Inclusion effects of different levels of levonorgestrel in the diet on the growth indices of three-spotted gourami (Trichopodus trichopterus)

Document Type : Research Paper

Authors
Zhila Mohammadian 1
Asiyeh Mohammadian Razekenari 2
1 Master of Science in Fisheries, Sari University of Agricultural Sciences and Natural Resources
2 Ph.D. in Fisheries, Culture and Breeding in Aquatic Sciences, Iran
10.22034/jar.2024.8057.1911
Abstract
Levonorgestrel is considered as an effective compound in contraceptive pills and a lipophilic-hydrophobic substance with the ability to bind to suspended organic matters.In this study,the inclusion effects of levels of levonorgestrel at 0 (control), 0.7, 7, 70, 100 and 150 ng/g of diet and a control-solvent treatment were evaluated on growth indices of gourami (Trichopodus trichopterus) during 45 days.Females (n=210;initial weight and length of 4.6 g and 63.2 mm, respectively) were randomly distributed in 21 aquariums with density of ten fish per aquarium;and fed daily at the rate of 3% of body weight.Results showed that body height, condition factor and survival rate of females were not affected by levonorgestrel levels.Females fed with levonorgestrel showed significant differences in terms of final weight and length, increment percentage in weight and body length, weight and length specific growth rate compared to the control(and control-solvent treatment). Nevertheless, the growth indices and maximum abdominal diameter of females fed with 150 ng/g showed no significant differences with lower levels (up to 7 ng/g) (P>0.05). Based on the results, it can be concluded that the addition of levonorgestrel in the diet of gourami females led to developmental disorders, especially at a level higher than 7 ng/g. Due to the binding ability of levonorgestrel to organic substances and the possibility of accidental feeding of these particles in the natural diet of fish, growth disorders and changes in the population dynamic of this species and probably other groups of aquatic animals can be expected in natural environments.

Keywords

Subjects

اثرات افزودن سطوح مختلف از لوونورژسترل (Levonorgestrel) در جیره غذایی بر شاخص­های رشد ماهی گورامی سه­خال (Trichopodus trichopterus)

ژیلا محمدیان1، ابوالقاسم اسماعیلی فریدونی1* و آسیه محمدیان رزکناری2

1 ایران، ساری، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، دانشکده علوم دامی و شیلات، گروه شیلات

2 ایران، گرایش تکثیر و پرورش آبزیان، دکترای شیلات

تاریخ دریافت: 06/01/1402          تاریخ پذیرش: 01/11/1402

چکیده

لوونورژسترل بعنوان یک ترکیب موثر در داورهای ضدبارداری و یک ماده چربی­دوست- آب­گریز با توانایی اتصال به ذرات آلی معلق در آب بشمار می­رود. در این مطالعه، اثرات افزودن لوونورژسترل در سطوح صفر (شاهد)، 7/0، 7، 70، 100 و 150 نانوگرم بر گرم جیره و یک تیمار کنترل-حلال بر شاخص­های رشد ماهی گورامی سه­خال (Trichopodus trichopterus) در مدت 45 روز بررسی شد. ابتدا 210 قطعه ماهی ماده (میانگین وزن و طول اولیه به ترتیب 6/4 گرم و 2/63 میلی­متر) بصورت کاملا تصادفی در 21 آکواریوم 60 لیتری با تراکم 10 قطعه در هر آکواریوم توزیع و روزانه به میزان 3 درصد از وزن تر بدن تغذیه شدند. نتایج نشان داد که ارتفاع بدن، فاکتور وضعیت و میزان بازماندگی ماده­ها متاثر از سطوح لوونورژسترل قرار نگرفت (05/0P>). ماده­های تغذیه شده با لوونورژسترل از نظر وزن و طول نهایی، درصد افزایش وزن و طول بدن، نرخ رشد ویژه وزنی و طولی در مقایسه با ماهیان شاهد (و کنترل-حلال) اختلافات معنادار کاهشی نشان دادند (05/0P<). با این وجود، شاخص­های رشد و بیشترین قطر شکم ماده­های تغذیه شده با 150 نانوگرم بر گرم اختلاف معناداری با سطوح پایین­تر (تا 7 نانوگرم بر گرم) نداشت (05/0P>). بر اساس نتایج می­توان گفت که افزودن لوونورژسترل در جیره ماده­های گورامی منجر به اختلالات رشدی در کلیه سطوح به خصوص در سطح بالاتر از 7 نانوگرم بر گرم گردید. با توجه به قابلیت اتصال لوونورژسترل به مواد آلی آب و احتمال تغذیه اتفاقی ماهیان از این ذرات در رژیم غذایی طبیعی ماهیان، اختلالات رشد و تغییر دینامیک جمعیت این گونه و احتمالا سایر گروه­های آبزیان در محیط­های طبیعی انتظار می­رود.

واژه­های کلیدی: لوونورژسترل، مختل­کننده غدد درون­ریز، گوارامی سه­خال، رشد.

* نویسنده مسئول، تلفن: 09112585081، پست الکترونیکی: a.esmaeili@sanru.ac.ir

مقدمه

 

در دهه­های اخیر ترکیبات شیمیایی مختل­کننده غدد درون­ریز (Endocrine-disrupting chemicals; EDCs) به دلیل اثرات مضر و نامطلوب بر موجودات زنده به شدت مورد توجه قرار گرفته­اند. این ترکیبات آلاینده­ زیستی از طریق تداخل در سنتز، رهاسازی، متابولیسم و عملکرد هورمون­های درون­ریز بر هموستازی، رشد، رفتار و تولیدمثل آبزیان تأثیر می­گذارند (9،11،16). در این میان، هورمون­های استروئیدی حتی در غلظت­های خیلی کم به واسطه پتانسیل بالا در ایجاد اختلال سیستم­های درون­ریز در مقایسه با سایر مختل­کننده­ها از اهمیت به مراتب بیشتری برخوردار می­باشند (1،22).

