeeping gene) صورت پذیرفت. پس از تهیه مخلوط واکنش (ذکر شده در بخش مواد) و ورتکس کردن، مجموعه مذکور به دستگاهThermal cycler منتقل گردید.
محصولات پس از الکتروفورز بر روی ژل آگاروز در محلول اتیدیوم بروماید به مدت ١٠ دقیقه رنگآمیزی شد. پس از رنگآمیزی و شستن ژل در آب مقطر، تصویر ژل توسط دستگاه UV Transluminator مشاهده و توسط دستگاه UV tec عکسبرداری گردید. با توجه به پرایمرهای انتخاب شده، طول قطعات سنتز شده مربوط به GAPDH و کلاژن تیپ دو به ترتیب برابر ۵٢٠ و bp۳٦١ میباشد. باندهای حاصل توسط برنامه Total Lab به صورت کمی در آمدند و سپس عمل نرمال سازی دادهها بوسیله دادههای مربوط به Housekeeping gene صورت گرفت.
روشهای آماری: برای آنالیز آماری نتایج به دست آمده از برنامه One way Anova به صورت online استفاده شد.
یافتهها
جداسازی و هضم آنزیمی بافت: نمونههای لیپوآسپیره تهیه شده دارای حجم تقریبی بین ml١٠٠-٤٠ بوده و وزن آنها پس از اندازهگیری درحدود gr١٤٠-٨٠ برآورد شد. جهت جداسازی سلولها از دو آنزیم تریپسین-EDTA و کلاژناز تیپ یک استفاده به عمل آمد که در بخش مواد و روشها به آنها اشاره شد. در زمان استفاده از آنزیم تریپسین-EDTA، ٩٩% سلولهای جداسازی شده شامل سلولهای آدیپوسیت بودند و تنها یک درصد سلولهای جداسازی شده را سلولهای مزانشیمی تشکیل میدادند چرا که این آنزیم به طور کامل، قادر به هضم بافت چربی نمیباشد. که این امر، دال بر عدم کارایی موفق این آنزیم جهت جداسازی سلولهای مزانشیمی از این بافت میباشد. در عوض آنزیم کلاژناز تیپ یک، آنزیم مؤثری جهت تفکیک بافت و جداسازی سلولها میباشد.
درصد بقای سلولی در تمامی تکرارها بالای ٩٨% تعیین شد. شایان ذکر است با توجه به محدوده سنی افرادی که مورد عمل قرارگرفته بودند (٢۵-۳۵ سال)، در مورد تمامی نمونههای تهیه شده توان بقای سلولی و ورود سلولهای بنیادی به حالت فیزیولوژیک فعال، جهت انجام تستهای بعدی به طور مشابهی یکسان بود.
در جدول 1 شمارش سلولها بعد از مرحله جداسازی نشان داده شده است، نتایج نشان میدهد که صرف نظر از حجم های متفاوت از نمونه لیپوآسپیره (ml١٠٠-٤٠) دادهها از نظر تعداد سلولهای بدست آمده از روند خاصی تبعیت میکند نتایج تعداد سلولها در مرحله نهایی تا حد زیادی منطقی است و از یک روند مشخص مطابق با دادههای موجود در مقالات تبعیت میکند.
