نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانش آموخته کارشناسی ارشد دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، دانشکده شیلات و محیط‌زیست، گروه تکثیر و پرورش آبزیان

2 عضو هیات علمی دانشگاه علوم پزشکی گلستان، مرکز تحقیقات علوم آزمایشگاهی/دانشکده پیراپزشکی، گروه علوم آزمایشگاهی

3 عضو هیات علمی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، دانشکده شیلات و محیط‌زیست، گروه تکثیر و پرورش آبزیان

چکیده

در سال های اخیر استفاده از ترکیبات کنترل کننده جمعیت باکتری‌ها در آب محیط پرورش ماهیان بسیار موردتوجه قرار گرفته است، در این راستا انتخاب ماده ضدعفونی کننده با خاصیت ضد باکتریایی مناسب از اهمیت بالایی برخوردار می‌باشد. در این مطالعه نانوذره اکسید روی به روش سل-ژل سنتز شده و پس از تعیین حداقل غلظت باکتری کشی (MBC ) نانوذره اکسید روی به روش استانداردرقت‌های سریالی ماکرودایلوشن، جمعیت باکتریایی محیط‌ آکواریوم در دو مرحله شامل آکواریوم‌های دارای ماهی قرمز و آکواریوم‌های فاقد ماهی مورد ارزیابی قرار گرفت. در مرحله اول غلظت‌های 0، 2 و 4 برابر MBC و در مرحله دوم غلظت‌های 0، 2، 4 و 8 برابر MBC در زمان‌های مورد نظر به آب آکواریوم‌ها افزوده و روند ضد باکتریایی نانوذره اکسید روی مورد بررسی قرار گرفت. MBC نانوذره اکسید روی برای جمعیت باکتریایی محیط آکواریوم 35/0 میکروگرم بر میلی لیتر اندازه‌گیری شد. بر اساس فعالیت ضد باکتریایی نانوذره اکسید روی مشاهده شده، بار باکتریایی کل آب آکواریوم در محیط دارای ماهی قرمز با افزایش غلظت نانوذرات و افزایش زمان تماس کاهش یافت. بیشترین روند کاهش بار باکتریایی کل در مواجهه با نانوذره اکسید روی در غلظت 4 برابرMBC مشاهده شد، همچنین روند کاهش بار باکتریایی گرم منفی محیط آکواریوم در هر دو غلظت 2 و 4 برابرMBC تقریبا به یک میزان مشاهده شد

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

The effect of antibacterial properties of zinc oxide nanoparticles on total count of bacterial and Gram-negative bacterial in the fresh water aquariums with goldfish (Carassius auratus Linnaeus, 1758)

نویسندگان [English]

  • Samira Faramarzpour 1
  • Seyedeh Sedigheh Hoseini 2
  • Mohammad Sudagar 3
  • Mohammad Mazandarani 3

1 M.Sc. Graduate of Fishery Dept., Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan, I.R. of Iran

2 Labratory Sicences Research Center/Labratory Sicence Dept., Faculty of Paramedicine, Golestan University of Medical Sciences, Gorgan, I.R. of Iran

3 Fishery Dept., Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan, I.R. of Iran

چکیده [English]

In recent years the using of population controller component for bacteria in the water of the fish is highly regarded. in this context, the selection of appropriate disinfectant with antibacterial property is very important. In this study zinc oxide nanoparticles synthesized by sol-gel method and the minimum bactericidal concentration (MBC) of zinc oxide nanoparticles were evaluated to standard methods broth macrodilution serial dilutions, to determine the bacterial population in the aquarium environment includes two steps aquarium with goldfish and aquarium without fish. In the first step, concentrations of 0, 2 and 4 of the MBC and in the second step, concentrations of 0, 2, 4 and 8 of the MBC at special times added to aquarium water and antibacterial nanoparticles of zinc oxide were studied. MBC were measured 0.35 ϻg/ ml for bacterial populations of aquarium environment. The antibacterial activity of nanoparticle zinc oxide was observed, the total count of bacterial reduced in aquarium water with goldfish by increasing the concentrations of nanoparticles and increased contact time. The process of reducing the total count of bacterial in concentrations of 4 to MBC were observed, as well as the reduction of gram-negative bacterial in aquariums environment in both of 2 and 4 of MBC almost to the same extent was observed (no significant differences P>0.05).

کلیدواژه‌ها [English]

  • Antibacterial properties
  • Nanoparticle zinc oxide
  • Minimum bactericidal concentration
  • total count of Bacterial
  • gram negative Bacterial

تأثیر خواص ضد باکتریایی نانوذره اکسید روی بر بار باکتریایی کل و بار باکتریایی گرم منفی در محیط­های آکواریوم آب شیرین دارای ماهی قرمز

(Carassius auratus Linnaeus, 1758)

سمیرا فرامرزپور1، سیده صدیقه حسینی2* ، محمد سوداگر1، و محمد مازندرانی1

1 گرگان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، دانشکده شیلات و محیط‌زیست، گروه تکثیر و پرورش آبزیان

2 گرگان، دانشگاهعلوم پزشکی گلستان، مرکز تحقیقات علوم آزمایشگاهی/دانشکده پیراپزشکی، گروه علوم آزمایشگاهی

تاریخ دریافت: 1/11/95                تاریخ پذیرش: 29/6/96

چکیده

در سال‌های اخیر استفاده از ترکیبات کنترل‌کننده جمعیت باکتری­ها در آب محیط پرورش ماهیان بسیار مورد توجه قرارگرفته است، در این راستا انتخاب ماده ضدعفونی‌کننده با خاصیت ضد باکتریایی مناسب از اهمیت بالایی برخوردار می­باشد. در این مطالعه نانوذره اکسیدروی به روش سل-ژل سنتز شده و پس از تعیین حداقل غلظت باکتری کشی (Minimum bactericidal concentration ) نانوذره اکسیدروی به روش استاندارد رقت‌های سریالی ماکرودایلوشن، جمعیت باکتریایی محیط­ آکواریوم در دو مرحله شامل آکواریوم­های دارای ماهی­قرمز و آکواریوم­های فاقد ماهی مورد ارزیابی قرارگرفت. در مرحله اول غلظت­های صفر، 2 و 4 برابر MBC و در مرحله دوم غلظت­های صفر، 2، 4 و 8 برابر MBC در زمان­های موردنظر به آب آکواریوم­ها افزوده و روند ضد باکتریایی نانوذره اکسیدروی مورد بررسی قرارگرفت. MBC نانوذره اکسیدروی برای جمعیت باکتریایی محیط آکواریوم 35/0 میکروگرم بر میلی‌لیتر اندازه­گیری شد. بیشترین روند کاهش بار باکتریایی کل در مواجهه با نانوذره اکسیدروی در غلظت 4 برابرMBC و بعد از 5 روز مشاهده شد. نتایج بار باکتریایی کل آب محیط آکواریوم در محیط فاقد ماهی نشان‌دهنده‌ی روند کاهش در غلظت 2 برابر MBC بود درحالی‌که در غلظت 4 و 8 برابر MBC فعالیت ضد باکتریایی نانوذره اکسیدروی نسبت به شاهد کاهش و بار باکتریایی کل محیط آکواریوم از روز 10 افزایش یافت، بنابراین باتوجه به اثرات ضد باکتریایی قابل‌قبول نانوذره اکسیدروی بر جمعیت باکتریایی محیط آکواریوم،این ماده می­تواند به‌عنوان یک ماده ضد باکتریایی مورداستفاده قرارگیرد.

