نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه تهران

چکیده

پکتین ترکیبی پلی ساکاریدی پیچیده است که علاوه بر دارا بودن فواید غذایی، دارای اثرات ضد سرطانی نیز است. نیتریک اکساید (NO) مولکول سیگنالیگ فعال در بسیاری از فرآیند‌های فیزیولوژیک است که در سلول‌های توموری می‌تواند نقش آنتی آپوپتوتیک یا پروآپوپتوتیک داشته باشد. در این مطالعه، اثر AP (پکتین سیب) و MCP (پکتین تغییر یافته مرکبات) بر میزان ترشح NO و القای آپوپتوز در دودمان سلولی سرطان پروستات انسانی (LNCaP) مطالعه شده است. برای این منظور، سلول های LNCaP با دوزهای متفاوت AP و MCP در زمان های 6، 24 و 48 ساعت تیمار شدند و میزان آزاد شدن NO و مهار تکثیر سلولی توسط این مواد بررسی گردید. در ابتدا تیمار سلول‌های LNCaP با SNP به عنوان یک دهنده NO، نشان داد که NO در سلول‌های LNCaP نقش مهاری بر تکثیر سلول ها دارد. نتایج نشان می‌دهد که انکوباسیون 6 ساعت با دوزهای مختلف AP و MCP تغییری در سنتز و ترشح NO و میزان تکثیر سلولی ایجاد نمی‌کند. تیمار 24 و 48 ساعت موجب افزایش معنی دار ترشح NO و مهار تکثیر سلول ها در مقایسه با گروه کنترل گردید. بررسی چرخه سلولی در این سلول ها نشان داد که با افزایش غلظت پکتین تعداد سلول‌هایی که در مرحله Sub-G1 از چرخه سلولی هستند افزایش می یابد. این امر می-تواند نشان دهنده هدایت سلول‌ها به سمت آپوپتوز باشد. این نتایج به همراه افزایش ترشح NO نشان می‌دهد که مشتقات پکتینی استفاده شده در این تحقیق می‌توانند از مسیر رها سازی NO سبب القا آپوپتوز در سلول‌های LNCaP گردند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Effect of Pectin Substances on NO Release and Apoptosis Induction in Human Prostate Cancer cells LnCap

چکیده [English]

Pectin is a complex polysaccharide compound with food and anticancer properties. NO as a signaling molecule. It plays role in various physiological process. It may have pro or anti apoptotic role in cancer cells. In this research the effect of apple pectin (AP) and modified citrus pectin (MCP) on NO releasing and apoptosis induction of human prostate cancer cell, LnCap, is under investigated. The cells were treated with different concentration of AP and MCP for 6, 24 and 48h. The amount of NO and proliferatin inhibition were studied. At first SNP treatment indicated that NO has an inhibitory role in LnCap cells. The results showed that long term incubation of cells with AP and MCP caused significant changes in NO release and proliferation rate. Under this condition cell cycle arrested in Sub-G1 phase though apoptosis was occurred. Therefore, AP and MCP could induce apoptosis in LnCap cell via NO release.

کلیدواژه‌ها [English]

  • pectin
  • Nitric oxide
  • Apoptosis
  • Lncap cells

اثر مواد پکتینی بر القا رهاسازی نیتریک اکساید و مهار تکثیر سلولی در دودمان سلولی سرطان پروستات انسانی LNCaP 

فاطمه منصوری، حوری سپهری* و لادن دلفی

تهران، دانشگاه تهران، پردیس علوم، دانشکده زیست‌شناسی، گروه علوم جانوری

تاریخ دریافت: 28/1/94                تاریخ پذیرش: 1/8/94 

چکیده

پکتین یک ترکیب پلی­ساکاریدی پیچیده است که علاوه بر دارا بودن فواید غذایی، دارای اثرات ضد سرطانی نیز است. نیتریک اکساید (NO) یک مولکول فعال پیام‌رسان در بسیاری از فرآیند­های فیزیولوژیکی است که در سلول­های توموری می­تواند نقش آنتی­آپوپتوتیک یا پروآپوپتوتیک داشته باشد. در این مطالعه اثر AP (پکتین سیب) و MCP (پکتین تغییریافته مرکبات) بر میزان ترشح NO و القای آپوپتوز در دودمان سلولی سرطان پروستات انسانی (LNCaP) مطالعه شده است. برای این منظور سلولهای LNCaP با دوزهای متفاوت AP و MCP در زمان‌های 6، 24 و 48 ساعت تیمار شدند و سپس میزان آزاد شدن NO و مهار تکثیر سلولی توسط این مواد بررسی گردید. در ابتدا تیمار سلول­های LNCaP با SNP به‌عنوان یک دهنده NO، نشان داد که NO در سلول­های LNCaP نقش مهاری بر تکثیر سلول‌ها دارد. نتایج نشان می­دهد که انکوباسیون 6 ساعتی با دوزهای مختلف AP و MCP تغییری در سنتز و ترشح NO و میزان تکثیر سلولی ایجاد نمی­کند درحالیکه تیمار 24 و 48 ساعته موجب افزایش معنی‌دار ترشح NO و مهار تکثیر سلول‌ها در مقایسه با گروه کنترل می‌گردد. بررسی چرخه سلولی در این سلول‌ها نشان داد که با افزایش غلظت پکتین تعداد سلول­هایی که در مرحله Sub-G1 از چرخه سلولی هستند افزایش می‌یابد. این امر می­تواند نشان‌دهنده هدایت سلول­ها به سمت آپوپتوز باشد. این نتایج به همراه افزایش ترشح NO نشان می­دهد که مشتقات پکتینی استفاده‌شده در این تحقیق می­توانند از مسیر رهاسازی NO سبب القا آپوپتوز در سلول­های LNCaP گردند.

