بررسی اثرات هیستولوژیکی وتغییرات آنزیم های کبدی درمواجهه ماهی گورامی سه خال باترکیب 4 chloro-N(2-(4-methoxyphenil)-4-oxotiazolidin-3-yl)-2-phenoxybenzamid بعنوان ضدتشنج

سهیلا نوروزی ¹، طاهره ناجی^1*، همایون حسین زاده صحافی² و علی الماسی راد³

¹ ایران، تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، علوم پزشکی تهران، دانشکده داروسازی و علوم دارویی، گروه علوم پایه

² ایران، تهران، سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزی، موسسه تحقیقات علوم شیلاتی کشور

³ ایران، تهران، دانشگاه آزاداسلامی، علوم پزشکی تهران، دانشکده داروسازی و علوم دارویی، گروه اموزشی شیمی دارویی

تاریخ دریافت: 29/04/1401          تاریخ پذیرش: 30/05/1401

چکیده

داروهای ضد تشنج موثر هر کدام بدرجاتی، فعالیت غیر طبیعی نورون‌‌‌‌ها را بصورت انتخابی سرکوب می‌کنند. با این حال مکانیسم اثر و کارایی آنها در انواع مختلف اختلالات تشنجی تفاوت دارد. بررسی اثرات هیستولوژیک ترکیب 4-chloro-N(2-(4-methoxyphenil)-4-oxotiazolidin-3-yl)-2-phenoxybenzamid (مشتق فنوکسی بنزآمید) برکبد ماهی گورامی سه خال و مقایسه آن با دیازپام بود. بدین منظور150 قطعه ماهی گورامی سه خال با وزن  0.5± 2 گرم از کارگاه خان ماهی قزوین تهیه شد. گروه‌ها شامل کنترل 1 (شاهد)، کنترل 2(حلال توئین80) و گروه کنترل رفرنس (دیازپام) 3و4  میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن گروه تیمار بترتیب با غلظت‌های1،3،5،7  میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن بود. نخست کلرزدایی و سنجش فاکتورهای فیزیکوشیمیایی آب انجام شد. تزریق‌ها یک روز در میان و طی ده تزریق انجام شد، سپس تمام تیمارها تشریح و کبدها برای تهیه مقطع بافت کبدی جهت بررسی با میکروسکوپ نوری و الکترونی داخل فیکساتیوهای مربوطه قرار گرفت و تغییرات آنزیم‌ها و بافت کبد در آزمایشگاه بررسی شد. تغییرات آنزیمALT، AST، و ALP در کنترل ها و تیمار ها  دارای اختلاف معنی‌دار بود ) ۰۵/۰ (P≤ . بررسی میکروسکوپی نیز حاکی از تغییرات غشایی، گسستگی، شکاف بین سینوزوئیدها و نکروز از دوز 5 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن به بالا بصورت وابسته به دوز بود. با افزایش دوز مشتق فنوکسی بنزآمید ، بافت کبد و آنزیم‌های کبدی تحت‌تأثیر قرار گرفته و افزایش سطح آنزیم‌ها و تغییراتی همچون گسستگی بافتی،  افزایش فاصله سینوزوئیدها و پیدایش واکوئل‌های چربی مشاهده شد.

واژه های کلیدی:  4- chloro-N(2-(4-methoxyphenil)-4-oxotiazolidin-3-yl)-2-phenoxybenzamid، بافت کبد، Trichogaster trichopterus ،  آنزیم های کبدی ،تشنج

* نویسنده مسئول، تلفن: 09123704676 ، پست الکترونیکی: naji_t@iaups.ac.ir

مقدمه

تشنج دوره محدودی از تخلیه غیرطبیعی نورونهای مغزی می باشد (9). داروهای ضد تشنج موثر هرکدام بدرجات مختلفی، فعالیت غیرطبیعی نورون‌ها را بصورت انتخابی سرکوب می‌کنند. با این حال مکانیسم اثر وکارایی آنها در انواع مختلف اختلالات تشنجی تفاوت دارد (3).  داروهای ضدتشنج بخوبی از راه خوراکی جذب می‌شوند و فراهم زیستی خوبی دارند. با در نظر گرفتن این واقعیت که بیشتر بنزودیازپین ها بطور بالقوه اثر منفی بر روی حافظه دارند بنابراین سنتزاگونیست‌ ‌های جدید این گیرنده ها برای بدست آوردن اثر قویتر و عوارض جانبی کمتر اهمیت دارد (6, 5).

استفاده بیش از حد از داروهای ضد تشنج باعث تجمع متابولیت‌ها دربافت کبد می‌شود و آسیب‌های سلولی، ساختاری  و تغییرات آنزیمی را بوجود می‌آورد (7). از طرفی بررسی تغییرات سطح آنزیم‌های کبدی AST, ALT, ALP  می‌تواند میزان تخریب ترکیباتی که اثرات سوء کبدی را نشان دهد.

شروع آسیب کبدی پس از دارو درمانی طی یک هفته تا چند ماه رخ می‌دهد که با افزایش  AST و ALT  و یا هر دو همراه است. از این رو بیماران بایستی بصورت دوره ‌ای ارزیابی شوند.  بیماری‌هایی نظیر روماتوئید آرتریت و اوستئوارتریت که مزمن بوده و در دراز مدت دارو می‌گیرند آسیب‌های کبدی بیشتری از خود نشان می‌دهند (16).

