مجله پژوهشهای جانوری (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)
تاثیر خواص ضدباکتریایی نانوذره اکسید روی بر بارباکتریایی کل و بار باکتریایی گرم منفی در محیطهای آکواریوم آب شیرین دارای ماهی قرمز (Carassius auratus Linnaeus, 1758)
نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانش آموخته کارشناسی ارشد دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، دانشکده شیلات و محیطزیست، گروه تکثیر و پرورش آبزیان
2 عضو هیات علمی دانشگاه علوم پزشکی گلستان، مرکز تحقیقات علوم آزمایشگاهی/دانشکده پیراپزشکی، گروه علوم آزمایشگاهی
3 عضو هیات علمی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، دانشکده شیلات و محیطزیست، گروه تکثیر و پرورش آبزیان
چکیده
در سال های اخیر استفاده از ترکیبات کنترل کننده جمعیت باکتریها در آب محیط پرورش ماهیان بسیار موردتوجه قرار گرفته است، در این راستا انتخاب ماده ضدعفونی کننده با خاصیت ضد باکتریایی مناسب از اهمیت بالایی برخوردار میباشد. در این مطالعه نانوذره اکسید روی به روش سل-ژل سنتز شده و پس از تعیین حداقل غلظت باکتری کشی (MBC ) نانوذره اکسید روی به روش استانداردرقت‌های سریالی ماکرودایلوشن، جمعیت باکتریایی محیط آکواریوم در دو مرحله شامل آکواریومهای دارای ماهی قرمز و آکواریومهای فاقد ماهی مورد ارزیابی قرار گرفت. در مرحله اول غلظتهای 0، 2 و 4 برابر MBC و در مرحله دوم غلظتهای 0، 2، 4 و 8 برابر MBC در زمانهای مورد نظر به آب آکواریومها افزوده و روند ضد باکتریایی نانوذره اکسید روی مورد بررسی قرار گرفت. MBC نانوذره اکسید روی برای جمعیت باکتریایی محیط آکواریوم 35/0 میکروگرم بر میلی لیتر اندازهگیری شد. بر اساس فعالیت ضد باکتریایی نانوذره اکسید روی مشاهده شده، بار باکتریایی کل آب آکواریوم در محیط دارای ماهی قرمز با افزایش غلظت نانوذرات و افزایش زمان تماس کاهش یافت. بیشترین روند کاهش بار باکتریایی کل در مواجهه با نانوذره اکسید روی در غلظت 4 برابرMBC مشاهده شد، همچنین روند کاهش بار باکتریایی گرم منفی محیط آکواریوم در هر دو غلظت 2 و 4 برابرMBC تقریبا به یک میزان مشاهده شد
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
The effect of antibacterial properties of zinc oxide nanoparticles on total count of bacterial and Gram-negative bacterial in the fresh water aquariums with goldfish (Carassius auratus Linnaeus, 1758)
نویسندگان [English]
- Samira Faramarzpour 1
- Seyedeh Sedigheh Hoseini 2
- Mohammad Sudagar 3
- Mohammad Mazandarani 3
1 M.Sc. Graduate of Fishery Dept., Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan, I.R. of Iran
2 Labratory Sicences Research Center/Labratory Sicence Dept., Faculty of Paramedicine, Golestan University of Medical Sciences, Gorgan, I.R. of Iran
3 Fishery Dept., Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan, I.R. of Iran
چکیده [English]
In recent years the using of population controller component for bacteria in the water of the fish is highly regarded. in this context, the selection of appropriate disinfectant with antibacterial property is very important. In this study zinc oxide nanoparticles synthesized by sol-gel method and the minimum bactericidal concentration (MBC) of zinc oxide nanoparticles were evaluated to standard methods broth macrodilution serial dilutions, to determine the bacterial population in the aquarium environment includes two steps aquarium with goldfish and aquarium without fish. In the first step, concentrations of 0, 2 and 4 of the MBC and in the second step, concentrations of 0, 2, 4 and 8 of the MBC at special times added to aquarium water and antibacterial nanoparticles of zinc oxide were studied. MBC were measured 0.35 ϻg/ ml for bacterial populations of aquarium environment. The antibacterial activity of nanoparticle zinc oxide was observed, the total count of bacterial reduced in aquarium water with goldfish by increasing the concentrations of nanoparticles and increased contact time. The process of reducing the total count of bacterial in concentrations of 4 to MBC were observed, as well as the reduction of gram-negative bacterial in aquariums environment in both of 2 and 4 of MBC almost to the same extent was observed (no significant differences P>0.05).