واژه‌های کلیدی:ZnO، ضد باکتریایی،MBC.

* نویسنده مسئول، تلفن:  01732540858 ، پست الکترونیکی: Hosseini.s@goums.ac.ir

مقدمه

 

درسال‌های اخیر، دانش فناوری نانو به‌عنوان پتانسیل عظیم برای ایجاد انقلابی بزرگ در صنعت آبزی‌پروری و شیلات مطرح‌شده که می­تواند روش­های جدیدی در آبزی‌پروری، بیوتکنولوژی، ژنتیک، تکثیر و بهداشت آبزیان باشد. این مواد در اشکال نانو دارای خواص منحصربه‌فرد فیزیکی، شیمیایی و الکتریکی می‌باشند (10 و 20).

اکسیدهای فلزی غیرآلی به‌طور فزاینده‌ای برای فعالیت‌های ضد میکروبی استفاده می‌شوند. مزایای اصلی استفاده از اکسیدهای فلزی ثبات، استحکام، عمر مفید طولانی و فعالیت ضد میکروبی در برابر پاتوژن­های مختلف می‌باشد (3 و 4). فعالیت ضد باکتری پودر MgO، CaO و اکسیدروی در مقابل برخی از گونه باکتری‌های بررسی شد، اکسید روی دارای فعالیت ضد میکروبی قابل ‌توجه در محدوده pH طبیعی (7 pH=) می­باشد و یکی از عناصر ضروری محسوب می­شود (17).

تحقیقات اندکی درخصوص مکانیسم عمل نانوذره اکسیدروی در محیط آکواریوم و برای آبزیان انجام‌شده، اما تصور می‌شود تولید هیدروژن پراکسید یک عامل اصلی فعالیت ضد باکتری می‌باشد، همچنین اتصال ذرات بر روی سطح باکتری باتوجه به نیروهای الکترواستاتیک می‌تواند یک مکانیزم ضد باکتریایی باشد (25 و 27). نانوذرات اکسید روی فعالیت ضد باکتری قوی در طیف گسترده‌ای از باکتری‌ها دارند، مکانیسم غالب برای فعالیت‌های ضد باکتری این نانوذره فعل­‌و انفعالات شیمیایی بین H2O2 و باکتری‌ها می‌باشد، چراکه به‌محض تماس باکتری با نانو ذرات اکسیدروی، نفوذ به پوشش سلول و به‌هم‌ریختگی غشاء باکتری جهت مهار رشد باکتری می‌شود بااتصال یون Zn+2 به غشاء میکروارگانیسم‌ها فاز تأخیر رشد میکروبی طولانی می‌شود (27).

نانوذرات ازجمله مواد مفید جهت از بین بردن آلاینده‌های موجود در آب می‌باشد، باتوجه به اینکه استفاده گسترده از آنتی­بیوتیک­ها در درمان بیماری­های ماهیان سبب مقاوم شدن برخی باکتری­ها به‌خصوص باکتری­های گرم منفی می­شود، امروزه از نانوذرات جهت حذف برخی باکتری‌ها از طریق روش بهینه جهت پاک‌سازی آب استخر پرورش ماهی استفاده می­شود. ماهی­قرمز قدیمی­ترین ماهی زینتی پرورش‌یافته در چین بوده است و امروزه از رایج­ترین ماهیانی است که در آکواریوم­ها یافت می­شود، این ماهی به‌عنوان مدل آزمایشگاهی و مناسب مطرح می­شود. بیماری­های باکتریایی شایع­ترین مشکل عفونی ماهیان زینتی است و اکثر عفونت­های باکتریایی توسط ارگانیسم­های گرم منفی ایجاد می­شوند (14).

قرار گرفتن ماهی در محیط آکواریوم متفاوت از شرایط طبیعی می­باشد، لذا در شرایط مختلف منجر به استرس بالایی در این موجودات می­شود که در این صورت شرایط برای فعالیت بیشتر باکتری­های فرصت‌طلب و بیماری‌زا فراهم می­گردد. بنابراین کنترل شرایط تحت پرورش بخصوص جمعیت باکتریایی این محیط می­تواند در کنترل سلامت ماهیان مفید باشد به همین دلیل در این بررسی اثرات ضد باکتریایی نانوذره اکسید روی بر کنترل جمعیت باکتریایی محیط آکواریوم مورد بررسی قرارگرفته است.

مواد و روشها

شرایط پرورش ماهی: این مطالعه در زمستان 93 در مرکز آبزی­پروری شهید ناصر فضلی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان انجام گرفت، به این منظور تعداد 48 قطعه ماهی­قرمز با میانگین وزنی 98/0±70/5 گرم و میانگین طول 63±93/6 تهیه و به مدت 2 هفته با شرایط جدید سازگار و با غذای تجاری بیومار به میزان 3 درصد بیومس 2 بار در روز غذادهی شدند. در طی دوره پرورش دمای آب، pH و سختی آب به ترتیب 71/0±98/16، 87/7 درجه سانتی گراد وppm 260 اندازه­گیری و ثبت شدند.

طرح آزمایش: این آزمایش به‌صورت طرح کاملاً تصادفی (CRD) در 7 تیمار با 3 تکرار که شامل 3 تیمار در محیط آکواریوم فاقد ماهی و4 تیمار در محیط آکواریوم دارای ماهی­قرمز انجام گرفت، ماهیان به‌صورت تصادفی به 6 آکواریوم با حجم آبگیری 04/33 انتقال یافتند، سپس به ‌منظور انجام آزمایش تیماربندی انجام شد.