قرص کنتراسپتیو ال-دی (داروی ضدبارداری ال- دی با نام تجاری Ovustop L) از دارو­های بر پایه ترکیبات استروژنی و پروژستینی در پیشگیری از بارداری در انسان به کار می­رود. این قرص عمدتا محتوی مخلوطی از دو ترکیب حاوی 03/0 میلی­گرم 17- آلفااتینیل استرادیول (17 α- Ethinylestradiol; EE2) و 15/0 میلی­گرم لوونورژسترل (Levonorgestrel; LNG) می­باشد. لوونورژسترل با فرمول شیمیایی C21H28O2 و وزن مولکولی 45/312 گرم بر مول یک پروژسترون مصنوعی نسل سوم مشتق شده از 19-نورتستوسترون بوده که حلالیت پایینی در آب (05/2 میلی­گرم بر لیتر در دمای 25 درجه سانتی­گراد) دارد ولی در اتانول، کلروفرم، دی­اتیل­اتر و دیوکسان محلول می­باشد (20). ترکیبات موثره داروهای ضدبارداری بعد از مصرف از راه خوراکی جذب بدن بانوان شده و پس از متابولیزه شدن در کبد نهایتا از طریق ادرار و مدفوع خارج می­شوند. بنابراین، فاضلاب­های خانگی، شهری و بیمارستانی محل اصلی و مستقیم ورود لوونورژسترل (و EE2) به منابع آبی سطحی و زیرزمینی می­باشند. با این­حال حتی در صورت ورود فاضلاب­ به تصفیه­خانه­ها، بخش زیادی از این ترکیبات در طی فرآیندهای تصفیه از درون فاضلاب حذف نشده (معمولاً در محدوده بین 10 تا 66 درصد) و نهایتا به صورت دست­نخورده و یا در ترکیب با سایر اشکال خود وارد محیط­های آبی می­شوند (1،15). بررسی­ها نشان می­دهند که میزان لوونورژسترل در آب خارج شده از سیستم­های تصفیه فاضلاب در کشورهای مختلف بسته به نوع روش تصفیه و تکنولوژی­های به کار رفته در محدوده بین 30-0081/0 نانوگرم بر لیتر می­باشد (24). این مقادیر در آبهای سطحی و زیرزمینی هم ارقام بالایی به خود اختصاص داد به طوری­که غلظت­های 11-4 نانوگرم بر لیتر در آبهای زیرزمینی (35) و غلظت­های تا 38 نانوگرم بر لیتر در رسوبات رودخانه و دریاچه­های کشورهای مختلف دنیا گزارش گردید (24،36).

لوونورژسترل بمانند سایر ترکیبات مشابه داروئی به واسطه مقاومت شدید در برابر تجزیه­های زیستی، قابلیت بالای اتصال به ذرات آلی آب و خاصیت چربی­دوست- آب­گریزی می­تواند در بخش­های پلاژیکی، بنتیکی و حتی در ناحیه حد واسطی آب- رسوبات پیوندهای محکم با انواع مواد آلی، ذرات کلوئیدی و مواد معلق دتریتوسی ایجاد نماید (10،11،19). بنابراین، لوونورژسترل علاوه بر وجود و پایداری خود در آب و تاثیر بر آبزیان می­تواند از طریق غذا در زنجیره­های غذایی موجودات پلاژیکی و کفزی وارد شده و توسط انواع آبزیان (با تغذیه پلاژیکی، دتریتوس­خواری، همه­چیزخواری و کفزی­خواری) مصرف گردد (10،19).

اثرات غلظت­های محیطی لوونورژسترل در آب در گروه­های مختلف آبزیان اعم از نرم­تنان، سخت­پوستان و ماهیان نشان از تاثیر مخرب آن بر بسیاری از شاخص­های رشدی، فیزیولوژیک، ژنتیکی و تولیدمثلی دارد (34). نتایج این مطالعات نشان داد که لوونورژسترل­ به گیرنده­های آندروژنی در ماهی متصل شده و با فعال کردن آنها عوارضی مانند کاهش هم­آوری و میزان باروری (13،26)، نرسازی جمعیت (تغییر جنسیت از ماده به نر) (4،33)، اختلال در چرخه طبیعی تولیدمثل و تغییر در بیان ژن­های استروئیدی (2)، افزایش بیان mRNA گیرنده­های استروژنی و ویتلوژن در کبد (20)، کاهش و حتی توقف تخمک­گذاری در ماهیان (14،38) را باعث می­شوند.

اگرچه اکثر مطالعات قبلی در زمینه تاثیر لوونورژسترل (و EE2) در آب و ورود به درون بدن آبزیان در قالب مطالعات سمیت حاد، نیمه-مزمن و مزمن به همراه قابلیت تجمع زیستی آن بر روی آبزیان انجام شده است ولی احتمال ورود لوونورژسترل به درون بدن از طریق رژیم­های غذایی هم به عنوان یکی دیگر از مسیرهای مهم ردیابی اثرات آنها در آبزیان به شمار رفته که این مسیر تاکنون کمتر بررسی شده است (5،8،25،28). نظر به قابلیت اتصال لوونورژسترل به ذرات آلی و احتمال ورود آن از طریق جیره­های غذایی، در مطالعه حاضر اثرات سطوح مختلف از افزودن لوونورژسترل به جیره بر شاخص­های رشد مولدین ماده گورامی سه­خال (Trichopodus trichopterus) (به عنوان یک ماهی مدل با رژیم همه­چیزخواری در مطالعات بیولوژیک و اکوتوکسیکولوژیک) متمرکز گردید.

مواد و روشها

تهیه و سازگاری ماهی گورامی سه­خال: ابتدا تعداد 550 قطعه ماهی گورامی سه­خال (T. trichopterus) از مرکز خصوصی دکتر شهریاری (استان گلستان) تهیه و به مدت دو هفته در 5 تانک با ظرفیت مفید آبگیری 200 لیتر و دمای 28-26 درجه سانتی­گراد، طول دوره نوری 12:12 (روشنایی:تاریکی)، pH آب 2/7-7 همراه با هوادهی ملایم جهت سازگاری نگهداری شدند. در هر سه روز یکبار، به میزان 50 درصد از حجم آب تانک­ تعویض شد و ماهیان سه بار در روز و به میزان سه درصد از وزن تر بدن با غذای تجاری  CP9910(30 درصد پروتئین و 6 درصد چربی) تغذیه شدند. به منظور تشخیص جنسیت، ماهیان نر و ماده بر اساس وضعیت باله پشتی (باله پشتی نرها بلندتر، کشیده­تر و نوک تیز ولی ماده­ها دارای باله پشتی کوتاه­تر با نوک مدور) جدا شدند به طوری­که برای این تحقیق فقط از ماهیان ماده استفاده گردید. نهایتا، تعداد 210 قطعه ماهی ماده در تیمارهای مختلف این تحقیق استفاده شد.

