اثر تره­هالوز و سیستئین بر کیفیت اسپرم گاو بعد از انجماد

مهدی ژندی^1*، الهه نجاتی امیری¹، اردشیر نجاتی جوارمی¹، محسن شرفی²، افشین سیفی­جمادی¹، حسین واثقی دودران³

¹ کرج، دانشگاه تهران، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، گروه علوم دامی

² تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده کشاورزی، گروه علوم طیور

³ تبریز، دانشگاه تبریز، دانشکده کشاورزی، گروه علوم دامی

تاریخ دریافت: 10/5/96                تاریخ پذیرش: 13/9/96

چکیده

هدف ازاین پژوهش مطالعه اثر مقادیر مختلف تره­هالوز و سیستئین بر کیفیت اسپرم گاو بعد از انجماد-یخ­گشایی بود. در این مطالعه، نمونه­های منی از سه رأس گاو نر جمع‌آوری و پس مخلوط شدن به شش بخش مساوی تقسیم‌شده و هربخش بایکی از رقیق‌کننده‌های زیر رقیق و منجمد شد. 1- فاقد سیستئین و تره­هالوز (T₀C₀)، 2- دارای 5 میلی­مول سیستئین و فاقد تره­هالوز (T₀C₅)، 3- دارای 10 میلی­مول سیستئین و فاقد تره­هالوز (T₀C₁₀)، 4- فاقد سیستئین و دارای 100 میلی­مول تره­هالوز (T₁₀₀C₀)، 5- دارای 5 میلی­مول سیستئین و 100 میلی­مول تره­هالوز (T₁₀₀C₅) و 6- دارای 10 میلی­مول سیستئین و 100 میلی­مول تره­هالوز (T₁₀₀C₁₀). پس­از یخ­گشایی، جنبایی، وضعیت آپوپتوزیس، زنده­مانی، یکپارچگی غشای پلاسمایی و آکروزوم مورد ارزیابی قرارگرفت. داده­های بدست آمده در قالب آزمایش فاکتوریل2×3 مورد تجزیه‌وتحلیل قرارگرفتند. نتایج این آزمایش نشان می‌دهد که سیستئین اثری بر فراسنجه‌های حرکتی، وضعیت آپوپتوزیس، یکپارچگی غشای آکروزومی و زنده‌مانی اسپرم گاو پس­از یخ­گشایی نداشته (0.05P≥) و در همه فراسنجه­های فوق در گروه فاقد تره­هالوز به‌طور معنی‌داری بهتر از گروه دارای تره­هالوز بود (0.05P≤). همچنین، بررسی اثرات متقابل تره­هالوز و سیستئین در این آزمایش نشان می­دهد که تیمار T₀C₁₀ بیشترین زنده‌مانی (0.05P≤) و کمترین میزان اسپرم­های آپوپتوز شده را داشت. براساس این نتایج می­توان نتیجه گرفت که سیستئین اثری بر اسپرم گاو نداشته و تره­هالوز اثر منفی بر کیفیت اسپرم گاو دارد.