کلیدواژه‌ها [English]
- Antibacterial properties
- Nanoparticle zinc oxide
- Minimum bactericidal concentration
- total count of Bacterial
- gram negative Bacterial
تأثیر خواص ضد باکتریایی نانوذره اکسید روی بر بار باکتریایی کل و بار باکتریایی گرم منفی در محیطهای آکواریوم آب شیرین دارای ماهی قرمز
(Carassius auratus Linnaeus, 1758)
سمیرا فرامرزپور1، سیده صدیقه حسینی2* ، محمد سوداگر1، و محمد مازندرانی1
1 گرگان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، دانشکده شیلات و محیطزیست، گروه تکثیر و پرورش آبزیان
2 گرگان، دانشگاهعلوم پزشکی گلستان، مرکز تحقیقات علوم آزمایشگاهی/دانشکده پیراپزشکی، گروه علوم آزمایشگاهی
تاریخ دریافت: 1/11/95 تاریخ پذیرش: 29/6/96
چکیده
در سال‌های اخیر استفاده از ترکیبات کنترل‌کننده جمعیت باکتریها در آب محیط پرورش ماهیان بسیار مورد توجه قرارگرفته است، در این راستا انتخاب ماده ضدعفونی‌کننده با خاصیت ضد باکتریایی مناسب از اهمیت بالایی برخوردار میباشد. در این مطالعه نانوذره اکسیدروی به روش سل-ژل سنتز شده و پس از تعیین حداقل غلظت باکتری کشی (Minimum bactericidal concentration ) نانوذره اکسیدروی به روش استاندارد رقتهای سریالی ماکرودایلوشن، جمعیت باکتریایی محیط آکواریوم در دو مرحله شامل آکواریومهای دارای ماهیقرمز و آکواریومهای فاقد ماهی مورد ارزیابی قرارگرفت. در مرحله اول غلظتهای صفر، 2 و 4 برابر MBC و در مرحله دوم غلظتهای صفر، 2، 4 و 8 برابر MBC در زمانهای موردنظر به آب آکواریومها افزوده و روند ضد باکتریایی نانوذره اکسیدروی مورد بررسی قرارگرفت. MBC نانوذره اکسیدروی برای جمعیت باکتریایی محیط آکواریوم 35/0 میکروگرم بر میلیلیتر اندازهگیری شد. بیشترین روند کاهش بار باکتریایی کل در مواجهه با نانوذره اکسیدروی در غلظت 4 برابرMBC و بعد از 5 روز مشاهده شد. نتایج بار باکتریایی کل آب محیط آکواریوم در محیط فاقد ماهی نشان‌دهنده‌ی روند کاهش در غلظت 2 برابر MBC بود درحالی‌که در غلظت 4 و 8 برابر MBC فعالیت ضد باکتریایی نانوذره اکسیدروی نسبت به شاهد کاهش و بار باکتریایی کل محیط آکواریوم از روز 10 افزایش یافت، بنابراین باتوجه به اثرات ضد باکتریایی قابل‌قبول نانوذره اکسیدروی بر جمعیت باکتریایی محیط آکواریوم،این ماده میتواند به‌عنوان یک ماده ضد باکتریایی مورداستفاده قرارگیرد.
واژه‌های کلیدی:ZnO، ضد باکتریایی،MBC.
* نویسنده مسئول، تلفن: 01732540858 ، پست الکترونیکی: Hosseini.s@goums.ac.ir
مقدمه
درسال‌های اخیر، دانش فناوری نانو به‌عنوان پتانسیل عظیم برای ایجاد انقلابی بزرگ در صنعت آبزیپروری و شیلات مطرح‌شده که میتواند روشهای جدیدی در آبزیپروری، بیوتکنولوژی، ژنتیک، تکثیر و بهداشت آبزیان باشد. این مواد در اشکال نانو دارای خواص منحصربه‌فرد فیزیکی، شیمیایی و الکتریکی میباشند (10 و 20).
