اثر نیکل (Ni) بر رشد و تراکم جمعیت روتیفر آب شیرین Brachionus calyciflorus 

مصیب سیدی آب الوان¹، مصطفی غفاری^2* و احمد قرایی²

¹ زابل، دانشگاه زابل، دانشکده منابع طبیعی، گروه شیلات 

² زابل، دانشگاه زابل، پژوهشکده تالاب بین المللی هامون، گروه شیلات 

تاریخ دریافت: 15/8/91               تاریخ پذیرش: 14/11/91 

چکیده 

روتیفر آب شیرین Brachionus calyciflorus یکی از مهمترین گونه­های زئوپلانکتونی می­باشد که درآبزی پروری، زنجیره غذایی اکوسیستم­های آبی و پایش­های محیطی دارای اهمیت می­باشد. نیکل یکی از آلاینده­های محیطی پایدار در محیط بوده که از لحاظ شیمیایی، قابلیت شکستن به ترکیبات دیگر را ندارد و به کندی از محیط حذف می­شود. در این تحقیق سطح پاسخ جمعیت روتیفر B. calyciflorus نسبت به شش غلظت مختلف از نیکل (0،025/0، 05/0، 1/0، 2/0 و 4/0 میلیگرم در لیتر) با سه تکرار به ازای هر غلظت طی مدت 8 روز مورد بررسی قرار گرفت. تراکم و نرخ رشد ویژه روتیفرها به طور روزانه در گروه شاهد و تیمارهای حاوی فلز نیکل محاسبه شد. نتایج نشان داد که رشد جمعیت روتیفرها با افزایش غلظت نیکل در محیط کشت به طور معنی­داری (05/0>P) کاهش یافت. بیشترین تراکم (05/0±15/49 فرد در میلی­لیتر) در روز هشتم  مربوط به تیمار شاهد و کمترین تراکم (0±67/1فرد در میلی­لیتر) مربوط به تیمار حاوی غلظت 4/0 میلیگرم در لیتر فلز نیکل بدست آمد. همچنین نرخ رشد ویژه روتیفرها با افزایش غلظت این فلز به طور معنی­داری (05/0>P) کاهش یافت و از 56/0 در تیمار شاهد به 07/0 در غلظت 4/0 میلیگرم در لیتر فلز نیکل رسید. نتایج این تحقیق نشان داد که روتیفر B. calyciflorus نسبت به فلز نیکل به شدت حساس می­باشد.

واژه های کلیدی: روتیفر Brachionus calyciflorus، نیکل، نرخ رشد ویژه، تراکم جمعیت.