واژه­های کلیدی: انجماد اسپرم، محافظت انجمادی، آنتی‌اکسیدان، منی گاو

* نویسنده مسئول، تلفن:  02632248082 ،  پست الکترونیکی: mzhandi@ut.ac.ir

مقدمه

بی­گمان تلقیح مصنوعی یکی­از موفق­ترین فناوری­های تولیدمثلی در صنعت گاو شیری است که به‌عنوان یک ابزار ارزشمند در برنامه­های ژنتیکی به شمار می­رود (16). موفقیت در یک برنامه تلقیح مصنوعی به مدیریت صحیح جمع­آوری، انجماد و یخ­گشایی بهینه منی و ذخیره­سازی مناسب آن بستگی دارد (2). گزارش­های بسیاری وجود دارد که نشان می­دهند، فرایند انجماد–یخ­گشایی منجر به تولید گونه­های فعال اکسیژن (ROS) می­شود که در تحرک، استحکام غشا و باروری اسپرم اختلال ایجاد می­کند و باعث واکنش زودهنگام آکروزومی، از دست دادن محتویات سلولی، کاهش جنبایی و باروری اسپرم می­شود (7). تنش اکسیداتیو درنتیجه عدم تعادل بین تولید رادیکال­های آزاد و آنتی­اکسیدان­ها رخ می­دهد و می­تواند منجر به تخریب، بدشکل شدن و احتمالاً ناباروری اسپرم شود. گزارش‌شده است که از یک‌سو تولید رادیکال­های آزاد به­وسیله اسپرم، یک فرایند طبیعی فیزیولوژیک است و نقش بسیار مهمی را در فرایند فیزیولوژیکی اسپرم همانند ظرفیت­دار شدن و واکنش آکروزومی ایفا می­کند. اما از طرف دیگر، مقادیر بالای ROS عامل اصلی اختلال در عملکرد اسپرم است (6 و 12). علاوه برآن، گونه­های فعال اکسیژن توسط اسپرم­های مرده، اکسیژن محیطی و یا اتمسفری تولید می­شوند و باعث کاهش جنبایی (احتمالاً به­وسیله از دست دادن ATP داخل سلولی که منجر به آسیب آکسونمال می‌شود)، کاهش یکپارچگی غشا و درنهایت کاهش باروری می­شوند (6 و 8).

غشای پلاسمایی یکی­از اجزای کلیدی سلول می­باشد که باید در حین انجماد به‌منظور زنده­ماندن سلول به شکل مناسبی از آسیب­های ایجادشده حفظ شود (1). وجود مقدار زیاد اسیدهای چرب غیراشباع در غشا موجب مستعد شدن اسپرم به واکنش پراکسیداسیون لیپیدی در حضور رادیکال­های آزاد می­شود (28). پژوهش‌های مختلف نشان داده­اند که محافظت از غشای اسپرم در مقابل واکنش اکسیداتیو، توسط آنتی­اکسیدان­ها صورت می­گیرد. درواقع آنتی­اکسیدان­ها با کاهش تشکیل، حذف و پاک­سازی و غیرفعال­سازی رادیکال­های آزاد، شرایط سلولی را به‌گونه‌ای تغییر می­دهند که جنبایی و کیفیت اسپرم حفظ شود. بسیاری از ترکیبات نظیر برخی از عصاره­های گیاهی، برخی مواد شیمیایی صنعتی و برخی از اسیدهای آمینه می­توانند به‌عنوان آنتی­اکسیدان فعالیت کرده و رادیکال­های آزاد را در محیط خنثی کنند (26). یکی­از اسیدآمینه­هایی که در پژوهش­های مختلف نقش آنتی­اکسیدانی آن تأییدشده است، سیستئین است (6). سیستئین اسیدآمینه‌ای با وزن مولکولی پایین است که دارای گروه تیول می­باشد. گروه­های تیول مانع از تشکیل پراکسید هیدروژن در اسپرم می­شوند. همچنین، تیول پیش­ماده بیوسنتز گلوتاتیون درون­سلولی است و سطح آن را افزایش می­دهد. از سوی دیگر، سیستئین می­تواند از فعالیت متابولیت­های سمی اکسیژن که باعث پراکسیداسیون لیپیدی غشای پلاسمایی اسپرم می­شوند، جلوگیری کند (34).

