نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان

چکیده

بیهوش‌کننده‌ها در آبزی‌پروری عمدتاً به‌منظور کاهش استرس و جلوگیری از آسیب ماهیان طی دستکاری استفاده می‌شود. بررسی حاضر اولین مطالعه در زمینه اثر امولسیون اسانس نعناع و متیل‌سالیسیلات (CMSE) بر بیهوشی ماهی سفید با میانگین وزنی 25/0±35/3 گرم در ایران می‌باشد. ماهیان در معرض غلظت‌های 197، 263 و 395 میکرولیتر در لیتر CMSE قرار گرفتند. در طول آزمایش دمای آب 20 درجه سانتیگراد و pH آن 1/8 بود. نتایج نشان داد که زمان القاء بیهوشی با افزایش غلظت CMSE به‌طور معنی‌داری کاهش یافت (05/0>P). در زنش سرپوش آبششی و زمان برگشت از بیهوشی بین تیمارهای مختلف تفاوت معنی‌داری وجود نداشت (05/0

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Effect of Spearmint (/-Carvon) Oil and Methyl Salicylate Oil Emulsion on Anesthesia of Rutilus frisii kutum

نویسندگان [English]

  • zahra roohi
  • mahsa javadi

چکیده [English]

Anesthetics are used with increasing frequency in aquaculture, mainly to reduce the stress and to prevent mechanical damage to fish during handling. Present study is the first study on the effect of spearmint (/-carvone) and methyl salicylate oil emulsion (CMSE) on anesthesia of Rutilus frisii kutum with average body weights 3.35±0.25 g in Iran. The water temperature was 20 ˚C and pH was 8.1 during the investigation. Fish were exposed to the concentrations of 197, 263 and 395 µl/L of CMSE. Results showed that induction time decreased significantly with increasing of the concentration of CMSE (P0.05). Opercular rate firstly increased and then slowly decreased with increasing the concentration of anesthetic. Also, no mortality was observed in the study. The results of this study show that applications of spearmint and methyl salicylate oil emulsion in 263 µl/L level, can be suitable for anesthetization of Rutilus frisii kutum.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Anesthesia
  • Induction time
  • Spearmint
  • Rutilus frisii kutum

اثر امولسیون اسانس نعناع (کاروون) و متیل­سالیسیلات بر بیهوشی ماهی سفید
(
Rutilus frisii kutum)

زهرا روحی*، محمدرضا ایمان­پور و بی­بی مهسا جوادی موسوی

گرگان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، دانشکده شیلات و محیط زیست، گروه شیلات

تاریخ دریافت: 25/8/92                تاریخ پذیرش: 11/12/92

چکیده

بیهوش­کننده­ها در آبزی­پروری عمدتاً به­منظور کاهش استرس و جلوگیری از آسیب ماهیان طی دستکاری استفاده می­شود. بررسی حاضر اولین مطالعه در زمینه اثر امولسیون اسانس نعناع (کاروون) و متیل­سالیسیلات (ECMS) بر بیهوشی ماهی سفید با میانگین وزنی 25/0±35/3 گرم در ایران می­باشد. ماهیان در معرض غلظت­های 197، 263 و 395 میکرولیتر در لیتر ECMS قرار گرفتند. در طول آزمایش دمای آب 20 درجه سانتی­گراد و pH آن 1/8 بود. نتایج نشان داد که زمان القاء بیهوشی با افزایش غلظت ECMS به­طور معنی­داری کاهش یافت (05/0>P). در زنش سرپوش آبششی و زمان برگشت از بیهوشی بین تیمارهای مختلف تفاوت معنی­داری وجود نداشت (05/0

واژه های کلیدی: بیهوشی، زمان القاء، نعناع، ماهی سفید

* نویسنده مسئول، تلفن:  09106071079 ، پست الکترونیکی: roohi26_iut@yahoo.com

مقدمه

 