اکسیدهای فلزی غیرآلی به‌طور فزاینده‌ای برای فعالیت‌های ضد میکروبی استفاده میشوند. مزایای اصلی استفاده از اکسیدهای فلزی ثبات، استحکام، عمر مفید طولانی و فعالیت ضد میکروبی در برابر پاتوژنهای مختلف میباشد (3 و 4). فعالیت ضد باکتری پودر MgO، CaO و اکسیدروی در مقابل برخی از گونه باکتریهای بررسی شد، اکسید روی دارای فعالیت ضد میکروبی قابل توجه در محدوده pH طبیعی (7 pH=) میباشد و یکی از عناصر ضروری محسوب میشود (17).
تحقیقات اندکی درخصوص مکانیسم عمل نانوذره اکسیدروی در محیط آکواریوم و برای آبزیان انجام‌شده، اما تصور میشود تولید هیدروژن پراکسید یک عامل اصلی فعالیت ضد باکتری میباشد، همچنین اتصال ذرات بر روی سطح باکتری باتوجه به نیروهای الکترواستاتیک میتواند یک مکانیزم ضد باکتریایی باشد (25 و 27). نانوذرات اکسید روی فعالیت ضد باکتری قوی در طیف گسترده‌ای از باکتریها دارند، مکانیسم غالب برای فعالیت‌های ضد باکتری این نانوذره فعل‌و انفعالات شیمیایی بین H2O2 و باکتریها میباشد، چراکه به‌محض تماس باکتری با نانو ذرات اکسیدروی، نفوذ به پوشش سلول و به‌هم‌ریختگی غشاء باکتری جهت مهار رشد باکتری میشود بااتصال یون Zn+2 به غشاء میکروارگانیسم‌ها فاز تأخیر رشد میکروبی طولانی میشود (27).
نانوذرات ازجمله مواد مفید جهت از بین بردن آلاینده‌های موجود در آب میباشد، باتوجه به اینکه استفاده گسترده از آنتیبیوتیکها در درمان بیماریهای ماهیان سبب مقاوم شدن برخی باکتریها به‌خصوص باکتریهای گرم منفی میشود، امروزه از نانوذرات جهت حذف برخی باکتریها از طریق روش بهینه جهت پاک‌سازی آب استخر پرورش ماهی استفاده میشود. ماهیقرمز قدیمیترین ماهی زینتی پرورش‌یافته در چین بوده است و امروزه از رایجترین ماهیانی است که در آکواریومها یافت میشود، این ماهی به‌عنوان مدل آزمایشگاهی و مناسب مطرح میشود. بیماریهای باکتریایی شایعترین مشکل عفونی ماهیان زینتی است و اکثر عفونتهای باکتریایی توسط ارگانیسمهای گرم منفی ایجاد میشوند (14).
قرار گرفتن ماهی در محیط آکواریوم متفاوت از شرایط طبیعی میباشد، لذا در شرایط مختلف منجر به استرس بالایی در این موجودات میشود که در این صورت شرایط برای فعالیت بیشتر باکتریهای فرصت‌طلب و بیماریزا فراهم میگردد. بنابراین کنترل شرایط تحت پرورش بخصوص جمعیت باکتریایی این محیط میتواند در کنترل سلامت ماهیان مفید باشد به همین دلیل در این بررسی اثرات ضد باکتریایی نانوذره اکسید روی بر کنترل جمعیت باکتریایی محیط آکواریوم مورد بررسی قرارگرفته است.
مواد و روشها
شرایط پرورش ماهی: این مطالعه در زمستان 93 در مرکز آبزیپروری شهید ناصر فضلی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان انجام گرفت، به این منظور تعداد 48 قطعه ماهیقرمز با میانگین وزنی 98/0±70/5 گرم و میانگین طول 63±93/6 تهیه و به مدت 2 هفته با شرایط جدید سازگار و با غذای تجاری بیومار به میزان 3 درصد بیومس 2 بار در روز غذادهی شدند. در طی دوره پرورش دمای آب، pH و سختی آب به ترتیب 71/0±98/16، 87/7 درجه سانتی گراد وppm 260 اندازهگیری و ثبت شدند.