تهیه و آماده­سازی داروی لوونورژسترل: ترکیب خالص لوونورژسترل از شرکت داروسازی آتی فارمد (استان البرز-کرج) تهیه شد. برای افزودن دارو به جیره­های غذایی و با توجه به ویژگی آب گریزی آن، ابتدا لوونورژسترل در حلال اتانول (97 درصد) حل و استوک لازمه تهیه شد. مقادیر در نظر گرفته شده برای هر تیمار از استوک (حاوی دارو و الکل) با میکروسمپلر برداشت و با مخلوط کردن آن با روغن اویلا (200 میکرولیتر در هر تیمار) توسط سرنگ 3 میلی­لیتری به غذای تجاری (که قبلا کاملا خردشده بود) اسپری شد. بعد از بخار شدن الکل و آغشته شدن جیره­ با دارو، کل جیره از دستگاه غذاساز عبور کرده و به اندازه 5/1 میلی­متری درآمده و در درون آون خشک شدند. نهایتا جیره­های ساخته شده در کیسه­های پلاستیکی زیپ­کیپ در دمای 4- درجه سانتی­گراد نگهداری و به صورت روزانه به تغذیه ماهیان رسیدند (5،8). ساخت جیره­ها با توجه به نیمه عمر لوونورژسترل به صورت هفتگی انجام شد.

تیمارها: برای این تحقیق، ماهیان مجموعا در 7 تیمار (هر سطح به عنوان یک تیمار و هر تیمار در سه تکرار) بررسی شدند. انتخاب سطوح در این مطالعه بر اساس غلظت­های محیطی گزارش شده از آن در آب و همچنین احتمال قابلیت تجمع زیستی آن با سطوح بالاتر در محدوده­ای بین 7/0 تا 150 نانو گرم بر گرم از جیره در نظر گرفته شد (24). بدین منظور، 6 سطح از لوونورژسترل با غلظت­های صفر (شاهد، فاقد دارو و روغن)، 7/0، 7، 70، 100 و 150 نانوگرم بر گرم از جیره غذایی در نظر گرفته شد (8،24). به دلیل استفاده از روغن و اتانول در تیمارهای دارویی، یک تیمار کنترل-حلال (حاصل از ترکیب اتانول و روغن- 1310 میکرولیتر بر گرم اتانول به ازای 200 میکرولیتر روغن در جیره - فاقد دارو) نیز جهت بررسی افزودن روغن و اتانول در نظر گرفته شد.

تغذیه ماهیان با لوونورژسترل: ابتدا، 210 قطعه ماهی ماده (میانگین وزن و طول اولیه به ترتیب 3/1 ± 6/4 گرم و 3/0 ± 2/64 میلی­متر) به طور کاملا تصادفی در 21 آکواریوم 80 لیتری (با ظرفیت مفید آبگیری 60 لیتر) با تراکم 10 قطعه ماهی در هر آکواریوم توزیع شدند. ماهیان به مدت 45 روز و روزانه به میزان 3 درصد از وزن تر بدن در سه وعده (ساعات 8، 11 و 19) در تیمارهای مختلف تغذیه شدند. میزان تعویض آب به مقدار 35 درصد از حجم مفید آکواریوم و در هر سه روز یکبار در کلیه آکواریوم­ها انجام گرفت. سایر شرایط لازم جهت پرورش ماهیان در آکواریوم­ها (مجهز به فیلتر مکانیکی) به صورت کاملا یکسان اعمال گردید. ماهیان در دمای 28-26 درجه سانتی­گراد، طول دوره نوری 12:12 (روشنایی:تاریکی)، pH آب 2/7-7 همراه با هوادهی دائمی در هر آکواریوم (متصل به هواده مرکزی) پرورش یافتند. جهت تامین آب برای آکواریوم­ها از آب چاه استفاده شد که خود قبلا به مدت 72 ساعت در تانک­های 250 لیتر ذخیره­ای هوادهی شده و نهایتا از فیلتر مکانیکی نیز عبور کردند.

شاخص­های رشدی ماهیان: در انتهای دوره، ابتدا ماهیان به مدت 24 ساعت گرسنگه نگه داشته شدند. پس از نمونه­برداری تصادفی (6 ماهی از هر تکرار)، ماهیان ابتدا با عصاره پودر گل میخک بیهوش و بعد از خشک کردن بدن (با دستمال کاغذی)، زیست­سنجی طولی و وزنی آنها به ترتیب با استفاده از کولیس دیجیتالی و ترازوی یک­هزارم گرم انجام گرفت. برخی از شاخص­های زیست­سنجی شامل ارتفاع بدن، وزن و طول نهایی بدن، درصد افزایش وزن و طول بدن، نرخ رشد ویژه وزنی و طولی، فاکتور وضعیت، بیشترین قطر شکم و میزان بازماندگی ماهیان در انتهای دوره پرورش بر اساس روابط زیر تعیین شد:

درصد افزایش وزن بدن = [(وزن نهایی - وزن اولیه) / وزن اولیه] × 100

درصد افزایش طول بدن = [(طول نهایی - طول اولیه) / طول اولیه] × 100

نرخ رشد ویژه وزنی = [(لگاریتم نپرین وزن نهایی- لگاریم نپرین وزن اولیه)] / طول دوره پرورش) × 100

نرخ رشد ویژه طولی = [(لگاریم نپرین طول نهایی - لگاریم نپرین طول اولیه)] / طول دوره پرورش) × 100

فاکتور وضعیت = [وزن نهایی / (طول نهایی)3] × 100

میزان بازماندگی (درصد) = (تعداد کل ماهیان سالم باقیمانده/ تعداد کل ماهیان ذخیره­سازی شده اولیه) × 100

تجزیه و تحلیل آماری: این مطالعه در قالب طرح کاملا تصادفی انجام گرفت. ابتدا نرمال بودن داده­ها از طریق آزمون کولموگروف-اسمیرنوف بررسی شد. پس از اطمینان از نرمال بودن، برای مقایسه متغیر­های محاسبه شده از آنالیز واریانس یکطرفه (One-way ANOVA) و مقایسه میانگین­های آنها با استفاده از آزمون چند دامنه­ای دانکن (Dancan) با سطح اطمینان 95 درصد انجام گرفت. برای آنالیز آماری داده­ها و ترسیم نمودارها به ترتیب از نرم­افزارهای SPSS و  Excelاستفاده شد.

