گونه آپیس ملیفرا، به‌عنوان زنبورعسل بومی سراسر مناطق اروپا به شمار می­رود و در ایران در مناطق غربی پراکنده است (2). در بیش­تر جوامع حشرات، اثر متقابلی میان حشرات نوزاد و بالغ وجود دارد که مهم­ترین بخش این اثر مربوط به غدد می­باشد (13). غدد شیری خاص بال غشاییان بوده و در زنبورهای عسل، به شکل اندام ترشحی زوج و به‌صورت دوطرفه در منطقه جلویی سر، درون صفحه هیپوفارنیکس جای گرفته و عامل اصلی تولید مواد غذایی نوزادان یا ژله رویال می­باشند (6 و 19). براساس پژوهش‌های صورت گرفته، سن زنبور کارگر یک نشانه تأثیرگذار روی فعالیت غدد شیری می­باشد (9). غدد شیری در زنبورهای کارگر در سن 12-4 روزگی فعال‌شده و باعث تولید ژله رویال در زنبورهای عسل کارگر پرستار، به‌منظور تغذیه ملکه در تمام دوران زندگی او و تغذیه لاروها و کارگرها در سه روز اول رشد آن­ها به کار می­رود (15). بر پایه پژوهش‌های صورت گرفته ثابت‌شده که پروتئین‌های متفاوتی از غدد شیری زنبورها در سنین مختلف ترشح می­شوند (10). پروتئین‌های شناخته‌شده در غدد شیری زنبورهای عسل شامل آلفا گلوکز اکسیداز، گلوکز اکسیداز و آمیلاز می­باشند که فعالیت­های گوارشی از خود نشان داده و در زنبورهای عسل جستجوگر به‌منظور پردازش شهد به عسل به کار می­روند. هم­چنین این پروتئین‌ها نقش مهمی را در ایجاد خاصیت ضدعفونی‌کنندگی عسل ایفا می­کنند (10). درواقع عملکرد غدد شیری در زنبورهای جستجوگر بسیار تخصصی است و بیان ژن آنزیم­های سوخت‌وساز کربوهیدرات ازجمله آمیلاز، گلوکز اکسیداز و آلفا گلوکز اکسیداز که برای پردازش شهد به عسل موردنیاز است براساس تغییرات نقش وابسته به سن زنبورعسل کارگر انجام می­شود (16). بنابراین به نظر می­رسد که سلول­های غدد شیری دارای دو حالت متمایزند که مطابق با الگوی بیان پروتئین در سنین مختلف رشد کارگر و با توجه به تغییر نقش آن­ها در سنین مختلف، بیان می‌شوند (16). سه پروتئین دیگر با وزن مولکولی 50، 56 و 64 کیلودالتون به‌عنوان پروتئین‌های اصلی جهت ساخت ژله رویال، در غدد شیری زنبورهای کارگر پرستار بیان می‌شوند (10 و 14). هم­چنین دو پروتئین دیگر نیز با نام­های آلفا گلوکز اکسیدازI و آلفا گلوکز اکسیدازII در غدد شیری زنبورهای جستجوگر وجود دارد که دارای وزن مولکولی 98 و 76 کیلو دالتون می­باشند (21). در حقیقت پروتئین‌های بسیاری در غدد شیری زنبورعسل وجود دارد که هرکدام بنا بر وظایفی که بر عهده‌ دارند در سنین مختلف بیان می­شوند و موجب عملکرد طبیعی زنبورهای عسل در کلنی می­گردند. از طرفی بیان متفاوت این پروتئین‌ها در غدد شیری زنبورعسل در سنین مختلف، موجب پردازش ساختار عسل و تولید ژله رویال می­شود. با توجه به این­که تعداد و نوع پروتئین‌های موجود در غدد شیری زنبورعسل و همچنین میزان بیان آن­ها در مراحل مختلف رشد و نمو زنبورعسل متفاوت است، این پژوهش باهدف بررسی تغییرات کمی و کیفی پروتئین‌های موجود در غدد شیری سنین مختلف زنبورعسل بود.