جدول ١- درصد نهایی سلول های بنیادی مزانشیمی جدا شده از نمونه لیپوآسپیره
نمونه |
تریپسین-(T)EDTA |
حجم اولیه نمونه (ml) |
حجم نهایی نمونه (پس از حذف بخش خونی (ml) |
وزن نهایی نمونه (پس از حذف بخش خونی) (gr) |
تعداد کل سلول های موجود در بافت* ( تعداد سلول ها |
تعداد سلول های مزانشیمی پس از هضم بافت چربی |
درصد سلول های مزانشیمی جداسازی شده به تعداد کل سلول ها |
کلاژناز تیپ (C) Ι |
|||||||
١ |
T |
١٠٠ |
۵۵ |
١٠ |
١٠٩×٤ |
٠ |
٠ |
٢ |
c |
٦٠ |
۵٠ |
١٠١ |
١٠١٠×٠٤/٤ |
١٠۵×٠٤/٢ |
۳-١٠ ×٠۷/۵ |
۳ |
c |
٤٠ |
٢۳ |
۵٩ |
١٠١٠×۳۶/٢ |
١٠۵ ×١ |
۳-١٠×٢۳/٤ |
٤ |
c |
٩٠ |
٦۵ |
٨٠ |
١٠١٠×٢/۳ |
١٠۵ ×۳ |
۳-١٠×۳۷/٩ |
۵ |
c |
۵٠ |
٤٢ |
٧١/٢ |
١٠١٠×۸۵/٢ |
١٠۵ ×٤۵/١ |
۳-١٠×٠۸/۵ |
٦ |
c |
۵۵ |
٤٠ |
٧٠ |
١٠١٠×۸/٢ |
١٠۵ ×١۵/١ |
۳-١٠×١/٤ |
٧ |
c |
٧۵ |
٦٤ |
٩۵ |
١٠١٠×۸/۳ |
١٠۵ ×١/٢ |
۳-١٠×۵٢/۵ |
کشت سلولهای بنیادین مزانشیمی: سلولهای بنیادین مزانشیمی سلولهای چسبنده هستند که از لحاظ مرفولوژیک، بسیار شبیه سلولهای فیبروبلاست می باشند و در محیط کشت سلولی به صورت اشکال دوکی شکل و کشیده، همراه با زوائد سیتوپلاسمی منشعب مشاهده می شوند. این سلولها در محیط کشتDMEM حاوی٢٠% سرم FBS و در انکوباتور در شرایط CO2 ۵%، 95% رطوبت و دمای °C۳٧ نگهداری شدند و با تراکم١٠٤×۵ سلول در هر سانتیمترمربع در ظروف کشت سلولی کشت داده میشدند و در نهایت پس از ٨-٧ پاساژ برای انجام تستهای ذکر شده در بخش روشها استفاده میشدند. شایان به ذکر است که سلولها در تمامی پاساژها دارای خصوصیات مرفولوژیک یکسان بوده و تفاوتی در ظاهر و یا بقای آنها مشاهده نشد (شکل1).
شکل 1-a- سلول های مزانشیمی در پاساژ دوم b- سلول های مزانشیمی در پاساژ هشتم (بزرگنمایی ١٠×۳٢ )
شکل2- تصویر سلول های مزانشیمی در روش ایمونوهیستوشیمی با آنتی بادی بر علیه Vimentin میانکنش داده و سپس توسط سوبسترای DAB در طی واکنش آنزیمی رنگ شده اند(بزرگنمایی ١٠×40).
شناسایی سلولهای مزانشیمی جداسازی شده به روشICC: به منظور تأیید سلولهای جداسازی شده به عنوان سلولهای بنیادی مزانشیمی از روش ICC و بکارگیری آنتیبادی Monoclonal mouse anti-vimentin که قادر به نشانهگذاری سلولهای مزانشیمی استفاده شد. پس از انجام آزمایش و مشاهده سلولها در زیر میکروسکوپ، ٩٩% سلولهای شمارش شده، توسط این آنتیبادی شناسایی شده و در رنگآمیزی نهایی توسط رنگ DAB به رنگ قهوهای در آمده بودند، که این نتایج دال بر خلوص سلولهای جداسازی شده به عنوان سلولهای بنیادی مزانشیمی میباشند (شکل2).
تمایز سلولهای مزانشیمی به سلولهای کندروسیت با بکارگیری داربستهای آلژینات: پس از تأیید سلولهای جداسازی شده، به عنوان سلولهای مزانشیمی و تکثیر آنها، در نهایت این سلولها جهت تمایز به سلولهای کندروسیت در داخل مهرههای آلژینات و بر روی ظروف کشت سلولی معمول به عنوان کنترل، کشت داده شدند و برای تمایز محیط تمایزی مطرح شده در بخش مواد به آنها افزوده گردید و هر سه روز یکبار این محیط تعویض شد. آنچه در رابطه با سلولهای کشت داده شده در ظروف کشت طبیعی(کنترل) بیشتر سلولها چسبندگی خود را با سطح حفظ کرده، اما در ارتباط با مهرههای آلژینات سلولها پس از قرارگرفتن در مهرههای آلژینات سلولها به صورت گرد در داخل مهرهها مشاهده شدند (شکل 3).