آنزیم‌های کبدی ترکیبات پروتئینی هستند و نقشی حیاتی در فعالیت‌های سلولی دارند و هر گونه آسیب کبدی می‌تواند منجر به افزایش این سه آنزیم اصلی کبد (AST, ALT, ALP) شود و در صورتی که فرآیند متابولیسم بصورت غیر معمول آهسته باشد ریسک آسیب کبدی افزایش می‌یابد (15).

آنزیم‌های کبدی از جمله فاکتورهای بیوشیمیایی مهم هستند که با سنجش آنها بعنوان یک شاخص آزمایشگاهی استاندارد جهت بررسی‌ ‌اختلالات کبدی در موجودات استفاده می‌شود. پرمصرف‌ترین آنزیم‌های تشخیص کبدی، شامل آسپارتات آمینوترانسفرازها (ASTیاSGOT) و آلانین آمینوترانسفراز (ALTیاSGPT) و آلکالین فسفاتاز (ALP) هستند. این آنزیم‌ها بطور معمول داخل سلول‌های کبدی قرار دارند. زمانی که کبد دچار آسیب شود سلول‌های کبدی این آنزیم‌ها را وارد خون می‌کنند. بالا رفتن سطح این آنزیم‌ها در خون نشانه آسیب کبدی است. این آنزیم‌ها در سیتوپلاسم سلول‌های کبدی چندین مرتبه بیشتر از مایع خارج سلولی بوده و زمانی که به غشای سلول‌های کبدی صدمه‌ای وارد شده و یا در صورت مرگ سلول‌های کبدی میزان آن در پلاسما افزایش می‌یابد و میزان این افزایش نشانه ای از درجه وسعت ضایعات کبدی است(14،17).

از آنجا که کبد اندامی حیاتی برای حفظ محیط داخلی بدن است مصرف طولانی مدت داروها باعث آسیب‌های جبران‌ناپذیر کبدی می‌شوند (2). تغییرات بافت شناسی در اثر محرکهای داخلی و خارجی ایجاد میشود که در هر صورت در نتیجه آشفتگی در سطح مولکولی سازماندهی زیستی رخ میدهد. بنابراین بررسی بافت شناسی یک شاخص جامع بوده که میتواند بصورت دقیق وضعیت سلامت ماهی و تجمع مواد آلاینده را بیش از حد نرمال در محیط زیست مشخص نماید. کبد اندامی است که متابولیسم اولیه مواد غیرزیستی را انجام میدهد و با تغییر در ساختار ریخت‌ شناسی مواد در برخی موارد سم زدایی مینماید (1). طراحی ترکیبات جدید بر اساس هیبرید شدن فارماکوفور 4- تیازولیدینون و 2 –فنوکسی فنیل بوده است (7). هر دو فارماکوفور فعالیت ضدتشنج نشان داده اند، انتظار می‌رود ساختار نهایی اثرات ضدتشنجی نشان دهد.

داروهای ضد تشنج موثر هر کدام بدرجاتی، فعالیت غیر طبیعی نورون ها را بصورت انتخابی سرکوب می کنند (18). اکثر آنها بوسیله‌ی آنزیم های کبدی متابولیزه می شوند، بنابراین مصرف همزمان آنها با داروهایی که القا کننده یا مهار کننده آنزیم های کبدی هستند می تواند باعث کاهش یا افزایش سطح پلاسمایی داروهای ضد تشنح شود. بنزودیازپین ها بعنوان یک دسته مهم از ضدتشنج ها بطور گسترده در بالین استفاده می شوند که برغم مزایای آنها، عوارض جانبی متعددی از جمله خواب آوری، فراموشی و اتاکسی دارند(10،13) . بنابراین سنتز اگونیست های جدید بنزودیازپین ها با اثرات ضد تشنجی قوی تر و عوارض جانبی کمتر دارای اهمیت بسیار زیادی می‌باشد(8،19). بررسی عوارض جانبی این ترکیبات از طریق تآثیرات آنها بر روی کبد و آنزیم های کبدی سنجیده می‌شود و از آنجایی که سیستم کبدی ماهی گورامی سه خال مدل ساده تر انسانی است و همچنین بدلیل سرعت تکثیر بالا و مقاومت در شرایط آزمایشگاهی بعنوان مدلی مناسب در این تحقیق انتخاب شده است. در این مطالعه قصد بر آن است که تآثیرات دوزهای مختلف یکی از مشتقات 4-تیازولیدینون بنام مشتق فنوکسی بنزآمید بعنوان اگونیست رسپتورهای بنزودیازپینی بر روی تغییرات سطوح آنزیم های کبدی ماهی گورامی سه خال بررسی شود (شکل 1).  با اندازه گیری و مقایسه سطوح آنزیم ها و همچنین برش گیری از بافت کبد قبل و بعد از ازمایش، اثرات این ترکیب بررسی گردید.