* نویسنده مسئول، تلفن: 05422251521، پست الکترونیکی: mgmostafaghaffari@gmail.com

مقدمه

روتیفرها غذای زنده با ارزشی برای پرورش مرحله لاروی اکثر گونه­های ماهیان می­باشند. چندین مشخصه روتیفرها از قبیل: اندازه بسیار کوچک، معلق ماندن در ستون آب، محتوای بالای مواد مغذی و حرکت نسبتاً آهسته موجب شده شکار بسیار مناسبی برای لاروهای فعال باشند (9). این موجودات میکروسکوپی یکی از موجودات پلانکتونی اصلی در زیست ­بوم­های آب شیرین هستند (32). روتیفرها بویژه Brachionus. calyciflorus و Brachionus patulus از جمله موجودات پلانکتونی هستند که به طور قابل توجهی بمنظور ارزیابی سمیت در محیط­های آبی مورد استفاده قرار می­گیرند (33). در سال­های اخیر، تمایل به استفاده از روتیفرها بعنوان موجودات زیست سنج در مطالعات سم شناسی محیطی از قبیل: مطالعات ساختار جمعیت، مطالعات رفتاری، روابط شکار و شکارچی، الگوهای رشد جمعیت و غیره بطور قابل ملاحظه­ای افزایش یافته است (20، 21، 24، 25). فلزات سنگین از جمله مهمترین آلاینده­های محیطی هستند که حضور آن­ها در محیط تا حدودی بواسطه فرایند­های طبیعی و بمیزان زیادی بواسطه فاضلاب­های صنعتی می­باشند (11). پلانکتون­ها بواسطه انباشتگی زیستی، موجب افزایش مواد آلاینده در زنجیره غذایی موجودات آبزی می­شوند (15) و بدین طریق غذا به شکل پلانکتونی منبع مهمی برای انباشتگی فلزات سنگین در بدن ماهیان می­باشد (16). فلز نیکل از جمله فلزات سنگینی است که بطور وسیعی در صنایع مختلف از قبیل: استخراج معادن (معدن کاری)، صنایع آب­کاری فلزات، و صنایع آلیاژی مورد استفاده قرار می­گیرد. ترکیبات این فلز یکی از آلاینده­های پایدار محیطی بوده که برخلاف آلاینده­های سمی آلی، از لحاظ شیمیایی قابلیت شکستن به ترکیبات دیگر را ندارد و به کندی از محیط حذف می­شود. بنابراین یک مشکل محیطی جدی در سطح جهانی محسوب می­شود (31). منابع آبی منطقه چاه­نیمه­های سیستان (سه آبگیر طبیعی بزرگ و یک آبگیر مصنوعی) بواسطه حضور گونه­های منحصر به فرد موجودات آبزی از جمله ماهی سفیدک سیستان (Schizothorax zarudnyi) (4) از اهمیت بالایی برخوردار است. از طرف دیگر، در رابطه با اثر فلز نیکل بر روتیفرها اطلاعاتی در دست نیست. در این راستا، با توجه به اهمیت روتیفرها در تغذیه لارو ماهیان و مشاهده آلودگی نیکل در منابع آبی منطقه چاهنیمه­های سیستان ، در مطالعه حاضر اثرات سمی نیکل بر تراکم و نرخ رشد جمعیت روتیفر آب شیرین B. calyciflorus جدا شده از منابع آبی چاه­نیمه­های سیستان مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روشها

مواد مورد نیاز: 1- فرمالین، 2- آب مقطر، 3- محلول لوگل، 4- اتانول 96%، 5- اسید هیدروکلریک 01/0 نرمال، 6- مواد شیمیایی NaHCo₃، KCl، MgSo₄ و CaSo₄.5H₂O جهت تهیه محیط کشت روتیفر، 8- کلرید نیکل 9- مواد مورد نیاز جهت تهیه محیط کشت زاندر (Z-8±N) که شامل:

HCl، FeCl₃.6H₂O، Na₂Co₃، KH₂Po₄، MgSo₄.7H₂O، Ca(No₃)₂.9H₂O، NaNo₃، KBr، (NH₄)₆ Mo₇O₂₇.4H₂O، MnCl₂.4H₂O، H₃Bo₃، Na₂So₃.9H₂O، EDTA.Na، LiCl.H₂O، Al₂So₄.18H₂O، CuSo₄.5H₂O، Co(No₃)₂.6H₂O، KI، ZnSo₄.7H₂O

کشت جلبک کلرلا ولگاریس: جلبک خالص کلرلا ولگاریس از پژوهشکده آبزی پروری آب­های داخلی انزلی تهیه و تحت شرایط استریل در محیط کشت زایندر (Z-8±N)(8، 13) در دمای 1±25 درجه سانتیگراد، نور 300±3500 لوکس و دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی به صورت نیمه انبوه کشت داده شد. 

نمونه برداری: بمنظور دستیابی به تعداد کافی از روتیفر آب شیرین B. calyciflorus مورد نیاز جهت کشت در آزمایشگاه، در اواخر فروردین سال 1390 از منابع آبی چاه­نیمه­های سیستان نمونه برداری صورت گرفت. جهت نمونه برداری از تور پلانکتونی 50 میکرونی استفاده شد. نمونه­های آب در ظروف شیشه­ای 5/0 تا 1 لیتری جمع آوری و بلافاصله به آزمایشگاه منتقل گردید.

