مجله پژوهشهای جانوری (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)

تغییرات بیان ژن Kiss1 در بافت مغز جنس نر و ماده ماهی سفید دریای خزر (Rutilus kutum) در مراحل مختلف رشد گناد

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه گیلان، رشت، ایران

2 هیئت علمی/ دانشگاه گیلان

چکیده

ماهی سفید دریای خزر یکی از گونه‌های اقتصادی و بومی دریای خزر می‌باشد. نورون‌های کیس‌پپتین (Kisspeptin) به‌عنوان یک پردازش کننده مرکزی در بازپخش سیگنال‌های محیطی به نورون‌های هورمون رهاکننده گنادوتروپین‌ها (GnRH) عمل می‌نمایند. برای بررسی نقش کیس‌پپتین به‌ویژه Kiss1 در تولید‌مثل ماهی سفید دریای خزر، میزان بیان ژن Kiss1 در بافت مغز با استفاده از روش Real time PCR ارزیابی شد. بدین منظور 36 قطعه ماهی از آبان 97 تا اردیبهشت 98 با میانگین وزنی50±650 گرم و طولی 0.2± 35.5 سانتی‌متر از سواحل انزلی صید شده و بافت مغز جدا گردید. بعد از استخراج RNA کل و سنتز cDNAاز بافت مغز، بیان ژن Kiss1 با استفاده از تکنیک Real time PCR به وسیله ژن مرجع-actin - β انجام شد. داده‌ها با استفاده از آنالیز واریانس یک‌طرفه (ANOVA) و پس‌آزمون Tukey و سطح اطمینان 95 درصدی ارزیابی گردید. نتایج نشان دادند که سطح بیان ژن Kiss1 در بافت مغز ماهی سفید نر و ماده تفاوت معنی‌داری را در ماه‌های مختلف نشان دادند (p< 0.05). بیشترین میزان بیان ژن Kiss1 در هر دو جنس نر و ماده در ماه اردیبهشت در زمان تخم‌ریزی ماهی سفید دریای خزر گزارش شد. همچنین بافت شناسی گنادها نشان داد که بیشترین رسیدگی جنسی در ماه‌های اسفند تا اردیبهشت بود. درمجموع به نظر می‌رسد می‌توان بیان کرد که Kiss1 در ماه‌هایی که ماهی سفید دریای خزر به رسیدگی جنسی خود می‌رسد بیشترین میزان بیان را دارد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Changes in Kiss1 gene expression in the brain tissue of the male and female Caspian kutum (Rutilus kutum) in different stages of gonadal growth

نویسندگان [English]

  • Mohadeseh Davoodi 1
  • Behrooz Heidari 2

1 Department of Biology, Faculty of Science, University of Guilan, Rasht, Guilan, Iran

2 Scientific Member/ University of Guilan

چکیده [English]

The Caspian kutum is one of the most important economic and native species of the Caspian Sea. Kisspeptin neurons act as a central processor in the transmission of peripheral signals to gonadotropin receptor (GnRH) neurons. To investigate the role of kisspeptin, especially Kiss1 in the reproduction of the Caspian kutum, the expression of the Kiss1 gene in brain tissue was evaluated using real-time PCR. For this purpose, 36 pieces of fish were caught from Anzali shores from November 1997 to May 1998 with an average weight of 650±50 g and a length 35.5±0.2 cm and brain tissue was separated. After extraction of total RNA and cDNA synthesis from brain tissue, expression of the Kiss1 gene was performed using real-time PCR technique by reference gene-actin-β. Data were evaluated using one-way analysis of variance (ANOVA) and Tukey post-test and 95% confidence level and the significant difference in expression of the Kiss1 gene was calculated per month in both sexes. The results showed that the expression level of the Kiss1 gene in the brain tissue of male and female fish showed a significant difference in different months (p< 0.05). The highest expression of the Kiss1 gene in both sexes was reported in May during the Caspian kutum spawning. In addition, morphohistology of gonads showed that the highest sexual maturity was from March to May. In conclusion, it seems that it can be stated that Kiss1 has the highest level of expression in the months when the Caspian kutum reaches its sexual maturity.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Kiss1 gene
  • sexual maturity
  • Caspian kutum
  • sampling period

تغییرات بیان ژن Kiss1 در بافت مغز جنس نر و ماده ماهی سفید دریای خزر

(Rutilus kutum) در مراحل مختلف رشد گناد

محدثه داودی1 و بهروز حیدری*2،1

۱ ایران، رشت، دانشگاه گیلان، دانشکده علوم پایه، گروه زیست‌شناسی

2 ایران، رشت، دانشگاه گیلان، پژوهشکده حوضه آبی دریای خزر، گروه علوم دریایی

تاریخ دریافت: 11/03/1401          تاریخ پذیرش: 09/09/1401

چکیده

ماهی سفید دریای خزر یکی از گونه‌های اقتصادی و بومی دریای خزر می‌باشد. نورون‌های کیس‌پپتین (Kisspeptin) به‌عنوان یک پردازش کننده مرکزی در بازپخش سیگنال‌های محیطی به نورون‌های هورمون رهاکننده گنادوتروپین­ها (GnRH) عمل می‌نمایند. برای بررسی نقش کیس‌پپتین به‌ویژه Kiss1 در تولید­مثل ماهی سفید دریای خزر، میزان بیان ژن Kiss1 در بافت مغز با استفاده از روش Real time PCR ارزیابی شد. بدین منظور 36 قطعه ماهی از آبان 97 تا اردیبهشت 98 با میانگین وزنی50±650 گرم و طولی 0.2± 35.5 سانتی‌متر از سواحل انزلی صید شده و بافت مغز جدا گردید. بعد از استخراج RNA کل و سنتز  cDNAاز بافت مغز، بیان ژن Kiss1 با استفاده از تکنیک Real time PCR به وسیله ژن مرجعactin -b انجام شد. داده­ها با استفاده از آنالیز واریانس یک‌طرفه (ANOVA) و پس‌آزمون Tukey و سطح اطمینان 95 درصدی ارزیابی گردید. نتایج نشان دادند که سطح بیان ژن Kiss1 در بافت مغز ماهی سفید نر و ماده تفاوت معنی‌داری را در ماه‌های مختلف نشان دادند (p< 0.05). بیشترین میزان بیان ژن Kiss1 در هر دو جنس نر و ماده در ماه اردیبهشت در زمان تخم‌ریزی ماهی سفید دریای خزر گزارش شد. همچنین بافت شناسی گنادها نشان داد که بیشترین رسیدگی جنسی در ماه‌های اسفند تا اردیبهشت بود. درمجموع به نظر می­رسد می‌توان بیان کرد که Kiss1 در ماه­هایی که ماهی سفید دریای خزر به رسیدگی جنسی خود می­رسد بیشترین میزان بیان را دارد.

واژه های کلیدی: ژن کیس1، رسیدگی جنسی، ماهی سفید دریای خزر، دوره نمونه برداری.

