نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانش آموخته کارشناسی ارشد شیلات، واحد لاهیجان، دانشگاه آزاد اسلامی، لاهیجان

2 استادیار گروه شیلات، دانشکده منابع طبیعی، واحد لاهیجان، دانشگاه آزاد اسلامی، لاهیجان

3 دانشیار گروه شیلات، دانشکده منابع طبیعی، واحد لاهیجان، دانشگاه آزاد اسلامی، لاهیجان

4 دکتری دامپزشک بخش بهداشت و بیماری‌های آبزیان، موسسه تحقیقات بین‌المللی تاسماهیان دریای خزر‌،‌رشت

چکیده

هدف از تحقیق حاضر بررسی تاثیرات عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس بر فراسنجه‌های خونی در ماهیان مبتلا شده به (Aeromonas hydrophila) بوده است. ایجاد آلودگی تجربی ماهیان آمور با باکتری آئروموناس‌هیدروفیلا با تراکم‌های 106× 5/1 ، 107× 5/1 ، 108× 5/1 و 109× 2/1 (cfu/ml) به محوطه صفاقی ماهیان انجام شد که نتایج نشان دهنده ایجاد بیماری در تراکم 108× 5/1 و 109× 2/1(cfu/ml) باکتری بوده است. تأثیر عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس در غلظت‌های تیماری 250، 410، 580 و 750 (ppm) به صورت حمام کوتاه مدت (به مدت 60دقیقه) بر بچه‌ماهیان آمور (با میانگین وزنی 25 گرم) طی مدت 10روز با 3 تکرار مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج حاصل از بررسی فراسنجه‌های خونی ماهیان مورد آزمایش که بر اساس آزمون تجزیه واریانس یکطرفه و آزمون دانکن انجام گرفت نشان داد که اختلاف معنی‌دار آماری در میزان گلبول‌های‌سفید، گلبول‌های‌قرمز، حجم متوسط گلبولی، غلظت متوسط هموگوبین در گلبول‌قرمز، غلظت متوسط هموگلوبین گلبول‌های‌قرمز، نوتروفیل، لینفوسیت خون ماهیان با تیمار شاهد حکایت دارد(P<0/05)، بررسی نتایج حاصل از این مطالعه نشان می‌دهد عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس خصوصا در غلظت‌های پایین به دلیل عدم ایجاد تغییرات قابل توجه در فراسنجه‌های خونی می‌توانند به عنوان ترکیبات ضدمیکروبی در کنترل عوامل بیماریزا و درمان ماهی آمور مورد توجه قرار گیرند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Effects of different amounts of hydroalcoholic extract of eucalyptus on the blood parameters of Gras Carp (Ctenopharyngodon idella) infected with Aeromonas hydrophila

نویسندگان [English]

  • Seyed Mohammad sadegh Roudbaraki 1
  • Hadi Ershad 2
  • Hossein Khara 3
  • Mahdi Maasoumzadeh 4

1 M.Sc. in Fisheries, Lahijan Branch, Islamic Azad University, Lahijan, I.R. of Iran

2 Assistant Professor in Department of Fisheries, Lahijan Branch, Islamic Azad University, Lahijan, I.R. of Iran

3 Assistant Professor in Department of Fisheries, Lahijan Branch, Islamic Azad University, Lahijan, I.R. of Iran

4 Dr. In veterinary International Sturgeon Research Institute, Agricultural Research Education and Extension Organization(AREEO), Rasht, Iran

چکیده [English]

The purpose of this study the effect of eucalyptus extract on blood and immune parameters in fish infected with Aeromonas hydrophila after treatment with eucalyptus extract was Created grass carp experimentally infected with Aeromonas hydrophila density 1.5×106 ,1.5×107 ,1.5×108 ,1.2 ×109 (cfu/ml ) The peritoneal cavity of fish was the results indicate that disease in dense 1.5×108 ,1.2 ×109 (cfu/ml ) bacteria have been. Effect of eucalyptus extract concentrations 250 , 410 ,580 ,750 (ppm) baths for a short time (60 minutes) on the grass carp (average weight 25 g) were evaluated over a period of 10 days with 3 replicates. The results of the analysis of blood parameters of the fish that were tested on the basis of one way ANOVA and Duncan test showed that there was a significant difference in the amount of white blood cells, red blood cells, mean corpuscular volume, mean concentration of hemoglobin in the red blood cell, medium concentration Hemoglobin, RBC, neutrophil, Lymphocyte, Fetal blood, with control treatment (p<0.05), The serological results showed that the extract increases the amount of lysozyme and immunoglobulin and albumin blood Eucalyptus species in different treatments were compared to the negative control and significant differences between the treatments in question existed (p<0.05).

کلیدواژه‌ها [English]

  • grass carp
  • eucalyptus
  • Aeromonas hydrophila
  • blood factors

تاثیر مقادیر مختلف عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس بر فراسنجه‌های خونی ماهیان آمور (Ctenopharyngodon idella) آلوده شده به باکتری آئروموناس­هیدروفیلا
 (Aeromonas hydrophila)

سید محمد صادق رودبارکی1*، هادی ارشاد1، حسین خارا1 و مهدی معصوم‌زاده2

1 لاهیجان، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد لاهیجان، دانشکده منابع طبیعی، گروه شیلات

2 رشت، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، موسسه تحقیقات بین­المللی تاسماهیان دریای­خزر، بخش بهداشت و بیماری‌های آبزیان