نتایج

شاخص­های رشد ماده­های گورامی سه­خال در تیمارهای مختلف حاوی افزودن لوونورژسترول در جیره طی یک دوره 45 روزه نشان داد که بیشترین میانگین وزن و طول نهایی بدن در تیمارهای شاهد (و کنترل-حلال) همراه با اختلاف معنادار با تیمارهای حاوی دارو به ثبت رسید (05/0P<). وزن و طول نهایی بدن در ماده­های تغذیه شده با دارو با افزایش غلظت تا 100 نانوگرم بر گرم روند کاهشی ولی در غلظت 150 نانوگرم بر گرم مجددا افزایش یافت ولی این غلظت با غلظت­های کمتر (7/0 و 7 نانوگرم بر گرم جیره) معنادار نبود (05/0P>). فاکتور وضعیت و میانگین ارتفاع نهایی بدن اختلاف معناداری بین تیمار­ها نشان نداد (05/0P>)؛ با این وجود ارتفاع بدن ماده­ها با افزایش غلظت دارو تا 100 نانوگرم بر گرم روند کاهشی ولی در غلظت 150 نانوگرم بر گرم مجددا افزایش یافت. از طرف دیگر هیچ­گونه تلفاتی در ماهیان حتی در تیمارهای حاوی سطوح مختلف از افزودن دارو مشاهده نشد (جدول 1).

بیشترین درصد افزایش وزن و رشد ویژه وزنی بدن در ماهیان تیمارهای شاهد (و کنترل-حلال) همراه با اختلاف معنادار با سایر تیمارها مشاهده شد (05/0P<). همچنین، شاخص­های درصد افزایش طول بدن و رشد ویژه طولی بدنی در ماهیان تیمارهای شاهد (و کنترل-حلال) با سایر تیمار­ها اختلاف معناداری داشت (05/0>P). کمترین مقادیر افزایش وزن و سرعت رشد روزانه وزنی بدن در ماهیان تغذیه شده با غلظت­های 70 و 100 نانوگرم بر گرم جیره دیده شد (05/0P<)؛ در حالی­که کمترین میزان افزایش طول و سرعت رشد روزانه طولی بدن در ماهیان تغذیه شده با غلظت­های 7 تا 100 نانوگرم بر گرم جیره به ثبت رسید (اشکال 1 و 2).

 

 

جدول 1- شاخص­های رشد ماده­های گورامی سه­خال (Trichopodus trichopterus) در افزودن سطوح مختلف از لوونورژسترل (نانوگرم بر گرم جیره) در طول دوره پرورش (45 روز)

شاخص

غلظت لوونورژسترل (نانوگرم بر گرم جیره)

کنترل-حلال

شاهد (صفر)

7/0

7

70

100

150

وزن اولیه (گرم)

1/0 ± 56/4

1/0 ± 6/4

1/0 ± 57/4

1/0 ± 6/4

1/0 ± 53/4

1/0 ± 5/4

13/0 ± 67/4

وزن نهایی (گرم)

3/0 ± 78/7 ab

58/0 ± 1/8 a

 bc57/0 ± 2/7

c 58/0 ± 5/6

 d6/0 ± 68/5

 d3/0 ± 26/5

c 57/0 ± 84/6

طول اولیه (میلی­متر)

2/0 ± 18/64

2/0 ± 11/64

4/0 ± 2/64

5/0 ± 1/64

5/0 ± 15/64

2/0 ± 2/64

3/0 ± 25/64

طول نهایی (میلی­متر)

75/80 ± 3/1 a

a 1/1 ± 85/81

b 9/3 ± 3/75

bc 75/2 ± 35/73

bc 5/4 ± 1/71

c 8/3 ± 7/69

b 1/4 ± 38/75

ارتفاع بدن (میلی­متر)

6/0 ± 5/25

2/1 ± 55/25

45/1 ± 96/25

1/2 ± 29/25

8/0 ± 74/22

3/1 ± 55/22

6/3 ± 75/24

فاکتور وضعیت

1/0 ± 48/1

1/0 ± 5/1

9/0 ± 35/1

07/0 ± 65/1

3/0 ± 6/1

3/0 ± 57/1

3/0 ± 62/1

* حروف متفاوت نشان­دهنده اختلاف معنادار در سطح 5 درصد بر اساس آزمون آماری دانکن می­باشد (05/0P<).

 

 

شکل 1- درصد افزایش وزن بدن و نرخ رشد ویژه وزنی بدن (درصد در روز) در ماده­های گورامی سه­خال (Trichopodus trichopterus) تغذیه شده با سطوح مختلف از لوونورژسترل (نانوگرم بر گرم جیره) در طول دوره پرورش (45 روز)

 

 

شکل 2- درصد افزایش طول بدن و نرخ رشد ویژه طولی بدن (درصد در روز) در ماده­های گورامی سه­خال (Trichopodus trichopterus) تغذیه شده با سطوح مختلف از لوونورژسترل (نانوگرم بر گرم جیره) در طول دوره پرورش (45 روز)

 

بیشترین قطر شکم در ماده­های تغذیه شده در گروه­های مختلف اختلاف معناداری را نشان داد (05/0>P)؛ به طوری­که کمترین مقدار در ماهیان با غلظت 100 نانوگرم بر گرم جیره ولی این شاخص در بالاترین غلظت مجددا روند افزایشی غیرمعنادار (05/0<P) با تیمارهای شاهد و کمترین غلظت دارو (7/0 نانوگرم بر گرم) نشان داد.