* نویسنده مسئول، تلفن: 09112301852، پست الکترونیکی: bheidari@guilan.ac.ir

مقدمه

 

ژن کد کننده‌ی کیس‌پپتین در سال 1996 به‌عنوان سرکوبگر متاستازی در ملانومای بدخیم انسانی شناسایی شد پپتیدی که به‌وسیله این ژن کد می‌شد، ابتدا متاستین (metastin)  و بعدها کیس‌پپتین (Kiss1) (kisspeptin) نام گرفت (12). در ماهیان ساختار ژن کیس مشابه پستانداران است. این تشابه در سایر مهره‌داران نیز دیده می‌شود (13،22). این ژن کدکننده پیش ساز پپتیدی با ۱۴۵ اسیدآمینه که شامل یک پپتید 19 اسیدآمینه‌ای و یک پپتید 54 اسیدآمینه‌ای مرکزی است. پروتئولیز پرو-کیس­پپتین منجر تولید پپتید 54 اسیدآمینه‌ای می‌شود که مهم‌ترین محصول ژن کیس 1 است و این پپتید ۵۴ اسیدآمینه­ای نیز با تقسیمات بعدی به پپتیدهای ۱۴، ۱۳ و ۱۰ اسیدآمینه­ای تقسیم می شود (24).

ترشح هورمون آزادکننده گنادوتروپین (GnRH) به‌عنوان یک محور کلیدی برای شروع و کنترل تولیدمثل، به شمار می‌رود. باوجود نقش مهم GnRH، در مسیر شبکه نورونی GnRH محدودیت‌های پیام رسانی وجود دارد(27).  کیس‌پپتین‌ها از پیام‌رسان‌هایی هستند که در بالادست نورون‌های ترشح‌کننده GnRH  قرار دارند و نسبت به بازخوردهای استروئیدهای جنسی حساس هستند. طبق مطالعات، واکنش بازخورد منفی استروئیدهای گنادی بر ترشح GnRH در هر دو جنس نر و ماده به وسیله نورون‌های کیس‌ پپتین۱ موجود در هسته‌های کمانی مغز کنترل می‌گردد (14).

بعد از اینکه در سال 2003 برای اولین بار نقش کیس‌پپتین و گیرنده‌های آن در تولیدمثل و بلوغ جنسی معین شد، جهش در ژن گیرنده‌های کیس‌پپتین (ازکارافتادن کیس‌پپتین ها) علائم هیپوگنادیسم هیپوگنادوتروپی را نشان داد که این علائم معمولاً در اثر کاهش ترشح گنادوتروپین ها صورت می‌گیرد. در مردانی که این جهش اتفاق می‌افتد رشد استخوان‌ها کمتر می‌شود، بیضه‌ها کوچک‌تر هستند، موها کم‌پشت می‌شوند و غلظت هورمون‌های گنادوتروپینی و استروئیدهای جنسی در پلاسما به‌صورت چشمگیری کم می‌شود. اگر این جهش در ژن‌ها اتفاق بیفتد علائم هیپوگنادیسم، تکامل نسبی پستان‌ها، سطوح پایین گنادوتروپین ها و هورمون‌های استروئیدی جنسی را نشان خواهد داد. این جهش در سایر مهره‌داران مانند ماهی‌ها نیز باعث نقصان در بلوغ جنسی می‌شود که نشان‌دهنده‌ی نقش مهم کیس‌پپتین و گیرنده‌ی آن در بلوغ مهره‌داران است (31).

بنابراین کیس‌پپتین‌ها به‌عنوان تنظیم‌کننده اساسی شروع بلوغ جنسی تنظیم ترشح گنادوتروپین­ها به‌واسطه هورمون‌های جنسی و کنترل باروری شناخته می‌شود (12، 23، 30). ترشحات نورون‌های کیس‌پپتین از طریق سیگنال‌هایی ازجمله استروئیدهای گنادی، فاکتورهای متابولیکی و دوره‌های نوری تنظیم می‌شوند (6).

در بدن ماهی‌ها، بیان ژن‌های کد کننده کیس‌پپتین‌ها و گیرنده‌های آن‌ها در مناطق مختلفی از مغز نظیر هیپوتالاموس، تلن سفالن، تالاموس، مغزمیانی، لوب‌های بویایی و تکتوم­ها و نورون‌های بینایی، منطقه مدولا و هیپوفیز گزارش شده است. درعین‌حال، ژن‌های کیس‌پپتین/gpr54 در طیف وسیعی از بافت‌های دیگر نظیر گنادها، قلب، ماهیچه، روده، طحال، کبد، کلیه، پانکراس، آبشش، چشم و حتی پوست ماهی نیز به مقدار متغیری بیان می‌شود (18).  بر اساس مطالعات ایمونوهیستوشیمی برای نخستین بار نورون‌های حاوی کیس‌پپتین در هسته خلفی پریونتریکولار (NPPv) (Posterioris periventricularis) و هسته شکمی توبریس (NVT) (Nucleus ventralis tuberis) در ماهی مداکا شناسایی شد که تعداد نورون‌ها در NVT ماهیانی که در فصل تخم‌ریزی بودند بیش از ماهیانی که در فصل غیر تخم‌ریزی بودند، مشاهده شد و در ماهیان نر بیش از ماهیان ماده بود. از نتایج این مطالعه چنین  استنباط شد که سیستم کیس‌پپتین محوری اصلی  برای تنظیم تولیدمثل در گونه‌های ماهیان است (8). با این حال محل دقیق عناصر سیستم کیس‌پپتین/KISSR در مغز اغلب ماهیان و معادل محل آن در مغز پستانداران در حال حاضر بسیار ناشناخته است. به‌عنوان یک اصل کلی، نوروآناتومی مغز جلویی ماهیان استخوانی به‌طور قابل‌توجهی متفاوت است، چرا که تنوع بسیار زیادی در گونه‌های این رده از جانوران وجود دارد که آن‌ها را متمایز می‌کند. درحالی‌که وقایع مورفوژنتیک اصلی در نیمکره‌های مغزی همه ماهیان استخوانی، مکانیسم مشترکی با سایر مهره‌داران دارد (32). در مغز ماهی، بیان گیرنده کیس پپتین (Kiss1r) به سلول‌های عصبی GnRH ترجمه می‌شود و در ماهی در ابتدای بلوغ جنسی در مقایسه با قبل یا بعد از بلوغ جنسی، زمانی که مقدار GnRH زیاد است بیان کیس پپتین و گیرنده آن نیز افزایش پیدا می‌کند (16، 17). این یافته‌ها شواهد اولیه را که سلول‌های GnRH اهداف مستقیمی برای کیس‌پپتین در ماهی هستند را نشان می‌دهد و کیس‌پپتین‌ها احتمالاً باعث آزاد شدن GnRH در بلوغ از طریق تعامل با Kiss1r  می‌شوند، همان‌طور که در پستانداران رخ می‌دهد.