تاریخ دریافت: 23/3/96                تاریخ پذیرش: 16/11/96 

چکیده

هدف از تحقیق حاضر بررسی تاثیرات عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس بر فراسنجه­های خونی در ماهیان مبتلا شده به (Aeromonas hydrophila) بوده است. ایجاد آلودگی تجربی ماهیان آمور با باکتری آئروموناس­هیدروفیلا با تراکم­های 106× 5/1 ،  107× 5/1 ، 108× 5/1 و 109× 2/1 (cfu/ml) به محوطه صفاقی ماهیان انجام شد که نتایج نشان دهنده ایجاد بیماری در تراکم 108× 5/1 و 109× 2/1(cfu/ml) باکتری بوده است. تأثیر عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس در غلظت­های تیماری 250، 410، 580 و 750 (ppm) به صورت حمام کوتاه مدت (به مدت 60دقیقه) بر بچه­ماهیان آمور (با میانگین وزنی 25 گرم) طی مدت 10روز با 3 تکرار مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج حاصل از بررسی فراسنجه­های خونی ماهیان مورد آزمایش که بر اساس آزمون تجزیه واریانس یکطرفه و آزمون دانکن انجام گرفت نشان داد که اختلاف معنی­دار آماری در میزان گلبول­های­سفید، گلبول­های­قرمز، حجم متوسط گلبولی، غلظت متوسط هموگوبین در گلبول­قرمز، غلظت متوسط هموگلوبین گلبول­های­قرمز، نوتروفیل، لینفوسیت خون ماهیان با تیمار شاهد حکایت دارد (P<0/05)، بررسی نتایج حاصل از این مطالعه نشان می­دهد عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس خصوصا در غلظت­های پایین به دلیل عدم ایجاد تغییرات قابل توجه در فراسنجه­های خونی می­توانند به عنوان ترکیبات ضدمیکروبی در کنترل عوامل بیماریزا و درمان ماهی آمور مورد توجه قرار گیرند.

واژه های کلیدی: ماهی آمور، اکالیپتوس، آئروموناس­هیدروفیلا ، فراسنجه‌های خونی

* نویسنده مسئول، تلفن: 01412229081  ، پست الکترونیکی:  sadegh.roudbaraki@gmail.com

مقدمه

 

کپورماهیان از جمله مهمترین ماهیان پرورشی در ایران بوده و در بیشتر مناطق کشور مزارع پرورشی ماهیان مذکور وجود دارد و بیش از 60 درصد از تولیدات آبزیپروری کشور را به خود اختصاص ‌داده‌اند. در بین ماهیان گرمابی نیز ماهی آمور یا کپور علف‌خوار(Ctenopharyngodon idella) با ارزش‌ترین و پرطرفدارترین گونه نزد مصرف­کنندگان و تولیدکنندگان می‌باشد.‌ولی متاسفانه طی سال‌های اخیر، تلفات این ماهی با ارزش، پرورش این گونه را با چالش جدی مواجه ساخته است. بطوری که بسیاری از پرورش‌دهندگان نسبت این گونه را در استخر به حداقل رسانده و یا آن را حذف نموده­اند ‌(10). ‌از مهمترین عوامل تهدید‌کننده پرورش متراکم ماهیان از جمله ماهی آمور آلودگی به عوامل بیماریزا و در نتیجه بروز تلفات در آنها می­باشد. اولین بار رضویلر و همکار‌ان با جدا سازی آئروموناس­هیدروفیلا از ماهی آمور در استان گیلان احتمال بیماری­زایی و ایجاد علائم بیماری توسط این باکتری را در گونه آمور گزارش نمودند (4). پیغان و اسماعیلی در بررسی علل این تلفات موفق به جداسازی آئروموناس­های متحرک از آبشش، کلیه و کبد ماهی آمور گردیدند (1). سلطانی و موسوی دو گونه آئروموناس­هیدروفیلا و آﺋﺮوﻣﻮﻧﺎس­وروﻧﯽ را از تلفات ماهی آمور در دو کارگاه در استان­های گیلان و تهران گزارش نمودند (5). باکتری­های خانواده آئروموناس، باسیل­های گرم منفی آب شیرین بوده که اشکال متحرک آنها می­توانند میکروفلور جانوران آبزی باشند و در جانوران خونسرد، خونگرم و حتی انسان نیز  بیماریزا باشند. آئروموناس­های متحرک عامل سپتی­سمی­هموراژیک در ماهیان آب شیرین عبارتند از: آئروموناس­هیدروفیلا، آﺋﺮوﻣﻮﻧﺎس­ﮐﺎوﯾﻪ و آئروموناس­سوبریا که همگی گرم منفی، بی­هوازی اختیاری، غیر­هاگزا و متحرک بوده که در مورد نقش آنها به عنوان پاتوژن اولیه شک و تردید وجود دارد اما نقش مهمی را در روند بیماری در ماهیان مبتلا ایفا می­کنند (12). داروهای گیاهی طی قرن­های متمادی تنها منبع قابل دسترس جهت درمان دردها و آلام بوده­اند و امروزه نیز با وجود پیشرفت علم و توسعه کاربرد داروهای سنتزی، هنوز گیاهان دارویی در مقیاس وسیع مورد استفاده قرار می­گیرند. در مورد بیماری­های عفونی باکتریایی با توجه به محدودیت­های استفاده از آنتی­بیوتیک­ها از جمله ایجاد مقاومت­های دارویی در ماهی و انسان (در مورد آنتی­بیوتیک­هایی که هم در ماهی و هم در انسان مصرف می­شوند)  مشکلات زیست­محیطی و قیمت بالای برخی آنتی­بیوتیک­ها، گرایش به جایگزینی آنها با مواد کم ضررتر و ارزان­تر را تقویت نموده است . از بین مواد مختلف جایگزینی آنتی­بیوتیک­ها، اخیر اً فرآورده­هایی با منشاء گیاهی جایگاه ویژه­ای یافته­اند (11).