شکل 1- ساختار شیمیایی ترکیب4- chloro-N(2-(4-methoxyphenil)-4-oxotiazolidin-3-yl)-2-phenoxybenzamid

مواد و روشها

تعداد 150 قطعه ماهی در اردیبهشت 1398 از کارگاه تکثیر و پرورش ماهی، خان ماهی‌ واقع در قزوین خریداری شد. پس از کلرزدایی آب آکواریوم ها، فاکتورهای فیزیکوشیمیایی آب شامل: سختی، دما و pH انجام پذیرفت. پیش از شروع اولین تزریق تمامی ماهی‌ها بوسیله محلول عصاره گل میخک با غلظت ^-6 10×2 میلیگرم بر کیلوگرم بیهوش شده و عملیات بیومتری شامل سنجش طول ماهی‌ها (با خط‌کش) و وزن آنها (با ترازوی دیجیتال با دقت 001/0 گرم) انجام شد، سپس با توجه به میانگین وزنی ماهی‌ها، غلظت‌های مورد نظر از ماده سنتز شده مشتق فنوکسی بنزآمید در حلال توئین 80 (4%) حل شده و با توجه به LD50 تعیین شده، غلظت‌های1،3،5،7میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن تهیه و در ویال‌های جداگانه برای تزریق نگهداری شد(6). بمنظورآداپته شدن  ماهی ها با شرایط محیطی،  بمدت 48  ساعت بدون تزریق در آکواریوم نگهداری شدند. آزمایشات در7 گروه (گروه کنترل1 (شاهد)، گروه کنترل2 (حلال)، گروه کنترل 3  رفرنس (دیازپام میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن) و 4 گروه تیمار بترتیب با غلظت‌های( 1،3،5،7میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن)  که هر گروه شامل 15 قطعه ماهی نابالغ بود صورت گرفت.  استفاده از حلال در این تحقیق بمنظور بررسی مؤثر و بی‌اثر بودن حلال در تحقیق بود که بدین منظور از حلال‌های مختلفی برای حل کردن ترکیب مورد نظر استفاده شد که در نهایت حلال توئین 80 انتخاب شد.  بمنظور تزریق ابتدا ویال‌های آماده شده (با غلظت‌های 1،3،5،7 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن) توسط دستگاه سونیکاتور پیش از انجام هر تزریق 15 دقیقه سونیکه شده و ذرات دارویی بصورت یکنواخت در حلال پراکنده و سپس دوزهای تعیین شده به گروه‌های تیمار توسط سرنگ انسولین BD تزریق شد. دوزهایی از ماده مورد نظر در غلظت‌های کم (1 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن ) ، متوسط (3 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن)، زیاد(5 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن) وخیلی زیاد (7 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن) بصورت یک روز در میان و طی 20 روز به ماهی‌ها تزریق شد. و طی این مدت تغذیه و تعویض آب اکواریم ها طبق استاندارد ماهی گورامی سه خال انجام شد. مقدار ماده تزریقی به ازای هر ماهی 02/0 میلی‌لیتر بوده و تزریق‌ها بصورت داخل عضله‌ای در محلی بین خط جانبی ماهی و عضله پشتی انجام شد. میزان مرگ و میر ماهی‌ها در طول مدت آزمایش بدقت ثبت شد. پس از10 تزریق و طی مدت 20 روز ماهی‌ها بوسیله عصاره گل میخک، بیهوش شده وبیومتری ماهی‌ها شامل اندازه‌گیری طول و وزن انجام شد. تمام آزمایشات 3 بار تکرار گردید. میزان تغییرات آنزیم‌های کبدی (AST, ALT, ALP) با کیت مخصوص اندازه گیری شد.جهت محاسبه شاخص هپاتوسوماتیک از فرمول زیر استفاده شد(2) هپاتوسوماتیک شاخص از طریق فرمول زیر محاسبه گردید:

100 × وزن بدن/ وزن کبد  = (%) HSI

بمنظور بررسی تغییرات بافت کبد، پس از بیهوشی کامل ماهی ها توسط محلول آبی از عصاره گل میخک و تشریح ماهی‌ها، بافت کبد با میکروسکوپ نوری و الکترونی  بترتیب در فیکساتیوهای فرمالین 10% و گلوتارآلدهید 5/2% قرار داده شد. سپس مقاطع تهیه شده از بافت کبد توسط میکروسکوپ نوری و الکترونی در آزمایشگاه مشاهده شده و در نهایت داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 26 و آزمون آماری One way ANOVA بررسی شد.

نمودار 1- بررسی شاخص هپاتوسوماتیک (HSI). Error Bars Mean ±SE

(حروف غیر مشابه بمعنای وجود اختلاف معنادار در سطح ۰۵/۰ ≥ P می‌باشد).

نتایج

بررسی شاخص هپاتوسوماتیک: بررسی شاخص هپاتوسوماتیک حاکی از آن بود که شاخص هپاتوسوماتیک در گروه کنترل 1(شاهد) و کنترل 2 (حلال) و کنترل رفرنس (دیازپام 3 میلیگرم بر کیلوگرم) نسبت بهم اختلاف معناداری نداشتند (۰۵/۰P≥).  همچنین بررسی شاخص هپاتوسوماتیک نشان داد که تیمارهای 1میلیگرم بر کیلوگرم و 3 میلیگرم بر کیلوگرم نیز نسبت به گروه کنترل اختلاف معناداری نشان ندادند (۰۵/۰≤P). نتایج تیمارهای 5 میلیگرم بر کیلوگرم و7 میلیگرم بر کیلوگرم نسبت بهم اختلاف معناداری نداشتند (۰۵/۰≤P)ولی نسبت به گروه کنترل و تیمارهای1میلیگرم بر کیلوگرم و 3 میلیگرم بر کیلوگرم اختلاف معناداری را نشان دادند (۰۵/۰ ≥ P) (نمودار1).

بررسی شاخص آنزیم AST : مقایسه نتایج سطح آنزیم ASTدر گروه‌های کنترل1 (شاهد) و کنترل2 (حلال) اختلاف معناداری را نشان نداد (۰۵/۰P>).

نمودار 2- بررسی شاخص هپاتوسوماتیک (AST). Error Bars Mean ±SE

(حروف غیر مشابه بمعنای وجود اختلاف معنادار در سطح ۰۵/۰ ≥ P می‌باشد).