واژه­های کلیدی: پکتین، نیتریک اکساید، آپوپتوز، سلول­های LNCaP

* نویسنده مسئول، تلفن: 02161112626 ، پست الکترونیکی: hsepehri@khayam.ut.ac.ir

مقدمه


نتیریک اکساید (NO) یک پیام­بر فیزیولوژیک لیپوفیل با قابلیت انتشار بالا و نیمه‌عمر کوتاه است که بسیاری از پاسخ­های فیزیولوژیک نظیر کشیدگی عروق (Vascular tone)، تنفس سلولی، مهاجرت، ارتباطات سیناپسی، رگزایی، ایمنی و آپوپتوز را تنظیم می­کند (10،8و19). NO به‌وسیله آنزیمی به نام نیتریک اکساید سنتاز (NOS) از ال-آرژینین سنتز می­شود. سه ایزوفرم مختلف از NOS به نام­های eNOS (اپیتلیومی)، nNOS (نورونی) وiNOS (القایی) شناخته شده است که فعالیت eNOS و nNOS به‌شدت وابسته به غلظت کلسیم داخل سلولی است، در حالیکه iNOS در مقادیر طبیعی کلسیم نیز فعال می­شود (3، 5 و26). NO در فرآیندهای سرطانزایی نقش تنظیمی مهمی دارد اما شناسایی نقش دوگانه NO در پیشرفت و یا سرکوب سرطان دشوار است (11و33). اثر NO بر وقایع پیام‌رسانی سلول به‌شدت تحت تأثیر غلظت، نوع محیط و مدت‌زمان در معرض قرارگیری آن می­باشد (3 و 9). به‌طور کلی مقادیر پایین NO ضد آپوپتوزی بوده و رشد تومور را ترویج می­بخشند، درمقابل مقادیر بالای NO در طولانی مدت از رشد تومور جلوگیری می­کنند (9و8). عمدتاً NO طی واکنشی به نام S نیتروزیلاسیون (Nitrosylation) یا نیتراسیون (nitration) با سیستئین گروه تیول ترکیب‌شده و تولید نیتروزوتیول­های پایدار می­کند. بسیاری از پروتئین­ها به‌واسطه داشتن سیستئین با این واکنش قابل تنظیم هستند. NO بسیاری از اثرات خود را از این طریق ایجاد می­کند (10). پکتین یک پلیمر طبیعی تشکیل‌دهنده دیواره سلولی در اغلب گیاهان است که حدود 70% آن از گالاکتورونیک اسید تشکیل شده است. پکتین به‌طور وسیعی در صنعت غذایی به‌عنوان قوام دهنده و تثبیت‌کننده مورد استفاده قرار می­گیرد (20، 22 و 27). منابع اصلی استخراج پکتین پوست مرکبات، تفاله سیب و چغندرقند می­باشد (2). اگرچه پکتین توسط مسیر فوقانی دستگاه گوارش هضم نمی­شود اما فواید زیادی بر سلامت انسان دارد (18). پکتین دارای اثرات کاهنده کلسترول است و نقش مهمی در پیشگیری از بیماری­های قلبی، فشارخون و دیابت دارد. شواهد قابل‌توجهی نیز در خصوص نقش پکتین در جلوگیری از سرطان و متاستاز وجود دارد (4، 7 و 28). پکتین­ها می­توانند با گالکتین (Galectin)(پروتئین متصل شونده به کربوهیدرات) سطح سلول­های سرطانی باند شده و در چسبندگی سلول-سلول و سلول-ماتریکس و درنتیجه متاستاز اختلال ایجاد کنند. پکتین نه‌تنها باعث مهار متاستاز می­شود بلکه آپوپتوز را نیز در سلول­های سرطانی القا می­کند (19،20 و 27). یکی از مکانیزم­های عمده مقاومت دارویی مهار مسیر­های آپوپتوتیک است که موجب پیشرفت تومور­ها می­شود. لذا هدف بسیاری از درمان­های رایج برای سرطان القای آپوپتوز در آنها است (11و9). سرطان پروستات یکی از رایج­ترین سرطان­های شناخته شده است که متأسفانه درمان­های محدودی برای آن وجود دارد (6). هدف از این پژوهش بررسی اثرات ترکیبات پکتینی بر رشد سلول­های سرطان پروستات انسانی LNCaP و تولید نیتریک اکساید تحت تأثیر این مواد در سلول­های مذکور می­باشد.