ماهیان در شرایط پرورشی اغلب در معرض عوامل استرس­زا مانند دستکاری، وزن­کشی، خون­گیری، تکثیر مصنوعی، حمل و نقل و جراحی قرار می­گیرند (27). استرس موجب مجموعه­ای از پاسخ­های فیزیولوژیکی می شود (11، 19، 21، 22)، که به شدت می­تواند رشد، تولید مثل، عملکردهای ایمنی و میزان بازماندگی را تحت تأثیر قرار دهد (13، 37). داروهای بیهوش­کننده برای کاهش یا به حداقل رساندن استرس در ماهیان مؤثر شناخته شده­اند (16، 31، 32). با این­حال، این عوامل می­توانند اثرات جانبی داشته باشند که باید با احتیاط مصرف شوند (38). معیارهای اساسی که برای ارزیابی بیهوش­کننده مطلوب در آبزی­پروی در نظر گرفته می­شود عبارتند از: بی­خطر بودن برای انسان، ماهی و محیط زیست، ارزان باشد، در دسترس و برگرفته از طبیعت باشد (14، 25، 30).

استفاده از بیهوش­کننده­ها در آبزی­پروری و مدیریت آن، کاهش استرس و کاهش تأثیر بر رفتار و فرآیندهای فیزیولوژی ماهی را به­همراه دارد (1). طی سالیان گذشته به­منظور به حداقل رساندن اثرات استرس در ماهی، مطالعاتی جهت استفاده از محصولات طبیعی با خواص بی­حس­کنندگی صورت گرفته است (33)، که از مهم­ترین آن­ها می­توان به­ اسانس میخک، به­لیمو و رزماری اشاره کرد (20، 23، 24، 29، 35، 36). گیاهان دارویی به­علّت دارا بودن مواد مؤثره گوناگون می­توانند در درمان بسیاری از بیماری­ها و علائم آن­ها مثل درد، مورد استفاده قرار گیرند (6).  

نعناع خوراکی (Mentha spicata) متعلق به خانواده لامیاسه (Lamiaceae) با سرشاخه­های معطر است که مصارف صنعتی و دارویی فراوانی دارد (3، 7). در ایران در اکثر مناطق این گیاه را می­توان کشت کرد (8). از اسانس این گیاه در زمینه تهیه داروهای مسکن در درمان تب، سردرد و غیره و در صنایع غذایی به عنوان طعم­دهنده غذاها و شیرینی­جات استفاده می­شود (2). کاروون ترکیبی از اسانس نعناع است که باعث طعم و عطر آن می­شود (8). اثر بی­حس­کنندگی کاروون روی سیستم عصبی مرکزی و محیطی شامل اثرات ضد درد، آرام بخش و ضد تشنج است (17).

اسانس کاج حاوی ماده خالص متیل­سالیسیلات است که در ساخت پمادهای مسکن درد استفاده می­شود. متیل­سالیسیلات را می­توان با استری کردن سالیسیلیک اسید با متانول سنتز کرد. خواص دارویی آن شامل اثرات ضد درد، ضد التهابی، مهار تجمعی پلاکت و سمیت است (17).

اگرچه نعناع و متیل­سالیسیلات به­طورجداگانه نیز داری اثر بیهوش­کنندگی هستند با این­حال، ترکیب آن­ها اثر بیهوشی­کنندگی با دوز پایین­تر، القاء سریعتر و برگشت از بیهوشی سریع­تر دارد (17). لذا هدف از این مطالعه بررسی اثر بیهوشی امولسیون اسانس نعناع و متیل­سالیسیلات و تعیین غلظت مؤثر آن در ماهی سفید است.

مواد و روشها

تهیّه ماهی: این پژوهش در تابستان 1392 در مرکز تحقیقات آبزی­پروری شهید فضلی برآبادی دانشگاه علوم‌‌کشاورزی و منابع­طبیعی گرگان انجام شد. در این مطالعه، ماهی سفید (با میانگین وزنی 25/0±35/3 گرم و میانگین طول کل 2/0±61/7 سانتی­متر) از کارگاه تکثیر و پرورش سیجوال در استان گلستان تهیه و به مدت دو هفته عمل سازگارشدن انجام شد. 