مواد و روشها

برای تولید زنبورهای یک­روزه از کلنی­هایی که از نظر ژنتیکی یکسان­سازی شده­ بودند استفاده گردید. برای این منظور از ملکه­های خواهری که همگی از یک مادر متولد شده بودند، استفاده شد. این ملکه­ها به‌صورت سفارشی و توسط شرکت اسپادانا مکمل تولید شدند، به‌طوری که همگی یک والد مشترک داشته و از روش پیوند زدن تخم­های یکسان و پرورش آنها در فنجانک­های تولید شده به روش مصنوعی درون کندوچه­های پرستار به وجود آمدند (7).

زنبورها در کل دوره آزمایش درون کندوچه­های چوبی نگهداری و دسترسی آزاد به آب و غذا داشتند و از یک جیره غذایی مخلوط عسل و پودر شکر تغذیه شدند. پودر شکری که به‌منظور تهیه کیک جانشین استفاده شد، کاملاً پودر شده و از الکی بامش 140 عبور داده شد. عسل نیز پیش از استفاده، درحمام آب گرم به مدت نیم ساعت در دمای 90 درجه سانتی­گراد گرم شد تا در صورت آلودگی باکتریایی، آلودگی بدین صورت حذف و گرانروی آن کاهش یابد. آزمایش در شرایط گرم­خانه­گذاری با شرایط دمایی (1±33 درجه سانتی­گراد) و رطوبت کنترل‌شده (1±65 درصد) انجام شد (6).

زنبورهای کارگر مورد آزمایش شامل 5 کندوچه حاوی 150 عدد زنبور یک‌روزه بودند که پس از اتمام دوره در هر رده سنی (تولد، روز پنجم، روز دهم، روز پانزدهم و روز بیستم) از هرکدام 20 عدد زنبور به‌صورت تصادفی انتخاب شد و به‌منظور استخراج غدد شیری، با قراردادن روی یخ بی‌حس شده و سپس غدد شیری آنها توسط برش در منطقه جلویی سر و برداشتن پوست پیشانی در زیر استریومیکروسکوپ استخراج شد (12 و 20). به‌منظور استخراج پروتیئن­های غدد شیری، چهار روش تریس، فسفات، تری کلرو اسیداستیک و فنل مورد بررسی قرارگرفت. سپس غدد شیری استخراج شده به روش پاوکوی و همکاران (2012) آماده‌سازی شد. در ادامه غلظت پروتئین‌های آنها با روش برادفورد و پروتئین‌های استاندارد سرم آلبومین گاوی تعیین و تمام پروتئین‌ها هم‌غلظت شدند (3 و 18).

جهت تفکیک پروتئین‌ها از روش الکتروفورز ژل پلی­اکریل­آمید در حضور سدیم دودسیل سولفات (SDS) استفاده شد. برای سدیم دودسیل سولفات معمولی (یک‌بعدی دارای چاهک) از دو ژل متمرکز کننده (5 درصد) و ژل جداکننده (5/12 درصد) استفاده شد. پس از آماده­سازی ژل، نمونه­ها در بافر رنگ (برومو فنول بلو، گلیسرول، اوره، سدیم دودسیل سولفات، تریس اچ-سی-ال 5/1 مولار با اسیدیته 8 و بتامرکاپتواتانول) به مقدار 30 میکرولیتر از هر نمونه با غلظت یکسان روی ژل بارگذاری شد. الکتروفوز با ولتاژ 90 ولت در ژل متمرکز کننده به مدت 2 ساعت و با ولتاژ 250 ولت در ژل جداکننده به مدت 3 ساعت انجام شد (1). برای رنگ­آمیزی ژل، سه روش مختلف کوماسی بریلیانت بلو آر 250، نیترات نقره و کوماسی بریلیانت بلو جی 250 ارزیابی شد. پس از ظاهر شدن باندها، اتمام رنگ‌آمیزی به کمک محلول خاتمه‌دهنده و تثبیت رنگ به کمک محلول اسید استیک 10 درصد انجام شد (16).