طرح آزمایش: این آزمایش به‌صورت طرح کاملاً تصادفی (CRD) در 7 تیمار با 3 تکرار که شامل 3 تیمار در محیط آکواریوم فاقد ماهی و4 تیمار در محیط آکواریوم دارای ماهیقرمز انجام گرفت، ماهیان به‌صورت تصادفی به 6 آکواریوم با حجم آبگیری 04/33 انتقال یافتند، سپس به منظور انجام آزمایش تیماربندی انجام شد.
آماده‌سازی نانوذره اکسیدروی: پودر پیشساز استاتروی (شرکت مرک آلمان) با فرمولZn(C2H3O2)2.2H2O و جرم مولکولی g/mLµ 5/219 تهیه و برای سنتز نانوذره اکسیدروی استفاده گردید. 5 گرم استات روی با 50 میلیلیتر آبمقطر دیونیزه در ارلن ریخته و در حرارت 80 درجه سانتیگراد به مدت 3-4 ساعت به نحوی مخلوط گردید تا به یکپنجم حجم اولیه رسید، محلول به دست‌آمده محلول کلوئیدی بود، پس‌ازآن به مدت 12 ساعت در فور با دمای 5±100 درجه سانتی گراد قرارداده شد. تا به‌تدریج خشک شود. پس‌ازآن در کوره الکتریکی در دمای 5±300 درجه سانتی گراد به مدت 12-24 ساعت قرار دادهشد تا کریستال‌ها کامل و پودر سفیدرنگ حاصل شود (8). ماده مؤثر نانوذره سنتز شده ppm 123 محاسبه شد. برای تأیید پراکنش مناسب و مشخص کردن فازهای کریستالی نمونه و اندازهگیری خصوصیات ساختاری نانوذره اکسیدروی از آزمون (X ray diffraction) XRD استفاده شد (16).
تهیه سوسپانسون باکتریایی آب آکواریوم: پساز گذشت 2 هفته سازگاری ماهیان، نمونه باکتریایی از آب کف آکواریوم معادل با کدورت نیم مک فارلند (108×5/1باکتری در هر میلیلیتر) تهیه شد. برای اطمینان از ایجاد کدورت مذکور، جذب آن به‌وسیله دستگاه اسپکتروفوتومتر مرئی- فرابنفش (USA; UNICO-2100) در محدوده طول‌موج 600 نانومتر اندازهگیری و میزان جذب در محدوده 08/0 تا1/0 تنظیم شد (7).
تعیین حداقل غلظت باکتریکشی (MBC) نانوذره اکسید روی بر باکتریهای آب آکواریوم به روش ماکرودایلوشن: جهت بررسی کمیت باکتریکشی نانوذره اکسید روی از روش استاندارد رقتهای سریالی ماکرودایلوشن استفاده و حداقل غلظت مهارکنندگی از رشد (MIC )، حداقل غلظت کشندگی اکسیدروی (MBC) تعیین گردید. برای تعیین MIC از یک سری 12 تایی از لوله‌های آزمایش استفاده شد. یک لوله به‌عنوان کنترل مثبت (حاوى نانوذره اکسیدروی به‌علاوه محیط کشت) و یک لوله به‌عنوان کنترل منفی (حاوی سوسپانسیون میکروبى به‌علاوه محیط کشت) که جهت تأیید عدم ایجاد کدورت در نظر گرفته شد. در 12 لوله ابتدا رقتهایی از نانوذره اکسیدروی با مقدار 6/1 اضافه و سوسپانسیون باکتریایی با مقدار استاندارد و مساوی به میزان 1/0 سیسی تلقیح گردید، سپس به مدت 24 ساعت در دمای 37درجه سانتی گراد در انکوباتور شیکردار با 200 دور در دقیقه قرار گرفتند. پساز انکوباسیون جهت تعیین حداقل غلظت کشندگی باکتریایی مقدار 100 میکرولیتر، از لوله‌های فاقد کدورت در محیط نوترینت آگار کشت داده و پس از گذشت زمان لازم، شمارش کلنی انجام‌گرفته و MBC تعیین شد (Nccls, National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2000). جهت جلوگیری از وقوع احتمال خطا در کلیه مراحل کار، این آزمایش با سه تکرار انجام گرفت (15).