مواد و روشها

کشت سلول: دودمان سلولی سرطان پروستات انسانی LNCaP، از بانک سلولی ایران (NCBI) تهیه شد و در محیط RPMI-1640 (Gibco-USA) حاوی 10% سرم جنین گاو (Gibco-USA) (FBS) در شرایط بهینه (دمای 37درجه سانتیگراد، رطوبت 95% و CO2 5%) کشت داده شد. به‌منظور جلوگیری از آلودگی IU/ml 100 پنی‌سیلین و µg/ml 100 استرپتومایسین (Gibco-USA) به محیط کشت اضافه گردید. استوک MCP از Econugenic-USA، AP از Sigma-Switzerland و SNP از Merck- Germany تهیه گردید.

مورفولوژی و درصد بقا: سلول­های LNCaP با تراکم 104 سلول در هر چاهک پلیت 96 تایی کشت داده شد. سلول­ها پس از 24 ساعت با تعویض محیط در غلظت­های mg/ml 5 و 3، 5/1، 1، 5/0 از MCP و AP و نیز غلظت­های mM 10و 1، 5/0، 1/0 از SNP به مدت 6، 24 و 48 تیمار شدند. مورفولوژی سلول­ها با میکروسکوپ فازمعکوس  (CETI- Belgium) و درصد بقا با استفاده از روش MTT در طول‌موج nm 570 موردبررسی قرارگرفت.

سنجش نیتریک اکساید: به‌منظور بررسی اثر مشتقات پکتینی و SNP بر ترشح نیتریک اکساید از روش غیرمستقیم سنجش NO بر پایه واکنش گریس (Griess) استفاده شد. تعداد 105 سلول در پلیت 24 تایی با غلظت­های مختلف AP، MCP و SNP به مدت 6، 24 و 48 تیمار شد. پس از تیمار µl 50 از محیط رویی هر چاهک به ترتیب و بافاصله زمانی 10 دقیقه با µl 50 سولفانیل آمید و NED (Merck- Germany) شیک و جذب در طول‌موج nm 490 با دستگاه پلیت ریدر (Bio Tek- UK) خوانده شد.

چرخه سلول: سلول­ها پس از کشت و تیمار با غلظت­های مختلف MCP و AP، به مدت یک ساعت در اتانول 70% و دمای 4 درجه سانتیگراد فیکس شدند. سپس رنگ PI اضافه گردید و چرخه سلول با استفاده از دستگاه فلوسایتومتری(Beckman- Germany)  و نرم‌افزار Flowjo بررسی شد.

DNA laddering: سلول­ها با غلظت­های مختلف MCP و AP تیمار شدند و سپس DNA با استفاده از کیت خریداری‌شده از شرکت سیناژن- ایران (Cinna pureDNA) استخراج گردید. در نهایت DNA بدست آمده بر روی ژل آگارز الکتروفورز شد. عکسبرداری از ژل با دستگاه ژل داک (uvi doc- UK) انجام شد.

آنالیز آماری: با استفاده نرم‌افزار SPSS version 16 و تست پارامتریک ANOVA یک‌طرفه و دوطرفه انجام‌شده است.  0.05>P به‌عنوان اختلاف معنی‌دار محاسبه و نتایج به‌صورت SEM ± میانگین (3= n) نشان داده‌شده است.

نتایج

مورفولوژی سلولها: سلول­های LNCaP، سلول­های اپی­تلیالی چسبنده می­باشند که به‌صورت نرمال کشیده و زاویه‌دار هستند و سلول­های در حال تقسیم نیز بین آن­ها دیده می­شود (شکل1).

 

 

شکل1- مورفولوژی سلول­های LNCaP در حالت طبیعی بدون تیمار، سلول­ها کشیده و به کف چسبیده هستند. علامت پیکان یک سلول در حال تقسیم را نشان می­دهد(25X) .

 

 

سلولها پس از 24 ساعت با غلظت­های پایین مواد پکتینی تغییر محسوسی را متحمل نشدند در حالیکه تیمار 24 ساعت با غلظت ­ mg/ml5 مواد پکتینی سبب ایجاد تغییرات قابل‌مشاهده‌ای شامل گرانوله شدن سلول و کاهش حجم در مقایسه با حالت طبیعی گردید (شکل2bوc) و (شکل3 b و c).

اثر مشتقات پکتینی و SNP بر درصد بقا: MTT یک سوبسترای زردرنگ است که می­تواند وارد سلول­های زنده شود و در صورت وجود میتوکندری فعال در سلول به شکل کریستال­های آبی به نام فورمازان درون سلول ظاهر شود. این کریستال­ها در حلال(DMSO) حل‌شده و جذب آن قابل‌اندازه‌گیری است. رابطه­ای مستقیم بین میزان جذب و تعداد سلول­های زنده وجود دارد. نتایج تست MTT نشان داد که تیمار 6 ساعت سلول­های LNCaP با مواد پکتینی و نیز SNP اثر معنی‌داری بر کاهش درصد بقای این سلول­ها نسبت به گروه کنترل ندارد. در حالیکه انکوباسیون 24 و 48 ساعت این سلول­ها با مواد پکتینی و نیز SNP با افزایش دوز موجب کاهش معنی‌دار بقای سلول­ها نسبت به گروه کنترل می­شود (شکلهای 4، 5 و 6). لازم به ذکر است با استفاده از تست Anova دوطرفه اختلاف معنی‌داری بین ساعت 24 و 48 مشاهده نگردید. 