تهیه امولسیون بیهوشی: امولسیون اسانس نعناع و متیل­سالیسیلات (ECMS) از 4/28% کاروون، 4% متیل­سالیسیلات، به­عنوان اجزاء گیاهی و 25% گلیسیرین و 5% پلی­سوربات 80% به عنوان ماده امولسیون­کننده در یک محلول آبی تشکیل شده است. اسانس نعناع از شرکت داروسازی گیاه اسانس (گرگان، ایران)، متیل­سالیسیلات، گلیسیرین و پلی­سوربات 80 از شرکت دانش صنعت پژوهش خزر (گرگان، ایران) تهیّه گردید. مواد تشکیل دهنده با هم ترکیب و با دستگاه همگن­کننده به مدت سه دقیقه با سرعت 8000 دور در دقیقه مخلوط شدند تا مایع سفید درخشان شکل گرفت.

برای تعیین غلظت مناسب امولسیون بیهوشی از هجده قطعه ماهی سفید (با میانگین وزنی 25/0±35/3 گرم و میانگین طول کل 2/0±61/7 سانتی­متر) استفاده شد که به طور تصادفی به سه گروه شش­تای تقسیم شدند. براساس مطالعات گذشته، غلظت­های مورد نظر برای انجام آزمایش عبارت بود از 197، 263 و 395 میکرولیتر در لیتر که به آبی با دمای 20 درجه سانتی­گراد و pH در حدود 1/8 اضافه گردید. در این آزمایش، مدت زمان القاء بیهوشی، مدت زمان بازگشت از بیهوشی، زنش سرپوش آبششی در زمان القاء بیهوشی و در زمان بازگشت از بیهوشی محاسبه گردید. تجزیه وتحلیل داده­ها به روش آنالیز واریانس یک­طرفه و آزمون دانکن جهت مقایسه میانگین­ها انجام شد. اختلاف بین میانگین­ها در تیمارهای مختلف با سطح اطمینان 05/0P< تعیین گردید. برای عملیات آماری از نرم­افزار 16 SPSS استفاده شد.

نتایج 

میانگین زیست سنجی ماهیان مورد آزمون مطابق جدول 1 می­باشد.

نتایج تحقیق حاضر نشان داد که میانگین زمان ایجاد بیهوشی در بین غلظت­های مختلف امولسیون اسانس نعناع و متیل­سالیسیلات تفاوت معنی­داری وجود دارد (05/0>P). به­طوری­که، بیهوشی با غلظت 395 میکرولیتر در لیتر در مقایسه با غلظت­های دیگر سریع­تر ایجاد شد (شکل 1). بین متوسط زمان برگشت از بیهوشی در غلطت­های مختلف تفاوت معناداری مشاهده نشد (05/0

 

 

جدول 1- میانگین زیست سنجی ماهی سفید بیهوش­شده با غلظت­های مختلف ECMS

غلظت ECMS (µl/L)

وزن (گرم)

طول کل (سانتی­متر)

197 (6=n)

a22/0±517/3

a306/0±56/7

263 (6=n)

a072/0±3/3

a115/0±66/7

395 (6=n)

a345/0±223/3

a2/0±6/7

تذکر: حروف مشابه در هر ردیف نشان­دهنده عدم اختلاف معنی­دار در سطح 05/0>P

 

شکل 1- میانگین زمان بیهوشی و برگشت از بیهوشی در ماهی سفید بیهوش شده با ECMS

حروف غیرمشابه بیانگر وجود اختلاف معنی­دار و حروف مشابه بیانگر عدم وجود اختلاف معنی­دار می­باشد (05/0>P)