پس از اتمام ژل­گذاری، باندهای حاصله از لحاظ تنوع و غلظت مورد مقایسه قرارگرفتند. در این مطالعه نرم‌افزارهای Gelanalyzer و ImageJ برای آنالیز داده‌های مولکولی و تعیین غلظت باندهای حاصل استفاده گردید. سپس با استفاده از نرم‌افزار SPSS و روش آزمون چند دامنه دانکن تفاوت بین میانگین‌ها مقایسه گردید.

نتایج و بحث

با توجه به نتایج به‌دست‌آمده از بررسی چهار روش استخراج پروتئین، روش فنول به‌عنوان بهترین روش استخراج پروتئین تعیین شد. لازم به ذکر است که کیفیت و کمیت پروتئین استخراج شده تأثیر بسیار زیادی درروند بررسی پروتئین‌ها دارد و همچنین نوع روش استخراج تأثیر به­سزایی در کیفیت و کمیت پروتئین‌های استخراج شده خواهد داشت. در بررسی­های کیفیت­سنجی با استفاده از روش برادفورد، کیفیت باندهای پروتئینی حاصل، درروش فنول دارای بالاترین میزان نسبت به دیگر روش­ها بودند. در مقایسه‌ای که توسط پاوکوی و همکاران (2012) میان سه روش مختلف استخراج پروتئین ازجمله روش فنول، تری کلرواسیداستیک و استون انجام شد، روش فنول حداکثر کمیت استخراج پروتئین از بافت­های گیاهی را داشت، که این امر با نتایج حاصل از تحقیق حاضر همسو بود (17). همچنین نتایج به‌دست‌آمده از میزان پروتئین استخراج شده با سه روش مختلف در این پژوهش با نتایج کوپکه و همکاران (2012) که براساس برادفورد اندازه­گیری کرده بودند، مطابقت داشت (11).

پس از به دست آوردن بهترین روش استخراج پروتئین، سه روش مختلف رنگ­آمیزی مورد بررسی قرارگرفت که با توجه به نتایج به‌دست‌آمده، روش رنگ­آمیزی به کمک کوماسی برلیانت بلوجی 250 بهترین وضوح را برای پروتئین‌های غدد شیری نشان داد (شکل‌های 1 و 2).

شکل 1- مقایسه روش­های مختلف استخراج پروتئین. A: استخراج به روش تریس، B: استخراج به روش فسفات، C: استخراج به روش تری کلرو اسیداستیک و D: استخراج به روش فنول

شکل 2- مقایسه روش­های مختلف رنگ‌آمیزی پروتئین. A: رنگ­آمیزی با روش نیترات نقره، B: رنگ­آمیزی با روش کوماسی برلیانت بلو آر250 ، C: رنگ­آمیزی با روش کوماسی برلیانت بلو جی250.

در گزارشات مرتبط به آشکارسازی پروتئین‌های مختلف غدد شیری و حفظ الگوی بیان آن­ها در مغز زنبورهای مخملی و زنبورهای عسل نتایج مشابهی در ارتباط با بهترین روش رنگ­آمیزی ژل پلی اکریل آمید پروتئین بدست آمده است (11).

مشخص­ترین پروتئین‌های موجود در غدد شیری زنبورعسل که در تحقیق حاضر موردمطالعه قرارگرفتند در شکل 3 نشان داده شده است که شامل آلفا گلوکز اکسیداز، گلوکز اکسیداز، آلفا گلوکز اکسیداز I و II، آمیلاز و پروتئین‌هایی با وزن مولکولی50، 56 و 64 کیلودالتون بودند.