 

شکل 2- مورفولوژی سلول­های LNCaP تیمار شده با دوز بی‌اثر پکتین: a) گروه کنترل b) AP (mg/ml1) c)MCP (mg/ml1)  دوز بی‌اثر سبب تغییر محسوسی در مورفولوژی سلول­ها نسبت به گروه کنترل نمی­شود(25X) .

 

شکل3- مقایسه مورفولوژی سلول­های تیمار شده با دوز مؤثر (mg/ml 5) : a) کنترل b) AP c) MCP همانطور که در تصویر نشان داده‌شده است سلول­ها تحت اثر غلظت­های بالای مواد پکتینی چروکیده می­شوند و حالت طبیعی خود را از دست می­دهند. در تیمار با MCP گرانوله شدن سلول­ها نیز قابل‌رؤیت است (25X).

 


سنجش نیتریک اکساید با واکنش گریس: ازآنجاکه NO یک گاز ناپایدار است به‌سرعت به متابولیت­های خود یعنی نیتریت و نیترات تجزیه می­شود. در این روش نیتریت نخست با سولفانیل­آمید واکنش داده و یک نمک ناپایدار دیازونیوم راتشکیل می­دهد. سپس این واسطه با محلول دوم واکنش NED واکنش می­دهد و ترکیبات پایدار آزو را تولید می­کند. شدت رنگ صورتی حاصل به‌منظور سنجش مقدار نیتریت با دستگاه پلیت ریدر قابل‌اندازه‌گیری است. رابطه مستقیمی بین مقدار جذب و میزان ترشح نیتریک اکساید وجود دارد. مقدار ترشح نیتریک اکساید از طریق فرمول زیر محاسبه می­شود.

 

 

 

شکل4- درصد بقای سلول­های LNCaP پس از تیمار با غلظت­های مختلف SNP در زمان 24و 48 با استفاده از تست MTT. مقادیر ارائه‌شده معادلS.E.M  mean 15آ±">  می­باشد. (3n= و0.05>P * = ). همانطور که مشاهده می­شود تیمار 24 ساعت با غلظت­های mg/ml 1 و 5/0، 1/0 موجب کاهش معنی‌دار بقای سلول­ها نسبت به گروه کنترل می­شود. نتایج در تیمار 48 ساعت نیز به همان شکل می­باشد.

 

    

شکل5- درصد بقای سلول­های LNCaP پس از تیمار با غلظت­های مختلف MCP در زمان 24و 48 با استفاده از تست MTT. مقادیر ارائه‌شده معادلS.E.M  mean 15آ±">  می­باشد. (3n= و0.05>P *=). تیمار 24 ساعت فقط در غلظت mg/ml5 موجب کاهش معنی‌دار بقای سلول­ها نسبت به گروه کنترل می­شود در حالیکه تیمار 48 ساعت موجب کاهش معنی‌دار بقای سلول­ها در سه غلظت mg/ml 5، 3، 5/1 می­گردد.

 

 

SNP یک دهنده NO است و در این پژوهش به‌عنوان کنترل مثبت مورداستفاده قرارگرفت. هدف از استفاده از یک کنترل مثبت (SNP) حصول اطمینان از مهار تکثیر سلول­های LNCaP به‌وسیله NO آزادشده می­باشد. تیمار 24 ساعت با SNP در غلظت­های mM 1 و 5/0 موجب افزایش معنی‌دار ترشح NO نسبت به گروه کنترل گردید.

 

  

شکل6- درصد بقای سلول­های LNCaP پس از تیمار با غلظت­های مختلف AP در زمان 24و 48 با استفاده از تست MTT. مقادیر ارائه‌شده معادلS.E.M  mean 15آ±">  می­باشد. (3n= و0.05>P * =). تیمار 24 و 48 ساعت سلول­ها در غلظت­های mg/ml 5، 3، 5/1 اسیدپکتیک موجب کاهش معنی‌دار بقای سلول­ها نسبت به گروه کنترل می­گردد.


این در حالی­است که تیمار 48 ساعت سلول­ها با SNP افزایش معنی‌داری نسبت به تیمار 24 ساعت نشان نداد (شکل7). تیمار 24 ساعت سلول­های LNCaP با AP و MCP در غلظت­های mg/ml 5 و 3، 5/1، 1 موجب افزایش معنی‌دار ترشح NO نسبت به گروه کنترل در این سلول­ها شد (شکلهای 8 و 9). لازم به ذکر است که تیمار AP و MCP در تیمار 48 ساعت افزایش معنی‌داری در ترشح NO نسبت به ساعت 24 ایجاد نکردند.