ولی اختلاف سطح آنزیم AST در تمامی گروه‌های تیمار و همچنین کنترل رفرنس (دیازپام 3 میلیگرم بر کیلوگرم) نسبت به کنترل 1 (شاهد) و کنترل2 (حلال) تفاوت معناداری را نشان داد (۰۵/۰P≤). در تمامی تیمارهای دریافت کننده ماده مورد نظر با افزایش دوز مصرفی، مقادیر آنزیم  ASTافزایش محسوسی یافت و اختلاف بین نتایج حاصل از تمام تیمارها نسبت به گروه کنترل معنادار بود (۰۵/۰P≤)(نمودار2).

نمودار3- بررسی شاخص آنزیم ALT(SGPT) . Error Bars Mean ±SE 

(حروف غیر مشابه بمعنای وجود اختلاف معنادار در سطح ۰۵/۰ ≥ P می‌باشد).

نتایج آنزیم ALT نشان داد که سطح این آنزیم در گروه کنترل1 (شاهد) و گروه کنترل 2 (حلال) اختلاف معناداری نداشت (5/0P>). اختلاف سطح آنزیم در تیمارهای 1میلیگرم بر کیلوگرم و 3 میلیگرم بر کیلوگرم نسبت به گروه کنترل 1 (شاهد) و کنترل2 (حلال) معنادار بود (۰۵/۰P≤)، ولی این اختلاف نسبت به کنترل رفرنس (دیازپام 3 میلیگرم بر کیلوگرم) معنادار نبود (۰۵/۰P>). با توجه به نمودار حاصل از تغییر سطوح آنزیم، تیمارهای 5 میلیگرم بر کیلوگرم و7 میلیگرم بر کیلوگرم نسبت به کنترل ۱ (شاهد) و کنترل 2 (حلال) و کنترل رفرنس (دیازپام 3 میلیگرم بر کیلوگرم) و تیمارهای 1میلیگرم بر کیلوگرم و3 میلیگرم بر کیلوگرم اختلاف معناداری را نشان داد (۰۵/۰P≤). نتایج حاکی از آن بود که تغییرات آنزیم ALT نیز همانندAST وابسته به دوز بود (نمودار 3).

نمودار4- بررسی شاخص آنزیم ALP .. Error Bars Mean ±SE

(حروف غیر مشابه بمعنای وجود اختلاف معنادار در سطح ۰۵/۰ ≥ P می‌باشد).

بررسی شاخص آنزیم الکالین فسفاتاز: نتایج حاصل از آنزیم ALP حاکی از آن بود که میزان تغییرات آنزیم در گروه‌‌های کنترل 1 (شاهد) و کنترل 2 (حلال) و تیمار 1میلیگرم بر کیلوگرم اختلاف معناداری را نشان نداد (۰۵/۰P>). تیمار میلیگرم بر کیلوگرم 3 و کنترل رفرنس (دیازپام 3 میلیگرم بر کیلوگرم) نیز با هم اختلاف معناداری نداشتند (۰۵/۰P>). ولی نسبت به گروه کنترل 1 (شاهد) و کنترل 2 (حلال) و تیمار 1میلیگرم بر کیلوگرم اختلاف معناداری را نشان داد (۰۵/۰P≤). تیمارهای5 میلیگرم بر کیلوگرم و 7 میلیگرم بر کیلوگرم نسبت بهم اختلاف معناداری را نشان ندادند (۰۵/۰P>) ولی نسبت به سایر تیمارها و گروه‌های کنترل اختلاف معناداری داشتند (۰۵/۰P≤). تغییرات سطح آنزیم ALP نیز وابسته به دوز بود (نمودار 4).

بافت‌شناسی کبد با میکروسکوپ نوری: جهت بررسی تغییرات بافت کبد در تیمارها، تصاویر مربوط به میکروسکوپ نوری آنها با یکدیگر مقایسه شد. این نتایج در شکل­های2 تا 4 آمده است.

نتایج حاصل نشان داد که در گروه کنترل1 (شاهد)، هپاتوسیت‌ها دارای هسته مرکزی و سیتوپلاسم مشخص بودند و همچنین از شکل طبیعی برخوردار بودند. همچنین سینوزوئیدهای کبدی بصورت نرمال در فاصله صفحات سلول‌های کبدی قرار گرفتند. توده چربی در این تیمار مشاهده نشد. بطور کلی یک نمای طبیعی از بافت کبد مشاهده شد )شکل2(.

شکل2- مقطعی از بافت کبد ماهی کنترل 1 (شاهد)، H: هپاتوسیت؛ S: سینوزوئید، K: سلول کوپفر رنگ‌آمیزی H & E، بزرگنماییX40

بررسی مقطع کبدی در تیمار 1میلیگرم بر کیلوگرم نشان داد که سلول‌ها کمابیش همانند گروه کنترل بوده و از ظرفیت کبدی نرمال برخوردار بودند. هپاتوسیت‌ها دارای هسته مرکزی و سیتوپلاسم واضح و مشخص بوده و شکل کاملاً طبیعی داشتند .همچنین سینوزوئیدهای کبدی بصورت نرمال در فاصله صفحات سلول‌های کبدی قرار گرفته بودند. در این نمونه اثری از توده چربی مشاهده نشد (شکل 3).