شکل 3- مکان و موقعیت پروتئین‌های شناسایی‌شده در غدد شیری زنبورعسل در روزهای متفاوت

نرخ بیان پروتئین‌های اصلی ژله رویال (50، 56 و 64 کیلودالتون) در غدد شیری زنبورعسل در شکل 4 نشان داده شده است.

شکل 4- نرخ بیان پروتئین‌های ژله رویال در غدد شیری زنبورعسل

نتایج به‌دست‌آمده نشان داد که بیشترین حجم بیان پروتئین‌های اصلی ژله رویال مربوط به سنین 5 و 10 روزگی می­باشد. این در حالی است که در 15 روزگی میزان بیان کمتری نسبت به سنین 5 و 10 روزگی مشاهده شد. هرچند که تفاوت قابل‌ملاحظه‌ای بین سنین 5 و 10 روزگی نمایان نگردید، اما اختلاف مشخصی با 15 روزگی وجود داشت (01/0>P). نکته جالب توجه این­که در 20 روزگی و پس‌ازآن روز تولد حداقل میزان بیان دیده شد، به‌گونه‌ای که در 20 روزگی تفاوت بسیار بارزی با سایر سنین (5، 10 و 15 روزگی) نمایان بود (01/0>P). این نکته قابل‌توجه است که با افزایش بیان یکی از این پروتئین‌ها در سنین 5، 10 و 15 روزگی، دو پروتئین دیگر نیز افزایش و با کاهش بیان یکی از پروتئین‌ها در سنین تولد و 20 روزگی، دو پروتئین دیگر هم کاهش پیدا کردند (شکل 4).

نرخ بیان پروتئین آلفا گلوکز اکسیداز در غدد شیری زنبورعسل در شکل 5 ارائه‌شده است. با افزایش سن، نرخ بیان دارای روندی صعودی بود. بطوریکه حداکثر میزان بیان پروتئین در سن20 روزگی و حداقل میزان بیان در این پروتئین در زمان تولد به دست آمد. نکته جالب توجه اینکه در سنین 5 و 10 روزگی که بیان پروتئین‌های ژله رویال زیاد بود، سطح بیان پروتئین آلفا گلوکز اکسیداز کاهش بسیار چشم­گیری نشان داد (شکل‌های 4 و 5).

شکل 5- نرخ بیان پروتئین آلفا گلوکز اکسیداز در غدد شیری زنبورعسل

همانطورکه در شکل 3 مشخص است، پروتئین آلفا گلوکز اکسیداز، با اندازه­ی 70 کیلودالتون و در ارتفاعی بالاتر از پروتئین‌های ژله رویال قرارمی‌گیرد و عملکردی کاملاً متفاوت با پروتئین‌های 50، 56 و 64 کیلودالتون دارد. بااینکه مقدار بیان این پروتئین نسبت به سایر پروتئین‌های موجود در غدد شیری کمتر می­باشد اما اثرات بسیار مهمی در تولید عسل ایفا می­کند و 50 درصد از کل پروتئین‌های زنبورهای جستجوگر را شامل می­شود. در بررسی بیان ژن آلفا گلوکز اکسیداز در غدد شیری زنبورعسل شرقی نشان داده شد که تغییر غدد شیری در زنبورهای کارگر، که وابسته به سن زنبور می­باشد منجر به تولید آنزیم­های گوارشی ازجمله آلفا گلوکز اکسیداز می­شود (4 و 5). از طرفی آلفا گلوکز اکسیداز در غدد شیری زنبورعسل کارگر درست زمانی بیان می­شود که زنبورعسل نقش خود را از زنبور پرستار به زنبور جستجوگر تغییر داده است (10). لذا این آنزیم به‌طور خاص تنها در زنبورهای جستجوگر بیان می­شود.