 

 

شکل 3- بیشترین قطر شکم در ماده­های گورامی سه­خال (Trichopodus trichopterus) تغذیه شده با سطوح مختلف از لوونورژسترل (نانوگرم بر گرم جیره) در طول دوره پرورش (45 روز)

 

بحث و نتیجه­گیری

لوونورژسترل به واسطه مصرف بالا و داشتن مقدار بالاتر در داروهای ضدبارداری (تقریبا 5 برابر در مقایسه با 17-آلفا اتینیل استرادیول) می­تواند از مسیرهای گوناگون وارد آب شده و به صورت مستقیم و یا غیرمستقیم بر حیات آبزیان تاثیر بگذارد. اگرچه غلظت­های محیطی لوونورژسترل در آبها مقادیر پایینی را نشان می­دهد ولی تجمع زیستی این ترکیبات در بدن آبزیان نشان از وجود مقادیر به مراتب بالاتر از غلظت­های محیطی گزارش شده برای ترکیبات پروژسترینی دارد (24). غلظت­های محیطی گزارش شده از لوونورژسترل سطوح کمتر از یک تا حداکثر 40 نانوگرم بر لیتر را در درون آب نشان داد؛ ولی بدلیل قابلیت اتصال به ترکیبات آلی و توان تجمع زیستی، این دارو به جیره غذایی ماهی افزوده و سطوح بالاتر از این مقدار (70 تا 150 نانوگرم بر گرم جیره) در مطالعه حاضر بررسی گردید.

بررسی نتایج مطالعه حاضر نشان می­دهد که افزودن لوونوژسترل در جیره در یک دوره 45 روزه هیچ­گونه تلفات، علائم نامطلوب و بدشکلی ظاهری بدن در ماهی گورامی ایجاد نکرد و بازماندگی 100 درصدی در کلیه ماهیان تغذیه شده با دارو و گروه­ شاهد (و کنترل-حلال) دیده شد. با توجه به این که داده­­های چندانی در زمینه تاثیر افزودن لوونوژسترل در جیره غذایی آبزیان وجود ندارد؛ لذا بایست نتایج مطالعه حاضر را با معدود مطالعات در زمینه تاثیر این دارو در درون آب مقایسه نمود. به عنوان مثال و در مطابقت با سایر مطالعات، نتایجی مبنی بر عدم تفاوت معنادار در میزان تلفات ماهی کلمه (Rutilus rutilus) (تلفات کمتر از 10 درصد) در غلظت­های مختلف لوونوژسترل در آب (صفر، 3، 31، 312، 3124 نانوگرم بر لیتر) گزارش شد (21). چنین روندی در سایر مطالعات ازجمله در مواجهه زبرای گورخری (Danio rerio) با غلظت­های لوونورژسترل در آب (100-1 نانوگرم بر لیتر) (17) و در مواجهه کپور معمولی (Cyprinus carpio) با غلظت­های مختلف لوونوژسترل در آب (310-31 نانوگرم بر لیتر) در یک دوره 47 روزه گزارش شد (31). این در حالی است که مواجهه با غلظت­های پایین لوونوژسترول در آب (3، 3/16، 9/86 نانوگرم بر لیتر) تاثیر چندانی بر میزان بازماندگی ماهی قنات سرچرب (Pimephales promelas) نداشت ولی مواجهه با غلظت­های بالا (462 و 2394 نانوگرم بر لیتر) سبب کاهش قابل توجه در میزان بازماندگی ماهی گردید (25). بر این اساس می­توان بیان کرد که اثرات این دارو بر بازماندگی ماهیان به عوامل متعددی از جمله نوع گونه، سطح غلظتی دارو، روش استفاده از دارو (آب یا غذا) و مدت زمان دوره آزمایش بستگی دارد.

نتایج مطالعه حاضر نشان از اثرات واضح در افزودن لوونورژسترل در جیره بر عملکرد رشد ماده­های گورامی سه­خال دارد. شاخص­های رشد ماهی از نظر میانگین وزن و طول نهایی بدن، درصد افزایش وزن و طول، همراه با سرعت رشد ویژه وزنی و طولی بدن در کلیه سطوح دارویی با افزایش میزان دارو در جیره کاهش معنادار داشت. همچنین، نتایج نشان از کاهش وزن حدود 40-35 درصدی ماده­های گورامی در سطح دارویی 100 نانوگرم بر گرم جیره در مقایسه با گروه شاهد داشت. چنین روندی نشان از تاثیر واضح در ایجاد اختلالات رشدی در ماهیان تغذیه شده و یا مواجه شده با لوونورژسترل دارد. وضعیت ایجاد اختلالات رشدی و دلائل احتمالی چنین روندی قبلا در سایر مطالعات در آبزیان (بخصوص در مطالعات درازمدت مواجهه ماهی با دارو در آب) با ترکیبات موثره دارویی موجود در قرص­های ضدبارداری نیز ارائه گردید. از این نظر یافته­های این مطالعه در برخی از موارد با سایر مطالعات فارغ از نوع روش استفاده از دارو (مواجهه در آب و یا گنجاندن در غذا)، انتخاب سطوح غلظتی متفاوت، نوع و سن گونه آبزی و شرایط متفاوت آزمایشی مطابقت دارد. به عنوان مثال، کاهش قابل ملاحظه­ای در رشد لارو ماهی قنات سرچرب پس از یک دوره مواجهه 28 روزه با لوونورژسترل گزارش گردید (25). مشابه با عملکرد لوونورژسترل، مواجهه ماهی زنده­زای کیلی فیش (Heterandria formosa) با داروی 17-آلفا اتینیل استرادیول در آب سبب کاهش رشد ماده­ها در سطوح غلظتی 5 و 25 نانوگرم بر لیتر گردید (18). همچنین، در ماهیان نوجوان تیلاپیای نیل (Oreochromis niloticus) تغذیه شده با غلظت‌های بالای 17-آلفا اتینیل استرادیول گزارش شد که افزودن 125 میکروگرم از این دارو در هر گرم غذا به مدت یک ماه سبب اختلالات شدید رشد (طول و وزن) در هر دو جنس نر و ماده گردید؛ بطوری‌که حتی بعد از 125 روز پس از قطع دارو در غذا، وزن و طول نهایی بدن ماده‌ها به ترتیب 40 و 15 درصد نسبت به گروه کنترل کاهش داشته که نشان از ماندگاری درازمدت تاثیر این نوع از ترکیبات داروئی در ماهیان دارد (29). برخلاف یافته­های مطالعه حاضر، در ماهی کلمه (R. rutilus) (20) و زبرای گورخری (D. rerio) (17) تفاوت فاحشی در میانگین وزن بدن و طول استاندارد در غلظت­های محیطی لوونورژسترل در آب گزارش نشد. همچنین، اختلاف معناداری در طول و وزن بدن در ماهی سه خاره (Gasterosteus aculeatus) مواجه شده با غلظت­های لوونورژسترل در آب (5/5، 40 و 358 نانوگرم بر لیتر) در یک مقطع 21 روزه مشاهده نشد (33).