بررسی مقطع کبد در تیمار 5 میلیگرم بر کیلوگرم گسستگی و شکاف‌های وسیع بین هپاتوسیت‌ها و همچنین فاصله گسترده بین سلول‌ها و اتساع سینوزوئیدها را نشان داد. در این دوز حفره‌ها و شکاف‌های بین سلولی افزایش یافته، واکوئل‌های چربی در همه جای سلول قابل مشاهده است. دیواره سلولی هپاتوسیت‌ها کاملا مشخص نیست و آشفتگی سلولی بوضوح قابل رویت است (شکل 4).

شکل3- مقطعی از بافت کبد ماهی تیمار 1میلیگرم بر کیلوگرم H: هپاتوسیت، S: سینوزوئید K: سلول کوپفر، رنگ‌آمیزی H & E، بزرگنمایی X40

شکل4- مقطعی از بافت کبد ماهی تیمار 5 میلیگرم بر کیلوگرم H: هپاتوسیت، S: سینوزوئید، F: واکویل چربی؛ رنگ‌آمیزیH & E، بزرگنمایی X40

بررسی مقطع کبد در تیمار 7 میلیگرم بر کیلوگرم نیز گسستگی و شکاف‌های وسیع بین هپاتوسیت‌ها و همچنین فاصله گسترده بین سلول‌ها و اتساع سینوزوئیدها را نشان داد . در این دوز حفره‌ها و شکاف‌های بین سلولی افزایش یافته، واکوئل‌های چربی در همه جای سلول قابل مشاهده است. دیواره سلولی هپاتوسیت‌ها مشخص نیست و آشفتگی سلولی بوضوح قابل رویت است )شکل5(.

شکل5- مقطعی از بافت کبد ماهی تیمار 7 میلیگرم بر کیلوگرم H: هپاتوسیت، S: سینوزوئید، F: سلول چربی؛ رنگ‌آمیزیH & E، بزرگنمایی40X

بافت‌شناسی کبد با میکروسکوپ الکترونی: جهت بررسی تغییرات بافت کبد در تیمارها، تصاویر مربوط به میکروسکوپ الکترونی آنها با یکدیگر مقایسه شد. این نتایج در شکل‌های 6 تا 8 آمده است.

تصاویر الکترونی گروه کنترل 1 (شاهد) هیچ مورد غیر طبیعی را نشان نداد. غشای مشخص سلول‌ها رویت شد. هسته، شبکه آندوپلاسمی گسترده، دستگاه گلژی و میتوکندری‌های طبیعی که نشانه فعالیت طبیعی یک سلول سالم است، از دیگر اجزایی بودند که با کیفیت طبیعی مشاهده شدند. توده چربی در این تیمار مشاهده نشد و بطور کلی یک نمای طبیعی از بافت کبد مشاهده شد (شکل6).

شکل6- تصویرمیکروسکوپ الکترونی از مقطعی از بافت کبد ماهی کنترل 1 (شاهد) N: هسته، M: میتوکندری، ER: شبکه اندوپلاسمی، V: وزیکول، (scale bar: 5µm)

بررسی مقطع کبدی در تیمار 3 میلیگرم بر کیلوگرم نشان داد که سلول‌ها با وجود تغییرات جزئی، کمابیش همانند گروه کنترل1(شاهد) بوده و از یک ظرفیت کبدی نرمال برخوردار بودند. هپاتوسیت­ها دیده می­شود. اما همچنان هسته و شبکه آندوپلاسمی و میتوکندری مشاهده می­شود (شکل 7).

شکل7- تصویرمیکروسکوپ الکترونی مقطع بافت کبد تیمار 3 میلیگرم بر کیلوگرم. N: هسته، M: میتوکندری، ER: شبکه اندوپلاسمی، V: وزیکول.  (scale bar:2 µm)

بررسی مقطع کبدی در تیمار 7 میلیگرم بر کیلوگرم  نشان می­دهد که سلول کبد دچار تخریب شده که احتمالا بعلت سیروز یا کبد چرب است، بوضوح غشای هپاتوسیت شاهد نیست. شبکه آندوپلاسمی تا حدی مشاهده می­شود اما پراکنده است. ارگانل ها واضح دیده نمی شوند و میتوکندری دیده نمی شود. بافت سلول آسیب دیده که بالا رفتن آلکالین فسفاتاز در اندازه گیری آنزیم های کبدی هم مبین همین اتفاق است (شکل8).

شکل8- تصویرمیکروسکوپ الکترونی از مقطع بافت کبد تیمار 7 میلیگرم بر کیلوگرم. N: هسته، M: میتوکندری، ER: شبکه اندوپلاسمی، V: وزیکول. F: واکوئل چربی (scale bar: 2 µm)