مطالعات زیادی نشان می‌دهد که ارتولوگ کیس‌پپتین در ماهی مانند پستانداران یک فعال‌کننده قوی محور تولیدمثل است. نورون‌های GnRH1 mRNA، ژن Kiss2 را در ماهی سیکلید بیان می‌کند (21). علاوه بر این، چندین مطالعه in vivo  در سی بس راه‌راه نشان داده است که تزریق پپتید Kiss2 ترشح گنادوتروپین‌ها را تقویت می‌کند (26). علاوه بر این، آنتاگونیست­های کیس‌پپتین برای جلوگیری از تولید اسپرم یافت شده است. در گورخرماهی ( Danio rerio) جهش در Kiss و حذف Kissr باعث بلوغ طبیعی غدد جنسی می‌شود (10، 4) و این نشان‌دهنده این است که پیام‌رسانی کیس‌پپتین برای تولیدمثل این گونه ضروری نیست. چندین مطالعه نشان داده‌اند که سلول‌های عصبی GnRH گیرنده‌های کیس‌پپتین را در مداکا ( Oryzias latipes ) یا ( Dicentrarchus labrax) بیان نمی‌کنند (10). در اواسط بلوغ ماهی قنات تزریق کیس‌پپتین ۱ سبب افزایش بیان گیرنده gpr54-2b و GnRH3 در مغز شد، اما در مورد GnRH2 تغییری رخ نداد (5). تزریق سیستمیک کیس‌پپتین ۱ به ماهی ماده زبرا در حالت بلوغ جنسی نیز تغییری در بیان GnRH2 و GnRH3 ایجاد نکرد (10). درحالی‌که تزریق سیستمیک کیس ۱ در ماهی ماده بالغ از نظر جنسی گروپر راه‌راه سبب افزایش قابل‌توجه بیان GnRH1 در هیپوتالاموس شد که فرم هیپوفیزیوتروپیک گنادوتروپین این گونه در حالت بلوغ جنسی است (29). همچنین در ماهی ماکرل، بررسی الگوی بیان دو کیس ۱ و ۲ و گیرنده‌های آن‌ها در طی بلوغ جنسی، نشان داد که در ماهیان نر کیس‌پپتین ۲ و سطح بیان GnRH1 درست قبل از شروع میوز در بیضه‌ها، افزایش یافت. در ماهیان ماده نیز بیان کیس ۱ و ۲ هم‌زمان با افزایش سطوح کیس، کیس ۲ و GnRH1، درست قبل از شروع زرده­سازی در تخمک ها، افزایش یافت (19).

ماهی سفید Rutilus kutum متعلق به خانواده کپور ماهیان است. ماهی سفید مهم‌ترین ماهی استخوانی دریای خزر بوده و با توجه به ارزش غذایی بالا، کیفیت عالی گوشت مورد توجه مردم کشور ما قرار گرفته است. این ماهی جز ماهیان رود کوچ و از خانواده کپور ماهیان است (9). عمده پراکنش ماهی سفید در دریای خزر مربوط به مناطق جنوبی و جنوب غربی این دریا بوده و از رودخانه اترک در منطقه قفقاز تا سواحل جنوب ترکمنستان ماهی سفید به‌عنوان یک ماهی اقتصادی ارزشمند صید می‌شود؛ لذا یکی از ماهی‌های بااهمیت در حوضه جنوبی دریای خزر است. این ماهی یک ماهی نیمه مهاجر است که برای تخم‌ریزی به رودخانه مهاجرت می‌کند زمانی که این ماهی در دریا حضور دارد زیستگاه آن تا عمق 30 متری است در ناحیه‌ای که موجودات کف زی مخصوصاً نرم‌تنان حضور دارند می‌باشد. در فصل پاییز و زمستان قسمت‌های عمیق‌تر را ترجیح می‌دهند. در مراحل لاروی تغذیه این ماهی از فیتوپلانکتون‌ها بعد از آن همراه با رشد بدن از زئوپلانکتون­ها، لارو حشرات آبزی، لارو شیرونومیده، نرم­تنان، سخت­پوستان و کرم پرتار است. در زمان بلوغ غذای اصلی این ماهی از نرم­تنان است و در زمان مهاجرت آن به رودخانه تغذیه ماهی متوقف می­شود. ماهیان مولد نر و ماده پس از رسیدن به مرحله­ی رسیدگی جنسی کامل و ورود به رودخانه تغییراتی در شکل ظاهری آن ها ایجاد می­گردد (2). سالیانه این ماهی معمولا از 10 مهر ماه شروع شده و تا 10 اردیبهشت ادامه می­یابد و سالانه به طور متوسط 5 تا 6 هزار تن از این گونه در سواحل دریای خزر و رودخانه­های آن صید می­شود (2).

با توجه به اینکه نورو پپتید کیس‌پپتین نقش حیاتی در هیپوتالاموس برای آغاز بلوغ و عملکرد تولیدمثل به‌وسیله‌ی پیام‌های هورمونی و محیطی ایفا می‌کنند ولی بیان مکانی و زمانی کیس پپتین در مغز و گناد ماهی سفید در مراحل مختلف رسیدگی نامشخص است. پی بردن به میزان تغییرات Kiss1 در ماهی سفید درک بهتری از سیستم تولیدمثلی ماهی سفید به ما خواهد داد. از طرف دیگر، در تکثیر مصنوعی ماهی سفید دریای خزر این اطلاعات پایه‌ای می‌تواند مورد استفاده قرار بگیرد؛ بنابراین در این تحقیق به مقایسه میزان تغییرات کیس‌پپتین 1 در مراحل مختلف رسیدگی جنسی ماهی سفید دریای خزر در دو جنس نر و ماده در طی فصل تولیدمثلی پرداخته شد.

مواد و روشها

تهیه نمونه‌ها: در تحقیق حاضر از ماه آبان تا اردیبهشت هر ماه 6 قطعه ماهی سفید از سواحل انزلی دریای خزر با روش تور پره ساحلی صید شد. در هر بار صید 3 قطعه ماهی ماده و 3 قطعه ماهی نر با میانگین وزنی50±650 گرم و میانگین طولی0.2±35.5 سانتی متر صید شد. برای تشریح و جداسازی بافت‌های گناد و مغز میانی به آزمایشگاه دانشکده علوم پایه گیلان منتقل شدند. نمونه‌ها پس از استخراج در فریزر 20- درجه سانتی گراد نگهداری شدند.

مورفوهیستولوژی گناد: مراحل توسعه تخمدان و بیضه هر نمونه پس از تثبیت گناد در بوئن (این محلول شامل75میلی لیتر اسید پیکریک اشباع شده، 25 سی سی فرمالین غلیظ و 5 سی سی اسید استیک گلاسیال می باشد) و انجام مراحل معمول بافت‌شناسی یعنی تثبیت نمونه (fixation)، آب‌گیری و شفاف‌سازی (Dehydration and Clearing)، حمام پارافینی و قالب‌گیری (Infiltration with paraffin and Embedding)، برش بافت (Paraffin Sectioning)، رنگ‌آمیزی (Staining) هماتوکسیلین-ائوزین مشخص گردید.