نتایج مطالعه حاضر نشان داد که اثرگذاری دارو بر شاخص­های رشد بدن ماده­ها بشدت به میزان غلظت دارو در غذا وابسته است؛ به طوری­که وزن و طول بدن در مولدین تغذیه شده تا سطح 100 نانوگرم بر گرم جیره روندی کاهشی ولی در بالاترین سطح (150 نانوگرم بر گرم جیره) مجددا افزایش یافته ولی به میزان رشد ماهیان گروه شاهد نرسید. بنابراین بایست در آینده روند رشدی مولدین در غلظت­های گنجاندن بالاتر از این سطح (150 نانوگرم بر گرم جیره) مورد بررسی قرار گرفته تا بتوان قضاوت بهتری از تاثیر غلظت دارو در غذا در مطالعات درازمدت داشت. از این نظر نتایج این مطالعه با یافته­های برخی از مطالعات همخوانی دارد به طوری­که در ماهیان امپراطور قطب (Hypseleotris compressa) مواجه شده با محلول‌های 50 و 100 درصد آب فاضلابی حاوی مقادیر بالای EDCs (endocrine-disrupting compounds)، روند افزایشی معنادار در وزن بدن نسبت به سایر تیمار‌ها (صفر، 5/12 و 25 درصد از آب فاضلاب) گزارش شد (23). همچنین، افزایش قابل توجهی در رشد آنهم فقط در بالاترین غلظت لوونورژسترل در آب (25 نانوگرم بر لیتر) از مواجهه ماهی قنات سرچرب در مقایسه با مواجهه با سطوح پایین­تر (5/0 و 5 نانوگرم بر لیتر) گزارش گردید (27).

در مطالعه حاضر، بیشترین قطر شکم ماده­های گورامی در کلیه سطوح افزودن داور در مقایسه با گروه شاهد کاهش یافت؛ به طوری­که کاهش 30-25 درصدی در قطر شکم ماده­های تغذیه شده با 100 نانوگرم بر گرم جیره در مقایسه با گروه شاهد دیده شد که بیانگر لاغرتر شدن بدن ماده­ها می­باشد. این روند را احتمالا بتوان به کاهش وزن تخمدان نسبت داد که تائید آن به مطالعات آینده نیاز دارد.

از نظر فیزیولوژیک، محور هیپوتالاموس- هیپوفیز- گناد برای رشد بدن و توسعه گنادها در آبزیان به عنوان یک محور کلیدی محسوب شده و هر گونه اختلال در این مسیر می­تواند سبب اختلال در رشد بدن، عملکرد گنادی و شاخص­های تولیدمثلی در آبزیان گردد. کلیه داروهای پروژستینی از جمله لوونورژسترل باعث فعالیت گیرنده­های پروژسترونی (progesterone receptors; PRs) می­گردند ولی بسته به نوع مشتقات­شان (پروژسترون، تستوسترون و یا اسپیرونولاکتون) ممکن است تداخل عملکردی با سایر گیرنده­های هورمونی ایجاد نمایند؛ با این وجود مکانیزم­های دقیق عملکردی آنها کاملا مشخص نشده است (12). ایجاد اختلالات رشدی و دلائل آن از نظر فیزیولوژیک ممکن است ارتباط واضح با اختلال در سنتز و میزان ترشح هورمون رشد (Growth hormone; GH) داشته باشد. مطالعات قبلی نشان داد که میزان بیان mRNA هورمون رشد در هیپوفیز ماهی تیلاپیای نیل تغذیه شده با 17-آلفا اتینیل استرادیول بشدت کاهش یافت که علت احتمالی آن به اثرات داور بر سلول‌های ترشح کننده GH در هیپوفیز و یا مهار رهاسازی GH در سطح هیپوتالاموس نسبت داده شد (29). همچنین، هورمون استروژن توانسته بیان سوماتوستاتین (هورمون مهارکننده هورمون رشد) در مغز ماهیان گلدفیش (Carassius auratus) مواجه شده با استروژن را افزایش دهد (6). سایر دلائل اختلال رشدی در آبزیان ناشی از وجود لوونورژسترل (در آب و یا غذا) را می­توان به اختلال در تولید استروئیدها نسبت داد به طوری­که اهمیت تولید استروئیدهای جنسی و تاثیر آنها بر رشد ماهی در مطالعات قبلی هم به اثبات رسید (3،25). هورمون­های استروئیدی علاوه بر نقش کلیدی در تولیدمثل، واسطه­های مهمی برای متابولیسم گلوکز و چربی­زایی نیز هستند. در این میان نقش پروژستین­ها به عنوان تنظیم کننده­های متابولیک مورد توجه قرار گرفته است به طوری­که بررسی­ها نشان داد که پروژسترون با القای سطح mRNA لپتین (هورمون سرکوب­کننده اشتهاء) در موش­های صحرایی ماده، واسطه هموستاز (تعادل) انرژی هستند (32). لوونورژسترل به عنوان یک ترکیب پروژسترونی از ویژگی آندروژنیک بالایی برخوردار بوده و سبب کاهش سرعت رسیدگی جنسی در ماهیان می­گردد (7،33). علاوه بر این، پروژسترون می­تواند موجب اختلال در متابولیسم گلوکز و افزایش فرآیند­های گلوکونئوژنز (فرآیند تشکیل گلوکز از آمینواسیدها و چربی­ها) و لیپولیز (تجزیه چربی­ها) گردد (30). تاکنون، اکثر مطالعات متابولیکی در این زمینه به مدل‌­های جوندگان محدود شده‌ و اطلاعات خیلی کمی در مورد مکانیسم اثرات این مواد بر متابولیسم ماهیان وجود دارد. با این حال نتایج Overturf و همکاران (2014) توانایی لوونورژسترل در تغییر حساسیت گیرنده استروژن و پروژسترون در ماهی قنات را نمایان می­کند؛ به طوری­که لوونورژسترل موجب کاهش سطح بیان mRNA گیرنده استروژنی بتا (ERβ) در ماهیان مواجه شده گردید. کاهش قابل توجه سطح ERβ با افزایش سطح لپتین (هورمون سرکوب­کننده اشتهاء) مرتبط است (37). بیان لپتین به طور قابل توجهی توسط استروژن از طریق ERα و  ERβدر سلول­های چربی تنظیم می­شود؛ به طوریکه ERα وERβ  به ترتیب اثرات تحریک­کننده و بازدارنده بر تولید لپتین در سلول‌­های چربی دارند. بر این اساس لازم است تا در آینده مطالعات بیشتری در زمینه مکانیسم‌­های موثر که توسط آن پروژستین‌­های مصنوعی باعث مهار رشد بسته به سطح غلظتی دارو در گونه­‌های ماهیان می­شود انجام گیرند.