شکل۳- تصویر مهره ها ی آلژینات تهیه شده به روش قطره ای a – بزگنمایی10 ×1 b – بزگنمایی 10× 5 - c,d تصویر سلول ها درون مهره ها ی آلژینات بزگنمایی10 ×32
رنگ آمیزی Alcian blue: رنگآمیزی فوق به منظور شناسایی گلیکوزآمینوگلیکانهای سولفاته (GAGs) (که به طور فراوان در ماتریکس خارج سلولی کندروسیتها وجود دارند) و جهت تأیید تمایز سلولهای مزانشیمی به سلولهای کندروسیت، انجام شد. برای این منظور سلولهای کنترل و سلولهای درون مهرههای آلژینات به روشهای شرح داده شده در بخش روشها در روزهای ۳، ۵، ٧ و ١٤ توسط آلشین بلو رنگآمیزی شدند و در هر بار ٢٠٠ سلول جهت تعیین سلولهای مثبت (سلولهای رنگ شده) و سلولهای منفی (سلولهای رنگ نشده)، شمارش گردید. در اثر سلول رنگآمیزی سلولها توسط آلشین بلو بخشهای رنگ شده به رنگ آبی و هسته و سیتوپلاسم در نتیجه رنگآمیزی بوسیله رنگ Neutlar fast red به رنگ صورتی در میآیند (شکل 4).
شکل 4- تصویر سلول های مزانشیمی تمایز یافته به سلولهای کندروسیت در بستر آلژینات که با رنگ آمیزی آلشین بلو رنگ شده اند a – بزگنمایی10 ×10 b – بزگنمایی 10× 40 - c تصویر سلول ها درون مهره ها ی آلژینات بزگنمایی10 ×32 -d سلولهای کنترل بزگنمایی 10× 40
در رنگآمیزی Alcian blue سلولهای درون مهرههای آلژینات به همراه محیط تمایزی در مقایسه با سلولهای درون مهرهها در شرایط کنترل نشان دهنده بیان گلیکوپروتئوگلیکانهای سولفاته و در نهایت تمایز این سلولها به سلولهای کندروسیت میباشد. لازم به ذکر است که آزمایش فوق سه بار تکرار گردید و نتایج حاصل از شمارش در شکل5 به صورت درصد میانگین سلولهای مثبت در هر روز، قابل مشاهده میباشند. درصد سلولهای رنگ شده در سلولهای کنترل و سلولهای کشت داده شده در بستر آلژینات به ترتیب در روز سوم (4.9 ± 56.5 و 0.7 ± %36.5) و در روز چهاردهم ( 2.8 ± 93 و 2.8 ± % 83) نسبت به کل سلولهای شمارش شده میباشد. این یافتهها و نسبتها در روزهای سوم و پنجم از نظر آماری اختلاف معنیدار با هم داشتند.
بیان کلاژن نوع II به روش RT-PCR : استخراج RNAی کل از نمونههای کنترل و نمونههای مربوط به آلژینات در روزهای ۳، ۵، ٧، 10 و١٤ به منظور استفاده در RT-PCR انجام گرفت. میزان خلوص RNA استخراج شده از نمونهها، بوسیله اندازهگیری نسبت جذبی٢٨٠/٢٦٠ نانومتر تعیین گردید. پس از تعیین غلظتهای استخراج شده، با توجه به کمترین غلظت استخراج شده میزان یکسان ١۳٠٠ نانوگرم RNA از تمامی نمونهها جهت ساخت cDNA استفاده شد و در نهایت مطابق آنچه در بخش روشها ارائه شد، واکنش PCR برای ژنهای کلاژن تیپ دو (به عنوان مارکر سلولهای کندروسیت) و ژن GAPDH(به عنوان (Housekeeping gene انجام شد و در پایان محصولات PCR بر روی ژل آگارز ٢% برده شد که در شکل ٦ قابل مشاهده میباشد. با توجه به پرایمرهای انتخاب شده، طول قطعات سنتز شده مربوط به GAPDH و کلاژن تیپ دو به ترتیب برابر ۵٢٠ و bp ۳٦١ میباشد.