بحث و نتیجه گیری

در این تحقیق میزان سمیت ماده سنتز شده  ضد تشنج مشتق فنوکسی بنزآمید با دیازپام مقایسه گردید. با توجه به نتایج حاصل از آنزیم ALP تغییرات سطح سرمی آنزیم در گروه‌های کنترل 1 (شاهد) و کنترل 2 (حلال) اختلاف معناداری مشاهده نشد (۰۵/۰P>). همچنین تیمار1 میلیگرم بر کیلوگرم  نیز با کنترل اختلاف معناداری نشان نداد (۰۵/۰P>)، که این موضوع نشانه عدم ایجاد آسیب‌های سلولی توسط ماده حلال است. تیمار 3 میلیگرم بر کیلوگرم  نسبت به گروه کنترل و تیمار1میلیگرم بر کیلوگرم اختلاف معناداری را نشان داد (۰۵/۰P≤). همچنین تیمارهای 5 میلیگرم بر کیلوگرم و7 میلیگرم بر کیلوگرم نسبت بهم اختلاف معناداری را نشان ندادند (۰۵/۰P>) ولی نسبت بسایر تیمارها و کنترل اختلاف معناداری داشتند (۰۵/۰P≤) (نمودار 4). تغییرات سطح آنزیم ALP نیز وابسته به دوز بود. از این­رو مصرف دارو با حداقل دوز و در کوتاه‌ترین دوره درمان توصیه شده است، ودر این مطالعه پس از حدود 3 هفته در دوزهای بالا (5 میلیگرم بر کیلوگرم  و7 میلیگرم بر کیلوگرم) افزایش سطح آنزیم‌های کبدی مشاهده شد که نشانه شروع سمیت کبدی بود (نمودار 4). با توجه به نتایج آزمایشگاهی و بررسی ساختار بافت در این مطالعه مشخص شد که بر اساس الگوی اول، سطح آنزیم‌های کبدی شامل  AST, ALT ALPبا افزایش دوز ماده مورد نظر افزایش یافت (نمودار 2 و 3 و 4). چنانچه در مطالعه حاضر نیز مشاهده شد با افزایش دوز مورد استفاده از ماده سنتز شده مشتق فنوکسی بنزآمید در تیمار5 میلیگرم بر کیلوگرم تجمع چربی بتبع کاهش بیان ژن متابولیزه کننده چربی افزایش یافت.از این رو اثرات هیستولوژیک و پاتولوژیک ماده سنتز شده مشتق فنوکسی بنزآمید بررسی شد تا بعنوان جایگزین احتمالی مناسبی برای دیازپام معرفی شود.

براساس الگوی دوم که حاکی از خونریزی و التهاب بافتی مزمن بود، تیمار5 میلیگرم بر کیلوگرم پس از 10 تزریق بصورت یک روز درمیان گسستگی و شکاف‌های وسیع بین ساختار هپاتوسیت‌ها را نشان داد. همچنین در این تیمار فاصله گسترده بین سلول‌ها، اتساع سینوزوئیدها، حفره‌ها و شکاف‌های بین سلولی افزایش یافت. غشاء سلولی هپاتوسیت‌ها بوضوح مشخص نبود. همچنین تعداد میتوکندری‌ها نسبت به گروه کنترل 1 (شاهد) و کنترل2 (حلال) و تیمار1 میلیگرم بر کیلوگرم  کاهش یافته که نشانه آسیب وسیع بافت کبد است (شکل 5).

با توجه بعوارض جانبی بنزودیازپین­ها از جمله تحمل، وابستگی و اختلال حافظه تحقیقات پیرامون سنتز اگونیست های رسپتورهای بنزودیازپینی انجام شده که به ترکیبات با قدرت اثر بیشتر و عوارض جانبی کمتر دست یابند (4،11،12،20) که در این زمینه تحقیقات زیادی انجام شده اکبرزاده و همکارانش در سال 2003 مجموعه ای  جدید از آنالوگ های جایگزین 4H-3(2-phenoxy)pheny-1,2,4-triazol  و مشتقات کلر شده آن طراحی و تهیه کردند که تجزیه و تحلیل سازگاری و مطابقت مینیمم انرژی کانفومر های ترکیبات سنتز شده روی استازولام (اگونیست گیرنده بنزودیازپین) نشان داد که با بخش اصلی فارماکوفور بنزودیازپین بخوبی همسان است. آزمایشات تشنجی از طریق  Rotarod، PTZ(penthylen tetrazol)  نشان داد که قرار دادن یک گروه امینو در موقعیت 5 حلقه -Triazol1،2،4 بویژه در مشتقات کلر ، بهترین اثر را داشته که با دیازپام قابل مقایسه بود(4).زرقی و همکارانش در سال 2008 یک سری جدید از 1,3,4-oxadiazol را بعنوان ضد تشنج طراحی و سنتز کردند و نشان دادند که با قرار دادن یک گروه آمینو در موقعیت 2 حلقه  1,3,4-Oxadiozoleو یک جایگزین فلورو در موقعیت ارتو بنزیل اکسی ترکیبات دارای بهترین فعالیت ضد تشنجی بوده و نتایج نشان میدهد که این اثر از طریق مکانیزم گیرنده های بنزودیازپینی متداول است(20). زرقی و همکارانش در سال   2005یک سری جدید از  2-substituted-5-(2-benzyloxyphenyl)-1, 3, 4-oxadiazoles را سنتز کرده و بعنوان ضد تشنج ارزیابی کرده است. ترکیب 4b فعالیت ضد تشنجی قابل توجه ای را در مدل های تشنجی نشان میدهد بنظر میرسد این اثر از طریق مکانیزم گیرنده های بنزودیازپینی مداخله می­کند (21).

در مطالعه حاضر مشاهده شد که تغییرات سطح آنزیم ALP بصورت وابسته به دوز بوده و این تغییرات در دوزهای 1،3،5 میلیگرم بر کیلوگرم  دارای اختلاف معنادار با گروه کنترل 1 (شاهد) و کنترل 2 (حلال) بود (۰۵/۰P≤) (نمودار 10). آنزیم AST بطور طبیعی در انواع مختلف بافت‌ها از قبیل: کبد، قلب، ماهیچه، کلیه و مغز قرار دارد. این آنزیم در صورت آسیب بهر یک از این بافت‌ها وارد خون شده و سطح سرمی آن افزایش می‌یابد، چنانچه نتایج مطالعه روی ماهی­ها نشان داد تغییرات آنزیم AST نسبت به گروه کنترل 1 (شاهد) و کنترل 2 (حلال) دارای اختلاف معنادار بود (۰۵/۰P≤) (نمودار 2).