در نتیجه­گیری نهایی می­توان بیان کرد که افزودن لوونورژسترل در کلیه سطوح غلظتی مطالعه حاضر سبب تغییرات و نوسانات رشدی در وزن و طول بدن مولدین ماده ماهی گورامی گشته و این اختلال به خصوص در سطوح بالاتر از 7 نانوگرم بر گرم شدت بیشتری داشت. با توجه به قابلیت بالای اتصال لوونورژسترل به مواد آلی معلق در آب و احتمال تغذیه اتفاقی ماهیان از این ذرات در رژیم غذایی طبیعی ماهیان، وجود اختلالات رشدی در این گونه و احتمالا سایر گروه­های آبزیان و تغییر در دینامیک جمعیت آنها در محیط­های طبیعی را می­توان از اثرات مخرب این ترکیب دارویی در آبهای آلوده دانست. بنابراین بایست تا حد امکان از ورود این ترکیبات به منابع آبی طبیعی جلوگیری نمود و یا از تکنولوژی­های بهتری جهت حذف و تصفیه آبهای آلوده به مواد دارویی بهره برد.

سپاسگزاری

بدین وسیله از مسئولین محترم شرکت داروسازی آتی­فارمد جهت تهیه داروی لوونورژسترل و همچنین سرکار خانم مهندس ظاهری که در انجام بخش­های آزمایشگاهی این پژوهش همکاری نمودند، صمیمانه تشکر و قدردانی می­شود.