آماده‌سازی نانوذره اکسیدروی: پودر پیش­ساز استات­روی (شرکت مرک آلمان) با فرمولZn(C2H3O2)2.2H2O  و جرم­ مولکولی g/mLµ 5/219 تهیه و برای سنتز نانوذره اکسیدروی استفاده گردید. 5 گرم استات روی با 50 میلی­لیتر آب­مقطر دیونیزه در ارلن ریخته و در حرارت 80 درجه سانتی­گراد به مدت 3-4 ساعت به نحوی مخلوط گردید تا به یک­پنجم حجم اولیه رسید، محلول به ‌دست‌آمده محلول کلوئیدی بود، پس‌ازآن به مدت 12 ساعت در فور با دمای 5±100 درجه سانتی گراد قرارداده شد. تا به‌تدریج خشک شود. پس‌ازآن در کوره الکتریکی در دمای 5±300 درجه سانتی گراد به مدت 12-24 ساعت قرار داده­شد تا کریستال‌ها کامل و پودر سفیدرنگ حاصل شود (8). ماده مؤثر نانوذره سنتز شده ppm 123 محاسبه شد. برای تأیید پراکنش مناسب و مشخص کردن فازهای کریستالی نمونه و اندازه­گیری خصوصیات ساختاری نانوذره اکسیدروی از آزمون  (X ray diffraction) XRD استفاده شد (16).

تهیه سوسپانسون باکتریایی آب آکواریوم: پس­از گذشت 2 هفته سازگاری ماهیان، نمونه­ باکتریایی از آب کف آکواریوم معادل با کدورت نیم مک فارلند (108×5/1باکتری در هر میلی‌لیتر) تهیه شد. برای اطمینان از ایجاد کدورت مذکور، جذب آن به‌وسیله دستگاه اسپکتروفوتومتر مرئی- فرابنفش (USA; UNICO-2100) در محدوده طول‌موج 600 نانومتر اندازه‌گیری و میزان جذب در محدوده 08/0 تا1/0 تنظیم شد (7).

تعیین حداقل غلظت باکتری­کشی (MBC) نانوذره اکسید روی بر باکتری­های آب آکواریوم به روش ماکرودایلوشن: جهت بررسی کمیت باکتری­کشی نانوذره اکسید روی از روش استاندارد رقت­های سریالی ماکرودایلوشن استفاده و حداقل غلظت مهارکنندگی از رشد (MIC )، حداقل غلظت کشندگی اکسیدروی (MBC) تعیین گردید. برای تعیین MIC  از یک سری 12 تایی از لوله‌های آزمایش استفاده شد. یک لوله به‌عنوان کنترل مثبت (حاوى نانوذره اکسیدروی به‌علاوه محیط کشت) و یک لوله به‌عنوان کنترل منفی (حاوی سوسپانسیون میکروبى به‌علاوه محیط کشت) که جهت تأیید عدم ایجاد کدورت در نظر گرفته شد. در 12 لوله ابتدا رقت­هایی از نانوذره اکسیدروی با مقدار 6/1 اضافه و سوسپانسیون باکتریایی با مقدار استاندارد و مساوی به میزان 1/0 سی­سی تلقیح گردید، سپس به مدت 24 ساعت در دمای 37درجه سانتی گراد در انکوباتور شیکردار با 200 دور در دقیقه قرار گرفتند. پس­از انکوباسیون جهت تعیین حداقل غلظت کشندگی باکتریایی مقدار 100 میکرولیتر، از لوله‌های فاقد کدورت در محیط نوترینت آگار کشت داده و پس از گذشت زمان لازم، شمارش کلنی انجام‌گرفته و MBC تعیین شد (Nccls, National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2000). جهت جلوگیری از وقوع احتمال خطا در کلیه مراحل کار، این آزمایش با سه تکرار انجام گرفت (15).

آزمایشات ضد باکتریایی در آب محیط آکواریوم: با در نظر گرفتن غلظت­های مختلف MBC نانوذره اکسیدروی، خواص ضد باکتریایی این ماده باگذشت زمان در دو مرحله شامل آکواریوم­های دارای ماهی­قرمز و آکواریوم­های فاقد ماهی مورد ارزیابی قرارگرفت. پس از تعیین MBC نانوذره اکسیدروی، در مرحله اول سه تیمار شامل تیمار شاهد و دو تیمار با دو غلظت­ دو و چهار برابر MBC و به آب آکواریوم­های حاوی ماهی­قرمز اضافه شد و در 6 ساعت، روزهای1، 5، 10، 16، 21 و 28 اثر حداقل غلظت باکتری­کشی نانوذره اکسید روی در مقایسه با گروه شاهد بررسی گردید، همچنین در مرحله دوم چهار تیمار شامل تیمار شاهد و سه تیمار با سه غلظت­ دو، چهار و هشت برابر MBC نانوذره اکسیدروی به آب آکواریوم­ها فاقد ماهی اضافه شد و در طی روزهای 1، 3، 5، 7، 10، 15، 25 و 30 اثر حداقل غلظت باکتری­کشی نانوذره اکسیدروی بررسی گردید، به‌طوری‌که در شرایط استریل بوسیله پیپت استریل از نزدیک بستر تیمارها نمونه‌برداری شد. جهت تعیین بار باکتریایی آب رقت‌های سریالی تهیه و از هر رقت 1/0 سی­سی در محیط کشت جامد حاوی آگار به روش پورپلیت کشت گردید. دراین مطالعه محیط کشت نوترینت آگار برای مطالعه بار باکتریایی کل و نیز محیط کشت مک­کانکی آگار برای مطالعه جمعیت باکتری­های گرم منفی مورد استفاده قرارگرفت، پس از گذشت 48 ساعت از انکوباسیون پلیت­ها در انکوباتور، پلیت­هایی که بین 30 تا 300 کلنی داشتند انتخاب و تعداد کلنی آن­ها شمارش شد. سپس برای هر نمونه، به‌منظور گزارش تراکم باکتریایی (CFU)، تعداد کلنی­های شمارش‌شده در پلیت، در ضریب و نسبت معکوس رقت مربوطه ضرب شده و نتیجه نهایی که بار باکتریایی موجود در یک میلی­لیتر نمونه آب آکواریوم بود، حاصل گردید (Institute of Standard and Industrial Research of Iran, 2007).

تجزیه ‌و تحلیل کلیه داده­ها در محیط نرم­افزار SPSS,18 و رسم نمودارها بااستفاده از نرم‌افزارExcel 2010 انجام گرفت. بااستفاده از آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه (ANOVA) مقایسه سطوح کلیه فاکتورها در بین تیمارهای مختلف و زمان­های نمونه­گیری انجام شد و تفاوت معنی­داری در بین میانگین­ها بااستفاده از آزمون چند دامنه دانکن (Duncan) به دست آمد.

نتایج

جهت بررسی ساختار کریستالی نانوذره اکسیدروی از روش XRD استفاده شد. نتایج حاصل از آنالیز پراش اشعه ایکس در شکل1 نشان داده ‌شده است، شدت پیک­ها و عرض نسبتاً کم آن­ها نشان­دهنده درجه بالای بلوری محصولات می­باشد، به ‌طوری ‌که پیک­ها نشان­دهنده ساختار هگزاگونال (شش­وجهی) اکسیدروی و حالت کریستالی آن در شکل 1 می­باشد.