شکل 5- نمودار درصد سلول های کنترل و کشت شده در بستر آلژینات رنگ شده توسط آلشین بلو در روز های ۳، ۵، ٧، 10 و ١٤.
شکل ٦- تصویر الکتروفورز محصولات PCR مربوط به تکثیر توالی کلاژن تیپ دو و GAPDH برروی ژل آگارز. MW- مارکر مولکولی DNA Neg , Pos نمونه های کنترل مثبت و کنترل منفی. C3-5- نمونه های کنترل(به ترتیب روزهای۳، ۵، ٧ و١٤). Alg3-14َ- نمونه های آلژینات(به ترتیب روزهای۳، ۵، ٧و 10 و١٤).
باندهای حاصل توسط برنامه Total Lab به صورت کمی در آمدند و سپس عمل نرمال سازی دادهها بوسیله دادههای مربوط به Housekeeping gene صورت گرفته و نتایج حاصلر براساس دادههای بدست آمده در شکل7 نشان داده شده است. با توجه به نمودار فوق، بیشترین بیان کلاژن نوع II در سلولهای درون مهرههای آلژینات مشاهده میشود. بطوریکه درصد بیان کلاژن نوع II سلولهای کنترل و کشت داده شده در بستر آلژینات به ترتیب در روز سوم (5 ± 70 و 4.5 ± 43) و در روز چهاردهم (1.4 ± 77 و2.8 ± 54) نسبت به بیان ژنGAPDH میباشد.
شکل 7- درصد بیان کلاژن نوع دو در سلول های کنترل و آلژینات در روز های ۳، ۵، ٧، 10 و ١٤
بحث
تحقیقات جهت تولید بافتها در محیط آزمایشگاهی قبل از کاشت در درون بدن، یک حوزه تحقیقاتی بسیار گسترده می باشد. این تحقیقات بیشتر تکیه برکشت جمعیتهای ویژه سلولی در Ex vivo در سطح و یا در داخل داربستهای سنتزی و یا طبیعی که مناسب انتقال به بدن و پیوند عضو دارد. کنترل رفتار جمعیت سلولی در محیط Ex vivo و همچنین توجه به پاسخ آنها در محیط میزبان بسیار مهم میباشد. ظرفیت محدود غضروف مفصلی در ترمیم و بازسازی ذاتی خود، به فقدان سیستم عروقی و همچنین به میزان کم و پراکنده سلولهای کندروسیت در ماتریکس خارج سلولی در این بافت نسبت داده میشود و در پی این محدودیت، یک جراحت و آسیب کوچک منجر به صدمه و تخریب مفصل میشود. گرچه متدهای بیشماری نظیر Subchondral drilling، Osteochondral allografting و... در جهت ترمیم ضایعات غضروفی انجام گرفتهاند اما این تکنیکها، قادر به باز تولیدی خصوصیات بافت غضروف نمیباشند. اما امروزه ثابت شده است که تکنیک مهندسی بافت بر پایه سلولهای بنیادی، یکی از مهمترین درمانهای مناسب و امید بخش برای درمان آسیبهای غضروفی می باشد (7).
توانایی سلولهای بنیادی مزانشیمال چه از منابع مغز استخوان و چه از بافت چربی در تمایز به سلولهای غضروفی این سلولها را منبع مناسبی برای ایجاد غضروف میسازد و فنوتیپ غضروفی و بقا آن در این سلولها توسط TGF-ß1 القا میشود (25).