 اکالیپتوس یکی از معروفترین گیاهان دارویی است که از دیرباز اثرات ضدمیکروبی و خواص دیگر آن مورد توجه بوده است . این گیاه منبع غنی از پلی­فنلها و ترپنوئیدهاست و ترکیب اصلی برگ آن اکالیپتول(C10H18O) می­باشد (8). عصاره برگ این گیاه دارای خواص ضد­سرطانی، ضد­التهابی، ضد­درد، آنتی­اکسیدان ، ضد­ازدیاد قند­خون ، ضد­مالاریایی، ضدقارچی و ضدویروسی است (21). هدف تحقیق حاضر ارزیابی اثر عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس  بر فراسنجه­هایی نظیر گلبول­های سفید، گلبول­های قرمز، هماتوکریت، هموگلوبین، ایمنوگلوبین، لیزوزیم در ماهیان مبتلا شده به آئروموناس­هیدروفیلا بوده است.

مواد و روشها

این تحقیق در پاییز 1391 در موسسه تحقیقات بین­المللی تاسماهیان دریای خزر به انجام رسید. عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس مصرفی در این تحقیق، جهت اطمینان از درصد خلوص (اتانول 70درصد) ماده مؤثره، از یکی از شرکت­های معتبر تولیدکننده داروهای گیاهی با نام شرکت زرد­بند، تهیه گردید (جدول1).

جدول 1- مشخصات عصاره اکالیپتوس تهیه شده از شرکت زردبند

ویژگی

Range 

Batch 

ظاهر

Clear

clear

رنگ

قهو ه ای

قهو ه ای

pH

4- 5/5

5/21

چگالی

1/022-1/045

1/037

Refractive Index

1/388-1/395

1/388

Dry residue 

3-4/6

4/00

 

به منظور ایجاد آلودگی تجربی در بچه­ماهیان آمور به باکتری آئروموناس­هیدروفیلا جدا شده از ماهیان خاویاری که جنس و گونه آن با استفاده از آزمایشات باکترولوژیک و روش ملکولی در موسسه تحقیقات بین­المللی تاسماهیان دریای خزر مشخص شده بود در محیط  کشتتریپیکاز سوی براث(TSB) کشت داده شده و در مدت زمان 24 ساعت در 27 درجه سانتی گراد مورد انکوباسیون قرار گرفت با استفاده از دستگاه سانتریوفوژ جدا نموده تا باکتری خالص مورد آزمایش بدست آید. سپس باکتری آئروموناس­هیدروفیلا که با غلظت­های  cfu/ml106،  cfu/ml107،  cfu/ml108 با استاندارد نیم مک­فارلند و cfu/ml 109 با استاندارد 4 مک­فارلند برابر بود، تهیه شد. برای رسیدن به این غلظت­ها و مقایسه آن با استاندارد مک­فارلند باکتری سانتریوفوژ شده را با استفاده از سمپلر به میزان 100 ماکرولیتر برداشته و به لوله آزمایش حاوی سرم فیزیولوژی اضافه و با دستگاه ورتکس آنها را میکس نموده و این کار تا زمانی که کدورت با استاندارد مک­فارلند برابر شود ادامه پیدا کرد و سپس بصورت چشمی مورد مقایسه قرار گرفت، باکتری تهیه شده بدین روش به محوطه صفاقی ماهیان آمور با استفاده از سرنگ تزریق شد (13)، سپس ماهیان به آکواریوم­های 20 لیتری با دمای 20 درجه سانتی گراد منتقل شدند. ماهیان تا 96 ساعت روزانه از نظر تلفات و علائم بیماری شامل بی­حالی، اگزوفتالمی، تیرگی پوست و غیره مورد بررسی قرار گرفتند و تلفات روزانه ماهیان ثبت شد. بر اساس نتایج بدست آمده از انجام آزمایشات LC50 96 ساعته­ عصاره هیدروالکلی اکالییپتوس  بر روی بچه­ماهیان آمور و نتایج حاصله از حداقل غلظت مهار کنندگی رشد (MIC) و حداقل غلظت کشندگی باکتری آئروموناس­­هیدروفیلا (MBC) اقدام به انتخاب 4 غلظت از عصاره هیدروالکلی اکالییپتوس شد. بر اساس غلظت­های مذکور گروه­های تیمار و شاهد(مثبت و منفی) انتخاب و برای هر کدام از این گروه ها 3 تکرار در نظر گرفته شد. ماهیان مبتلا به  آئروموناس­هیدروفیلا با غلظت­های تیماری (ppm)250 مقدار(cc)5 عصاره هیدروالکلی اکالییپتوس دریافت کردند، (ppm)480 برابر(cc)8.2 از عصاره هیدروالکلی اکالییپتوس، (ppm)510 برابر(cc)11 عصاره هیدروالکلی اکالییپتوس، (ppm)750 به مقدار (cc)15 از عصاره هیدروالکلی اکالییپتوس دریافت نمودند. شاهد مثبت (ماهیانی که به آنها باکتری آئروموناس ­هیدروفیلا تزریق شده بود ولی مرحله درمان روی آنها صورت نگرفت و  هیچگونه عصاره ای دریافت نکردند) و شاهد منفی (ماهیانی که به آنها باکتری آئروموناس­هیدروفیلا تزریق نشده بود و مرحله درمان روی آنها صورت نگرفت و  هیچگونه عصاره ای دریافت نکردند) انتخاب گردید و برای هر کدام از این گروه ها 3 تکرار در نظر گرفته شد. پس از تعیین گروه­های تیمار و شاهد نسبت به حمام بچه­ماهیان آمور آلوده شده به باکتری آئروموناس­هیدروفیلا و دارای علائم ناشی از بیماری بعد از 96 ساعت از زمان آلودگی، روزانه بمدت یک ساعت در طی 10 روز اقدام گردید. جهت بررسی تاثیر مقادیر مختلف عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس بر فراسنجه­های خونی ماهیان آمور تیمار شده با عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس مورد مطالعه نسبت به خونگیری از 30 درصد نمونه ها (3 قطعه ماهی از هر تکرار)  به وسیله سرنگ 2 سی­سی از ساقه دمی و در بعضی موارد با قطع ساقه دمی اقدام و خون بدست آمده بلافاصله وارد اپندورف­های حاوی ماده ضدانعقاد هپارین گردید. پس از تهیه نمونه­های خون از ماهیان مورد بررسی اندازه­گیری شاخص­های خونی­(CBC) به روش استاندارد به شرح ذیل انجام گردید:

تعیین درصد هموگلوبین در نمونه­های­خون (Hb): اندازه­گیری هموگلوبین با واحد گرم در دسی­لیتر به دو روش دستگاهی با استفاده از­Sysmexlys  و یا با استفاده از محلول سیانومت هموگلوبین در طول موج 540 نانومتر با درابکین و منحنی استاندارد به روش دستی امکان پذیر است. این آزمایش از روش دستگاهی استفاده شد (18).