مراحل استخراج RNA : استخراج RNA کل از 100-50 میلی‌گرم بافت مغز میانی هموژن شده انجام گرفت. در این تحقیق استخراج کل RNA با استفاده از RNX PLUS (سیناکلون، ایران) و طبق دستورالعمل شرکت سازنده انجام گرفت. برای تعیین کیفیت RNA های استخراج شده، از الکتروفورز نمونه‌ها با ژل 1% آگارز استفاده شد. همچنین برای تعیین کمیت RNA های استخراج شده از دستگاه NanoDrop Spectrophotometer استفاده شد. بدین صورت که با قرار دادن مقدار 2 میکرولیتر از هر نمونه در جایگاه دستگاه، نسبت میزان جذب نور در طول موج 260 به 280 نانو متر خوانده شد و میزان غلظت RNA نانوگرم بر میکرولیتر موجود در هر نمونه مشخص گردید. قبل از آغاز سنتز cDNA نمونه باید عاری از وجود DNA شود بدین منظور از DNAase I Thermo Scientific استفاده شد. از آنجایی که RNA ناپایدار است و به سرعت تخریب می‌گردد لذا باید RNA به مولکول پایدار cDNA تبدیل شود. ساخت رشته cDNA با استفاده از کیت سنتز First Strand cDNA  (سیناکلون، ایران) در دو مرحله انجام شد. در مرحله ی اول، 2 میکروگرم از RNA استخراج شده به یک میکرولیتر پرایمر Oligo(dT) و یک میکرولیتر  dNTP با غلظت 10 mM  افزوده شد و  تا حجم نهایی 10 میکرولیتر آب DEPC به آن افزوده شد. مخلوط حاصل به مدت 5 دقیقه در دمای ℃70 قرار گرفت و سپس به مدت 2 دقیقه تا 4 درجه ی سانتیگراد سرد شد.در ویال جداگانه مخلوط حاوی 4 میکرولیتر بافرM-MuLV، 1 میکرولیتر آنزیم نسخه بردارمعکوس M-MuLV، 5/0 میکرولیتر مهار کننده ی RNase و 5/4 میکرولیتر آب DEPC مخلوط شد. در مرحله دوم محتویات ویال دوم به محصول مرحله ی اول افزوده شد. مخلوط به دست آمده به مدت 50 دقیقه در دمای ℃50 قرار گرفت و سپس برای غیرفعال شدن آنزیم، به مدت 15 دقیقه  در دمای ℃70 قرار گرفت. در نهایت، cDNA به دست آمده به فریزر ۸۰- درجه منتقل شد و به عنوان رشته الگو برای مراحل بعد مورد استفاده قرار گرفت.

بررسی RNA با دستگاه نانودرآپ: میانگین غلظت RNA های مورداستفاده در نمونه‌های آزمایش شده بین ng/µl500 تا ng/µl 2000 بوده است و نسبت جذب‌های به دست آمده در محدوده 8/1-2 قرار داشتند.

بررسی کیفیت RNA با استفاده از ژل الکتروفورز 1 درصد: بمنظور بررسی کیفیت RNA استخراج شده و اطمینان از عدم تخریب آن، روش الکتروفورز افقی انتخاب شد. پس از انجام الکتروفورز، عکس برداری از ژل توسط دستگاه Gel Doc صورت گرفت. شکل 1، نمونه‌ای از ژل 1% است که در آن RNA های، 28s، 18s و 5.8s بهمراه DNA Ladder قابل مشاهده است. تصویر ارائه شده حاکی از کیفیت مناسب RNA استخراج شده است که فاقد آلودگی پروتئین و DNA بوده و مناسب برای سنتز cDNA می‌باشد.

 

شکل 1- بررسی کیفیت استخراج Total RNA با ژل آگارز 1%. موقعیت سه باند 28s, 18s, 5.8s در ژل مشخص شده است.

 

واکنش زنجیره‌ای پلی مراز (PCR) جهت بهینه سازی شرایط تکثیر ژن Kiss1 : کیفیت مرحله استخراج RNA، با استفاده از الکتروفورز و بررسی میزان جذب RNA توسط دستگاه نانودراپ (EzDrop 1000, Taiwan) مشخص گردید.

بمنظور بهینه سازی دمای اتصال پرایمر برای هر دو ژنِ Kiss1 و B-actin از روش مرسوم PCR با گرادیان دمایی در مرحله ی اتصال پرایمر استفاده شد. مخلوط آنزیمی فرآیند PCR از کمپانی Ampliqon ( (Taq DNA Polymerase 2x Master Mix RED ) تهیه شد و محتوای هر ویال بر مبنای دستور کار شرکت سازنده تهیه شد.  سیکل PCR پس از 5 دقیقه پیش انکوباسیون در دمای ℃ 95 به صورت 30 ثانیه دمای ℃ 95، 30 ثانیه محدوده ی دمایی 55 تا ℃ 62 و 30 ثانیه دمای ℃72، 35 بار تکرار شد. فرآیند تکثیر با  5 دقیقه دمای ℃72 بمنظور تکمیل فرآیند همانندسازی پایان یافت. در انتها محصول نهایی در ژل 2% آگارز بررسی شد و از بهترین دمای اتصال برای Real-time PCR استفاده شد.  

مشخصات پرایمرهای مورد استفاده برای تکثیر ژن‌های Kiss1 و B-actin در جدول1 آورده شده است. پرایمرهای reverse و forward  به صورت آنلاین و از طریق سایت NCBI طراحی شده و در شرکت تکاپو زیست ساخته شده‌اند.

 

 

جدول 1- مشخصات پرایمر سنتزی Kiss1 و کنترل داخلی β-actin.

رو به عقب

رو به جلو

پرایمر

CAAGATTTAGCCCGACCCAG

TGAGTGCAAATCCTCACCGAA

Kiss1

CCGCAAGATTCCATACCCAGG

GACTTCGAGCAGGAGATGGG

β-actin

 

 

بررسی کیفیت محصولات PCR : پس از سنجش کمی و کیفی RNA استخراج شده، با توجه به غلظت‌های به‌دست‌آمده و با استناد به پروتکل ذکرشده، سنتز cDNA و RT-PCR انجام شد. ‌بمنظور یافتن بهترین دمای اتصال پرایمر به ژن موردنظر Gradient PCR انجام گرفت. محصولات تکثیر ژن Kiss1 وβ-actin  در بازه دمایی 54 تا 62 درجه سانتی گراد با استفاده از ژل 2% در دستگاه الکتروفورز مورد ارزیابی قرار گرفت و ضخیم‌ترین باند مشاهده شده در ژل آگارز 2% در این بازه دمایی قرار داشت. در صورت مناسب بودن شرایط PCR، قطعه‌ای به طول 94 جفت باز از ژن Kiss1 شکل (2) و قطعه­ای به طول 133 جفت باز از ژن β-actin شکل (3) تکثیر شد.