آزمایشات ضد باکتریایی در آب محیط آکواریوم: با در نظر گرفتن غلظتهای مختلف MBC نانوذره اکسیدروی، خواص ضد باکتریایی این ماده باگذشت زمان در دو مرحله شامل آکواریومهای دارای ماهیقرمز و آکواریومهای فاقد ماهی مورد ارزیابی قرارگرفت. پس از تعیین MBC نانوذره اکسیدروی، در مرحله اول سه تیمار شامل تیمار شاهد و دو تیمار با دو غلظت دو و چهار برابر MBC و به آب آکواریومهای حاوی ماهیقرمز اضافه شد و در 6 ساعت، روزهای1، 5، 10، 16، 21 و 28 اثر حداقل غلظت باکتریکشی نانوذره اکسید روی در مقایسه با گروه شاهد بررسی گردید، همچنین در مرحله دوم چهار تیمار شامل تیمار شاهد و سه تیمار با سه غلظت دو، چهار و هشت برابر MBC نانوذره اکسیدروی به آب آکواریومها فاقد ماهی اضافه شد و در طی روزهای 1، 3، 5، 7، 10، 15، 25 و 30 اثر حداقل غلظت باکتریکشی نانوذره اکسیدروی بررسی گردید، به‌طوری‌که در شرایط استریل بوسیله پیپت استریل از نزدیک بستر تیمارها نمونهبرداری شد. جهت تعیین بار باکتریایی آب رقتهای سریالی تهیه و از هر رقت 1/0 سیسی در محیط کشت جامد حاوی آگار به روش پورپلیت کشت گردید. دراین مطالعه محیط کشت نوترینت آگار برای مطالعه بار باکتریایی کل و نیز محیط کشت مککانکی آگار برای مطالعه جمعیت باکتریهای گرم منفی مورد استفاده قرارگرفت، پس از گذشت 48 ساعت از انکوباسیون پلیتها در انکوباتور، پلیتهایی که بین 30 تا 300 کلنی داشتند انتخاب و تعداد کلنی آنها شمارش شد. سپس برای هر نمونه، به‌منظور گزارش تراکم باکتریایی (CFU)، تعداد کلنیهای شمارش‌شده در پلیت، در ضریب و نسبت معکوس رقت مربوطه ضرب شده و نتیجه نهایی که بار باکتریایی موجود در یک میلیلیتر نمونه آب آکواریوم بود، حاصل گردید (Institute of Standard and Industrial Research of Iran, 2007).
تجزیه و تحلیل کلیه دادهها در محیط نرمافزار SPSS,18 و رسم نمودارها بااستفاده از نرمافزارExcel 2010 انجام گرفت. بااستفاده از آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه (ANOVA) مقایسه سطوح کلیه فاکتورها در بین تیمارهای مختلف و زمانهای نمونهگیری انجام شد و تفاوت معنیداری در بین میانگینها بااستفاده از آزمون چند دامنه دانکن (Duncan) به دست آمد.
نتایج
جهت بررسی ساختار کریستالی نانوذره اکسیدروی از روش XRD استفاده شد. نتایج حاصل از آنالیز پراش اشعه ایکس در شکل1 نشان داده شده است، شدت پیکها و عرض نسبتاً کم آنها نشاندهنده درجه بالای بلوری محصولات میباشد، به طوری که پیکها نشاندهنده ساختار هگزاگونال (ششوجهی) اکسیدروی و حالت کریستالی آن در شکل 1 میباشد.
شکل 1- تصویر XRD از نانوذره اکسیدروی
نتایج تعیین حداقل غلظت باکتریکشی (MBC) نانوذره اکسیدروی بر باکتریهای محیط آکواریوم، در جدول 1 آورده شده است. همانگونه که نشان داده‌شده است درروش رقتهای سریالی ماکرودایلوشن باکتریها تا رقت 4 لولهگذاری رشد یافت و غلظت 35/0 میکروگرم در میلیلیتر علیه باکتریهای موردمطالعه دارای حداقل غلظت باکتریکشی در جدول 1 محاسبه شد.