یکی دیگر از عوامل اصلی تخریب سلول اسپرم طی فرایند انجماد، تشکیل کریستال­های یخ در داخل سلول است که درنهایت منجر به کاهش زنده­مانی اسپرم می­شود. یکی از راه­های جلوگیری از تشکیل کریستال­های یخ، استفاده از قندها در رقیق­کننده است (1و 3). قندها ترکیباتی هستند که در مطالعات مختلف، نقش سرما محافظی آن­ها اثبات‌ شده است (16). افزون براین، قندها، نقش­های دیگری از قبیل فراهم کردن انرژی برای اسپرم (10) و حفظ فشار اسمزی رقیق‌کننده را نیز (1 و 29) ایفا می­کنند. دراین‌بین و براساس گزارش­های مختلف، به نظر می­رسد که دی­ساکارید تره­هالوز اثر بهتری نسبت به سایر قندها بر اسپرم داشته باشد (1، 25و 36). برخی از پژوهش­گران گزارش کرده­اند که تره­هالوز یک محیط هایپرتونیک ایجاد می­کند و با ایجاد فشار اسمزی باعث دهیدراسیون اسمزی سلول قبل از انجماد می­شود. این اثر، یخ­زدگی داخل سلولی را کاهش و باعث کاهش تعداد سلول­های آسیب‌دیده به­وسیله کریستال­های یخ می­شود (30). در پژوهشی دیگر، گزارش‌شده است که فرایند انجماد – یخ‌گشایی، ظرفیت­دار شدن اسپرم را تحریک و باعث کاهش باروری آن می‌شود. تره­هالوز پتانسیل کاهش ظرفیت­دار شدن را دارد و یکپارچگی آکروزوم را حفظ می­کند (31). در خصوص اثر متقابل تره­هالوز و سیستئین، گزارش‌شده است که اثر افزودن همزمان تره­هالوز و سیستئین باعث بهبود فراسنجه‌های کیفی اسپرم قوچ طی سردسازی شده است (13). علاوه بر آن بدر و همکاران (2014) گزارش کردند که ترکیب تره­هالوز (5 میلی­مول)، سیستئین (100 میلی­مول) و هایپوتائورین (20 میلی­مول) باعث بهبود فراسنجه­های کیفی اسپرم گاومیش پس از یخ­گشایی می­شود (5). بنابراین، باتوجه به این فرضیه که احتمالاً ترکیب تره­هالوز و سیستئین بااثر هم‌افزایی ایجادشده، سبب بهبود ویژگی­های اسپرم گاو پس از یخ‌گشایی می‌شوند، هدف این پژوهش مطالعه اثر افزودن همزمان سطوح مختلف سیستئین به‌عنوان یک آنتی‌اکسیدان و تره­هالوز به‌عنوان منبع قندی در رقیق­کننده بر فراسنجه‌های کیفی اسپرم گاو بود.

مواد‌ و روشها

جمع­آوری منی: دراین پژوهش از منی سه راس گاو نر هلشتاین با میانگین سنی 5/2-2 سال استفاده شد. گاوهای نر در مرکز تولید و انجماد اسپرم در فیروزکوه (شرکت زرژن) نگه­داری می­شدند. جمع­آوری منی با استفاده از واژن مصنوعی از گاوهای نر آموزش‌دیده، به مدت سه هفته و به‌صورت دو بار در هفته (درمجموع 6 تکرار) انجام شد.

محیط انجماد: درپژوهش حاضر از رقیق­کننده تجاری اپتیدیل (IMV، فرانسه) استفاده گردید. طبق راهنمای موجود برای رقیق‌کننده اپتیدیل، میزان 500 میلی­لیتر مایع رقیق­کننده در داخل 750 میلی­لیتر آب دوبار تقطیر ریخته شده و سپس به مدت 5 دقیقه روی شیکر (IMV، فرانسه) با دمای 50 درجه سانتی­گراد هم زده شد. پس‌ازآن، رقیق­کننده پایه داخل حمام آب 37 درجه سانتی­گراد قرارداده شد. تیمارهای آزمایش به‌صورت ترکیب دو سطح از تره­هالوز (شامل سطوح صفر و 100 میلی­مول) و سه سطح سیستئین (شامل سطوح صفر، 5 و 10 میلی­مول) در قالب طرح فاکتوریل 3×2 [6 تیمار شامل: 1- رقیق­کننده فاقد سیستئین و تره­هالوز (T0C0)، 2- رقیق­کننده دارای 5 میلی­مول سیستئین  و فاقد تره­هالوز (T0C5)، 3- رقیق­کننده دارای 10میلی­مول سیستئین و فاقد تره­هالوز (T0C10)، 4- رقیق­کننده فاقد سیستئین و دارای 100 میلی­مول تره­هالوز (T100C0)، 5- رقیق­کننده دارای 5 میلی­مول سیستئین و 100 میلی­مول تره­هالوز (T100C5) و 6- رقیق­کننده دارای 10 میلی­مول سیستئین و 100 میلی­مول تره­هالوز (T100C10)] آماده شدند.