در مطالعه صورت گرفته، نشان داده شد که بافت چربی انسانی، منبع بافتی مناسبی برای جداسازی سلولهای بنیادی مزانشیمال میباشد چرا که این بافت به راحتی و به طور روتین در مقادیر لیتری از جراحیهای لیپوساکشن در دسترس می باشد و بازده سلولی آن (%5-١) نسبت به منبع بافتی مغز استخوان (%001/٠-٠١/٠) بسیار بالاتر میباشد (15). سلولهای بنیادی بدست آمده از بافت چربیhASC، سلولهایی چند توانه بوده و قادر به بیان خصوصیات بیوشیمیایی آدیپوسیتها، استئوبلاستها، کندروسیتها و مایوسیتها تحت شرایط کشت مناسب میباشند. همچنین نشان دادهاند که قادر به برآورده ساختن بسیاری از انتظارات نظیر آنچه در بالا مطرح شد میباشند و توانایی تولید تعداد کافی سلول جهت کاربردهای مهندسی بافت را دارا میباشند (11). همچنین در طی این مطالعه نشان داده شده که سلولهای مزانشیمال جداسازی شده از بافت چربی بدون از دست دادن خصوصیات مرفولوژیک خود دارای توانایی تکثیر بالایی در محیط کشت میباشند.
بسیاری از تحقیقات تاکنون شرایط ضروری جهت غضروفزایی برای سلولهای مزانشیمی انسانی نظیر محیطهای کشت سه بعدی، فاکتورهای رشد، محیطهای رشد با میزان کم سرم و یا فاقد سرم را نشان دادهاند (24).
Ballock و همکارانش نشان دادند که دستکاری و تغییرات غلظت سرم به سطوح مطلوب کمتر از ١/٠ و٠١/٠ درصد در محیط کشت تمایزی ایجاد غضروف منجر به تشکیل جنبههای ایجاد توسعه در معماری غضروف میشود (2).
در مطالعات صورت گرفته، چندین سیتوکاین گزارش شدهاند که در تبدیل سلولهای مزانشیمال به سلولهای کندروسیت مؤثر میباشند. در این میان TGF-β در استخوان بسیار متراکم میباشد و مقدار آن متجاوز از μg/kg٢٠٠ در بافت می باشد. این فراوانی در میزان TGF-β بیان کننده نقش مهم این سیتوکاین در این بافت میباشد (13). برخی دیگر از محققین نشان دادهاند که چندین عضو از خانواده TGF-β، نقش مهمی را در تمایز غضروفی ایفا میکنند (24).
در مطالعه انجام شده، ما از 1TGF-β به منظور تمایز سلولهای مزانشیمال به سلولهای کندروسیت استفاده کردیم و با توجه به نتایج حاصل از رنگآمیزی هیستوشیمی صورت گرفته توسط آلشین بلو و بیان پروتئوگلیکانهای سولفاته و نتایج حاصل از تست RT-PCR و بیان ژن کلاژن تیپ دو به عنوان مارکر سلولهای کندروسیت در شرایط کشت کنترل و آلژینات و در مقایسه با کنترل منفی مربوط به سلولهای مزانشیمی در روز صفر، نشان داده شد که 1TGF-β فاکتور رشد مؤثری در تمایز سلولهای مزانشیمی به سلولهای کندروسیت و القاء فنوتیپ ویژه غضروفی در این سلولها در جهت تأیید مطالعات قبلی در رابطه با این سایتوکاین، میباشد. برخی از محققین نشان دادهاند که سلولها قابلیت تمایز در بسترهایی مانند آگار، آلژینات، ژلاتین و حتی محیطهای سوسپانسیون که توانایی حفظ شکل گرد شده کندروسیتی را داشته باشند، دارند و به نظر میرسد وجود این بسترها برای حفظ فنوتیپ سلولها ضروری میباشد (24).
در مقایسه با سیستمهای کشت شرح داده شده به صورت سیستمهای کشت تک لایه دو بعدی برای کشت سلولهای غضروفی، امروزه تکنیکهای کشت سلول سه بعدی با هدف تولید داربستهای متخلخل که موجب تسهیل اتصال سلول و رشد آنها میشوند، با بکارگیری انواع گستردهای از بیومواد شامل پلیمرهای سنتزی تا پلیمرهای طبیعی، بسیار توسعه یافته اند و در این میان بیشترین استفاده از سیستمهای کشت مربوط به ژل آگارز که موجب تحریک شبکههای سه بعدی پروتئوگلیکانها در طی کشت میشود، به عمل آمده است (1).