جدول1- نتایج مربوط به MBC و غلظتهای مورد استفاده برای مطالعه ضد باکتریایی نانوذره اکسیدروی
|
نمونه مورد بررسی |
MBC (میکروگرم در میلیلیتر) |
2 برابرMBC (میکروگرم در میلیلیتر) |
4 برابرMBC (میکروگرم در میلیلیتر) |
8 برابرMBC (میکروگرم در میلیلیتر) |
|
باکتریهای محیط آکواریوم |
35/0 |
7/0 |
4/1 |
8/2 |
فعالیت ضد باکتریایی نانوذره اکسیدروی بر بار باکتریایی آب محیط آکواریوم در طی زمان و غلظتهای مختلف نانوذره بررسی شد، جدول تغییرات بار باکتریایی (دادهها لگاریتمی و به‌صورت X+1 نرمال شدند) نسبت به زمان ترسیم شد. نتایج حاصل از آزمون دانکن سطوح مختلف حداقل غلظت باکتری کشی نانوذره اکسیدروی ازنظر تعداد کلنیهای رشد یافته در یک واحد میلیلیتر آب آکواریوم نشان داد.
با توجه به نتایج بار باکتریایی کل آب محیط آکواریوم در محیط حاوی ماهی بین تیمارهای شاهد، 2 برابر MBC و 4 برابر MBC باگذشت زمان تفاوت معنیداری مشاهده شد (05/0P<)، همچنین بیشترین روند کاهش بار باکتریایی کل در مواجهه با نانوذره اکسیدروی در غلظت 4 برابرMBC و بعد از 6 ساعت مشاهده شد. بااین‌حال در این غلظت از روز 5 روند افزایش بار باکتریایی مشاهده شد درحالی‌که در غلظت 2 برابرMBC روند کاهشی تا انتهای دوره ادامه پیدا کرد درحالی‌که در تیمار شاهد (فاقد نانوذره اکسیدروی) روند افزایش بار باکتریایی مشاهده شد (جدول2).
جدول2- مقادیر (میانگین ± انحراف معیار) تأثیر فعالیت ضد باکتریایی غلظتهای (2 و 4 برابر MBC) نانوذره اکسید روی در مدت 6 ساعت، 1، 28، 21 ،16، 10 ، 5 روز بر بار باکتریایی کل محیط آکواریوم دارای ماهی قرمز
|
غلظت نانوذره اکسید روی (میکروگرم در میلیلیتر) |
بار باکتریایی کل (CFU بر میلی لیتر) |
||||||
|
6 ساعت |
روز 1 |
روز 5 |
روز 10 |
روز 16 |
روز 21 |
روز 28 |
|
|
0 |
Aa06/0±42/4 |
Aab22/0±88/4 |
Aa09/0±98/4 |
Aa11/0±03/5 |
Aab13/0±48/5 |
Aa13/0±82/5 |
Aa01/0±98/5 |
|
2برابر MBC |
Bab05/0±67/1 |
Bbc22/0±85/1 |
Cc07/0±20/2 |
ABbc11/0±76/2 |
Bbc22/0±09/3 |
Bbc11/0±11/3 |
Ba05/0±97/3 |
|
4برابر MBC |
ABab09/0±08/1 |
ABa09/0±96/1 |
Babc03/0±45/2 |
Bbc50/0±66/3 |
Babc08/0±88/3 |
Bc22/0±16/4 |
Cabc13/0±58/4 |
حروف کوچکa,b,c نشاندهنده اختلاف معنادار بین غلظتهای مختلف نانوذره اکسیدروی(میکروگرم در میلیلیتر) با شاهد میباشد.
حروف بزرگ A,B,Cنشاندهنده اختلاف معنادار بین زمانهای مختلف با شاهد میباشد.
حروف کوچک و بزرگ با همدیگر نشاندهنده اختلاف معنادار غلظت نانوذره(میکروگرم در میلیلیتر) در زمانهای مختلف میباشد (0.05P<).