آنزیم ALT بر عکس AST بطور طبیعی بیشتر در بافت کبد یافت می‌شود. اگرچه نمی‌توان گفت این آنزیم منحصراً در کبد قرار دارد، اما کبد جایی است که در برگیرنده بیشترین غلظت این آنزیم است (1)، بررسی تغییرات آنزیم ALT نیز نشان داد تغییرات سطح سرمی این آنزیم وابسته به دوز بوده و دارای اختلاف معناداری با کنترل 1 (شاهد) و کنترل 2 (حلال) بود (نمودار 3). هاروی در سال 2011 پس از مطالعه در خصوص آنزیم‌های کبدی بیان کرد که آلانین آمینوترانسفراز (ALT) بطور انحصاری در داخل سیتوپلاسم سلول‌های کبدی وجود دارد در حالی که آسپارتات آمینوترانسفراز (AST) هم بصورت سیتوپلاسمی و هم بصورت میتوکندریایی وجود دارد و ارزیابی سطح پلاسمایی آمینوترانسفرازها نشان دهنده آسیب سلولی در ارگانی‌ است که این آنزیم داخل آن بالا رفته است (13).

نتایج تحقیق آدبایودر سال 2003  نشان داد که تغییرات نسبت وزن هر یک از ارگان­ها به بدن ممکن است نشانه­ای از انقباض یا التهاب سلولی باشد. انقباض در ارگان می‌تواند بعلت از دست دادن مایع بافتی یا سلولی رخ دهد؛ در حالی که افزایش وزن هر ارگان به بدن می‌تواند نشان دهنده التهاب باشد(3). چنانچه در مطالعه حاضر مشاهده شد، نتایج حاصل از میانگین وزن و طول ماهی‌ها قبل و بعد از تزریق اختلاف معناداری نداشتند(۰۵/۰P>). بررسی شاخص هپاتوسوماتیک گروه کنترل 1 (شاهد) و کنترل2 (حلال) و کنترل رفرنس (دیازپام3 میلیگرم بر کیلوگرم) نسبت بهم اختلاف معناداری نداشتند (۰۵/۰P>)، که این موضوع نشانه عدم ایجاد آسیب‌های سلولی توسط ماده حلال بود. همچنین نتایج نشان داد که تیمارهای 1و3 میلیگرم بر کیلوگرم  نیز نسبت به گروه‌های کنترل اختلاف معناداری نشان ندادند (۰۵/۰P>) که حاکی از حداقل آسیب سلولی در دوزهای پایین ماده  سنتز شده مشتق فنوکسی بنز آمید بود. در نهایت نتایج شاخص هپاتوسوماتیک تیمارهای5 میلیگرم بر کیلوگرم و7میلیگرم بر کیلوگرم  نسبت بهم اختلاف معناداری نداشتند (۰۵/۰P>) ولی نسبت به گروه‌های کنترل و تیمارهای 1میلیگرم بر کیلوگرم و3 میلیگرم بر کیلوگرم اختلاف معناداری نشان دادند که این اختلاف نشانه وجود التهاب در تیمارهای 5 و7میلیگرم بر کیلوگرم بود (۰۵/۰P≤) (نمودار 1).

در این مطالعه پروفایل سمیت کبدی ماده سنتز شده  مشتق فنوکسی بنزآمید  بعنوان جایگزین مناسبی برای دیازپام با عوارض بالای کبدی بررسی شد و نتایج بررسی بافت کبد در تیمار3 میلیگرم بر کیلوگرم حاکی از آن بود که سلول‌ها کمابیش همانند گروه کنترل بوده و از یک ظرفیت کبدی نرمال برخوردار بودند. هپاتوسیت‌ها دارای هسته مرکزی و سیتوپلاسم واضح و مشخص بوده و از شکل کاملاً طبیعی برخوردار بودند. همچنین سینوزوئیدهای کبدی بصورت نرمال در فاصله صفحات سلول‌های کبدی قرار گرفتند. توده چربی در این تیمار مشاهده نشد. همچنین بررسی مقطع کبدی با میکروسکوپ الکترونی در 3 تیمارمیلیگرم بر کیلوگرم نشان داد که سلول‌ها کمابیش همانند گروه کنترل بوده و از یک ظرفیت کبدی نرمال برخوردار بودند. هپاتوسیت‌ها دارای هسته مرکزی و سیتوپلاسم واضح و مشخص بوده و اندامک‌های سلولی از شکل کاملاً طبیعی برخوردار بودند. در این تیمار هم همانند گروه کنترل 1 توده چربی مشاهده نشد. از این نتایج چنین استنتاج شد که ماده‌  سنتز شده مشتق فنوکسی بنز آمید دوزهای 1 میلیگرم بر کیلوگرم و3 میلیگرم بر کیلوگرم سمیت کبدی‌ چندانی بر بافت کبد نداشته و بافت کبد کمابیش مشابه گروه کنترل 1 (شاهد) بود. از این  رو ماده سنتز شده مشتق فنوکسی بنزآمید  با پروفایل سمیت کبدی کمتر و در برخی موارد معادل داروی رفرنس (دیازپام 3 میلیگرم بر کیلوگرم) بررسی شد (شکل 8). در مطالعه حاضر بررسی مقطع بافت کبد تیمار7 میلیگرم بر کیلوگرم توسط میکروسکوپ الکترونی نشان داد تعداد اندامک‌هایی نظیر میتوکندری‌ها که نشانه فعالیت سلول سالم است کاهش یافته و در نهایت نکروز و از بین رفتن سلول هپاتوسیت سالم دیده شد. در این دوز واکوئل‌های چربی در همه جای سلول مشخص بود و غشاء سلولی هپاتوسیت‌ها از بین رفته و آشفتگی سلولی بوضوح قابل رویت بود (شکل8).