در رابطه با مرفولوژی سلولها همان طور که بیان شد با انتقال سلولهای مزانشیمال به درون مهرههای آلژینات و تمایز این سلولها به سلولهای کندروسیت، سلولها فنوتیپ ویژه کندروسیتی را از خود نشان داده و به شکل گرد در آمدند. در حالیکه سلولها در شرایط کنترل و بر روی ظروف کشت معمولی (پلاستیک) پس از تمایز نیز مرفولوژی فیبروبلاستی شکل خود را حفظ کرده و به صورت چسبیده به سطح باقی میمانند و تنها تعداد محدودی از سلولها (کمتر از1%) فنوتیپ ویژه کندروسیتی را از خود نشان دادند. پایداری فنوتیپ کندروسیتی مشکل اصلی و اساسی در مطالعات In vitro در رابطه با مهندسی بافت غضروف میباشد. نکته قابل توجه این است که بقاء فنوتیپ ویژه غضروفی برای حفظ ساختار و خصوصیات بیومکانیکی غضروف بسیار مهم میباشد (22).
همان طور که در بخش نتایج نشان داده شد در رنگآمیزی هیستوشیمیایی توسط آلشین بلو، سلولهای مزانشیمال پس از تمایز به سلولهای کندروسیت در شرایط ذکر شده آلژینات پروتئوگلیکانهای سولفاته را که به طور فراوان در سلولهای کندروسیت یافت میشود، را بیان کردند. که این رنگآمیزی مثبت خود، تأیید کننده تمایز سلولهای مزانشیمال جداسازی شده به سلولهای کندروسیت میباشد. اما تفاوت، در میزان سلولهای بیان کننده این ماکرو مولکولها در شرایط مطرح شده میباشد. با گذشت زمان در بررسی بیان پروتئوگلیکانهای سولفاته از روز صفر تا روز چهاردهم از تمایز، افزایش تعداد سلولهای بیان کننده این ماکرو مولکولها در شرایطی که سلولها درون مهرههای آلژینات قرار داشتند نسبت به سلولهای کنترل کشت داده شده، گویای این مطلب است که سلولهای مزانشیمال بیشتری درون مهرههای آلژینات به سلولهای کندروسیت تمایز مییابند. بنابراین میتوان این گونه نتیجه گرفت که مهرههای آلژینات شرایط مطلوبتری را برای تمایز سلولهای مزانشیمال به سلولهای کندروسیت نسبت به کنترل مهیا میکنند.
از تستهای انجام شده در رابطه با تأیید و چگونگی تمایز سلولهای مزانشیمال به سلولهای کندروسیت، بررسی بیان ژن کلاژن تیپ دو به عنوان یک ژن مشخص در سلولهای کندروسیت به روش RT-PCR میتوان اشاره کرد. پس از نرمال سازی دادههای بدست آمده از محصولات PCR مربوط به تکثیر توالی کلاژن تیپ دو نسبت بهHousekeeping gene(GAPDH)، مشخص شد که بیان این ژن در روزهای مختلف تمایز در ارتباط با سلولهای درون آلژینات بیشتر از دو شرایط دیگر میباشد و بیشترین میزان بیان در روز چهاردهم از تمایز مشاهده گردید. این نتایج نیز در تأیید نتایج حاصل از رنگآمیزی هیستوشیمیایی توسط آلشین بلو، نشانه آن است که سلولهای مزانشیمال بیشتری درون مهرههای آلژینات به سلولهای کندروسیت تمایز مییابند و بیان قویتری برای این سلولها در رابطه با کلاژن تیپ دو در شرایط آلژینات نسبت به کنترل تفاوت معنیداری در میزان بیان این ژن در آنها مشاهده میشود.
با توجه به نتایج و بحثهای ارائه شده میتوان نتیجهگیری کرد که زیست پلیمر و مهرههای آلژینات میتواند یک سیستم In vitro مناسب جهت کاربری در تولید و مهندسی بافت غضروف انسانی باشند.