 

شکل 1- تصویر XRD از نانوذره اکسیدروی

نتایج تعیین حداقل غلظت باکتری­کشی (MBC) نانوذره اکسیدروی بر باکتری­های محیط آکواریوم، در جدول 1 آورده شده است. همان­گونه که نشان داده‌شده است درروش رقت­های سریالی ماکرودایلوشن باکتری­ها تا رقت 4 لوله­گذاری رشد یافت و غلظت 35/0 میکروگرم در میلی‌لیتر علیه باکتری­های موردمطالعه دارای حداقل غلظت باکتری­کشی در جدول 1 محاسبه شد.

 

جدول1- نتایج مربوط به MBC و غلظت­های مورد استفاده برای مطالعه ضد باکتریایی نانوذره اکسیدروی

نمونه مورد بررسی

MBC

(میکروگرم در میلی­لیتر)

2 برابرMBC

(میکروگرم در میلی­لیتر)

4 برابرMBC

(میکروگرم در میلی­لیتر)

8 برابرMBC

(میکروگرم در میلی­لیتر)

باکتری­های محیط آکواریوم

35/0

7/0

4/1

8/2

 

 

فعالیت ضد باکتریایی نانوذره اکسیدروی بر بار باکتریایی آب محیط آکواریوم در طی زمان و غلظت­های مختلف نانوذره بررسی شد، جدول تغییرات بار باکتریایی (داده­ها لگاریتمی و به‌صورت X+1 نرمال شدند) نسبت به زمان ترسیم شد. نتایج حاصل از آزمون دانکن سطوح مختلف حداقل غلظت باکتری کشی نانوذره اکسیدروی ازنظر تعداد کلنی­های رشد یافته در یک واحد میلی‌لیتر آب آکواریوم نشان داد.

با توجه به نتایج بار باکتریایی کل آب محیط آکواریوم در محیط حاوی ماهی بین تیمارهای شاهد، 2 برابر MBC و 4 برابر MBC باگذشت زمان تفاوت معنی­داری مشاهده شد (05/0P<)، همچنین بیشترین روند کاهش بار باکتریایی کل در مواجهه با نانوذره اکسیدروی در غلظت 4 برابرMBC و بعد از 6 ساعت مشاهده شد. بااین‌حال در این غلظت از روز 5 روند افزایش بار باکتریایی مشاهده شد درحالی‌که در غلظت 2 برابرMBC روند کاهشی تا انتهای دوره ادامه پیدا کرد درحالی‌که در تیمار شاهد (فاقد نانوذره اکسیدروی) روند افزایش بار باکتریایی مشاهده شد (جدول2).

 

جدول2- مقادیر (میانگین ± انحراف معیار) تأثیر فعالیت ضد باکتریایی غلظت­های (2 و 4 برابر MBC) نانوذره اکسید روی در مدت 6 ساعت، 1، 28، 21 ،16، 10 ، 5 روز بر بار باکتریایی کل محیط آکواریوم دارای ماهی قرمز

غلظت نانوذره اکسید روی

(میکروگرم در میلی­لیتر)

بار باکتریایی کل (CFU بر میلی لیتر)

6 ساعت

روز 1

روز 5

روز 10

روز 16

روز 21

روز 28

0

Aa06/0±42/4

Aab22/0±88/4

Aa09/0±98/4

Aa11/0±03/5

Aab13/0±48/5

Aa13/0±82/5

Aa01/0±98/5

2برابر MBC

Bab05/0±67/1

Bbc22/0±85/1

Cc07/0±20/2

ABbc11/0±76/2

Bbc22/0±09/3

Bbc11/0±11/3

Ba05/0±97/3

4برابر MBC

ABab09/0±08/1

ABa09/0±96/1

Babc03/0±45/2

Bbc50/0±66/3

Babc08/0±88/3

Bc22/0±16/4

Cabc13/0±58/4

حروف کوچکa,b,c نشان‌دهنده اختلاف معنادار بین غلظت‌های مختلف نانوذره اکسیدروی(میکروگرم در میلی­لیتر)  با شاهد می‌باشد.

حروف بزرگ A,B,Cنشان‌دهنده اختلاف معنادار بین زمان‌های مختلف با شاهد می‌باشد.

حروف کوچک و بزرگ با همدیگر نشان‌دهنده اختلاف معنادار غلظت نانوذره(میکروگرم در میلی­لیتر)  در زمان‌های مختلف می‌باشد (0.05P<).

 

 

نتایج حاصل از خاصیت ضد باکتریایی نانوذره اکسیدروی در برابر باکتری­های گرم منفی محیط آکواریوم دارای ماهی قرمز. باتوجه به اینکه جمعیت غالب باکتری­های محیط آکواریوم، باکتری­های گرم منفی می­باشند روند کاهش بار باکتریایی گرم منفی محیط آکواریوم در مواجهه با نانوذره اکسیدروی در هر دو غلظت 2 و 4 برابرMBC در مقایسه با شاهد اختلاف معنی‌داری داشت (0.05 P<)، و با افزایش غلظت نانوذره و گذشت زمان تأثیر فعالیت ضد باکتریایی نانوذره اکسیدروی تا روز 10 نسبت به کنترل کاهش‌یافته و از روز 16 فعالیت ضد باکتریایی اکسیدروی کاهش‌یافته و افزایش رشد باکتریها مشاهده گردید (جدول3).


جدول3- مقادیر (میانگین ± انحراف معیار) تأثیر فعالیت ضد باکتریایی غلظت­های (2و4 برابر MBC) نانوذره اکسید روی در مدت 6 ساعت، 1، 28،21،16،10،5روز بر بار باکتریایی گرم منفی محیط آکواریوم دارای ماهی قرمز

غلظت نانوذره اکسید روی

(میکروگرم در میلی­لیتر)

بار باکتریایی گرم منفی (CFU بر میلی لیتر)

6 ساعت

روز 1

روز 5

روز 10

روز 16

روز 21

روز 28

0

Aa09/0±12/4

Ab04/0±35/4

Ac07/0±89/4

Ab09/0±08/5

Abc04/0±22/5

Ad02/0±14/5

Ac05/0±78/5

2برابر MBC

Bab21/0±45/3

Bbc27/0±80/2

Cc00/0±00/2

Bc00/0±690/1

Babc15/0±36/2

Ba15/0±42/2

Bab11/0±58/2

4 برابر MBC

Bab03/0±60/2

Bab49/0±35/2

Ba26/0±88/1

Bb00/0±00/1

Bb05/0±13/2

Bb50/0±14/2

Bab05/0±32/2

حروف کوچکa,b,c نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار بین غلظت‌های مختلف نانوذره اکسیدروی(میکروگرم در میلی­لیتر)  با شاهد می‌باشد.