نرخ بیان پروتئین‌های آلفا گلوکز اکسیدازI و آلفا گلوکز اکسیدازII در غدد شیری زنبورعسل در شکل 6 نشان داده شده است. تغییرات بیان این دو پروتئین نسبت به سن شبیه روند تغییرات بیان پروتئین آلفا گلوکز اکسیداز بود. به این صورت که با افزایش سن، نرخ بیان نیز دارای روندی صعودی بود. یعنی اینکه بیش­ترین حجم بیان پروتئین‌های آلفا گلوکز اکسیداز I و آلفا گلوکز اکسیدازII متعلق به سن 20 روزگی و پس‌ازآن مربوط به سن 15 روزگی می­باشد. از طرفی کمینه میزان بیان در این پروتئین‌ها در سن یک­روزگی مشاهده شد. نکته جالب توجه اینکه بیان این پروتئین‌ها در سنین مختلف دارای تفاوت نسبتاً بارزی باهم بودند (01/0>P). 

شکل 6- نرخ بیان پروتئین‌های آلفا گلوکز اکسیدازI و II در غدد شیری زنبورعسل

همانطورکه در شکل 3 مشخص است، دو پروتئین آلفا گلوکز اکسیدازI و آلفا گلوکز اکسیدازII به ترتیب با اندازه­های 98 و 76 کیلودالتون از نظر اندازه دارای طول بزرگتر از پروتئین‌های آلفا گلوکز اکسیداز، گلوکز اکسیداز و پروتئین‌های ژله رویال می­باشند. نتایج بدست آمده از بیان ژن آلفا گلوکز اکسیداز در غدد شیری زنبورعسل شرقی نشان داد که خواص مشابهی در آلفا گلوکز اکسیدازI و آلفا گلوکز اکسیدازII موجود در سر و شکم زنبورعسل نژاد آپیس ملیفرا با آلفا گلوکز اکسیداز موجود در عسل وجود دارد که این امر نشان­دهنده آن است که این آنزیم­ها در غدد شیری زنبورهای جستجوگر ساخته‌شده و در تبدیل ساکارز شهد به گلوکز و فروکتوز نقش داشته است (5 و 8).

همانطورکه در شکل 7 مشخص شده است، سطح بیان پروتئین گلوکز اکسیداز در سنین مختلف نیز دارای روندی صعودی بود. به طوریکه در سنین تولد، 5 و 10 روزگی بیانی از این پروتئین مشاهده نشد. این در حالی است که بیش‌ترین میزان بیان در این پروتئین متعلق به 20 روزگی و پس‌ازآن مربوط به 15 روزگی می­باشد که بین آنها اختلاف معنی‌دار وجود داشت (01/0>P). همچنین این تفاوت بیان بین سن 15 روزگی و سنین تولد، 5 و 10 روزگی نیز به‌صورت بارز در شکل 7 نمایان است.

شکل 7- نرخ بیان پروتئین گلوکز اکسیداز در غدد شیری زنبورعسل

شکل 8- نرخ بیان پروتئین آمیلاز در غدد شیری زنبورعسل

با توجه به شکل 3 مشخص می‌شود که پروتئین گلوکز اکسیداز از نظر اندازه دارای طول (57 کیلودالتون) بسیار نزدیک به پروتئین‌های ژله رویال می­باشد و در جایگاهی بین آن­ها قراردارد. این پروتئین از نظر عملکرد و میزان بیان در سطوح مختلف، کاملاً متفاوت با پروتئین‌های ژله رویال عمل می­کند و در حفظ خاصیت اسیدی عسل و ضدعفونی آن نقش به­سزایی دارد. مقدار بیان پروتئین گلوکز اکسیداز در اندازه­ای بیشتر نسبت به سایر پروتئین‌های موجود در غدد شیری می­باشد. بیان آمیلاز و گلوکز اکسیداز در غدد شیری زنبورعسل کارگر آپیس ملیفرا با توجه به تغییر نقش وابسته به سن زنبورعسل کارگر بررسی و نشان داده شد که گلوکز اکسیداز به‌طور خاص تنها در غدد شیری زنبورهای جستجوگر بیان شده و جدا کردن آن از راه کلون کردن cDNA مربوط به دو زنبورعسل انجام شد (16). نقش گلوکز اکسیداز در تبدیل گلوکز به پراکسیدهیدروژن و گلوکونیک­اسید بوده و گلوکونیک­اسید باعث نگهداری خاصیت اسیدی عسل شده و همراه با پراکسیدهیدروژن می­توانند اقدام به ضدعفونی عسل کنند. درنتیجه حضور این آنزیم در زنبورهای جستجوگر برای تبدیل شهد به عسل ضروری هستند (10).