- تعیین غلظت هماتوکریت در نمونه­های خون (HCT) : اندازه­گیری هماتوکریت با لوله­های میکروهماتوکریت و توسط میکروسانتریفوژ Hettich  با دور 14000rpm اندازه­گیری شده است (18).

گلبول­قرمز به کمک محلول Lewis و با کمک پیپت ملانژور و لام نئوبار شمارش شده است.

گلبول­سفید به کمک محلول Lewis در 1/0گرم (Brillant cresyl blue) به کمک پیپت ملانژور و لام نئوبار شمارش شده است (18).

شمارش افتراقی لکوسیت­ها در نمونه­های خون (diff): در این بررسی جهت تعیین مقادیر لوکوسیت­های خون از روش­های توصیه شده توسط Svobodova  و همکاران در سال 1991 و Feldman و همکاران در سال 2000 استفاده و شمارش جمعیت انواع گلبول­های­سفید نمونه­های خون ماهیان مورد بررسی با استفاده از لام نئوبار صورت پذیرفت (15 ،18 ،21).

محاسبه MCV (حجم متوسط سلول) با واحد  (u3) میکرون مکعب:

      =(mean cell volume) MCV

محاسبه MCH (هموگلوبین متوسط ​​گویچه ای) با واحد پیکوگرم

   =( mean corpuscular haemoglobin) MCH

محاسبه MCHC (متوسط ​​غلظت هموگلوبین سلول) با واحد درصد     

100 ×    = (mean cell Hb concentration) MCHC

نمونه­های خون تهیه شده در دمای آزمایشگاه با سرعت 3000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ و سرم آنها جدا گردید.

اندازه­گیری ایمنوگلوبین(IgM):

شکل6-2- ایجاد آلودگی تجربی در ماهی آمور

 

 

 

جهت اندازه­گیری  IgMنمونه­های سرم تهیه شده از ماهیان تیمار و شاهد از روش Nephelometry استفاده گردید (25).

اندازه­گیری غلظت آلبومین سرم: جهت اندازه­گیری مقادیر آلبومین نمونه­های سرم تهیه شده از ماهیان تیمار و شاهد از روش BCG/Colorinetric استفاده گردید (14).

Albumin+BCG  pH 4.2 Albumin-BCG(complex)

آلبومین موجود در سرم با Bromocresol green در pH اسیدی یک کمپلکس رنگی سبز-آبی را ایجاد می‍کند. شدت رنگ ایجاد شده متناسب با میزان آلبومین نمونه می‍باشد.

اندازه­گیری مقادیر لیزوزیم: برای تعیین میزان لیزوزیم از روش ارائه شده توسطKumari  در سال 2006 استفاده شد. به این منظور از پلیت­های 96 خانه­ای شکل الیزا، مقدار 15 میکرولیتر سرم افزوده شد (17). سپس 150 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتری میکروکوکوس لیزودیکتیکوس تهیه شده در بافر سیترات­سدیم 02/0 مولار و pH 5/5 به میزان 2/0 میلی­گرم در لیتر اضافه گردید و جذب نوری اولیه در 450 نانومتر اندازه­گیری شد و پس از 1 ساعت در دمای اتاق، مجدداً جذب نوری اندازه­گیری شد.

روش­های آماری: به منظور بررسی توزیع نرمال داده­ها در گروه­ها و تکرار­ها جهت تشکیل تیمار­ها از آزمون  Shapiro-Wilk استفاده شد. در صورت نرمال بودن داده­ها به منظور مقایسه آماری بین گروه­ها در تیمار­ها از آزمون آنالیز واریانس یکطرفه(Oneway anova)  و پس از انجام آزمون Test of Homogeneity of Variances جهت مقایسه گروه­ها با یکدیگر از آزمون دانکن استفاده شد. کلیه آنالیز های آماری با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 17 استفاده شد.

نتایج

با سپری شدن 96 ساعت از مدت زمان تزریق تعداد 140 عدد بچه­ماهیان آمور به باکتری آئروموناس­هیدروفیلا ماهیان روزانه مورد بررسی قرار می­گرفتند در نتیجه مشخص شد که ماهیان تزریق شده با غلطت cfu /ml106 ، cfu /ml107 ( با استاندارد نیم مک­فارلند) فاقد علائم بیماری و همچنین تلفات ناشی از تزریق باکتری بودند. علائم بیماری در 12 عدد بچه­ماهی آمور در غلظت cfu /ml 108 (با استاندارد نیم مک­فارلند) در مشاهده شد. اما علائم بیماری در غلظت cfu /ml 109 (با استاندارد چهار مک­فارلند) با شدت بیشتر نمایان شد و تعداد 56 عدد از ماهیان در این غلظت تزریقی دچار تلفات گردیدند. 

تیمار ماهیان آمور آلوده شده به باکتری آئروموناس­هیدروفیلا با غلظت cfu /ml 108 (با استاندارد نیم مک­فارلند)  به تعداد 84 عدد ماهی انجام گردید که در طی مرحله درمان در 24 ساعت در تیمار چهارم با غلظت (ppm)750 که بر اساس آن (cc) 15 عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس  به این تیمار و تکرار آن وارد شده بود دچار تلفات گردیدند (جدول2).