بحث و نتیجه­گیری

در آبزی­پروری مدرن، ماهیان اغلب در معرض عوامل مختلف استرس­زا مانند دستکاری، تکثیر مصنوعی و حمل و نقل قرار می­گیرند که اثر منفی بر عملکرد رشد و بقاء ماهی دارد (9، 21). یکی از روش­های متداول برای کاهش پاسخ استرس و مرگ و میر ماهیان طی دستکاری، استفاده از بیهوش­کننده­ها است (11، 12، 18). بیهوشی مجموعه­ای از حالات بی­حسی، خواب­آلودگی، بی­دردی و شلی اسکلتی و عضلانی است. روش القاء بیهوش­کننده­های ماهی شامل غوطه­وری، تزریق وریدی، عضلانی و یا داخل صفاقی و بلع از راه دهان است (17). متداول­ترین روش از طریق استنشاق است که داروی بیهوشی در آب پراکنده شده و توسط آبشش­ها جذب می­شود (28). فاکتورهای متعددی مانند گونه­ماهی، اندازه­ی بدن و کیفیت آب (مانند سختی، دما و شوری) بر عملکرد بیهوش­کننده­ها اثر می گذارد (15، 34).

 

 

شکل 2- متوسط سرعت زنش سرپوش آبشش در ماهی سفید بیهوش شده با ECMS

حروف غیر مشابه بیانگر وجود اختلاف معنی­دار و حروف مشابه بیانگر عدم وجود اختلاف معنی­دار می­باشد (05/0>P)


تحقیق حاضر نشان داد که امولسیون اسانس نعناع و متیل­سالیسیلات می­تواند بدون مشاهده تلفات و با موفقیت باعث بیهوشی ماهی شود. نتایج آنالیز آماری در مورد زمان بیهوشی بین تیمارهای مختلف دارای اختلاف معنی­دار است، به­طوری که هرچه مقدار دوز دارو بیشتر باشد مدت زمان رسیدن به مرحله 4 بیهوشی کمتر می­شود. این نتایج در مورد سایر بیهوش­کننده­ها مانند گل میخک، تنباکو، بی­کربنات سدیم و اسانس آویشن نیز گزارش شده است (4، 5، 10). بنابراین، زمان ایجاد بیهوشی با غلظت امولسیون بیهوشی رابطه مستقیم دارد که با مطالعه جواهری و همکاران (2012) بر ماهی سفید بیهوش­شده با اسانس میخک مطابقت دارد.

شکل 2 تغییرات سرعت زنش سرپوش آبشش ماهی سفید را طی القاء بیهوشی و طی برگشت از بیهوشی نشان می­دهد. در ابتدا زنش سرپوش با افزایش غلظت بیهوش­کننده افزایش و سپس کاهش می­یابد. سرعت زنش سرپوش آبشش طی بیهوشی و طی برگشت از بیهوشی در بین تیمارهای مختلف تفاوت معنی­داری نداشت. با این حال، بیشترین سرعت زنش سرپوش طی القاء بیهوشی و برگشت از بیهوشی مربوط به تیمار 263 میکرولیتر در لیتر بود. گونه­های مختلف ماهیان سرعت زنش سرپوش آبششی متفاوتی دارند که می­تواند میزان جذب داروی بیهوش­کننده و القاء بیهوشی را نشان دهد. طبق نتایج بدست آمده از این مطالعه، تیمار 263 میکرولیتر در لیتر برای بیهوشی مناسب تشخیص داده می­شود. در مطالعه دنیر و همکاران (2011) بر اثر امولسیون اسانس نعناع و متیل­سالیسیلات در بیهوشی آزاد ماهی اطلس با میانگین وزنی 26±117 گرم، غلظت 789 میکرولیتر در لیتر مناسب تشخیص داده شد.

با توجه به اینکه پس از انجام آزمایش تلفات یا رفتارهای غیرطبیعی در ماهی­ها طی دو هفته تحت نظر گرفتن آن­ها مشاهده نگردید، به نظر می­رسد که امولسیون اسانس نعناع (کاروون) و متیل­سالیسیلات (ECMS) اثرات منفی بر فیزیولوژی یا رفتار ماهی ندارد و از آنجایی که یک ترکیب گیاهی است انتظار می­رود که به آسانی در محیط تجزیه شود و اثرات سوء زیست­محیطی نیز نداشته باشد. با توجه به نتایج این تحقیق می­توان گفت که امولسیون اسانس نعناع و متیل­سالیسیلات می­تواند در کنار سایر بیهوش­کننده­ها به عنوان یک داروی بیهوشی مؤثر و مطلوب مد نظر قرار داد.