 

 

شکل7-اثر غلظت‌های متفاوت SNP بر ترشح نیتریک اکساید در سلول­های LNCaP پس از 24 ساعت. غلظت­هایmM 1، 5/0 باعث افزایش معنی‌دار ترشح نیتریک اکساید در سلول­های تحت تیمار نسبت به گروه کنترل می­شوند. مقادیر ارائه‌شده معادل mean±S.E.M می‌باشند. (0.001>P = ***،0.01>P = **،0.05>P = *و3 n=)

 

شکل8- اثر غلظت­های متفاوت AP بر ترشح نیتریک اکساید در سلول­های LNCaP پس از 24 ساعت. غلظت­های mg/ml 5 و 3، 5/1، 1 باعث افزایش معنی‌دار ترشح نیتریک اکساید در سلول­های تحت تیمار نسبت به گروه کنترل می­شوند. مقادیر ارائه‌شده معادل mean±S.E.M می‌باشند (0.001>P = ***،0.01>P = **،0.05>P = *و3 n=)

نمودار 9- اثر غلظت­های متفاوت MCP بر ترشح نیتریک اکساید در سلول­های LNCaP پس از 24 ساعت. غلظت­های mg/ml 5و3 باعث افزایش معنی‌دار ترشح نیتریک اکساید در سلول­های تحت تیمار نسبت به گروه کنترل می­شوند. مقادیر ارائه‌شده معادل mean±S.E.M می‌باشند. (0.001>P = ***،0.01>P = **،0.05>P = *و3 n=)


چرخه سلولی: در مراحل پایانی آبشار آپوپتوتیک، DNA کروموزومی توسط آنزیم اندونوکلئاز به قطعات نوکلئوزومی تجزیه می­گردد. درنتیجه شمار زیادی از قطعات DNA که اندازه آن­ها در حدود bp 180 است در داخل سلول انباشته می­شوند. اگر این سلول­ها با اتانول فیکس و مجدداً هیدراته شوند قطعات DNA با وزن مولکولی پایین­تر از دیواره سلول نشت می­کنند. درنتیجه محتوای DNA سلول­های آپوپتوزی از محتوای DNA سلول­های طبیعی کمتر بوده و این سلول­ها با پیک Sub-G1 در هیستوگرام DNA قابل‌مشاهده هستند (25). لذا تعداد سلول­های موجود در فاز Sub-G1 میتواند شاخصی برای احتمال وقوع آپوپتوز باشد. تیمار 24 ساعت سلول­های LNCaP با AP به‌صورت وابسته به دوز سبب افزایش تعداد سلولهای در ناحیه Sub-G1 در مقایسه با گروه کنترل گردید. تیمار سلول­ها با MCP نیز به‌صورت وابسته به دوز سبب افزایش تعداد سلولها در فاز Sub-G1گردید. درصد سلول­های موجود در فاز Sub-G1 در تیمار 24 و 48 ساعت با AP و MCP در جدول 1 نشان داده شده است. اگرچه تیمار 48 ساعت سلول­ها با مواد پکتینی درصد سلول­های موجود در فاز Sub-G1 را می­افزاید اما این افزایش در مقایسه با ساعت 24 معنی­دار نمی­باشد.

 

 

 

 

 

جدول1- اثر AP و MCP بر پیشرفت چرخه سلولی در سلول­های LNCaP با روش فلوسایتومتری 

   

 

 

 

 

شکل10- هیستوگرام چرخه سلولی برای سلول­های LNCaP در حالت کنترل 

 

شکل 11- هیستوگرام چرخه سلولی سلول­های LNCaP پس از تیمار با, MCP   AP


نردبان DNA : یکی از ویژگی­های کلاسیک آپوپتوز شکستن DNA ژنومی به قطعات کوچکتر bp 200-180 است. نردبان DNA یک روش کیفی برای ارزیابی مرگ سلول با استفاده از شناسایی این قطعات می­باشد. در این روش سلول­های آپوپتوتیک یک نردبان مجزا تشکیل می­دهند در حالیکه سلول­های نکروتیک تشکیل اسمیر می­دهند (یا اصلاً DNA شأن قطعه‌قطعه نمی­شود). DNA سلول­های سالم نیز به‌صورت یک باند با وزن مولکولی زیاد در بالای ژل باقی می­ماند (12). همانطور که در تصویر مشخص است در غلظت­های mg/ml 5، 3، 5/1 از AP و MCP،  DNA خردشده است در حالیکه DNA نمونه کنترل به‌صورت یک باند در بالای ژل قرارگرفته است (شکل 12).