 

 

جدول2- تیمار ماهیان آلوده شده به Aeromonas hydrophila

شماره تیمار

1

2

3

4

5

6

غلظت تیمار

(ppm)250

(ppm)480

(ppm)510

(ppm)750

شاهد مثبت(+)

شاهدمنفی

(-)

(cc)5

(cc)8.2

(cc)11

(cc)15

تکرار

1

2

3

1

2

3

1

2

3

1

2

3

0

0

تلفات

0

0

0

0

0

0

0

0

0

1

2

0

                                   

 

بعد از طی دوره درمانی و تیمار ماهیان با غلظت­های مختلف عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس  نتایج مربوط با توجه به عدم وجود علائم ظاهری بیماری در ماهیان بر اساس فراسنجه­های خونی و سرمی مورد بررسی قرار گرفت که در ذیل به آنها پرداخت شده است:

نتایج حاصل از بررسی فراسنجه­های خونی ماهیان مورد آزمایش که بر اساس آزمون تجزیه واریانس یکطرفه و آزمون دانکن انجام گرفت نشان داد که گلبول­های­سفید در تیمار­های اول، دوم و سوم نسبت به تیمارهای شاهد با کاهش قابل ملاحظه ای مواجه شده­اند و در تیمار چهارم میزان گلبول­های­سفید نسبت به تیمار شاهد منفی افزایش پیدا کرده است، همچنین میزان گلبولهای­قرمز در تیمار دوم نسبت به سایر تیمار­ها از کمترین میزان برخوردار می­باشد و تیمارهای اول و چهارم نسبت به تیمارهای شاهد کمتر می­باشد. میزان هموگلوبین در تیمار دوم نسبت به تیمار شاهد منفی افت چشمگیری داشته و نسبت به سایر تیمار­ها نیز از مقدار کمتری برخوردار می­باشد. هماتوکریت خون ماهیان در تیمار دوم به طور قابل ملاحضه ای نسبت به تیمار شاهد منفی کاهش یافته است ودر تیمارهای اول و چهارم این کاهش کمتر می­باشد.حجم متوسط گلبولی­خون ماهیان در تیمار اول نسبت به تیمار شاهد منفی پایین­تر بوده و در سایر تیمار­ها بالاتر می­باشد. غلظت متوسط هموگوبین گلبول­های­قرمز خون در تیمار اول نسبت به تیمار­های شاهد کاهش یافته و در تیمار سوم از بالاترین میزان برخوردار می­باشد. غلظت متوسط هموگلوبین گلبول­های­قرمز خون در تیمار دوم نسبت به تیمارهای شاهد کاهش یافته و در سایر تیمارها افزایش داشته که این میزان در تیمار چهارم بیش از سایر تیمارها می­باشد. میزان نوتروفیل در تیمار­های اول، دوم و سوم نسبت به تیمار­های شاهد کاهش یافته و در تیمار چهارم افزایش چشمگیری را میتوان دید. همچنین میزان لنفوسیت در تیمار چهارم نسبت به تیمار­های شاهد کاهش و در تیمارهای اول، دوم و سوم افزایش را نشان می­دهد. نتایج از اختلاف معنی­دار آماری در میزان گلبول­های­سفید، گلبول­های­قرمز، حجم متوسط گلبولی، غلظت متوسط هموگوبین در گلبول­قرمز، غلظت متوسط هموگلوبین گلبول­های­قرمز، نوتروفیل، لینفوسیت خون ماهیان حکایت دارد (P<0/05)، هچنین در نتایج حاصل از شمارش میزان مونوسیت و ائوزینوفیل خون ماهیان در بین تیمار­های مختلف هیچگونه اختلاف معنی دار آماری مشاهده نمی­گردد (P>0/05) )جدول 3).

نتایج حاصل از بررسی فراسنجه­های سرمی ماهیان مورد آزمایش که بر اساس آزمون تجزیه واریانس یکطرفه و آزمون دانکن انجام گرفت نشان داد که میزان لیزوزیم در تیمار چهارم نسبت به تیمار­های شاهد افزایش داشته اما به نسبت تیمار­های اول، دوم و سوم کمتر می­باشد و در تیمار اول از بالاترین مقدار برخوردار است، شمارش حاصل از ایمنوگلوبین نشان داد که تیمار سوم در مقایسه با تیمار شاهد منفی از میزان بیشتری برخوردار بوده اما نسبت به شاهد مثبت این میزان کمتر می­باشد اما در تیمارهای اول، دوم و چهارم بطور قابل ملاحظه­ای از هر دو شاهد مثبت و منفی بالاتر می باشد مقدار آلبومین موجود در خون ماهیان در تیمارهای اول تا چهارم نسبت به تیمار­های شاهد بالاتر بوده و در تیمارهای اول، دوم و چهارم تقریبا برابر بوده و در تیمار سوم بالاترین میزان را دارا می­باشد، نتایج اختلاف معنی­دار آماری را در میزان لیزوزیم، ایمنوگلوبین و آلبومین خون ماهیان در بین تیمارهای مختلف نشان می­دهد (P<0/05) جدول (4).