تشکر و قدردانی

بدین وسیله از سرکار خانم دکتر سارا خراسانی­نژاد و آقای دکتر خدایار همتی، اعضای محترم هیئت علمی دانشکده علوم باغبانی و سرکار خانم مهندس معصومه کمالی از دانشکده شیلات و محیط­زیست دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، نهایت تشکر و قدردانی بعمل می­آید.

  1. ابطحی، ب.، شریف­پور، ع.، آقاجانپور، م.، رسولی، ع.، فقیه­زاده، س.، امیدبیگی، ر. و محمدنظری، ر. 1381. مقایسه LC50 اسانس گل میخک و MS222 در بچه­ماهیان تاسماهی ایرانی، قزل­آلای رنگین­کمان و کپورمعمولی. مجله شیلات ایران. سال یازدهم، شماره 3، صفحه 12-1.  
  2. زارع ده­آبادی، س. و اسرار، ز. 1388. بررسی اثر مقدار اضافی عنصر روی (Zinc) بر القای تنش اکسیداتیو و تجمع برخی عناصر در گیاه نعناع سبز (Mentha spicata). مجله زیست شناسی ایران. جلد 22، شماره 2، صفحه 218-228.      
  3. زارع ده­آبادی، س. و اسرار، ز. 1387. اثر مقدار اضافی عنصر روی بر میزان تجمع عناصر ضروری و پاسخ­های آنتی­اکسیدانی گیاه دارویی نعناع سبز (Mentha spicata). فصلنامه علمی- پژوهشی تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران. جلد 24، شماره 4، صفحه 530-540.       
  4. شریف روحانی، م.، حقیقی، م.، عصائیان، ح. و لشتوآقایی، غ. 1386. بررسی اثر بیهوشی اسانس آویش شیرازی بر ماهی آزاد دریای خزر (Salmo trutta caspius) و ماهی قزل­آلای­رنگین­کمان پرورشی (Oncorhynchus mykiss). مجله علمی شیلات ایران. سال شانزدهم، شماره 4، صفحه 106-99.
  5. ضرغام، د.، شریف­روحانی، م.، فلاحت ناصر آباد، ع. و باشتی، ط. 1391. بررسی اثر بیهوش­کنندگی عصاره­های آبی و الکلی تنباکو (Nicotiana tabacum) بر ماهی قزل­آلای ­رنگین­کمان (Oncorhynchus mykiss). مجله شیلات ایران. سال بیست و یکم، شماره 4، صفحه 40-33.  
  6. فاضلی، ن. 1383. تأثیر سوپرمینت (اسانس نعناع) بر شدت درد پس از سزارین. مجله دانشگاه علوم پزشکی بابل. سال هفتم، شماره 1، صفحه 33-28.   
  7. کامکار، ا.، اسدی، ف.، جبلی جوان، ا. و جمشیدی، ر. 1388. ارزیابی ظرفیت آنتی­اکسیدانی اسانس و عصاره نعناع ایرانی. مجله دامپزشکی و آزمایشگاه. دوره 1،شماره 1، صفحه 72-64.       
  8. نورالدینی، م.، نورالدین، م.، سلامی، م.، مصداقی­نیا، ا.، وردی، ج. و سلیمیان، م. 1385. بررسی اثرات ضد دردی عرق نعناع در موش صحرایی نر. فصلنامه علمی- پژوهشی فیض. دوره دهم، شماره 4، صفحه 23-19.    
    1. Akar, A.M.A. 2011. Effects of clove oil on the response of blue tilapia (Oreochromis aureus) by transportation stress. Journal of the Arabian Aquaculture Society, 6(1): 77-86. 
    2. Altun, T., Bilgin, R. and Danabas, D. 2009. Effects of sodium bicarbonate on anaesthesia of common carp (Cyprinus carpio) juveniles. Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 9: 29-31.       
    3. Barton, A.B. 2002. Stress in fishes: Adversity of responses with particular reference to changes in circulating corticosteroids. Integrative and Comparative Biology 42: 517-525.
    4. Bressler, K. and Ron, B. 2004. Effect of anesthetics on stress and the innate immune systemof gilthead sea bream (Sparus aurata). The Israeli Journal of Aquaculture – Bamidgeh, 56: 5–13.
    5. Carmichael, G.J. 1984. Long distance truck transport of intensively reared largemouth bass. Progressive Fish-Culturist 46: 111-115.