بحث 

با توجه به روند افزایشی بروز سرطان در اندام­های مختلف بدن نیاز به درمان­های مؤثر با حداقل عوارض جانبی ضروری به نظر می­رسد. در این رابطه برخی از مولکول­های زیستی غیرسمی داری خاصیت ضد توموری بوده و قادر به کاستن دوز مصرفی دارو­های شیمیایی هستند (34). پکتین­ یکی از عمده‌ترین ترکیبات دیواره سلولی و احتمالأ پیچیده‌ترین ماکرومولکول طبیعت است که دارای اثرات ضد سرطانی می­باشد (1و31). متأسفانه سلول­های انسان قادر به تولید آنزیم تجزیه‌کننده پکتین نیستند لذا استفاده از برگه‌های اصلاح شده آنها گسترش یافته است (24). MCP پکتین تغییریافته مرکبات با pH است که در آب راحت‌تر حل‌شده و قابلیت جذب بالاتری در بدن دارد (32 و 33). مطالعات درون تنی وبرون تنی نشان داده‌اند که MCP به‌طور مؤثری بر ضدسرطان­هایی نظیر پروستات، کولون، سینه، ملانوما، (Multiple Myeloma) و همانژیوسارکوم (Hemangiosacrum) عمل می­کند (17). احتمالاً MCP اثرات خود را از طریق مهار گالکتین­ها و به‌ویژه گالکتین3 (Gal3) ایجاد می­کند.

 

شکل 12- DNA استخراج‌شده از سلول­هایLNCaP تیمار شده با غلظت­های مختلف AP و MCP. وجود اسمیر در تمامی غلظت­های AP و MCP و به‌خصوص در غلظت­ها بالاتر مشاهده ­گردید.

Gal3 متنوع­ترین عضو از خانواده لکتین­های باند شونده به گالاکتوز است که در طیف گسترده­ای از عملکرد­ها نظیر تکثیر سلولی، آپوپتوز، رگ­زایی، پیشرفت تومور و متاستاز دخیل است (13و14). اوکامی و همکاران نشان دادند که پکتین سیب می­تواند تعداد تومور­های کولون در موش­های تحت تأثیر آزوکسی متان را کاهش دهد در حالیکه پکتین مرکبات چنین اثری را نشان نمی­دهد (23). در سال 2010 نیز لی و همکاران اثر پکتین تغییریافته سیب (MAP) را بر سه نوع دودمان سلولی سرطان کولون موردبررسی قراردادند و دریافتند که MAP اثرات مهاری بر رشد دارد و آپوپتوز را نیز در این سلول­ها القا می­کند، همچنین عملکرد مهمی در جلوگیری از متاستاز کبدی می­باشد (13، 27 و 32). نقش NO در اتیولوژی و پیشرفت سرطان بسیار پیچیده است. NO تحت شرایط ویژه می­تواند ژنوتوکسیک باشد، درعین‌حال مطالعات متعددی بر نقش سرکوب‌کننده NO در فنوتیپ بسیاری از سرطان­ها تأکید دارد. اثرات تحریکی و مهاری NO بر پیشرفت سرطان وابسته به فاکتور­های متنوعی است. NO در جنبه­های مختلف متاستاز نیز تأثیرگذار است این در حالی است که 90% مرگ‌ومیر ناشی از سرطان به دلیل متاستاز می­باشد (8).