 

جدول3 - میانگین فراسنجه­های خونی در تیمارهای مختلف

         تیمار

 

فراسنجه خونی

 

تیمار 1

 

تیمار2

 

تیمار 3

 

 

تیمار 4

 

تیمار 5

(شاهد مثبت)

تیمار 6

(شاهد منفی)

گلبول­سفید

a 50 ± 4550

a25± 4425

a 25± 4725

c50± 8350

c25± 8375

b75± 7725

گلبول­قرمز

C 5000± 2165000

a 4500± 1585000

e 4000± 2485000

b 5000± 2015000

d 3500± 2405000

f 4507± 2925000

هموگلوبین

b 1/0± 1/6

a1/0± 5/4

e05/0± 75/7

b1/0± 6

c05/0± 05/7

d1/0± 4/8

هماتوکریت

b 1± 24

a 5/0± 5/19

cd  5/0± 5/31

b1 ± 24

c  5/0± 5/29

d 5/0± 5/33

حجم متوسط گلبولیخون (MCV)

a5/ 0 ± 5/114

b75/0± 5/125

b25/0 ± 5/125

a 1 ± 116

b5/1± 5/123

a5/0 ± 5/115

غلظت متوسط هموگوبین در گلبول­قرمز(MCH)

a 56/ 0 ± 5/27

a50/0 ± 5/28

b87/0 ± 5/31

ab 81/0 ± 5/29

a50/0 ± 5/28

a37/0 ± 5/28

غلظت متوسط هموگلوبین گلبول های قرمز(MCHC)

b5/ 0 ± 5/24

a 5/1± 5/22

b 45/0 ± 5/25

b 50/0 ± 5/26

a 49/0 ± 5/23

b 37/0 ± 5/24

نوتروفیل

a 50/ 0 ± 50/32

b45/ 0 ± 5/34

a0 5/1 ± 5/32

d50/0 ± 50/43

c  68/1 ± 5/38

c5/0 ± 50/38

لینفوسیت

c5/ 1± 50/63

c5/0± 5/62

c50/2± 50/63

a50/1 ± 5/54

b50/0± 50/58

b 2 ± 50/58

مونوسیت

b81/ 0 ± 3

b5/0± 3

c 68/0± 3

a5/0 ± 2

c  81/0± 3

a85/0 ± 2

ائوزینوفیل

ERR ± 1

0

ERR ± 1

0

0

ERR ± 1

 

شکل1- مقایسه میزان گلبول­های سفید در تیمارهای مختلف

 

شکل2- مقایسه میزان گلبول­های قرمز در تیمارهای مختلف

 

شکل3-مقایسه میانگین میزان هموگلوبین در تیمارهای مختلف

 

شکل4- مقایسه میانگین میزان هماتوکریت در تیمارهای مختلف

 

شکل5- مقایسه میانگین میزان حجم متوسط گلبولی در تیمارهای مختلف

 

شکل6- مقایسه میانگین میزان MCH در تیمارهای مختلف

 

شکل7- مقایسه میانگین میزان MCHC در تیمارهای مختلف

 

شکل8- مقایسه میانگین میزان نوتروفیل در تیمارهای مختلف

 

شکل9- مقایسه میانگین میزان لینفوسیت در تیمارهای مختلف

 

شکل10- مقایسه میانگین میزان مونوسیت در تیمارهای مختلف

 

شکل11- مقایسه میانگین میزان ائوزینوفیل در تیمارهای مختلف

 

 

جدول4 - میانگین فراسنجه­های سرمی در تیمار­های مختلف

               فراسنجه سرمی

تیمار

لیزوزیم 

IgM ایمنوگلوبین 

آلبومین 

تیمار1

f 5/ 0 ± 5/79

c 05/ 0 ± 65/10

c 005/ 0± 64/0

تیمار2 

e56/0± 50/49

c05/0± 45/10

c01/0± 68/0

تیمار3 

d  1± 45

a 32/0± 4/8

d  01/0± 84/0

تیمار4 

c87/1 ± 39

c1/0± 8/10

c01/0 ± 66/0

تیمار5 (شاهد مثبت) 

b  88/0 ± 5/33

b  5/0± 05/9

b 005/0± 41/0

تیمار6 (شاهد منفی) 

a87/0± 5/18

a14/0± 2/8

a01/0 ± 36/0

 

 

شکل12- مقایسه میانگین میزان لیزوزیم با تیمارهای مختلف

 

شکل13- مقایسه میانگین میزان IGM در تیمارهای مختلف

 

شکل14- مقایسه میانگین میزان آلبومین در تیمارهای مختلف


بحث

با توجه به اینکه باکتری آئروموناس­هیدروفیلا بطور طبیعی در اکثر منابع آبی حضور دارند ضروری است به منظور کنترل و حذف باکتری در مراکز تکثیر و پرورش ماهیان گرمابی اقدام نمود برای این منظور در حال حاضر از مواد ضدعفونی­کننده شیمیایی و نیز از انواع آنتی­بیوتیک­ها جهت درمان ماهیان بیمار استفاده می­گردد که نتایج متفاوتی در ارتباط با هر کدام از آنها حاصل گردیده است که این امر می­تواند ناشی از تغییر فراسنجه­های فیزیکی و شیمیایی آب مانند دما، pH، اکسیژن محلول، مواد آلی و مواد معلق  باشد (6). تاثیرات سوء زیست­محیطی مواد شیمیایی ضدعفونی­کننده و آنتی­بیوتیک­ها در کنار اثرات منفی آنها بر مصرف­کنندگان ماهیان تحت درمان مانند ایجاد مقاومت داروئی در برابر عوامل باکتریایی موجب گردیده است امروزه استفاده از مواد طبیعی مانند گیاهان دارویی مورد توجه ویژه قرار گیرد.