جداسازی و کشت روتیفر: با توجه به این که نمونه­های آب، حاوی گونه­های متعددی از موجودات آبزی مختلف از جمله دافنی، کپه پود، کلادوسر و روتیفر بودند، لذا بمنظور جداسازی گونه روتیفر مورد نظر ، پس از هم زدن نمونه ها، 1 تا 2 میلی­لیتر از نمونه آب در پتری دیش با استفاده از استریومیکروسکوپ با بزرگنمایی X10 مشاهده و مطابق با کلید شناسایی (18)، گونه B. calyciflorus شناسایی و جداسازی گردید. پس از آماده سازی اتاقک کشت روتیفر (نصب لامپ، پمپ هواده، ظروف مورد نیاز و میز کار) و استریل نمودن محیط آزمایشگاه با استفاده از اشعه فرابنفش (UV) و اتانول °96، بمنظور دست یابی به تراکم مورد نیاز (50 فرد در هر میلی­لیتر) جهت انجام آزمایش­های مربوط به سمیت نیکل، روتیفر جداسازی شده در آزمایشگاه در شرایط مطلوب (که در ادامه ذکر شده اند)، کشت داده شد. درجه حرارت محیط آزمایشگاه در طول مدت آزمایش c˚1± 25 (21، 30) و 5/7= pH (21) ثابت نگه داشته شد. جهت کشت روتیفر از محیط کشت نیمه سخت EPA (1) و جهت تغذیه روتیفرها در طی دوره آزمایش، از جلبک سبز تک سلولی کلرلای آب شیرین (Chlorella vulgaris) با تراکم cells/ml 10⁶×5/1- 1 استفاده گردید. کشت خالص روتیفر به عنوان استوک جهت انجام آزمایش استفاده گردید و برای تأمین تعداد مورد نیاز روتیفر در طول مدت آزمایش، کشت روتیفر به طور پیوسته تا پایان آزمایش ادامه پیدا کرد.

تیماردهی روتیفرها با فلز سنگین نیکل: جهت انجام آزمایش، روتیفرها (150 عدد) با 5 غلظت مختلف از فلز نیکل (025/0، 05/0، 1/0، 2/0 و 4/0 میلی­گرم در لیتر) تیمار شدند. جهت تیماردهی، مقدار مورد نیاز از ترکیب شیمیایی کلرید نیکل با استفاده از ترازوی حساس توزین و به محیط کشت EPA پایه (غلظت یک گرم بر لیتر کلرید نیکل) با غلظت مشخص در 10 عدد لوله­ی آزمایش 50 میلی لیتری مخصوص کشت روتیفر اضافه گردید. سپس جلبک و روتیفر (10 عدد روتیفر ماده نوزاد با سن تقریبی 2 ساعت در هر لوله آزمایش) به این لوله­های آزمایش حاوی محیط کشت روتیفر معرفی گردید. غلظت­های انتخابی بر اساس استاندارد فلز سنگین نیکل جهت اهداف شیلاتی (14) و همچنین غلظت کشنده این فلز برای روتیفر آب شیرین B.calyciflorus (33) انتخاب گردیدند. برای فلز نیکل 5 غلظت (تیمار)، به ازای هر تیمار 3 تکرار و یک تیمار عاری از فلز سنگین با سه تکرار به عنوان شاهد در نظر گرفته شد و در مجموع گروه­های آزمایشی شامل 6 تیمار و 18 تکرار (نمونه) آماده شدند. به طور روزانه پس از بررسی نمونه­ها و ثبت شاخص­های مربوط به رشد و تولید مثل، محیط کشت روتیفرها در همه نمونه­ها با محیط کشت جدید (تازه تهیه شده) تعویض می شد (21، 29). جهت تغذیه روتیفرها جلبک کلرلای آب شیرین با تراکم 10⁶×5/1-1 سلول در هر میلی­لیتر به هر کدام از لوله­های آزمایش اضافه گردید. بمنظور تعویض محیط کشت، محتوی لوله­های آزمایش با استفاده از توری پلانکتونی 50 میکرونی فیلتر شده و با استفاده از محیط کشت از قبل آماده شده ، به لوله­های جدید منتقل شدند. جهت تعیین تراکم جلبکی از لام نئوبار و میکروسکوپ معمولی دو چشمی و جهت شمارش روتیفرها از لام بوگاروف و استریومیکروسکوپ استفاده شد. بطور روزانه شاخص­های مربوط به رشد روتیفر (تراکم و نرخ رشد ویژه) در همه تیمارها بررسی و نتایج ثبت گردید. تا روز سوم پس از شروع آزمایش، به دلیل پایین بودن تراکم روتیفرها و به منظور کاهش خطای آزمایش، تمام حجم نمونه­ها بررسی و از روز سوم تا پایان آزمایش، از هر کدام از لوله­ها پس از همگن سازی، 3 نمونه یک میلی­لیتری بررسی می شد.