حروف بزرگ A,B,Cنشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار بین زمان‌های مختلف با شاهد می‌باشد.

حروف کوچک و بزرگ با همدیگر نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار غلظت نانوذره(میکروگرم در میلی­لیتر)  در زمان‌های مختلف می‌باشد (0.05P<).

 

 

نتایج حاصل از خاصیت ضد باکتریایی نانوذره اکسیدروی در برابر باکتری­های محیط آکواریوم فاقد ماهی نشان‌دهنده‌ی وجود اختلاف معنی­داری بین سطوح 2، 4 و 8 برابر حداقل غلظت باکتری­کشی نانوذره اکسیدروی ازنظر تعداد کلنی‌های رشد یافته در یک واحد میلی‌لیتر آب آکواریوم، در یک‌زمان مشخص در مقایسه با گروه شاهد بود (0.05 P<). باتوجه به جدول 4 روند کاهش بار باکتریایی کل در غلظت­های 2، 4 و 8 برابر MBC باگذشت زمان تا روز 7 مشاهده شد، این روند در غلظت 2 برابر MBC تا انتهای دوره ادامه یافت درحالی‌که در غلظت 4 و 8 برابر MBC فعالیت ضد باکتریایی نانوذره اکسیدروی نسبت به شاهد کاهش و بار باکتریایی کل محیط آکواریوم افزایش‌یافته است به‌طوری‌که در غلظت 8 برابر MBC این روند افزایش باشدت بیشتری مشاهده شد. در غلظت 8 برابر MBC اختلاف معنی‌داری نسبت به 2و 4 برابر کاهش بار باکتریایی مشاهده شد (0.05P<)، (جدول4).

 

جدول4- مقادیر (میانگین ± انحراف معیار) تأثیر فعالیت ضد باکتریایی غلظت­های (2و4 برابر MBC) نانوذره اکسیدروی در روزهای 1،3،5،7،10،15،25،30  تأثیر فعالیت ضد باکتریایی غلظت­های مختلف نانوذره اکسید روی باگذشت زمان‌بر بار باکتریایی کل محیط آکواریوم فاقد ماهی

غلظت نانوذره اکسید روی

(میکروگرم در میلی­لیتر)

 

بار باکتریایی کل (CFU بر میلی لیتر)

روز1

روز 3

روز 5

روز 7

روز 10

روز 15

روز 25

روز 30

0

Abc03/0±31/4

Aa14/0±57/4

Ade07/0±88/4

Acd04/0±12/4

Ab03/0±12/5

Acde06/0±24/5

Ade03/0±33/5

Ae07/0±54/5

2برابر MBC

Ba10/0±88/3

Ba05/0±91/3

BCbc18/0±12/3

Bc42/0±60/2

Bbc43/0±04/3

Cb03/0±17/3

Cbc17/0±26/3

Cb06/0±37/3

4 برابر MBC

Cab04/0±50/3

Cab02/0±76/3

Bb32/0±82/3

Bc25/0±66/2

Ba05/0±43/3

Bab03/0±65/3

Cab08/0±83/3

Cab10/0±67/3

8 برابر MBC

Dd21/0±75/2

Dde06/0±69/2

Cde08/0±65/2

Be09/0±47/2

Bc09/0±03/3

BCb09/0±64/3

Ba06/0±93/3

Ba09/0±18/4

حروف کوچکa,b,c نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار بین غلظت‌های مختلف نانوذره اکسیدروی(میکروگرم در میلی­لیتر)  با شاهد می‌باشد.

حروف بزرگ A,B,Cنشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار بین زمان‌های مختلف با شاهد می‌باشد.

حروف کوچک و بزرگ با همدیگر نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار غلظت نانوذره(میکروگرم در میلی­لیتر)  در زمان‌های مختلف می‌باشد (0.05P<).

 

 

نتایج حاصل از خاصیت ضد باکتریایی نانوذره اکسیدروی در برابر باکتری­های گرم منفی محیط آکواریوم فاقد ماهی در جدول 5 نشان‌دهنده وجود اختلاف معنی‌دار در سطوح 2، 4 و 8 برابر حداقل غلظت باکتری­کشی نانوذره اکسیدروی ازنظر تعداد کلنی رشد یافته در یک واحد میلی‌لیتر آب آکواریوم، در یک‌زمان مشخص با گروه شاهد بود (0.05P<). نانوذره اکسیدروی در برابر باکتری­های گرم منفی فعالیت ضد باکتریایی بسیار بالایی را نشان داد، به‌طوری‌که با افزایش غلظت­ این نانوذره از 2 برابرMBC به 4 و 8 برابرMBC روند کاهش بار باکتریایی در روز 10 مشاهده شد، همچنین باگذشت زمان این خاصیت افزایش یافت، به‌طوری‌که در انتهای دوره، محیط آکواریوم فاقد بار باکتریایی گرم منفی شد (جدول5).

 

 

جدول5- مقادیر (میانگین ± انحراف معیار) تأثیر فعالیت ضد باکتریایی غلظت­های (2و4 برابر MBC) نانوذره اکسید روی در مدت تأثیر فعالیت ضد باکتریایی غلظت­های مختلف نانوذره اکسید روی باگذشت زمان‌بر بار باکتریایی گرم منفی محیط آکواریوم فاقد ماهی

غلظت نانوذره اکسید روی

(میکروگرم در میلی­لیتر)

 

بار باکتریایی گرم منفی (CFU بر میلی لیتر)

روز1

روز 3

روز 5

روز 7

روز 10

روز 15

روز 25

روز 30

0

Aa07/0±06/4

Aab00/0±67/4

Abc09/0±17/5

Ad08/0±24/5

Acd22/0±12/5

Acd13/0±58/5

Ad18/0±2/5

Ad08/0±71/5

2برابر MBC

Ba18/0±67/2

Bb03/0±30/2

BCc00/0±00/2

Bab21/0±75/1

Bc00/0±30/1

Bd00/0±00/0

Bd00/0±00/0

Bd00/0±00/0

4 برابر MBC

Ba18/0±45/2

Bb00/0±02/2

Cc00/0±00/0

Cc00/0±00/0

Cc00/0±00/0

Bc00/0±00/0

Bc00/0±00/0

Bc00/0±00/0

8 برابر MBC

C00/0±00/0

C00/0±00/0

C00/0±00/0

C00/0±00/0

C00/0±00/0

B00/0±00/0

B00/0±00/0

B00/0±00/0

حروف کوچکa,b,c نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار بین غلظت‌های مختلف نانوذره اکسیدروی(میکروگرم در میلی­لیتر)  با شاهد می‌باشد.

حروف بزرگ A,B,Cنشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار بین زمان‌های مختلف با شاهد می‌باشد.