سنجش میزان بیان ژن Kiss1 با واکنش Real-Time PCR : فرآیند Real-time PCR با استفاده از رنگ سایبرگرین انجام شد. مخلوط آنزیم Taq DNAplymerase  و رنگ از شرکت سیناکلون (Sina Green HS-qPCR Mix, 2X
(no ROX) ) تهیه شد و محتوای هر ویال بر اساس دستور شرکت سازنده تهیه شد. غلظت cDNA در این واکنشng/µl  500، حجم پرایمر مورد استفاده µl 1 و حجم نهایی مخلوط واکنش µl 25 در نظر گرفته شد. میزان بیان ژن از روش نسبی اندازه گیری شد.

 

 

 

شکل 2- تکثیر قطعه‌ای به طول 94 جفت بازی از ژن Kiss1 درژل آگارز 2%. با استفاده از Ladder 100 جفت بازی که در طول قطعه تکثیر شده در شکل مشخص است.

 

 

شکل 3- تکثیر قطعه‌ای به طول 133 جفت بازی از ژ ن B-actin درژل آگارز 2%. با استفاده از Ladder 100 جفت بازی که طول قطعه تکثیر شده در شکل مشخص شده است

 

در این پژوهش از B-actin به‌عنوان ژن کنترل داخلی استفاده شده است. سیکل دمایی دستگاه Real Time PCR   (Roche Light Cycler96) کاملا مشابه PCR شرح داده شده در مرحله ی قبل تنظیم شد با این تفاوت که دمای اتصال پرایمر ℃60  و تعداد سیکل ها 45 تعیین شد.

آنالیز آماری: جهت بررسی  میزان بیان نسبی ژن Kiss1، از ژن کنترل داخلی β-actin برای نرمال سازی داده های خروجی استفاده شد. تکنیک Real-time PCR توسط اندازه گیری میزان نور فلورسنت گزارشگر سایبرگرین مورد تجزیه وتحلیل قرار گرفت بدین صورت که هر چه میزان بیان ژن بیشتر بود در سیکل های پایین تری وارد فاز نمایی شده و نور بیشتری را ساطع کرد. برای محاسبه ی میزان بیان ابتدا، داده‌های به دست آمده از Real Time PCR ابتدا وارد نرم افزار Microsofr Excel 2016 شدند و پس از محاسبه ΔCt  و ΔΔCt طبق فرمول زیر، Fold Change   نیز محاسبه شد. سپس مقادیر Fold Change در نرم افزار SPSS ورژن 19 وارد شدند و در صورت مشاهده­ی اختلاف معنی‌دار، پس‌آزمون Tukey جهت مشخص نمودن معنی‌دار بودن با سطح اطمینان 95 درصد در هریک از گروه­ها استفاده گردید. برای رسم نمودارها از نرم افزار Graphpad Prism  ورژن 8.2 استفاده گردید.

 

نتایج

بافت‌شناسی تخمدان: نتایج بافت­شناسی تخمدان نشان می­دهد که اووسیت­ها در تخمدان­های نمونه­های آبان و آذر (شکل 4 a و b) در مراحل اولیه­ی رشد هستند و اووسیت­های نمونه­های اسفند و بهمن در مراحل پیشرفته­تری نسبت به نمونه­های آبان و آذر قرار دارند (شکل 4 d و e) (جدول 2).

 

b

CA

 

شکل 4- میزان رسیدگی اسپرماتوسیت­ها ماهی سفید دریای خزر در ماه­های مختلف.  a : وضعیت رسیدگی اووسیت­ها در بافت تخمدان ماهی سفید خزر در ماه آبان. اووسیت‌ها غالباً در مراحل پیش از زرده سازی PVO قرار دارند. خط مقیاس: 500 میکرومتر. b: وضعیت رسیدگی اووسیت‌ها در ماه آذر (اووسیت­های آلوئل کورتیکال CA).  خط مقیاس: 150 میکرومتر. c: وضعیت رسیدگی اووسیت‌ها در ماه دی. اووسیت‌ها غالباً در مرحله‌ی زرده سازی (VO) قرار دارند. خط مقیاس: 500 میکرومتر d: وضعیت رسیدگی اووسیت‌ها در ماه بهمن. اووسیت‌ها غالباً در مراحل انتهایی زرده سازی (LVO) قرار دارند. خط مقیاس: 500 میکرومتر. e: وضعیت رسیدگی اووسیت‌ها در ماه اسفند. اووسیت‌ها غالباً در مرحله‌ی رسیدگی (MO) قرار دارند. خط مقیاس: 500 میکرومتر.

 

بافت‌شناسی بیضه: نتایج بافت­شناسی بیضه نشان می­دهد که اسپرم­ها در بیضه­های نمونه­های آبان و آذر (شکل 5 a و b) در مراحل اولیه­ی رشد هستند و نمونه­های اسفند در مراحل پیشرفته‌تری نسبت به نمونه­های آبان و آذر قرار دارند (شکل 5 d و e) (جدول 2).

 

 

 

 

شکل 5- میزان رسیدگی اسپرماتوسیت­ها ماهی سفید دریای خزر در ماه­های مختلف. a: وضعیت رسیدگی اسپرماتوسیت­ها در بافت بیضه ماهی سفید دریای خزر در ماه آبان. بیضه‌ی ماهی در مرحله‌ی بلوغ اولیه و حاوی اسپرماتوگونیای فراوان (دایره) و اسپرماتوسیت اولیه (نوک فلش). خط مقیاس: 15 میکرومتر. b: وضعیت رسیدگی اسپرماتوسیت‌ها در ماه آذر و دی. بیضه‌ی ماهی در مرحله‌ی بلوغ ثانویه رسیدگی جنسی و سرشار از اسپرماتوسیت اولیه (فلش پایین سمت راست) و ثانویه (فلش بالا سمت چپ). خط مقیاس: 15 میکرومتر . c: وضعیت رسیدگی اسپرماتوسیت‌ها در ماه دی تا اسفند. مرحله‌ی بالغ رسیدگی جنسی که حاوی اسپرماتوسیت اولیه (دایره)، اسپرماتوسیت ثانویه (فلش بالا سمت راست)، اسپرماتید و اسپرماتوزوآهای آزاد (فلش پایین سمت چپ) است. خط مقیاس: 15 میکرومتر . d: وضعیت رسیدگی اسپرماتوسیت‌ها در ماه اسفند تا اردیبهشت. در مرحله‌ی کاملاً رسیده‌ی بیضه لوبول­های (دایره) حاوی اسپرماتوزوآ (فلش). خط مقیاس: 15 میکرومتر.

 

جدول 2- مراحل رسیدگی تخمدان و بیضه ماهی سفید دریای خزر در ماه­های مختلف.