فرآوری و انجماد منی: پس­از جمع­آوری منی، نمونه­ها به‌طور هم­زمان در حمام خشک 37 درجه سانتی­گراد قرارگرفتند و بررسی­های ابتدایی نظیر ارزیابی جنبایی به روش چشمی و به‌وسیله میکروسکوپ نوری و تعیین غلظت به‌وسیله لام هموسایتومتر روی آن­ها انجام شد. نمونه­هایی با غلظت بیشتر از 109 × 2 اسپرم در میلی­لیتر، جنبایی پیش­رونده بیش­تر از 75 درصد در هر انزال به‌عنوان منی بهینه در نظر گرفته ­شد (14). پس از اطمینان از بهینه بودن کیفیت نمونه­ها، برای از میان برداشتن اثرات فردی، نمونه­ها با یکدیگر آمیخته شدند و به شش قسمت مساوی (به تعداد تیمارهای آزمایش) تقسیم شدند. رقیق­سازی تیمارها تا رسیدن به غلظت پایانی اسپرم به میزان 106 × 100 اسپرم در هر میلی­لیتر انجام شد. پس‌ازاین مرحله، لوله­های آزمایش به مدت 10 دقیقه در حمام آب 37 درجه سانتی­گراد قرار داده‌شده و سپس به مدت 150 دقیقه داخل کابینت سرد (IMV، فرانسه) در 4 درجه سانتی‌گراد قرارداده شدند. پس از گذشت این زمان، نمونه­های داخل کابینت سرد به درون پایوت­های 25/0 میلی­لیتری (IMV، فرانسه) کشیده شدند. در گامه بعد، پایوت­های پرشده برای انجماد در داخل دستگاه قابل‌برنامه‌ریزی انجماد اسپرم (IMV، فرانسه) گذاشته شدند. سپس دما تا رسیدن به 10- درجه سانتی­گراد با سرعت منفی 3 درجـه در هـردقیقه کاهش یافت تا از رسیدن هرگونه شوک دمایی در این مرحله حساس جلوگیری شود و پس‌ازاین دما که مرحله کریستال شدن شروع می­شود دما با سرعت منفی 40 درجـه سـانتی­گراد در هر دقیقه به 110- درجه سانتی­گراد رسید. سپس دما با سرعت منفی 20 درجه سانتی‌گراد در هر دقیقه به 140- درجه سانتی­گراد رسید. پس از رسیدن دما به 140- درجه سانتی­گراد، نمونه­ها به‌سرعت برداشته شدند و بی‌درنگ در درون لیوان­های پر از ازت قرارگرفته و درنهایت در تانک ازت برای مدت یک ماه ذخیره شدند.