حروف کوچک و بزرگ با همدیگر نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار غلظت نانوذره(میکروگرم در میلی­لیتر) در زمان‌های مختلف می‌باشد (0.05P<).

 


بحث

باتوجه به استفاده گسترده از آنتی‌بیوتیک‌ها در درمان عفونت­ها و حضور این مواد در محیط­زیست باعث ایجاد مقاومت در باکتری­های بیماری‌زا، مشکلات زیست­محیطی و آسیب به طبیعت می‌شود، ازاین‌رو مواد جایگزین آنتی‌بیوتیک‌ها در بهداشت آبزیان ضروری می‌باشد (21).

ترکیبات ضد باکتریایی دیگری نیز شناسایی‌شده که می‌توان به اثر عصاره‌ها، ترکیبات شیمیایی اشاره نمود. سیف زاده و خانی پور در سال 1394 بابررسی و مقایسه خواص ضد باکتریایی کاتچین، فرولیک اسید و عصاره دانه انگور بر باکتری‌های عامل مسمومیت غذایی در میگوی پا سفید غربی پرورشی دریافتند که شمارش کلی باکتری‌ها در نمونه‌های تیمار شده با کاتچین بیشترین مقدار و در نمونه‌های عمل‌آوری شده با عصاره دانه انگور کمترین مقدار بود (1).

باتوجه به پیشرفت فناوری نانو و کاربردهای مختلف آن در علوم جدید، جباری و همکاران در سال 1393 به بررسی تأثیر نانوذره کیتوسان در درمان سوختگی بر روی مدل موشی در روزهای 7، 14 و 28پرداخته و مشاهده نمودند که تعداد و کاهش قطر ضایعه نسبت به گروه کنترل معنی‌دار بود (2). نانوذرات نقش‌های دیگری نیز دارند که از آن جمله می‌توان به مطالعات فرانسیسکو و همکاران در سال 2008 حداقل غلظت باکتری­کشی برای نانوذره اکسیدروی به‌صورت محلول 500 میکروگرم بر میلی­لیتر تعیین شد در این مطالعه اندازه نانوذره مورداستفاده 500 نانومتر بود، باتوجه به استفاده گسترده از آنتی‌بیوتیک‌ها در درمان عفونت­ها و حضور این مواد در محیط­زیست باعث ایجاد مقاومت در باکتری­های بیماری‌زا، مشکلات زیست­محیطی و آسیب به طبیعت می‌شود، ازاین‌رو مواد جایگزین آنتی‌بیوتیک‌ها در بهداشت آبزیان ضروری می‌باشد (6).

همچنین با توجه به مطالعات جونز، ری، رانجیت، مانا و همکاران در سال 2011 افزایش اندازه نانوذرات اکسیدروی باعث کاهش فعالیت باکتری­کشی این مواد می­شود. در تحقیق انجام‌شده حداقل غلظت باکتری­کشی نانوذره اکسیدروی برای باکتری­های محیط آکواریوم 35/0 میکروگرم در میلی­لیتر تعیین شد که این تفاوت می‌تواند به علت اندازه نانوذرات مورد استفاده، شرایط کشت و باکتری­های موجود در محیط آکواریوم باشد (18 و 11).

بر اساس مطالعات ابی، کارن، فرانجیتون، گلن و همکاران در سال 2008 حداقل غلظت باکتری­کشی نانوذرات اکسید روی محلول، برای باکتری اشرشیا کلی 9/0 میکروگرم بر میلی­لیتر بدست آمد درحالی‌که برای باکتری­های استافیلوکوکوس اورئوس، استافیلوکوکوس اپیدرمیس به ترتیب 225 و 1 میکروگرم بر میلی­لیتر محاسبه شد (5).

دراین مطالعه نیز از نانوذره اکسیدروی به علت خاصیت ضد میکروبی جهت کاهش بار باکتریایی آب محیط آکواریوم استفاده شد، به‌طوری‌که با افزایش غلظت نانوذرات اکسیدروی، بار باکتریایی در مقایسه با گروه شاهد به‌سرعت کاهش یافت که بیانگر افزایش فعالیت باکتری­کشی نانوذرات در غلظت­های بالاتر تا زمان 5 روز می­باشد که در کلیه جداول و غلظت‌ها این کاهش بار باکتریایی نسبت به شاهد معنی‌دار است (0.05P<) (جدول های 2 و 5).

در مطالعه سوآوی و همکاران (2001) با بررسی خاصیت کشندگی محلول پودر آهک حرارت دیده بر باکتری­های استافیلوکوکوس اورئوس و اشریشیاکلی مشاهده کردند، رشد باکتری­ها در فواصل زمانی نمونه­برداری، دارای روند کاهشی ولی نوسان داشته، که علت این نوسان را رشد مجدد برخی باکتری­ها در طول دوره آزمایش بیان کردند که در این مطالعه هم نوسانات رشد باکتری در روزهای مختلف مشاهده گردید (13، 23 و 24).

در مطالعه حاضر خاصیت ضد باکتریایی نانوذره اکسیدروی در دو غلظت 2 و 4 برابر MBC این نانوذره در محیط آکواریوم دارای ماهی­قرمز، برعلیه بار باکتریایی کل و بار باکتریایی گرم منفی انجام شد بیان داشتند، میزان مرگ باکتری­ها باافزایش زمان تماس و غلظت نانوذرات اکسیدروی در هر دو گروه باکتری­های گرم منفی و گرم مثبت افزایش می­یابد که با نتایج مطالعه حاضر در خصوص خاصیت ضد باکتریایی نانوذره اکسیدروی در محیط آکواریوم دارای ماهی قرمز مطابقت دارد به‌طوری‌که با افزایش غلظت نانوذره و گذشت زمان در هر دو تیمار 2 و 4 برابر MBC نسبت به تیمار شاهد (فاقد نانوذره اکسیدروی) بار باکتریایی کل و بار باکتریایی گرم منفی تا روز 5 کاهش‌یافته است در روزهای بعدی این روند کاهش بار باکتریایی نوسان داشته و فقط در غلظت MBC2 نانوذره توانست اثر مهارکنندگی کم اما پایداری را باگذشت زمان‌بر بار باکتریایی کل ایجاد نماید (جدول های 5 و 2).

بر اساس مطالعات انجام‌شده بسیاری از باکتری­های محیط آکواریوم باکتری­های گرم منفی می­باشند و اکثر عفونت­های باکتریایی توسط ارگانیسم­های گرم منفی ایجاد می­شوند که شامل آئرو موناس هیدروفیلا، آئروموناس سالمونیسیدا،  فلاوباکتریوم کولامنار (علت بیماری کلومناریس)، ویبریو و گونه­های سودوموناس می­باشند (UF/IFAS Fact Sheets FA-14 Aeromonas Infections, FA-31 Vibrio Infections of Fish and FA-11 Columnaris disease). استرپتوکوکوس­ها گروه بزرگی از باکتری­های گرم مثبت ایجادکننده بیماری در ماهیان می­باشند (UF/IFAS Circular 57 Streptococcal Infections in Fish) (12، 14 و 19) براساس مطالعه حاضر، نانوذرات اکسیدروی بر باکتری­های گرم منفی محیط آکواریوم دارای ماهی خاصیت ضد باکتریایی بالاتری را نسبت به جمعیت باکتری­های کل نشان دادند.