ماه نمونه برداری

آبان

آذر

دی

بهمن

اسفند تا اردیبهشت

مراحل رشد تخمدانی

پیش از زرده سازی

آلوئل کورتیکال

زرده سازی

مراحل انتهایی زرده سازی

رسیده

مراحل رشد بیضه

بلوغ اولیه یا اسپرماتوگونیا

بلوغ ثانویه یا اسپرماتوسیت اولیه

بلوغ ثانویه یا اسپرماتوسیت اولیه

رسیدگی جنسی، اسپرماتید و اسپرماتوزوآهای آزاد

کاملاً رسیده‌، اسپرماتوزوآ

 

بیان نسبی ژن Kiss1 در بافت‌های مغز در جنس نر ماهی سفید: همان‌طور که در شکل 6 مشاهده مقایسه میزان بیان نسبی ژن Kiss1 در بافت مغز ماهی سفید جنس نر در ماه‌های آبان تا اردیبهشت انجام گرفته است. میزان بیان ژن Kiss1 در این جنس به‌صورت صعودی بوده و در تمام طول دوره نمونه برداری افزایش ‌یافته است. این افزایش بیان در ماه‌های ابتدای دوره آزمایش ناچیز بوده و به مرور زمان تفاوت آشکارتر و فاحش‌تر می‌شود به‌طوری که بین ماه آبان و ماه آذر اصلاً تفاوت معناداری از لحاظ آماری مشاهده نمی‌شود (3632/0=P) ولی بین ماه آذر و ماه دی تفاوت قابل توجه مشاهده می‌شود (0388/0=P) و حتی پس از آن، تفاوت میزان بیان ژن مورد نظر بین ماه‌های بعدی بسیار زیاد می‌شود. بیشترین اختلاف در میزان بیان ژن مورد نظر بین ماه‌های بهمن و اسفند است (0001/0>P) که بر روی نمودار نیز قابل مشاهده است.

 

 

شکل 6- نمودار بیان نسبی ژن Kiss1 در بافت مغز جنس نر ماهی سفید طی ماه‌های مختلف. تعداد نمونه­ها در هر گروه 3 قطعه بود و از آنووای یک طرفه و پس آزمون توکی با ضریب اطمینان 95% برای تحلیل داده­ها استفاده شده است.

 

 

بیان نسبی ژن Kiss1 در بافت‌های مغز در جنس ماده ماهی سفید: مقایسه میزان بیان نسبی ژن Kiss1 در بافت مغز ماهی سفید جنس ماده در ماه‌های آبان تا اردیبهشت در شکل 7 آورده شده است. با توجه به میانگین بیان ژن Kiss1 در بافت مغز ماهی سفید جنس ماده، افزایش بیان با مراحل رسیدگی جنسی در ارتباط می‌باشد به‌طوری‌که در ماه اردیبهشت بیشترین میزان بیان قابل مشاهده است. با توجه به نمودار بین ماه‌های اسفند و اردیبهشت (4013/0=P) و همچنین ماه‌های آذر و دی (1271/0=P) اختلاف معنی‌داری در بیان ژن Kiss1 مشاهده نشد همچنین با توجه به P<0.0001، اختلاف معنی‌داری در میزان بین ژن Kiss1 در طی ماه‌های آبان تا اردیبهشت مشاهده شد.

مقایسه‌ی بیان نسبی ژن Kiss1 در جنس نر و ماده: همان‌طور که در شکل 8 مشاهده می‌شود تفاوت معنی‌داری در بیان ژن Kiss1 در دو جنس نر و ماده مشاهده نشده است (P>0.05). همچنین ضریب همبستگی مثبت معناداری بین بیان ژن Kiss1 در جنس نر و ماده در ماه‌های مختلف مشاهده شد (r =%75 ،P<0.0567).

بحث و نتیجه گیری

در مطالعه‌ی حاضر میزان بیان ژن Kiss1 در رسیدگی جنسی ماهی سفید خزر بررسی شده است.

 

 

شکل 7- نمودار بیان ژن Kiss1 در بافت مغز جنس ماده ماهی سفید دریای خزر طی ماه‌های مختلف. عداد نمونه­ها در هر گروه 3 قطعه بود و از آنووای یک طرفه و پس آزمون توکی با ضریب اطمینان 95% برای تحلیل داده­ها استفاده شده است.

 

 

شکل 8- مقایسه میانگین بیان نسبی ژن Kiss1 در هیپوتالاموس مغز در دو جنس نر و ماده.

 

در ماهی‌ها بیشتر تحقیقات کیس‌پپتین روی تولیدمثل و به‌ویژه تنظیم شروع بلوغ صورت گرفته است و اطلاعات کمی در مورد اثرات دیگر کیس‌پپتین وجود دارد؛ بنابراین احتمال دارد که هر ژن پارالوگ در ماهی اعمال پلی تروپیک داشته باشد. مثلاً در ماهی زبرا ژن Kiss2 در تولیدمثل دخیل است درحالی‌که Kiss1 وابسته به سیگنال‌های متابولیکی است (1، 11). بامطالعه‌ی بیان ژن کیس‌پپتین در بلوغ، Kitahashi و همکاران (10) نشان دادند که میزان بیان ژن Kiss1 و Kiss2 با آغاز بلوغ در ماهی زبرا افزایش پیدا می‌کند. در سال 2012 میزان بیان ژن Kiss2 را در هیپوتالاموس در فصل تخم‌ریزی و بعد از تخم‌ریزی در دو جنس بررسی کردند و نشان دادند که میزان بیان Kiss2 در هر دو جنس در اوایل فصل تخم‌ریزی در مقایسه با فصل بعد از تخم‌ریزی بیشتر بود (8).

در مطالعه حاضر نیز، از آبان ماه تا اردیبهشت ماه که فصل رسیدگی جنسی، تولیدمثل و تخم‌ریزی ماهی سفید است میزان رسیدگی جنسی گنادها و سلول­های جنسی رفته‌رفته افزایش پیدا کرده است طوری که در آبان ماه سلول­های جنسی نر و ماده در مراحل اولیه رشد قرار دارند و در اردیبهشت ماه به رسیدگی کامل می­رسند. همچنین بیشترین میزان بیان ژن Kiss1 ماهی سفید دریای خزر در فصل تولیدمثلی و بخصوص تخم­ریزی (ماه اردیبهشت) گزارش شد. به نظر می‌رسد این ژن می‌تواند در تحریک ترشح هورمون‌های جنسی مرتبط با تخم­ریزی نقش مؤثری داشته باشد. میزان بیان ژن Kiss1 در هیپوتالاموس مداکا در هر دو جنس طی فصل تولیدمثل نسبت به فصل غیر تولیدمثل افزایش داشته است درحالی‌که در فصل غیر تولیدمثل این افزایش بیان در جنس نر نسبت به جنس ماده بیشتر بود (Kanda et al., 2008). در جنس نر ماهی sea bass اروپایی طی چرخه‌ی تولیدمثلی میزان بیان ژن Kiss1 در مرحله‌ی اسپرماتوژنز میانی و اواخر آن در مقایسه با دوره‌ی پس از اسپرم ریزی به‌طور قابل‌توجهی بالا بود (15).