ارزیابی اسپرم پس از یخ­گشایی:

جنبایی: در این پژوهش، یخ­گشایی در دمای 37 درجه سانتی­گراد و به مدت 30 ثانیه صورت گرفته و فراسنجه­های جنبایی با میکروسکوپ نوری– فاز کنتراست و با استفاده از نرم­افزار CASA (Sperm Class analyzer (SCA), Version 5.1; Microptic, Barcelona, Spain) ارزیابی شد. فراسنجه­های جنبایی شامل جنبایی پیشرونده (PM)، سرعت واقعی اسپرم درمسیر طی شده ( VCL)، سرعت اسپرم در خط مستقیم (VSL)، میانگین سرعت در مسیر مستقیم (VAP)، معیار خطی بودن حرکت اسپرم (LIN)، معیار مستقیم بودن حرکت اسپرم (STR)، متوسط زاویه چرخش (WOB)، حداکثر دامنه حرکات جانبی (ALH) و متوسط زاویه چرخش (MAD)، فرکانس حرکات جانبی (BCF) بودند.

فعالیت غشاء اسپرم: دراین پژوهش، برای تعیین فعالیت غشای اسپرم از آزمون HOS استفاده شد. باتوجه به این­که اسمولاریتی محیط این آزمون، 100 میلی­اسمول در کیلوگرم و اسمولاریته­ی موردنیاز برای اسپرم گاو 525 – 425 میلی­اسمول در کیلوگرم است. بنابراین، اسپرم با قرارگرفتن در یک محیط با اسمولاریتی پایین به‌سرعت واکنش می­دهد و انتهای دم آن‌ها گره می­خورد. بدیهی است که تنها اسپرم­های زنده و دارای غشای فعال (سالم) توانایی دارند به­این محیط واکنش دهند. برای ساخت محیط HOS، 9/0 گرم فروکتوز و 49/0 گرم سدیم سیترات در 100 میلی‌لیتر آب مقطر حل شد (20). سی میکرولیتر از منی یخ­گشایی شده به 300 میکرولیتر از محیط هایپواسموتیک HOS افزوده شد. سپس 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی­گراد انکوبه شد. پس از گذشت این زمان، از نمونه­ها اسلاید تهیه‌شده و تعداد 200 اسپرم از هر اسلاید شمارش شد و درصد اسپرم­های بادم گره‌خورده و متورم (دارای غشای فعال) محاسبه شد.

یکپارچگی آکروزوم: برای اندازه­گیری یکپارچگی آکروزم از روشی که توسط تس و همکاران (2009) توضیح داده‌شده بود باکمی تغییرات استفاده شد (32). در این روش، 500 میکرولیتر از اسپرم یخ­گشایی شده
(106×1 اسپرم/میلی­لیتر) در میکروتیوپی ریخته و با سرعتی معادل g 600 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس محلول رویی بیرون ریخته شده و پلت اسپرم در 50 میکرولیتر اتانول 96 درصد حل شد. پس از مخلوط شدن کامل اسپرم با اتانول، محلول بدست آمده به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی­گراد نگه­داری شد. سپس، 20 میکرولیتر از محلول روی یک لام قرار داده‌شده و به شکل یک‌لایه نازک پخش شد تا اتانول نمونه کاملاً تبخیر گردد. پس‌ازاین مرحله، 20 میکرولیتر رنگ PSA (Pisum sativum agglutinin) روی نمونه ریخته شده و به مدت 10 تا 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگه­داری شد. اسلاید بدست آمده با استفاده از آب مقطر (15 بار) شستشو شده و پس از خشک شدن و آغشته شدن با گلیسرول، لامل گذاری شد. سپس، 200 اسپرم در هر اسلاید با میکروسکوپ فلورسنت (Olympus, BX51, Japan) ارزیابی شد. اسپرم­هایی با سر، سبز به‌عنوان آکروزوم سالم و اسپرم دارای یک کمربند سبز در قسمت استوایی یا بدون رنگ فلورسنت سبز به‌عنوان اسپرم­های با آکروزم تخریب‌شده در نظر گرفته شدند (شکل 1) (9).

شکل 1- اسپرم­های رنگ­آمیزی شده بارنگ PSA برای سنجش یکپارچگی آکروزوم.