در مطالعه حاضر که بر روی ماهی گورامی سه خال انجام شد دوزی معادل 26-6 برابر این محدوده برای بررسی اثر سمیت دارو تزریق شد که در نهایت سنجش سطح آنزیم AST و مقایسه نتایج میزان آنزیم در گروه‌های کنترل 1 (شاهد) و کنترل2 (حلال) اختلاف معناداری را نشان نداد (۰۵/۰P>) که این امر نشان دهنده عدم تأثیر منفی حلال مورد استفاده در نتایج آنزیم بود. اختلاف سطح آنزیم AST در تمامی گروه‌های تیمار نسبت به کنترل نشان داد که در گروه‌های دریافت کننده ماده سنتز شده فنوکسی بنزآمید  با افزایش دوز مصرفی، سطح سرمی آنزیمAST در تمامی تیمارها افزایش محسوسی یافت و اختلاف بین نتایج حاصل از تمام تیمارها نسبت به گروه کنترل ۱ (شاهد) و کنترل 2 (حلال) معنادار بود (۰۵/۰P≤). این اختلاف حاکی از آن بود که با افزایش دوز این آنزیم به تدریج افزایش یافته تا جایی که در دوز 7میلیگرم بر کیلوگرم افت نسبی آنزیم AST را شاهد بودیم که این حالت ناشی از تخریب گسترده و نکروز سلول‌های ترشح کننده آنزیم بود، به زبان ساده‌تر آسیب و تخریب سلولی به حدی وسیع بود که تعداد کثیری از سلول‌های کبدی از بین رفته و دیگر سلول‌های زیادی برای ترشح آنزیم وجود ندارد (نمودار 2). نتایج آنزیمALT نشان داد که سطح این آنزیم در گروه کنترل 1 (شاهد) و گروه کنترل  2 (حلال) اختلاف معناداری نداشت (۰۵/۰P>) ولی اختلاف سطح آنزیم در تیمارهای 1میلیگرم بر کیلوگرم و3 میلیگرم بر کیلوگرم نسبت به گروه کنترل معنادار بود (۰۵/۰P≤). با توجه به نمودار حاصل از تغییر سطوح آنزیم، سطح آنزیم در تیمارهای5 میلیگرم بر کیلوگرم و 7 میلیگرم بر کیلوگرم  نسبت به کنترل و تیمارهای 1میلیگرم بر کیلوگرم و 3 میلیگرم بر کیلوگرم اختلاف معناداری داشت (۰۵/۰P≤).  مقایسه نتایج این آنزیم حاکی از آن بود که تغییرات  ALT نیز همانند AST وابسته به دوز بود (نمودار 3).

بررسی مقطع کبدی در تیمار 5 میلیگرم بر کیلوگرم حاکی از گسستگی و شکاف‌های وسیع بین هپاتوسیت‌ها بود. همچنین فاصله گسترده بین سلول‌ها و اتساع سینوزوئیدها صورت گرفته بود.در این دوز حفره‌ها و شکاف‌های بین سلولی افزایش یافته، واکوئل‌های چربی در همه جای سلول مشخص است و دیواره سلولی هپاتوسیت‌ها بوضوح مشخص نیست و آشفتگی سلولی به وضوح قابل رویت است (شکل 5). بررسی یافته‌های آنزیمی، بالینی و مشاهدات میکروسکوپ نوری و الکترونی حاصل از این مطالعه نشان داد که ماده سنتز شده مشتق فنوکسی بنزآمید با افزایش دوز بیش از5 میلیگرم بر کیلوگرم بافت کبد و آنزیم‌های کبدی را تحت‌تأثیر قرار داده و باعث افزایش سطح سرمی آنزیم‌های کبدی و تغییراتی همچون گسستگی و نکروز بافت، افزایش فاصله سینوزوئیدها و پیدایش واکوئل‌های چربی در بافت کبد شده بود.

نتیجه‌گیری

با بررسی تصاویر میکروسکوپ نوری و الکترونی و برآیندی از مقایسه آنزیم‌های کبدی مشاهده شد که اثرات سوء ترکیب با افزایش دوز دارو ارتباط مستقیم دارد. همچنین با توجه به نتایج این مطالعه اثرات زیان‌آور ترکیب ضد تشنج مشتق فنوکسی بنزآمید در دوزهای  میلیگرم بر کیلوگرم 1 و3 میلیگرم بر کیلوگرم روی بافت کبد کمتر از دیازپام بود. اما در دوز5 میلیگرم بر کیلوگرم  هر دو ترکیب آسیب‌های بافتی و برآیند افزایش آنزیمی تقریباً یکسان بود و با افزایش دوز این آسیب‌زایی به صورت وابسته به دوز افزایش یافت و باعث افزایش سطح آنزیم‌های کبدی و نکروز بافتی گردید و شکاف‌های وسیع بین سلولی بوضوع دیده شد(شکل 5).

سپاسگزاری

این تحقیق برگرفته از پایان نامه دانشجویی با کد اخلاق IR.IAU.PS,RES 1397.374 می­باشد.  بدین وسیله بر خود لازم می­دانیم از زحمات تمام کسانی­که ما را در انجام این تحقیق یاری نموده اند تشکر و قدردانی نماییم.