تأثیر نانوذره اکسیدروی بر گونه­های ویبریو به‌عنوان عامل بیماری­­زا در محیط آکواریوم توسط سارواس و همکاران در سال 2016 مطالعه شد، این نانو ذرات توانایی حذف آلودگی باکتریایی شامل گونه­های ویبریو از آب­های بخش ساحلی خلیج­فارس را دارا می­باشند، به‌طوری‌که نانوذره اکسید روی در غلظتg/mL ϻ 6 تا 95% باکتری­ها را حذف می­کند (14)، همچنین یاماموتو در سال 2001 با بررسی تأثیر سایز برفعالیت ضد باکتریایی اکسیدروی نشان داد، اکسیدروی در محدوده 100 نانومتر تا 8/0 میکرومتر فعالیت ضد باکتریایی مناسبی دارد و با افزایش غلظت آن بر باکتری­های اشریشیاکلی و استافیلوکوکوس اورئوس این فعالیت ضد باکتریایی افزایش می­یابد (26 و 22). در مطالعه حاضر نیز به بررسی فعالیت ضد باکتریایی نانوذره اکسیدروی با ابعاد80 نانومتر و غلظت‌های 2 و 4 برابر MBC پرداخته شد و مشاهده گردید که با افزایش غلظت نانوذره اکسید روی اثر ضد باکتریایی آن در محیط آکواریوم افزایش می‌یابد.

بر اساس نتایج، روند کاهش بار باکتریایی کل در غلظت­های 2، 4 و 8 برابر MBC باگذشت زمان تا روز 7 مشاهده شد، این روند در غلظت 2 برابر MBC تا انتهای دوره ادامه یافت در حالی ‌که در غلظت 4 و 8 برابر MBC فعالیت ضد باکتریایی نانوذره اکسیدروی نسبت به شاهد کاهش و بار باکتریایی کل محیط آکواریوم افزایش‌یافته است به‌طوری‌که در غلظت 8 برابر MBC این روند افزایش باشدت بیشتری مشاهده شد البته این موضوع نمی­تواند بیانگر رابطه خطی بین غلظت- خاصیت ضد میکروبی نانوذرات باشد زیرا در غلظت­های بالاتر احتمال ایجاد مقاومت و سازگاری در برخی سویه‌ها وجود دارد. این‌که در تحقیقات حسین زاده و همکاران در سال 2012 باکتری سودوموناس آئروژینوزوا در غلظت 2 برابر­ Minimum inhibitory concentration) MIC) مقاوم بود، این باکتری ازجمله باکتری­های گرم منفی بیماری­زا در آبزی­پروری می‌باشد (9). براساس نتایج تأثیر نانوذره اکسیدروی بر بار باکتریایی گرم منفی، ­این نانوذره فعالیت ضد باکتریایی بسیار بالایی را نسبت به جمعیت باکتریایی گرم منفی نشان می­دهد، باتوجه به اینکه باکتری­های گرم مثبت دارای لایه پپتیدوگلیکان ضخیم می‌باشند، بنابراین دراین مطالعه تأثیر باکتری­کشی نانوذره اکسیدروی اثر بیشتری بر باکتری­های گرم منفی نسبت باکتری­های گرم مثبت نشان داد که به مکانیزم اثر اکسیدروی و تأثیرگذاری بیشتر بر غشاءسلولی اشاره دارد (17). آزمایش­های باکتری‌شناسی جهت تشخیص عوامل بیماری­زای موجود درنتیجه آلودگی در آب می­باشد. باکتری­های ایجادکننده آلودگی آب شامل استرپتوکوکوس فکالیس و کلستردیوم پرفرژنز،  همچنین باسیل­های گرم منفی شامل اشریشیاکلی و انتروباکترآئروژنز می­باشند (18، 19 و 20).

با توجه به مطالعات حسین زاده و همکاران 2012 میزان کاهش جمعیت باکتری اشریشیاکلی به‌عنوان یک باکتری گرم منفی، در طی زمان با سرعت بالاتری در غلظت 2 برابرMIC صورت گرفت. همچنین زانگ در سال 2009 رفتار ضد باکتری نانوذره اکسیدروی در زمان‌های ذخیره‌سازی متفاوت (1، 90 و120 روز) بررسی کردند و روند کاهش در جمعیت باکتری اشریشیاکلی پس از 1 روز ذخیره‌سازی در غلظت 2 برابر MIC مشاهده شد (21)، در حالی ‌که در روزهای 90 و 120 کاهش جمعیت باکتریایی با سرعت بیشتری انجام شد، همچنین در غلظت 10 گرم در لیتر نانوکلوئید در زمان‌های 90 و 120 روز، 100 درصد رشد باکتری‌ها مهار شدند که با نتایج مطالعه حاضر مبتنی بر کاهش جمعیت باکتریایی گرم منفی و جمعیت باکتریایی کل در غلظت 2 برابرMBC مطابقت داشت. در خصوص اثر زمان در این مطالعه چون از کلوئید اکسیدروی استفاده‌شده که در این کار سنتزشده استفاده گردید و ویژگی کلوئید داشتن 100 درصد ماده فعال دارویی است در غلظت بسیار پایین 4/1 میکروگرم بر میلی‌لیتر سبب مهار گردیده ولی به دلیل خاصیت رسوبی ذرات کلوئیدی باگذشت زمان خاصیت ضد میکروبی کاهش‌یافته بود.

با توجه خاصیت ضد باکتریایی نانوذرات اکسیدروی، این ماده می­تواند در غلظت 4/1 میکروگرم بر میلی‌لیتر و هر 5 روز یک‌بار به محیط آکواریوم، جهت ضدعفونی و مهار رشد بار باکتریایی آکواریوم استفاده گردد و می‌تواند در کنترل سلامت ماهیان بخصوص کنترل جمعیت باکتری­های فرصت‌طلب و بیماری‌زای محیط آکواریوم باشد.

تشکر و قدردانی

از کمک­های کارشناسان آزمایشگاه گروه تکثیر و پرورش آبزیان کمال تشکر می‌گردد، همچنین به جهت حمایت مالی از جانب معاونت علمی و فناوری ریاست جمهوری (ستاد ویژه توسعه فناوری نانو) سپاسگزاری می‌گردد.