محاسبه نرخ رشد جمعیت روتیفرها در تیمارهای مختلف: بمنظور بررسی اثر غلظت­های مختلف نیکل بر رشد ویژه و تراکم روتیفر، پس از تیماردهی روتیفرها با غلظت­های متفاوت فلز سنگین و ثبت داده­های خام، نرخ رشد جمعیت روتیفرها در هر روز برای هر یک از تیمارها با استفاده از فرمول زیر محاسبه گردید (7).

(ln N_t – ln N₀)/t  r =

در این فرمول، r نرخ رشد جمعیت روتیفرها بر حسب روز، N₀ و N_t به ترتیب تراکم اولیه و نهایی روتیفرها در هر تیمار و t تعداد روزهای آزمایش می باشد.

آنالیز آماری: پس از ثبت داده­ها، ابتدا از آزمون لون و کولموگروف- اسمیرنوف، نرمال بودن داده­ها بررسی شد و برای مقایسه کلی بین تیمارها از آزمون تجزیه واریانس یکطرفه (one way ANOVA) و برای مقایسه میانگین بین تیمارها و بررسی روند معنی­داری از آزمون دانکن تحت نرم افزار SPSS (نسخه 19) استفاده شد. همچنین جهت رسم نمودارها از نرم افزار Excel استفاده شد.

نتایج

میانگین تراکم روتیفرهای تیماردهی شده با غلظت­های مختلف فلز سنگین نیکل در روزهای مختلف در جدول 1 نشان داده شده است.

نتایج نشان داد که با افزایش غلظت این فلز تراکم روتیفرها بطور معنی­داری (05/0>P) کاهش می یابد. بطوری که در همۀ روزهای آزمایش (از روز دوم تا هشتم) بین تیمار شاهد و تیمارهای آزمایش اختلاف معنی­داری (05/0>P) مشاهده شد. بیشترین تراکم در روز هشتم (05/0±15/49) مربوط به تیمار شاهد و کمترین تراکم (0±67/1) مربوط به تیمار پنجم بود.

شکل­های 1- الف تا 1- ج روند تغییر تراکم روتیفرها در غلظت­های مورد آزمایش نیکل طی روزهای اول تا هشتم را نشان می­دهد. بطوری که در تیمار شاهد و تیمارهای اول و دوم از روز اول تا روز پنجم تراکم روتیفرها افزایش و از روز پنجم تا روز ششم کاهش نشان داد. همچنین در تیمار شاهد از روز ششم تا روز هشتم روند افزایشی مشاهده شد. تراکم روتیفرها در تیمار سوم از روز اول تا چهارم روند افزایشی و از روز چهارم تا هشتم روند کاهشی داشت. در تیمار چهارم، تراکم روتیفرها از روز اول تا چهارم کاهش و از روز چهارم تا روز هشتم با روند نامنظمی کاهش یافت.

شکل1- تراکم روتیفرها (بر حسب تعداد در میلی لیتر) در غلظت­های مختلف فلز سنگین نیکل در روزهای مختلف.

روزهای دوم و ششم، بین تراکم روتیفرها در تیمارهای چهارم و پنجم و در روز چهارم آزمایش بین تیمارهای دوم و سوم اختلاف معنی­داری (05/0>P) مشاهده نشد. در روزهای سوم، پنجم، هفتم و هشتم، بین تراکم روتیفرها در تیمار شاهد و تیمارهای آزمایش و همچنین بین تیمارهای مختلف آزمایش با یکدیگر اختلاف معنی­داری (05/0>P) مشاهده شد.  

همچنین نتایج مشخص نمود که با افزایش غلظت فلز نیکل، نرخ رشد ویژۀ جمعیت روتیفرها کاهش می یابد و از 56/0 در تیمار شاهد به 07/0 در غلظت 4/0 میلیگرم در لیتر فلز نیکل می رسد (شکل 2).

شکل 2- نرخ رشد ویژۀ جمعیت روتیفرها (به ازای روز) در غلظت­های مختلف فلز سنگین نیکل(Ni). حروف مشابه روی نمودار در هر روز، نشان دهنده عدم وجود اختلاف معنی­دار می­باشد (05/0>P ).