ارزیابی   وضعیت   آپوپتوزیس  ( جابجایی   فسفاتیدیل

سرین): برای سنجش جابجایی فسفاتیدیل سرین اسپرم از کیت آنکسین-V (Immune Quality Products (IQP), Groningen, The Netherlands)  و براساس دستورالعمل ارائه‌شده توسط شرکت سازنده استفاده شد. آنکسین-V یک پروب وابسته به کلسیم است که می­تواند بیرون آمدن فسفاتیدیل سرین را در غشای اسپرم مشخص نماید. در مرحله نخست، اسپرم در یک بافر کلسیم شستشو داده شده و با غلظت یک‌میلیون اسپرم در هر میلی­لیتر محلول تنظیم شد. سپس، 10 میکرولیتر آنکسین-V متصل به پروب FITC به 100 میکرولیتر از محلول اسپرم اضافه‌شده و به مدت 20 دقیقه روی یخ انکوبه شد. پس‌ازآن، 10 میکرولیتر رنگ پروپیدیوم آیوداید (PI) به محلول اضافه‌شده و محلول بدست آمده مجدداً به مدت 10 دقیقه روی یخ انکوبه شد. سپس، برای هر نمونه 10000 رخداد به­وسیله دستگاه فلوسایتومتر (Becton Dickinson, San Khosoz, CA, USA) ثبت شد. اسپرم­ها به چهار گروه زیر تقسیم شدند: اسپرم­های آپوپوتوز نشده ( آنکسین منفی و  PIمنفی)، اسپرم­هایی که اوایل مرحله آپوپتوز بودند (آنکسین مثبت و PI منفی)، اسپرم­هایی که در اواخر مرحله آپوپتوز بودند (آنکسین منفی و PI مثبت) و اسپرم­های نکروز شده (آنکسین مثبت و PI مثبت) (35).

آنالیز آماری: این آزمایش در قالب طرح آماری فاکتوریل 3 × 2 با شش تکرار انجام شد. داده­ها به‌صورت میانگین حداقل مربعات ± انحراف معیار میانگین (Lsmean ± SEM) نشان داده‌شده‌اند. داده­ها با نرم­افزار آماری SAS 9.1 (24) و به رویه­ی Mixed با استفاده از مدل آماری زیر تجزیه ‌و تحلیل شدند. برای مقایسه میانگین­های بدست آمده از آزمون توکی استفاده شد.

Y_ijkl=μ+C_i+T_j+R_k+CT_ij+e_ijkl

 Yijkl: مشاهدات، μ: میانگین جامعه، Ci: اثر سیستئین (i=1, 2, 3)، :Tj  اثر ترهالوز (j=1, 2)، Rk: اثر تکرار (j=1, 2, …, 6)، TCij: برهمکنش تره­هالوز و سیستئین، eilk: اثرات باقیمانده.

نتایج

نتایج حاصل از این آزمایش نشان می­دهد که سیستئین اثری بر فراسنجه­های حرکتی اسپرم گاو پس­از یخ‌گشایی ندارد (0.05P≥). همچنین، میزان جنبایی پیش­رونده، سایر فراسنجه­های حرکتی، یکپارچگی غشای پلاسمایی و یکپارچگی آکروزوم و زنده­مانی گروه T0 بیشتر از گروه T100 بودند (0.01P≤). نتایج گزارش‌شده حاکی از آن است که اثر متقابل تره­هالوز و سیستئین بر فراسنجه­های جنبایی، یکپارچگی غشای پلاسمایی یکپارچگی آکروزوم و زنده­مانی ازنظر آماری معنی­دار نبودند (جدول 1 و 2).