1- سیف زاده، م.، و خانی پور، ع.، 1394. بررسی و مقایسه خواص ضدباکتریایی کاتچین، فرولیک اسید و عصاره دانه انگور بر باکتری های عامل مسمومیت غذایی در میگوی پا سفید غربی پرورشی (Litopenaeus vannamei)، مجله پژوهشهای جانوری (مجله زیست‌شناسی ایران)، جلد28، شماره3، صفحات 360-353.

2- جباری، ن.، پریور،ک.، و حیاتی رودباری، ن.،1394. تأثیر نانوذره کیتوسان در درمان سوختگی بر روی مدل موشی. مجله پژوهشهای جانوری (مجله زیست‌شناسی ایران)، جلد 28، شماره3، صفحات292-282.

 

3- Atmaca, S., Gul, K., and Clcek, R., 2011. The effect of zinc on microbial growth.Turk J Med Sci 1998; 28: 595-597.Rather MA, Sharma R and Aklakur M. Nanotechnology: A Novel Tool for Aquaculture and Fisheries Development.  J IJFA J; 23, PP: 12-25.

4- Brayner, R., Ferrari-Iliou, R., Brivois, N., Djediat, S., Benedett, M. F., and Fiévet, F., 2006. Toxicological impact studies based on Escherichia coli bacteria in ultrafine ZnO nanoparticles colloidal medium. Nano Letters. 6, PP: 866-870.

5- Eby, D., Karen, M., Farrington, E., and Glenn, R., 2008. Synthesis of Bioinorganic Antimicrobial Peptide Nanoparticles with Potential Therapeutic Properties. Journal of Biomacromolecules, 9(9), PP: 2487-2494.

6- Francisco, J., Ruiz, F., Corina, D., and Martinez, F., 2008. The antimicrobial sensitivity of Streptococcus mutans to nanoparticles of silver, zinc oxide and gold. Nanomedicine, 4(3), PP: 237-240.

7- Hahm, D. H., Yeom, M., Lee, E. H., Shim, I., Lee, H. J., and Kim, H. Y., 2001. Effect of Scutellariae radix as a novel antibacterial herb on the ppk (Polyphosphate kinase) mutant of Salmonella typhimurium, Journal of Microbiology and Biotechnology. 11, PP: 1061-1065.

8- Hosseini, S. S., Joshaghani, H. R., and Eskandari, M., 2013. Assessment of nanoparticle zinc oxide antifungal activity against Candida dubliniensis biofilms by Colorometric, Journal Sci Medical. 12 (1(, PP: 70-80.

9- Hosseinzadeh, A., Samarghandi, M., Alikhani, M., and Asgari, G. h., 2012. ZnO nanoparticles influence the kinetics of gram positive and negative bacteria death.J Babil university of medical sic. 14(5), PP: 13-19.

10- Jiang, W. H., and Xing, B., 2009. Bacterial toxicity comparison between nano- and micro-scaled oxide particles, Environmental Pollution, 157, PP: 1619–1625.

11- Jones, N., Ray, B., Ranjit, K. T., and Manna, A. C., 2008. Antibacterial activity of ZnO nanoparticle suspensions on a broad spectrum of microorganisms, FEMS Microbiology Letters, 279, PP: 71-76.

12- Jayaseelan, C., Rahuman, A. A., Kirthi, A. V., Marimuthu, S., Santhoshkumar, T., Bagavan, A. and Rao, K. B., 2012. Novel microbial route to synthesize ZnO nanoparticles using Aeromonas hydrophila and their activity against pathogenic bacteria and fungi, Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 90, PP: 78-84.

13- Maness, P. C., 1999. Bactericidal activity of photocatalytic TiO2 reaction: to ward an understanding of its killing mechanism. Applied Environmental Microbiology. 65, PP: 40-94.

14- Matyar, F., Din cerss kaya, A., and Colak, O., 2004. Prevalence and resistance to antibiotics in Gram negative bacteria isolated from retial fish in Turkey. Annals of microbiology. 54, PP: 151-160.

15- Nccls (National Committee for Clinical Laboratory Standards). 2000. Methods for dilution ntimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, Approved Standard. PP: M7- A5.

16- Nebauer, E., Merkel, U., and Würfl, J., 1997. Structure and stability studies on W, WSi, SiN/GaAs systems by XRD Semiconductor Science and Technology. Semicond Sci Technol; 12(9), PP: 1072-8.

17- Ohira, T., Yamamoto, O., Iida, Y., and Nakagawa, Z. E., 2008. Antibacterial activity of ZnO powder with crystallographic orientation .J Mater Sci Mater_Med. 19(3), PP: 1407-1412.

18- Raghupathi, K. R., Koodali, R. T., and Manna, A. C., 2011. Size-dependent bacterial growth inhibition and mechanism of antibacterial activity of zinc oxide nanoparticles, Langmuir. 27(7), PP: 4020-4028.

19- Raissy, M., Momtaz, H., Moumeni, M., Ansari, M., and Rahimi, E., 2011. Molecular detection of Vibrio spp, in lobster hemolymph, African Journal of Microbiology Research. 5, PP: 1697-1700.

20- Rather, M. A., Sharma, R., and Aklakur, M., 2011. Nanotechnology: A Novel Tool for Aquaculture and Fisheries Development, A Prospective Mini-Review, Aquacult. 23, PP: 12-25.

21- Ruparelia, J. P., Chatterjee, A. K., Duttagupta, S. P., and Mukherji, S., 2008. Strain specificity in antimicrobial activity of silver and copper nanoparticles. Acta Biomaterialia.4(3), PP: 707-716.

22- Sarwar, S., Chakraborti, S., Bera, S., Sheikh, I. A., Hoque, K. M., Chakrabarti, P., 2016. The antimicrobial activity of ZnO nanoparticles against Vibrio cholerae: Variation in response depends on biotype.Nanomedicine, 12(6), PP: 1499-509.

23- Sawai J, Shiga H, Kojima H., 2001, Kinetic analysis of the bactericidal action of Heated Scallop- shell powder. Int J Food Microbiology. 200; 30(71); 211-18.

24- Soawei, J., Shiga, H., and Kojima, H., 2001. Kinetic analysis of death of bacteria in CaO powder slurry, Int Biodeter Biodegr.47(1), PP: 23-6.

25- Shrivastava, S., Bera, T., Roy, A., Singh, GRamachandrarao, P. and Dash, D., 2007. Characterization of enhanced antibacterial effects of novel silver nanoparticles, Nanotech, 18, PP: 225103-225112.

26- Yamamoto, O., 2001. Influence of particle size on the antibacterial activity of zinc oxide. International Journal of Inorganic Materials, 3, PP: 643-646.

27- Zhang, Q., Dandeneau, C. S., Zhou, X., and Cao, G., 2009. ZnO Nanostructures for Dye‐Sensitized Solar Cells, Advanced Materials, 21, PP: 4087-4108.