    6. Cho, G.K. and Heath, D.D. 2000. Comparison of tricaine methanesulphonate (MS-222) and clove oil anaesthesia effects on the physiology of juvenile chinook salmon )Oncorhynchus tshawytscha(. Aquaculture Research, 31: 537–546.
    7. Coyle, S.D., Durrorow, R.M. and Tidwell, H.J. 2004. Effects of anaesthetics on the water parameters in a simulated transport experiment of platy fish (Xiphorus maculatus). Aquaculture Research, 26: 256-271. 
    8. Cunha, M.A., Silva, B.F., Delunardo, F.A.C., Benovite, S.C., Gomes, L.C., Heinzmann, B.M. and Baldisserotto, B. 2011. Anesthetic induction and recovery of Hippocampus reidi exposed to the essential oil of Lippia alba. Neotropical Ichthyology, 9(3): 683-688.  
    9. Danner, G.R., Muto, K.W., Zieba, A.M., Stillman, C.M., Seggio, J.A. and Ahmad, S.T. 2011. Spearmint (l-carvone) oil and wintergreen (methyl salicylate) oil emulsion is an immersion anesthetic of fishes. Journal of Fish and Wildlife Management, 2(2): 146-155.  
    10. Façanha, M.F. and Gomes, L.C. 2005. A eficácia do mentol como anestésico para tambaqui (Colossoma macropomum, Characiformes: Characidae). Acta Amazonica, 35: 71–75. 
    11. Feng, G., Liu, J., Zhuang, P., Zhang, L. and Duan, M. 2011. Anesthesia and recovery with clove oil in juvenile Siberian sturgeon (Acipenser baerii). Bioinformatics and Biomedical Engineering. 1-4. 
    12. Ghazilou, A. and Chenary, F. 2011. Evaluation of rosemary oil anesthesia in carp. Online Journal of Veterinary Research, 15(2): 112-118.  
    13. Gholipourkanani, H. and Ahadizadeh, S. 2013. Use of propofol as an anesthetic and its efficacy on some hematological values of ornamental fish Carassius auratus. SpringerPlus, 2: 76-80.  
    14. Gholipour Kanani, H., Mirzargar, S.S., Soltani, M., Ahmadi, M., Abrishamifar, A., Bahonar, A. and Yousefi, P. 2011. Anestthetic effect of tricaine methanesulfonate, clove oil and electroanesthesia on lysozyme activity of Oncorhynchus mykiss. Iranian Journal of Fisheries Sciences, 10(3): 393-402. 
    15. Gressler, L.T., Riffel, A.P.K., Parodi, T.V., Saccol, E.M.H., Koakoski, G., Costa, S.T., Pavanato, M.A., Heinzmann, B.M., Caron, B., Schmidt, D., Llesuy, S.F., Barcellos, L.J.G. and Baldisserotto, B. 2012. Silver catfish (Rhamdia quelen) immersion anaesthesia with essential oil of Aloysia triphylla (L’Hérit) Britton or tricaine methanesulfonate: effect on stress response and antioxidant status. Aquaculture Research, doi:10. 1111/are.12043.  
    16. Imanpoor, M.R., Bagheri, T. and Hedayati, S.A.A. 2010. The anesthetic effects of clove essence in persian strurgeon (Acipenser persicus). World Journal of Fish and Marine Sciences, 2(1): 29-36.
    17. Iversen, M., B. Finstad, B., McKinley, R.S. and Eliassen, R.A. 2003. The efficacy of metomidate, clove oil, Aqui-Sk and BenzoakR as anaesthetics in atlantic salmon (Salmo salar) smolts and their potential stress-reducing capacity. Aquaculture, 221: 549-566. 