هدف از این پژوهش

1-     بررسی نقش مهاری یا تحریکی NO بر بقای سلولهای LNCaP

2-     تولید NO تحت تأثیر MCP, AP در سلولهای LNCaP

3-     بررسی نقش مشتقات پکتینی در مهار سلولهای LNCaP

4-     ارتباط احتمالی مهار تکثیر و تولید NO در این سلولها

تیمار سلول­های LNCaP با غلظت­های مختلف SNP به‌عنوان یک دهنده NO موجب کاهش معنی‌دار بقای سلول­ها در تمام دوز­های مورداستفاده گردید. بنابراین می­توان نتیجه گرفت که NO در سلول­های سرطان پروستات نقش پروآپوپتوتیک داشته و بر بقای سلول­ها اثر مهاری دارد. درصد بقای سلول­ها در حضور مواد پکتینی با استفاده از تست MTT نیز موردبررسی قرارگرفت و مشاهده شد که MCP و AP هر دو موجب کاهش معنی‌دار درصد بقای سلول­ها نسبت به حالت کنترل می­گردند. با تعیین اثر مهاری ترکیبات پکتینی بر بقای سلول­های LNCaP، بار دیگر سلول­ها به‌منظور سنجش مقدار NO آزادشده با MCP و AP تیمار شدند. این بار تیمار 24 و 48 ساعت هر دو ترکیب پکتینی افزایش معنی‌دار تولید NO را موجب شد. به‌منظور تأیید اثر کاهشی مواد پکتینی بر بقای سلول­های LNCaP، میزان تخریب DNA سلول­های تیمار شده با استفاده از روش DNA laddering و نیز تغییرات چرخه سلولی با استفاده از تکنیک فلوسایتومتری موردبررسی گرفت. خرد شدن DNA در تمامی سلول­های تیمار شده با غلظت­های موردنظر MCP و AP مشاهده گردید که این خرد شدن هم مشخصه سلول­های آپوپتوتیک و هم نکروتیک است. نتایج حاصل از بررسی چرخه سلولی نیز نشان داد که درصد Sub-G1 و درنتیجه وقوع آپوپتوز در سلول­های LNCaP تحت تیمار، به‌صورت وابسته به دوز افزایش‌یافته است. این مشاهده می­تواند مؤید وقوع آپوپتوز در این سلول­ها باشد. به‌طور کلی در این تحقیق مشاهده شد که مواد پکتینی بر بقای سلول­های LNCaP اثر کاهشی داشته و بسیار محتمل است که این اثر از طریق القای آپوپتوز باشد، چراکه رنگ‌آمیزی با پروپیدیوم آیوداید (PI) و انجام تست نکروز و نیز رنگ‌آمیزی با اتیدیوم بروماید و آکریدین اورنج، حاکی از سطح بسیار پایین سلول­های نکروتیک در تیمار با مواد پکتینی است. اگرچه گزارش­هایی مبنی بر عدم بیان گالکتین 3 در سلول­های LNCaP وجود دارد (29و30)، اما گزارشات نشان داده‌اند که سایر انواع گالکتین­ها و به‌ویژه گالکتین 1 نیز به‌اندازه گالکتین3 در پیشرفت سرطان دخیل‌اند و این گالکتین به میزان زیادی در سلول­های LNCaP بیان می­شود. لازم به ذکر است که گالکتین 1 به دلیل رفتار پیش برنده آپوپتوز یک هدف درمانی بالقوه برای درمان سرطان است (16 و 21). به نظر می­رسد که مسیر اثرات پکتین در این سلول­ها از طریق مسیری مستقل از گالکتین3 می­باشد. از طرف دیگر با توجه به افزایش ترشح NO در حضور AP و MCP می­توان احتمال آپوپتوز در این سلول­ها، حداقل در بخشی از طریق تولید NO باشد زیرا در مقایسه با SNP که کنترل مثبت بوده است، تأیید این مطلب را می­توان مشاهده کرد. در توضیح این موضوع شاید بتوان اثر NO را با کلسیم مرتبط دانست. NO می­تواند از طریق نیتروزیلاسیون، رسپتور­های رایانودینی و NMDA را تحت تأثیر قرار بدهد (10 و 15). با افزایش کلسیم سیتوزولی، بار کلسیم در میتوکندری نیز افزایش خواهد یافت. افزایش کلسیم میتوکندری نیز به‌نوبه خود موجب نفوذپذیری غشای آن و آزادسازی فاکتور­های آپوپتوتیک و در نهایت آپوپتوز می­شود (16). اما قطعاً به‌منظور ردیابی مسیر­های انتقال پیام آزمایش­های مولکولی دقیق‌تر و بیشتری لازم است.