در مطالعه­ی حاضر میانگین میزان بیان ژن Kiss1 در جنس ماده بیشتر از جنس نر بود ولی این اختلاف معنی­دار نبود. در این مطالعه نیز در مراحل اولیه­ی رشد گنادهای نر و ماده (آبان ماه و آذر ماه) میزان بیان این ژن به صورت معنی‌داری نسبت به فصل تخم­ریزی (اسفند ماه و اردیبهشت ماه) پایین بود. در سال 2010 میزان بیان ژن Kiss1 و Kiss2 در مراحل مختلف رسیدگی جنسی ماهی مارکرل مورد مطالعه قرار گرفت و نشان داده شد که میزان بیان ژن Kiss1 و Kiss2 در جنس نر بین مراحل نابالغ و دوره‌ی اوایل اسپرم ریزی به حداکثر خود رسیده و بعد از اسپرم ریزی این میزان کاهش پیداکرده است. در جنس ماده میزان بیان ژن Kiss1 در آغاز دوره‌ی ویتلوژنیک به حداکثر میزان خود رسیده است (20). در سال 2010 با بررسی فصلی میزان بیان ژن Kiss2 در طول چرخه‌ی گناد دریافتند که میزان بیان در مغز به‌طور قابل‌توجهی در طول دوره‌ی تخم‌ریزی در هر دو جنس بالا بود (28). در سال 2016 با بررسی میزان بیان ژن Kiss1 در ماهی Ruho نشان داد که میزان بیان ژن Kiss1 به‌طور قابل‌توجهی در دوره تخم‌ریزی در هر دو جنس بالا بود (25). در سال 2017 با بررسی میزان بیان Kiss1 و Kissr (گیرنده کیس­پپتین) در ماهی Odonthestes bonariensis بیان کردند که میزان بیان Kiss1 و Kissr در طی تکامل بیضه در مقایسه با بیضه نابالغ افزایش‌یافته و در ماهیان ماده بیان بالایی از گیرنده را در بلوغ نهایی تخمدان نشان دادند (3). در ماهی سفید دریای خزر، در جنس ماده در مراحل زرده سازی و پیش از زرده سازی، بیان ژن کیس‌پپتین مشاهده شده است اما میزان آن در مقایسه با مرحله رسیده و تخم‌ریزی به‌طور معناداری کمتر بوده است. همچنین در جنس نر چنین الگویی دیده شد به­طوری­که در هنگام اسپرم ریزی (مرحله رسیده) بیشترین بیان ژن Kiss1 گزارش شد.

با توجه به اینکه کیس‌پپتین­ها در بسیاری از گونه‌های مختلف ماهیان از طریق شبکه‌های عصبی شناخته شده و غیر شناخته شده در موفقیت تولیدمثلی و رسیدگی جنسی نقش دارند در مطالعه‌ی حاضر برای درک نقش ژن Kiss1 در رسیدگی جنسی ماهی سفید دریای خزر، تغییرات بیان ژن Kiss1 در هیپوتالاموس هر دو جنس نر و ماده ماهی سفید در طول ماه­های مختلف نشان داده شد. مراحل رشد جنسی و بلوغ ماهی سفید دریای خزر از اوایل آبان تا اردیبهشت است و در طی مراحل مختلف جنسی میزان بیان ژن Kiss1 و رسیدگی جنسی گناد نر و ماده افزایش معنی‌داری نشان داد به‌طوری‌که در مراحل اولیه رشد گنادها میزان بیان ژن Kiss1 افزایش معنی‌داری را نشان نمی‌دهد ولی با توسعه و رشد گنادها میزان بیان ژن Kiss1 افزایش پیدا می‌کند به‌طوری‌که در ماه‌های اسفند و اردیبهشت با حداکثر رسیدگی جنسی میزان بیان ژن Kiss1 افزایش‌یافته که مصادف با سنتز حداکثری هورمون‌های جنسی است که این نشان‌دهنده ارتباط و تأثیر مستقیم کیس‌پپتین بر روند سنتز و تولید هورمون‌های جنسی ماهی است.

در مجموع، با توجه به نتایج به‌دست‌آمده در خصوص بررسی بیان ژن Kiss1 در مغز ماهی سفید دریای خزر با استفاده از تکنیک Real time PCR کمی و افزایش بیان این ژن در ماه­هایی که ماهی تخم­ریزی دارد به نظر می­رسد که Kiss1 یکی از عوامل مهم در سیستم تولیدمثل ماهی سفید دریای خزر است.

سپاسگزاری

نویسندگان مقاله نهایت تشکر و قدردانی خود را از سرکار خانم دکتر مهوش هادوی و جناب آقای دکتر عبدالمجید ولی پور به جهت کمک در تهیه مقاله اعلام می‌دارد.