  • Aris AZ, Shamsuddin AS., Praveena SM (2014). Occurrence of 17 α-ethynylestradiol (EE2) in the environment and effect on exposed biota: A review. Environ Int, 69: 104-119.
  • Bain PA, Kumar A, Ogino Y, Iguchi, T (2015). Nortestosterone-derived synthetic progestogens do not activate the progestogen receptor of Murray- Darling rainbow fish (Melanotaenia fluviatilis) but are potent agonists of androgen receptors alpha and beta. Aquat Toxicol, 163: 97-101.
  • Bhatt S, Iwai T, Miura C, Higuchi M, Shimizu-Yamaguchi S, Fukada H, Miura T (2012). Gonads directly regulate growth in teleost. P Nat Acad Sci (PNAS), 109: 11408-11412.
  • Brockmeier EK, Scott PD, Denslow ND, Leusch FDL (2016). Transcriptomic and physiological changes in Eastern Mosquitofish (Gambusia holbrooki) after exposure to progestins and anti- progestagens. Aquat Toxicol, 179: 8-17.
  • Cabas I, Chaves-Pozo E, Alcázar AG, Meseguer J, Mulero V, García-Ayala A (2011). Dietary intake of 17 α-ethinylestradiol promotes leukocytes infiltration in the gonad of the hermaphrodite gilthead seabream. Mol Immunol, 48 (15-16): 2079-2086.
  • Canosa LF, Lin X, Peter RE (2002). Regulation of expression of somatostatin genes by sex steroid hormones in goldfish forebrain. Neuroendocrinol, 76: 8-17.
  • Cardoso PG, Rodrigues D, Madureira TV, Oliveira N, Rocha MJ, Rocha E (2017). Warming modulates the effects of the endocrine disruptor progestin levonorgestrel on the zebrafish fitness, ovary maturation kinetics and reproduction success. Environ Pollut, 229: 300-311.
  • Colli-Dula RC, Martyniuk CJ, Kroll KJ, Prucha MS, Kozuch M, Barber DS, Denslow ND (2014). Dietary exposure of 17-alpha ethinylestradiol modulates physiological endpoints and gene signaling pathways in female largemouth bass (Micropterus salmoides). Aquat Toxicol, 156: 148-160.
  • DeCourten BM, Forbes JP, Poark HK, Burns NP, Major KM, White JW, Li J, Mehinto AC, Connon RE, Brander SM (2020). Multigenerational and transgenerational effects of environmentally relevant concentrations of endocrine disruptors in an estuarine fish model. Environ Sci Technol, 54 (21): 13849-13860.
  • Dussault EB, Balakrishnan VK, Borgmann U, Solomon KR, Sibley PK (2009). Bioaccumulation of the synthetic hormone 17 alpha-ethinylestradiol in the benthic invertebrates Chironomus tentans and Hyalella azteca. Ecotox Environ Safe, 72: 1635-1641.
  • Fent K (2015). Progestins as endocrine disrupters in aquatic ecosystems Concentrations, effects and risk assessment. Environ Int, 84: 115-130.
  • Fick J, Lindberg RH, Parkkonen J, Arvidsson B, Tysklind M, Larsson DG (2010). Therapeutic levels of levonorgestrel detected in blood plasma of fish: results from screening rainbow trout exposed to treated sewage effluents. Environ Sci Technol, 44 (7): 2661-2666.
  • Frankel TE, Meyer AT, Orlando EF (2016). Aqueous exposure to the progestin, levonorgestrel, alters anal fin development and reproductive behavior in the eastern mosquitofish (Gambusia holbrooki). Gen Comparat Endocrinol, 234: 161-169.
  • Frankel T, Yonkos L, Ampy F, Frankel J (2018). Exposure to levonorgestrel increases nest acquisition success and decreases sperm motility in the male fathead minnow (Pimephales promelas). Environ Toxicol Chem, 37 (4): 1131-1137.
  • Huang Y, Wang XL, Zhang JW, Wu KS (2014). Impact of endocrine disrupting chemicals on reproductive function in zebrafish (Danio rerio). Reprod Domest Anim, 50 (1): 1-6.
  • Hou L, Chen H, Tian C, Liang Y, Wu R, Zhang X, Fang X, Zhang C, Hu J, Song L, Laing Y, Schlenk D, Xie L (2018). Alterations of secondary sex characteristics, reproductive histology and behaviors by norgestrel in the western mosquitofish (Gambusia affinis). Aquat Toxicol, 198: 224-230.
  • Hua J, Han J, Guo Y, Zhou B (2015). The progestin levonorgestrel affects sex differentiation in zebrafish at environmentally relevant concentrations. Aquat Toxicol, 166: 1-9.
  • Jackson LM, Klerks PL (2019). Impact of long‑term exposure to 17 α‑ethinylestradiol in the live‑bearing fish Heterandria formosa. Arch Environ Cont Tox, 77 (1): 51-61.
  • Johnson AC, Williams RJ (2004). A model to estimate influent and effluent concentrations of estradiol, estrone, and ethinyl estradiol at sewage treatment works. Environ Sci Technol, 38 (13): 3649-3658.
  • Kroupova HK, Trubiroha A, Lorenz C, Contardo-Jara V, Lutz I, Grabic R, Kocour M, Kloas M (2014). The progestin levonorgestrel disrupts gonadotropin expression and sex steroid levels in pubertal roach (Rutilus rutilus). Aquat Toxicol, 154: 154-162.
  • Kroupova H (2015). The challenge presented by progestins in ecotoxicological research: A critical review. Environ Sci Technol, 49 (50): 2625-2638.
  • Kumar V, Johnson AC, Trubiroha A, Tumova J, Ihara M, Grabic R, Kloas W, Tanaka H, Kroupova H (2015). The challenge presented by progestins in ecotoxicological research: A critical review. Environ Sci Technol, 49 (50): 2625-2638.
  • Melvin SD (2016). Short-term exposure to municipal wastewater influences energy, growth, and swimming performance in juvenile Empire Gudgeons (Hypseleotris compressa). Aquat Toxicol, 170: 271-278.
  • Oropesa AL, Guimarães L (2021). Occurrence of levonorgestrel in water systems and its effects on aquatic organisms: A review. Rev Environ Con Tox, 254: 57-84.
  • Overturf MD, Overturf CL, Carty DR, Hala D, Huggett DB (2014). Levonorgestrel exposure to fathead minnows (Pimephales promelas) alters survival, growth, steroidogenic gene expression and hormone production. Aquat Toxicol, 148: 152-161.
  • Runnalls TJ, Beresford N, Losty E, Scott AP, Sumpter JP (2013). Several synthetic progestins with different potencies adversely affect reproduction of fish. Environ Sci Technol, 47(4): 2077-2084.
  • Runnalls TJ, Beresford N, Kugathas S, Margiotta-Casaluci L, Scholze M, Scott AP, Sumpter JP (2015). From single chemicals to mixtures- Reproductive effects of levonorgestrel and ethinylestradiol on the fathead minnow. Aquat Toxicol, 169: 152-167.
  • Segner H, Caroll K, Fenske M, Janssen CR, Maack G, Pascie D, Schafers C, Vandenbregh GF, Watts M, Wenzel A (2003). Identification of endocrine-disrupting effects in aquatic vertebrates and invertebrates: report from the European IDEA project. Ecotox Environ Safe, 54: 302-314.
  • Shved N, Berishvili G, D’Cotta H, Baroilller JF, Segner H, Eppler E, Reinecke M (2007). Ethinylestradiol (EE2) differentially interferes with insulin-like growth factor-I (IGF-I) in liver and extrahepatic sites during development of male and female bony fish. Endocrinol, 195, 513-523.
  • Shirling D, Ashby JP, Baird JD (1981). Effect of progesterone on lipid metabolismin the intact rat. J Endocrinol, 90: 285-294.
  • Steinbach C, Lutz I, Sandova M, Pech M, Salkova E, Borík A, Valentova O, Kroupov HK (2023). Effects of the synthetic progestin levonorgestrel on some aspects of thyroid physiology in common carp (Cyprinus carpio). Chemosphere, 310: 136860.
  • Stelmanska E, Kmiec Z, Swierczynski J (2012). The gender- and fat depot-specificregulation of leptin, resistin and adiponectin genes expression by progesteronein rat. J Steroid Biochem Mol Biol, 132: 160-167.
  • Svensson J, Fick J, Brandt I, Brunström B (2013). The synthetic progestin levonorgestrel is a potent androgen in the three- spined stickleback (Gasterosteus aculeatus). Environ Sci Technol, 47: 2043-2051.
  • Teigeler M, Schaudien D, Bohmer W, Lange R, Schafers C (2022). Effects of the gestagen levonorgestrel in a life cycle test with zebrafish (Danio rerio). Environ Toxicol Chem, 41(3): 580-591.
  • Vulliet E, Cren-Olivé C (2011). Screening of pharmaceuticals and hormones at the regional scale, in surface and groundwaters intended to human consumption. Environ Pollut, 159: 2929-2934.
  • Yarahmadi H, Duy SV, Hachad M, Dorner S, Sauvé S, Prévost M (2018). Seasonal variations of steroid hormones released by wastewater treatment plants to river water and sediments: Distribution between particulate and dissolved phases. Sci Total Environ, 635: 144-155.
  • Yi KW, Shin JH, Seo HS, Lee JK, Oh MJ, Kim T, Saw HS, Kim SH, Hur JY (2008). Role of estrogen receptor-alpha and -beta in regulating leptin expressionin 3T3-L1 adipocytes. Obesity, 16: 2393-2399.
  • Zeilinger J, Steger-Hartmann T, Maser E, Goller S, Vonk R, Lange R (2009). Effects of synthetic gestagens on fish reproduction. Environ Toxicol Chem, 28 (12): 2663-2670.
Journal of Animal Research (Iranian Journal of Biology)
Volume 37, Issue 1
Winter 2024
Pages 48-64

  • Receive Date 26 March 2023
  • Revise Date 29 November 2023
  • Accept Date 21 January 2024