  1. Alphons, G.J., Voragen, G.J., Coenen Rene, P., and Verhoef Henk, A., Schols, 2009. Pectin, a versatile polysaccharide present in plant cell walls. Struct Chem, 20, PP:263–275.
  2. Baississe, S., Ghannem, H., Fahloul, D., and Lekbir, A., 2010. Comparison of Structure and Emulsifying Activity of Pectin Extracetd from Apple Pomace and Apricot Pulp. World Journal of Dairy & Food Sciences, 5 (1), PP: 79-84.
  3. Bonavida, B., Baritaki, S., 2011. Dual role of NO donors in the reversal of tumor cell resistance and EMT: Downregulation of the NF-jB/Snail/YY1/RKIP circuitry. Nitric Oxide, 24, PP: 1–7.
  4. Bergman, M., Djaldetti, M., Salman, H., and Bessler, H., 2010. Effect of citrus pectin on malignant cell proliferation. Biomedicine & Pharmacotherapy, 64, PP: 44–47.
  5. Choi, B.M., Pae, H.O., Jang, S., Kim, Y.M., and Chung, H.T., 2002. Nitric Oxide as a Pro-apoptotic as well as Anti-apoptotic Modulator. Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 35(1), PP: 16-126.
  6. Choudhari, S.K., Chaudhary, M., Bagde, S., Gadbail, A.R., and Joshi, V., 2013. Nitric oxide and cancer: a review. World Journal of Surgical Oncology, 11,118 p.
  7. Glinsky, V.V., and Raz, A., 2009. Modified citrus pectin anti metastatic properties: one bullet, multiple targets, Carbohydrate Research, 344, PP: 1788–1791.
  8. Hickok, J.R., and Thomas, D.D., 2010. Nitric Oxide and Cancer Therapy: The Emperor has NO Clothes. Curr Pharm Des. 16(4), PP: 381–391.
  9. Huerta-Yepez, S., Vega, M., Jazirehi, A., Garban, H.,  Hongo, F., Cheng, G., and Bonavida, B., 2004. Nitric oxide sensitizes prostate carcinoma cell lines to TRAIL-mediated apoptosis via inactivation of NF-jB and inhibition of Bcl-xL expression, Oncogene, 23, PP: 4993–5003.
  10. Jordi, M., and Mata, M., 2010. Nitric oxide and cancer. World J Hepatol, 27 2(9), PP: 337-344.
  11. Kim, P., Zamora, R., Petrosko, P., and Billiar, T.R., 2001. The regulatory role of nitric oxide in apoptosis. International Immunopharmacology, 1 (8), PP: 1421- 1444.
  12. Matassov D, Kagan T, Leblanc J, Sikorska M, Zakeri Z., 2004. Measurement of apoptosis by DNA fragmentation Methods. Molecular Biology, 282:1-17.
  13. Li, L., Niu, Y., Wu, H., Sun, Y., Li, Q., Kong, X., Liu, L., and Mei, Q., 2010. Modified Apple Polysaccharides Could Induce Apoptosis in Colorectal Cancer Cells. Journal of Food Science,. 75 (8), PP: 224-229
  14. Leclere, L., Cutsem, P.V., and Carine Michiels, C., 2013. Anti-cancer activities of pH or heat-modified pectin. Front Pharmacol, 8 (4), 128 p.
  15. Leon, L., Jeannin, J.F., and Bettaieb, A., 2008. Post-translational modifications induced by nitric oxide (NO): Implication in cancer cells apoptosis. Nitric Oxide, 19, PP: 77–83.
  16. Simeng Suy, D.J., Gentilini, L.D., and Giribaldi, L., et al., 2013. A Unique Galectin Signature in Human Prostate Cancer Progression Suggests Galectin-1 as a Key Target for Treatment of Advanced Disease. Cancer Res, 73, PP: 86-96.
  17. Mohnen, D., 2008. Pectin structure and biosynthesis. Plant Biology, 11, PP: 266–277.
  18. Maxwell, E.G., Belshaw, N.J, Waldron, K.W., and Morris, V.J., 2012. Pectin An emerging new bioactive food polysaccharide. Trends in Food Science & Technology, 24, PP: 64e-73.
  19. Muntané, J., De la Rosa, A.J., Marín, L.M., and Padillo, F.J., 2013. Nitric oxide and cell death in liver cancer cells. Mitochondrion, 13, PP: 257–262.
  20. Munarin, F., Tanzi, M.C., and Petrini, P., 2012. Advances in biomedical applications of pectin gels. International Journal of Biological Macromolecules, 51, PP: 681– 689.
  21. Nangia-Makker, P., Conklin, J., Hogan, V., and Raz, A., 2002. Carbohydrate-binding proteins in cancer, and their ligands as therapeutic agents. TRENDS in Molecular Medicine, 8 (4), PP: 187-192.
  22. Ochoa-Villarrea, M., Aispuro-Hernandez, E., Vargas-Arispuro, I., Angel Martinez-Téllez, M., 2012. Plant Cell Wall Polymers: Function, Structure and Biological Activity of Their Derivatives. Chapter4, Page. 145-173.
  23. Ohkami, H., Tazawa, K., Yamashita, O., Shimizu, T., and Murai, K., 1995. Effect of Apple Pectin on Fecal Bacterial Enzymes in Azoxymethane-induced Rat Colon Carcinogenesis. Jpn. J. Cancer Res. 86, PP: 523-529.
  24. Ping-Hsiu, H., Li-Chun, F., Cian-Song, H., Yuh-Tai, W., and Ming-Chang, W., 2012. The uptake of oligogalacturonide and its effect on growth inhibition, lactate dehydrogenase activity and galactin-3 release of human cancer cells. Food Chemistry, 132, PP: 1987–1995.
  25. Pozarowski, P., and Darzynkiewicz, Z., 2004. Analysis of Cell Cycle by Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology, 281, PP: 301-311.
  26. Reynolds, M.M., Witzeling, S.D., and Damodaran, V., et al., 2013. Applications for nitric oxide in halting proliferation of tumor cells. Biochemical and Biophysical Research Communications 431, PP: 647–651.
  27. Suryakant, K., and Niture, L. R., 2013. Plant Pectin: A Potential Source for Cancer Supression. American Journal of Pharmacology and Toxicology, 8 (1), PP: 9-19.
  28. Sharma, B.R., Naresh, L., Dhuldhoya, N.C., Merchant, S.U., and Merchant. U.C., 2006. An Overview on Pectins. Journal Times Food Processing, PP: 44-51.
  29. Wang, Y., Nangia-Makker, P., Tait, L., and Balan, V., et al., 2009. Regulation of Prostate Cancer Progression by Galectin-3. The American Journal of Pathology, 174 (4), PP: 1515-1523
  30. Wang, Y., Balan, V., Gao, X., Reddy, P.G., Kho, D., Tait, L., and Raz, A., 2013. The significance of galectin-3 as a new basal cell marker in prostate cancer. Cell Death and Disease, 4, e753 p.
  31. William, G.T., Knox, J.P., and Mikkelsen, J.D., 2006. Pectin: new insights into an old polymer are starting to gel. Trends in Food Science & Technology, 17, PP: 97–104.
  32. Yan, J., and Katz, A., 2010. PectaSol-C Modified Citrus Pectin Induces Apoptosis and Inhibition of Proliferation in Human and Mouse Androgen-Dependent and - Independent Prostate Cancer Cells. Integrative Cancer Therapies, 9(2), PP: 197–203.
  33. Yu, S.h., Jia, L., Zhang, Y., and Wu, D., et al., 2013. Increased expression of activated endothelial nitric oxide synthase contributes to antiandrogen resistance in prostate cancer cells by suppressing androgen receptor transactivation. Cancer Letters, 328, PP: 83–94.
  34. Zong, A., Cao, H., and Wang, F., 2012. Anticancer polysaccharides from natural resources: A review of recent research,Carbohydrate Polymers, 90, PP: 1395– 1410.