بررسی نتایج ایجاد آلودگی تجربی ماهی کپورعلفخوار به باکتری آئروموناس­هیدروفیلا­ با غلظت­های­106×­5/1­و
107× 5/1 و 108× 5/1و 109× 2/1 (cfu/ml ) از ایجاد بیماری در تزریق داخل صفاقی مقادیر 108× 5/1و 109× 2/1 حکایت می­نماید هرچند علائم کلینیکی بیماری و نیز تلفات ماهیان در تزریق غلظت باکتریایی 109× 2/1 نسبت به 108× 5/1 بیشتر بوده است، بررسی نتایج مذکور با نتایج بدست آمده از مطالعه Aboud در سال 2010 با تزریق غلظت 109× 1(cfu/ml) از باکتری آئروموناس­هیدروفیلا در ماهی تیلاپیا نشان داد ماهی آمور نسبت به ماهی تیلاپیا در مقادیر پایین­تر از باکتری آئروموناس­هیدروفیلا به بیماری آئرومونازیس مبتلا می­شود (13).  در بررسی دیگری نتایج بدست آمده از مطالعه توکلی و اخلاقی در سال 1388 با تزریق غلظت­های باکتریایی105× 2  ، 106× 4 ،  107× 3 (cfu/ml) باکتری آئروموناس­هیدروفیلا به ماهی قزل­آلای­رنگین­کمان (2)، طافی و همکاران در سال 1392 با تزریق 107 (cfu/ml) باکتری آئروموناس­هیدروفیلا به ماهی قزل­آلای­رنگین­کمان (9) و همچنین نتیجه بدست آمده از مطالعه انجام شده توسط رحمتی اندانی و همکاران در سال 1390 با تزریق غلظت باکتریایی 106× 8/9 (cfu/ml) باکتری آئروموناس­هیدروفیلا به ماهی قزل­آلای­رنگین­کمان نشان داده شد که ماهی آمور نسبت به ماهی قزل­آلای­رنگین­کمان در مقادیر بالاتر به بیماری آئرومونازیس مبتلا می شود و در نتیجه مقاوم­تر می­باشد (3). در مطالعه انجام شده توسط علیشاهی و همکاران در سال 1388 میزان LD50  باکتری آئروموناس­هیدروفیلا برای ماهی کپور علفخوار برابر 107× 1/1 (cfu/ml) مشخص گردید(10) ، همچنین در مطالعه دیگری از Weifeng  و همکاران در سال 2004 مشخص شد که میزان LD50 آئروموناس­هیدروفیلا برای ماهی کپور علفخوار در حدت 107 (cfu/ml)  می باشد (23). Zheng  و همکاران در سال 2012 میزان LD50 باکتری آئروموناس­هیدروفیلا را برای ماهی کپور علفخوار در حدت 108× 0/1 (cfu/ml) تعیین نمودند(24). میتوان علت تفاوت در نتایج بدست آمده از تحقیق حاضر با نتایج بدست آمده از مطالعه علیشاهی و همکاران و Weifeng  و همکاران و Zheng  و همکاران را در شرایط محیطی نظیر دمای آّب جستجو نمود. تعداد گلبول­های­سفید و نسبت انواع آنها به عنوان یکی از شاخص های مهم سلامتی و وضعیت سیستم ایمنی به شمار می آید (20). بر این اساس می توان نتیجه گرفت حمام ماهیان آمور با مقادیر250 ppm،410ppm ،580 ppm و750 ppm عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس به مدت 10 روز، روزانه به مدت 1 ساعت می­تواند در تعداد انواع گلبول های سفید خون تغییرات قابل توجهی ایجاد نماید. در میزان گلبول­های­قرمز خون، هموگلوبین و هماتوکریت در بین تیمارهای مختلف اختلاف معنی دار آماری مشاهده شد. بیشترین میزان گلبول­قرمز، هموگلوبین، هماتوکریت در شاهد منفی مشاهده شد و در غلظت  ppm 410 از کمترین میانگین برخوردار بود.

مقدار شاخص­های سرمی از دیگر عوامل تعیین کننده وضعیت سلامتی جانوران مختلف از جمله ماهیان می باشند. نتایج حاصل از این بررسی نشان داد در بین گروه­های تیمار با یکدیگر و نیز بین گروه­های تیمار با  شاهد مثبت و منفی در مقادیر آلبومین، لیزوزیم و IgM اختلاف معنی دار آماری وجود داشته بطوریکه لیزوزیم در مقدار ppm 250 بیشتر از سایر تیمارها و شاهد منفی کمتر از سایر تیمارها بوده است. بیشترین میزان آلبومین در غلظت ppm 580 و تیمار منفی از کمترین میزان برخوردار بود. بیشترین میزان IgM در غلظت های  ppm250،  ppm410 و  ppm 750 بود درحالی که شاهد منفی از کمترین مقدار برخوردار بوده است. بر اساس نتایج شیخ زاده و همکاران در سال 1388 غلظت های پایین اسانس اکالیپتوس به دو روش حمام و خوراکی می تواند منجر به افزایش گلبول های­سفید خون در ماهی کپور معمولی (Cyprinus carpio) نسبت به گروه شاهد گردند (7). بررسی نتایج حاصل از این مطالعه و نیز نتایج حاصل از سایر مطالعات نشان می دهد عصاره هیدروالکلی اکالیپتوس خصوصا در غلظت­های پایین به دلیل عدم ایجاد تغییرات قابل توجه در فراسنجه­های خونی می­توانند به عنوان ترکیبات ضدمیکروبی در کنترل عوامل بیماریزا در ماهی آمور مورد توجه قرار گیرند. با توجه به اینکه در مدت زمان انجام آزمایش دمای آب پایین تر از حد اپتیموم برای ماهی آمور بوده است بنابراین دمای آب میتواند عاملی برای عدم تحریک ایمنی در ماهی عمل نماید.