روند نرخ بیان صعودی پروتئین آمیلاز در سنین مختلف در شکل 8 نشان داده شده است. همانطورکه مشاهده می‌شود، بیشترین میزان بیان پروتئین آمیلاز متعلق به سن 20 روزگی و پس‌ازآن با تفاوت زیاد در سن 15 روزگی است. این در حالی است که عدم بیان پروتئین آمیلاز در سنین تولد و 5 و 10 روزگی مشاهده گردید.

پروتئین آمیلاز با وزن مولکولی 85 کیلودالتون در ارتفاعی بالاتر از پروتئین آلفا گلوکز اکسیدازII در شکل 3 قراردارد و از نظر عملکرد و میزان بیان در سنین مختلف، کاملاً مشابه پروتئین‌های گلوکز اکسیداز رفتار می­کند. پروتئین آمیلاز به همراه پروتئین گلوکز اکسیداز %3-2 از کل پروتئین‌های موجود در غدد شیری زنبورهای عسل جستجوگر را شامل می­شود و نقش مهمی را در این زنبورها ایفا می­کند. مطالعه بیان آمیلاز و گلوکز اکسیداز در غدد شیری زنبورعسل کارگر آپیس ملیفرا با توجه به تغییر نقش وابسته به سن زنبورعسل کارگر نشان داده است که mRNA آنزیم آمیلاز توسط ایمنوبلاتینگ در غدد شیری زنبورعسل جستجوگر کشف شد، درحالی‌که غدد شیری زنبورهای پرستار فاقد این فعالیت بودند (16). این نتایج نشان داد که عملکرد غدد شیری در زنبورهای جستجوگر بسیار تخصصی است و بیان ژن آنزیم­های متابولیسم کربوهیدرات مانند آمیلاز که برای پردازش شهد به عسل موردنیاز است براساس تغییرات نقش وابسته به سن زنبورعسل کارگر انجام می­شود.

نتیجه‌گیری کلی:

به‌طورکلی با توجه به نتایج به نظر می­رسد که در مقایسه الگوهای پروتئین‌های غدد شیری مؤثر در تولید ژله رویال و عسل بین سنین مختلف، حداکثر میزان بیان در پروتئین گلوکز اکسیداز، در سن 20 روزگی مشاهده شد. درحالی‌که کمترین میزان بیان در پروتئین‌های مذکور در پروتئین‌های آمیلاز و گلوکز اکسیداز در سن تولد، 5 و 10 روزگی و پس‌ازآن در پروتئین آلفا گلوکز اکسیداز در روز تولد مشاهده گردید. همچنین میزان بیان تمامی پروتئین‌های ذکرشده در غدد شیری زنبورعسل به‌جز پروتئین‌های ژله رویال در سن یک­روزگی (روز تولد) بسیار جزئی و قابل‌چشم‌پوشی می‌باشد. همچنین به نظر می­رسد که تفاوت‌های زیاد در نرخ بیان پروتئین­ها در سنین مختلف، یکی از مهم­ترین عوامل مؤثر در کیفیت و کمیت عسل و ژله رویال در زنبورعسل باشد.