  1. Alvarado, M., Servili, A., Molés, G., Gueguen, M.-M., Carrillo, M., Kah, O., Felip, A., 2016. Actions of sex steroids on kisspeptin expression and other reproduction-related genes in the brain of the teleost fish European sea bass. Journal of Experimental Biology 219, 3353-3365.
  2. Aminian Fatideh, B., Mohammadi, M., Karimzadeh, G., Jafari, A.G., Vahdati Rad, N., 2017. Effect of biological and environmental conditions on the catch rate and migration of Rutilus Frisii Kutum in the southeast basin of the Caspian Sea (Golestan Province). Journal of Animal Research (Iranian Journal of Biology) 29, 380-399.
  3. Bohórquez, M.O.T., Mechaly, A.S., Hughes, L.C., Campanella, D., Ortí, G., Canosa, L.F., Somoza, G.M., 2017. Kisspeptin system in pejerrey fish (Odontesthes bonariensis). Characterization and gene expression pattern during early developmental stages. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology 204, 146-156.
  4. Felip, A., Zanuy, S., Pineda, R., Pinilla, L., Carrillo, M., Tena-Sempere, M., Gómez, A., 2009. Evidence for two distinct Kiss genes in non-placental vertebrates that encode kisspeptins with different gonadotropin-releasing activities in fish and mammals. Molecular and Cellular Endocrinology 312, 61-71.
  5. Filby, A.L., Aerle, R.v., Duitman, J., Tyler, C.R., 2008. The kisspeptin/gonadotropin-releasing hormone pathway and molecular signaling of puberty in fish. Biology of Reproduction 78, 278-289.
  6. Kah, O., 2009. Endocrine targets of the hypothalamus and pituitary. Fish Physiology 28, 75-112.
  7. Kanda, S., Akazome, Y., Matsunaga, T., Yamamoto, N., Yamada, S., Tsukamura, H., Maeda, K.-i., Oka, Y., 2008. Identification of KiSS-1 product kisspeptin and steroid-sensitive sexually dimorphic kisspeptin neurons in medaka (Oryzias latipes). Endocrinology 149, 2467-2476.
  8. Kanda, S., Akazome, Y., Mitani, Y., Okubo, K., Oka, Y., 2013. Neuroanatomical evidence that kisspeptin directly regulates isotocin and vasotocin neurons. PloS one 8, e62776.
  9. Kiabi, B.H., Abdoli, A., Naderi, M., 1999. Status of the fish fauna in the South Caspian Basin of Iran. Zoology in the Middle East 18, 57-65.
  10. Kitahashi, T., Ogawa, S., Parhar, I.S., 2009. Cloning and expression of kiss2 in the zebrafish and medaka. Endocrinology 150, 821-831.
  11. Le Page, Y., Vosges, M., Servili, A., Brion, F., Kah, O., 2011. Neuroendocrine effects of endocrine disruptors in teleost fish. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B 14, 370-386.
  12. Lee, J.-H., Miele, M.E., Hicks, D.J., Phillips, K.K., Trent, J.M., Weissman, B.E., Welch, D.R., 1996. KiSS-1, a novel human malignant melanoma metastasis-suppressor gene. JNCI: Journal of the National Cancer Institute 88, 1731-1737.
  13. Luan, X., Zhou, Y., Wang, W., Yu, H., Li, P., Gan, X., Wei, D., Xiao, J., 2007. Association study of the polymorphisms in the KISS1 gene with central precocious puberty in Chinese girls. European Journal of Endocrinology 157, 113-118.
  14. Matsuda, F., Ohkura, S., Magata, F., Munetomo, A., Chen, J., Sato, M., Inoue, N., Uenoyama, Y., Tsukamura, H., 2019. Role of kisspeptin neurons as a GnRH surge generator: Comparative aspects in rodents and non‐rodent mammals. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research 45, 2318-2329.
  15. Migaud, H., Ismail, R., Cowan, M., Davie, A., 2012. Kisspeptin and seasonal control of reproduction in male European sea bass (Dicentrarchus labrax). General and Comparative Endocrinology 179, 384-399.
  16. Mohamed, J.S., Benninghoff, A.D., Holt, G.J., Khan, I.A., 2007. Developmental expression of the G protein-coupled receptor 54 and three GnRH mRNAs in the teleost fish cobia. Journal of Molecular Endocrinology 38, 235-244.
  17. Nocillado, J.N., Levavi-Sivan, B., Carrick, F., Elizur, A., 2007. Temporal expression of G-protein-coupled receptor 54 (GPR54), gonadotropin-releasing hormones (GnRH), and dopamine receptor D2 (drd2) in pubertal female grey mullet, Mugil cephalus. General and Comparative Endocrinology 150, 278-287.
  18. Oakley, A.E., Clifton, D.K., Steiner, R.A., 2009. Kisspeptin signaling in the brain. Endocrine Reviews 30, 713-743.
  19. Ohga, H., Adachi, H., Matsumori, K., Kodama, R., Nyuji, M., Selvaraj, S., Kato, K., Yamamoto, S., Yamaguchi, A., Matsuyama, M., 2015. mRNA levels of kisspeptins, kisspeptin receptors, and GnRH1 in the brain of chub mackerel during puberty. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology 179, 104-112.
  20. Ohga, H., Selvaraj, S., Matsuyama, M., 2018. The roles of kisspeptin system in the reproductive physiology of fish with special reference to chub mackerel studies as main axis. Frontiers in Endocrinology 9, 147.
  21. Parhar, I.S., Ogawa, S., Sakuma, Y., 2004. Laser-captured single digoxigenin-labeled neurons of gonadotropin-releasing hormone types reveal a novel G protein-coupled receptor (Gpr54) during maturation in cichlid fish. Endocrinology 145, 3613–3618.
  22. Pasquier, J., Kamech, N., Lafont, A.-G., Vaudry, H., Rousseau, K., Dufour, S., 2014. Kisspeptin/kisspeptin receptors. Journal of Molecular Endocrinology 52, T101-T117.
  23. Pinilla, L., Aguilar, E., Dieguez, C., Millar, R.P., Tena-Sempere, M., 2012. Kisspeptins and reproduction: physiological roles and regulatory mechanisms. Physiological Reviews 92, 1235-1316.
  24. Roa, J., Aguilar, E., Dieguez, C., Pinilla, L., Tena-Sempere, M., 2008. New frontiers in kisspeptin/GPR54 physiology as fundamental gatekeepers of reproductive function. Frontiers in Neuroendocrinology 29, 48-69.
  25. Saha, A., Pradhan, A., Sengupta, S., Nayak, M., Samanta, M., Sahoo, L., Giri, S.S., 2016. Molecular characterization of two kiss genes and their expression in rohu (Labeo rohita) during annual reproductive cycle. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology 191, 135-145.
  26. Selvaraj, S., Ohga, H., Kitano, H., Nyuji, M., Yamaguchi, A., Matsuyama, M., 2013. Peripheral administration of Kiss1 pentadecapeptide induces gonadal development in sexually immature adult scombroid fish. Zoological Science 30, 446-454.
  27. Seminara, S.B., Messager, S., Chatzidaki, E.E., Thresher, R.R., Acierno Jr, J.S., Shagoury, J.K., Bo-Abbas, Y., Kuohung, W., Schwinof, K.M., Hendrick, A.G., 2003. The GPR54 gene as a regulator of puberty. New England Journal of Medicine 349, 1614-1627.
  28. Shahjahan, M., Motohashi, E., Doi, H., Ando, H., 2010. Elevation of Kiss2 and its receptor gene expression in the brain and pituitary of grass puffer during the spawning season. General and Comparative Endocrinology 169, 48-57.
  29. Shi, Y., Zhang, Y., Li, S., Liu, Q., Lu, D., Liu, M., Meng, Z., Cheng, C.H., Liu, X., Lin, H., 2010. Molecular identification of the Kiss2/Kiss1ra system and its potential function during 17alpha-methyltestosterone-induced sex reversal in the orange-spotted grouper, Epinephelus coioides. Biology of Reproduction 83, 63-74.
  30. Skorupskaite, K., George, J.T., Anderson, R.A., 2014. The kisspeptin-GnRH pathway in human reproductive health and disease. Human Reproduction Update 20, 485-500.
  31. Tsutsui, K., Bentley, G., Kriegsfeld, L.J., Osugi, T., Seong, J.Y., Vaudry, H., 2010. Discovery and evolutionary history of gonadotrophin‐inhibitory hormone and kisspeptin: new key neuropeptides controlling reproduction. Journal of Neuroendocrinology 22, 716-727.
  32. Wullimann, M.F., 2017. Nervous system architecture in vertebrates. The Wiley Handbook of Evolutionary Neuroscience.
مجله پژوهشهای جانوری (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)
دوره 36، شماره 1
فروردین 1402
صفحه 1-14
  • تاریخ دریافت: 11 خرداد 1401
  • تاریخ بازنگری: 19 مرداد 1401
  • تاریخ پذیرش: 09 آذر 1401