    18. Javahery, S., Haji Moradlu, A. and Ghornani, R. 2012. Efficacy of clove oil as an anaesthetic for two size of Rutilus frisii kutum. Global Veterinaria, 9(3): 319-322.
    19. Kiessling, A., Johansson, D., Zahl, I.H. and Samuelsen, O.B. 2009. Pharmacokinetics, plasma cortisol and effectiveness of benzocaine, MS-222 and isoeugenol measured in individual dorsal aorta-cannulated atlantic salmon (Salmo salar) following bath administration. Aquaculture, 286: 301-308.   
    20. Mavadati, A.H. and Habibian, R. 2011. Comparison of effect of clove oil and 2-Phenoxyethanol on serum biochemical parameters in Oncorhynchus mykiss. World Journal of Fish and Marine Sciences, 3(4): 318-322.    
    21. Parodi, T.V., Cunha, M.A., Becker, A.G., Zeppenfeld, C.C., Martins, D.I., Koakoski, G., Barcellos, L.G., Heinzmann, B.M. and Baldisserotto, B. 2013. Anesthetic activity of the essential oil of Aloysia triphylla and effectiveness in reducing stress during transport of albino and gray strains of silver catfish (Rhamdia quelen). Fish Physiology and Biochemistry, doi: 10.1007/s10695-013-9845-z.
    22. Pirhonen, J. and Schreck, C.B. 2003. Effects of anaesthesia with MS-222, clove oil and CO2 on feed intake and plasma cortisol in steelhead trout (Oncorhynchus mukiss). Aquaculture, 220: 507-514. 
    23. Rotllant, J., Balm, P.H.M., Pérez-Sánchez, J., Bonga, S.E.W. and Tort, L. 2001. Pituitary and interrenal function in gilthead sea bream (Sparus aurata) after handling and confinement stress. General Comparative Endocrinology, 121: 333-342.
    24. Skjervold, P.O., Fjoera, S.V., Østby, P.B., Einem, O. 2001. Livechilling and crowding stress before slaughter of atlantic salmon (Salmo salar). Aquaculture, 192: 265-280.
    25. Toni, C., Becker, A.G., Simões, L.N., Pinherio, C.G., de Lima Silva, L., Heinzmann, B.M., Caron, B.O. and Baldisserotto, B. 2013. Fish anesthesia: effects of the essential oils of Hesperozygis ringens and Lippia alba on the biochemistry and physiology of silver catfish (Rhamdia quelen). Fish Physiology and Biochemistry, DOI: 10.1007/s10695-013-9877-4.
    26. Ucar, A. and Atamanalp, M. 2010. The effects of natural (clove oil) and synthetical (2-phenoxyethanol) anesthesia substances on hematology parameters of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and brown trout (Salmo troutta fario). Journal of Animal and Veterinary Advances, 9(14): 1925-1933. 
    27. Velisek, J., Svobodova, Z., Piackova, V., Groch, L. and Nepejchalova, L. 2005. effects of clove oil anaesthesia on common carp (Cyprinus carpio). Veterinary Medicine-Czech, 50: 269-275.
    28. Wagner, G.N., Singer, T.D. and McKinley, R.S. 2003. The ability of clove oil and MS-22 to minimize handling stress in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture Research, 34: 1139-1146.
    29. Wendelaar Bonga, S.E. 1997. The stress response in fish. Physiological Reviews, 77: 591–625. 
    30. Zahl, I.H., Samuelsen, O. and Kiessling, A. 2012. Anaesthesia of farmed fish: implications for welfare. Fish Physiology and Biochemistry, 38: 201–218.