  1. پیغان، ر.، اسماعیلی، ف.، 1372. آلودگی ماهی کپور علف­خوار به ارگانیسم های شبیه آئروموناس­های متحرک. مجله علمی شیلات. شماره 2. صفحات 8-1.
  2. توکلی، ه.، اخلاقی، م.، 1388. بررسی تغییر میزان لیزوزیم،ایمنوگلوبولین،گلبول ها و هماتوکریت خون در ماهی قزل آلای رنگین کمان به دنبال عفونت تجربی با آئروموناس هیدروفیلا بیماریزا. مجله تحقیقات دامپزشکی.دوره 64، شماره 2. صفحات 162-157.
  3. رحمتی اندانی، ح.، توکمه­چی، ا.، مشکینی، س.، ابراهیمی، ه.، 1390. افزایش مقاومت ماهی قزل آلای رنگین کمان در برابر عفونت با آئروموناس هیدروفیلا و یرسینیا روکری با استفاده از لاکتوباسیلهای جدا شده از روده ماهی کپور معمولی. مجله دامپزشکی ایران، دوره هفتم. شماره 2. صفحات 35-26.
  4. رضویلر، و.، حسنی طباطبائی، ع.، آذزی تاکامی، ق.، 1360. بررسی نقش بیماریزایی آئروموناس هیدرو فیلا در بعضی از بیماری های ماهی، مجله دانشکده دامپزشکی. دوره 37. شماره 2. صفحات 37-21.
  5. سلطانی، م.، ابراهیم زاده موسوی، ح.، 1375. جداسازی آئروموناس هیدروفیلا و آئروموناس ورونی از تلفات ماهی آمور در استان گیلان و تهران. مجله علمی دانشکده دامپزشکی اهواز. سال سوم. شماره چهارم. صفحات 29-24.
  6. شریف روحانی، م.، 1384. بررسی کاربرد برخی اسانس ها گیاهی در کنترل آلودگیهای قرچی تخم ماهیان قزل آلای رنگین کمان بعنوان جایگزین احتمالی مالاشیت گرین در شرایط کارگاهی. پایان نامه دکترای  تخصصی بهداشت و بیماری های آبزیان دانشگاه تهران. شماره 193.
  7. شیخ­زاده، ن.، سلطانی، م.، ابراهیم­زاده موسوی، ح.، خسروی، ع.، باقری، ه.، فتحی، ع.، زرگر، ا.، 1388. مطالعه اثر اسانس اکالیپتوس بر برخی فاکتورهای ایمنی ماهی کپور معمولی.مجله دامپزشکی ایران. دوره 64. شماره 1. صفحات 54-47.
  8. صمصام شریعت، ه.، معطر، ف.، 1370. گیاهان و داروهای طبیعی. انتشارات مشعت اصفهان. چاپ دوم. صفحات 431-432.
  9. طافی، ع.، مشکینی، س.، توکمه­چی، ا.، 1392. مطالعه تاثیر کیتوزان بر برخی از پاسخ­های ایمنی قزل­آلای رنگین کمان و افزایش مقاومت آن به دنبال رویاروئی تجربی با آئروموناس هیدروفیلا. مجله پژوهش­های جانوری. جلد 26. شماره 4. صفحات 477-468.
  10. علیشاهی، م.، سلطانی، م.، زرگر، ا.، 1388. بررسی باکتریایی تلفات ماهی آمور در استان خوزستان. مجله دامپزشکی ایران . شماره 22. صفحات34-25.
  11. علیشاهی، م.، قربانپور نجف­آبادی، م.، نجف­زاده، ح.، پشم­فروش، م.، 1389. مطالعه اثر ضد باکتریایی برخی عصاره های گیاهی بر علیه استرپتوکوکوس اینیایی، آئروموناس هیدروفیلا، یرسینا راکری. مجله دامپزشکی ایران. دوره ششم. شماره 2. صفحات 30-21.
  12. مخیر، ب.،1385 . بیماری­های ماهیان پرورشی. چاپ پنجم. انتشارات دانشگاه تهران. 638 صفحه.
    1. Aboud, O., 2010. Application of some Egyptian medicinal Plants to eliminate  Trichodina sp and Aeromonas hydrophila in  tilapia (Oreochromis  niloticus). Tishreen Magazine. researcher.2(10): p 12-16.
    2. Doumas, B., Watson, W., Biggs, H., 1971. Clin Chem Acta 31: p 87-96
    3. Feldman, B., Zinkl, J.,  Jian, N.,  Schalm, S., 2000. Veterinery Hematology. Lippincott Williams & Publications, Canada. p 1120- 1125.
    4. Krajnovic-Ozretic, M., 1991. Hematological and biochemical characteristics of reared sea bass (Dicentrarchus  Labrax L.). Acta Biol. Jogosl. Ichtyologia.23:p 25-34.
    5. Kumari, J., 2006. Seasonal variation in the innate immune parameters of the Asian catfish Clarias batrachus. Aquaculture. 252: p 121-127.
    6. Lewis, S., 1975. Practical haematology. Edinburgh . New York . Churchill Livingstone . New York : distributed by Longman, 629 p
    7. Roberrts, T., Hutson, D., 1998. Metabolic pathway of agrochemicals part2: Insecticides and fungicides. The royal society chemistry. Cambrides.UK.
    8. Shalaby, A., Khattab, Y.,  Abdel Rahman,  A., 2006. Effects of Garlic (Allium sativum) and chloramphenicol on growth performance, physiological parameters and survival  of Nile tilapia (Oreochromis niloticus). J.Venom. Anim. Toxins incl. Trop. Dis.12: p 172 - 201.
    9. Svobadova, Z., Pravda, D., Palackova, Y., 1991. Unifid methods of hematological examination of fish. Research Institue of fish Culture and Hydrobiology, Vodrany, Czechoslovakia. p 31.
    10. Takasaki, M., Konoshima, T., Etoh, H., 2000. Cancer chemo preventive activity of euglobal-G1 from leaves of Eucalyptus grandis. Can Let. 155: 61-65.
    11. Weifeng, M., Yaping, W., Wenbo, W., Jianxin, F., Zuoyan, Z., 2004. Enhanced resistance to Aeromonas hydrophila infection and enhanced phagocytic activities in human lactoferrin-transgenic grass carp (Ctenopharyngodon idella). Aquaculture.p 93-103
    12. Zheng, W., Haipeng, C., Xianle, Y., 2012. Grass carp (Ctenopharyngodon idella) infected with multiple strains of Aeromonas hydrophila .African Journal of Microbiology Research Vol. 6(21). p 4512-4520
    13. Zilva, J F. Pannall, P R.1984. Cilinical chemistry in diagnosis and treatment.publ.Lioyd-Luke(medical book)Ltd.London. p 348-352