جدول 1- اثر سطوح مختلف تره­هالوز و سیستئین بر فراسنجه­های جنبایی، یکپارچگی آکروزم و غشای پلاسمایی اسپرم گاو پس از یخ­گشایی.

a و b: میانگین­های دارای حروف غیرمشابه نشان­دهنده­ی وجود تفاوت معنی­دار می­باشد (**: P ≤ 0.01، ns: عدم وجود تفاوت معنی­دار)

جدول 2- اثر سطوح مختلف تره­هالوز و سیستئین بر یکپارچگی  و فعالیت غشای پلاسمایی و یکپارچگی غشای آکروزومی اسپرم گاو پس از یخ‌گشایی.

a و b: میانگین­های دارای حروف غیرمشابه نشان­دهنده­ی وجود تفاوت معنی­دار می­باشد (**: P ≤ 0.01، *: P ≤ 0.05، ns: عدم وجود تفاوت معنی­دار)

نتایج ارائه‌شده در جدول 3 نشان می­دهد که سطوح مختلف سیستئین هیچ اثری بر میزان اسپرم­های زنده (آپوپتوز نشده) نداشته است (0.05P≥). همچنین، افزودن تره­هالوز باعث کاهش میزان اسپرم­های زنده و افزایش میزان اسپرم‌ها در مرحله نهایی آپوتوزیس نسبت به گروه فاقد تره­هالوز شده است (0.05P≤).

جدول 3- اثر سطوح مختلف تره­هالوز و سیستئین بر وضعیت آپوپتوز اسپرم گاو پس از فرآیند یخ­گشایی.

 a و b: میانگین­های دارای حروف غیرمشابه نشان­دهنده­ی وجود تفاوت معنی­دار می­باشد (**: P ≤ 0.01، *: P ≤ 0.05، ns: عدم وجود تفاوت معنی­دار)

نتایج گزارش‌شده در نمودارهای 1 و 2 اثرات متقابل سطوح مختلف تره­هالوز و سیستئین در مورد اسپرم­های زنده و اسپرم­های در مرحله نهایی آپوپتوزیس را نشان می­دهد. تیماری که حاوی 10 میلی­مول سیستئین و بدون تره­هالوز بود (T0C10) بیشترین زنده­مانی (0.05P≤) و کمترین میزان اسپرم­های آپوپتوز شده را نشان داده است. براساس این نتایج، نامطلوب­ترین ترکیب، گروه تیماری حاوی 100 میلی­مول تره­هالوز و 10 میلی­مول سیستئین (T100C10) بوده است (0.05P≥ ).

نمودار 1- اثر متقابل سطوح مختلف تره­هالوز و سیستئین بر میزان زنده­مانی اسپرم­ها. T₀C₀: رقیق‌کننده بدون ترهالوز و بدون سیستئین، T₀C₅:رقیق­کننده بدون ترهالوز و حاوی 5 میلی­مول سیستئین، T₀C₁₀: رقیق­کننده بدون ترهالوز و حاوی 10 میلی­مول سیستئین، T₁₀₀C₀:رقیق­کننده حاوی 100 میلی­مول ترهالوز و بدون سیستئین، T₁₀₀C₅:رقیق­کننده حاوی 100 میلی­مول ترهالوز و 5 میلی­مول سیستئین و T₁₀₀C1₀:رقیق­کننده حاوی 100 میلی­مول ترهالوز و 10 میلی­مول سیستئین.

نمودار 2- اثر متقابل سطوح مختلف تره­هالوز و سیستئین بر میزان اسپرم­هایی که در مرحله نهایی آپوپتوز هستند. T₀C₀: رقیق‌کننده بدون ترهالوز و بدون سیستئین، T₀C₅:رقیق­کننده بدون ترهالوز و حاوی 5 میلی­مول سیستئین، T₀C₁₀: رقیق­کننده بدون ترهالوز و حاوی 10 میلی­مول سیستئین، T₁₀₀C₀:رقیق­کننده حاوی 100 میلی­مول ترهالوز و بدون سیستئین، T₁₀₀C₅:رقیق­کننده حاوی 100 میلی­مول ترهالوز و 5 میلی­مول سیستئین و T₁₀₀C1₀:رقیق­کننده حاوی 100 میلی­مول ترهالوز و 10 میلی­مول سیستئین.