نتایج حاصل از خاصیت ضد باکتریایی نانوذره اکسیدروی در برابر باکتریهای گرم منفی محیط آکواریوم دارای ماهی قرمز. باتوجه به اینکه جمعیت غالب باکتریهای محیط آکواریوم، باکتریهای گرم منفی میباشند روند کاهش بار باکتریایی گرم منفی محیط آکواریوم در مواجهه با نانوذره اکسیدروی در هر دو غلظت 2 و 4 برابرMBC در مقایسه با شاهد اختلاف معنیداری داشت (0.05 P<)، و با افزایش غلظت نانوذره و گذشت زمان تأثیر فعالیت ضد باکتریایی نانوذره اکسیدروی تا روز 10 نسبت به کنترل کاهش‌یافته و از روز 16 فعالیت ضد باکتریایی اکسیدروی کاهش‌یافته و افزایش رشد باکتریها مشاهده گردید (جدول3).
جدول3- مقادیر (میانگین ± انحراف معیار) تأثیر فعالیت ضد باکتریایی غلظتهای (2و4 برابر MBC) نانوذره اکسید روی در مدت 6 ساعت، 1، 28،21،16،10،5روز بر بار باکتریایی گرم منفی محیط آکواریوم دارای ماهی قرمز
|
غلظت نانوذره اکسید روی (میکروگرم در میلیلیتر) |
بار باکتریایی گرم منفی (CFU بر میلی لیتر) |
||||||
|
6 ساعت |
روز 1 |
روز 5 |
روز 10 |
روز 16 |
روز 21 |
روز 28 |
|
|
0 |
Aa09/0±12/4 |
Ab04/0±35/4 |
Ac07/0±89/4 |
Ab09/0±08/5 |
Abc04/0±22/5 |
Ad02/0±14/5 |
Ac05/0±78/5 |
|
2برابر MBC |
Bab21/0±45/3 |
Bbc27/0±80/2 |
Cc00/0±00/2 |
Bc00/0±690/1 |
Babc15/0±36/2 |
Ba15/0±42/2 |
Bab11/0±58/2 |
|
4 برابر MBC |
Bab03/0±60/2 |
Bab49/0±35/2 |
Ba26/0±88/1 |
Bb00/0±00/1 |
Bb05/0±13/2 |
Bb50/0±14/2 |
Bab05/0±32/2 |
حروف کوچکa,b,c نشاندهنده اختلاف معنی‌دار بین غلظتهای مختلف نانوذره اکسیدروی(میکروگرم در میلیلیتر) با شاهد میباشد.
حروف بزرگ A,B,Cنشاندهنده اختلاف معنی‌دار بین زمانهای مختلف با شاهد میباشد.
حروف کوچک و بزرگ با همدیگر نشاندهنده اختلاف معنی‌دار غلظت نانوذره(میکروگرم در میلیلیتر) در زمانهای مختلف میباشد (0.05P<).
نتایج حاصل از خاصیت ضد باکتریایی نانوذره اکسیدروی در برابر باکتریهای محیط آکواریوم فاقد ماهی نشان‌دهنده‌ی وجود اختلاف معنیداری بین سطوح 2، 4 و 8 برابر حداقل غلظت باکتریکشی نانوذره اکسیدروی ازنظر تعداد کلنیهای رشد یافته در یک واحد میلیلیتر آب آکواریوم، در یک‌زمان مشخص در مقایسه با گروه شاهد بود (0.05 P<). باتوجه به جدول 4 روند کاهش بار باکتریایی کل در غلظتهای 2، 4 و 8 برابر MBC باگذشت زمان تا روز 7 مشاهده شد، این روند در غلظت 2 برابر MBC تا انتهای دوره ادامه یافت درحالی‌که در غلظت 4 و 8 برابر MBC فعالیت ضد باکتریایی نانوذره اکسیدروی نسبت به شاهد کاهش و بار باکتریایی کل محیط آکواریوم افزایش‌یافته است به‌طوری‌که در غلظت 8 برابر MBC این روند افزایش باشدت بیشتری مشاهده شد. در غلظت 8 برابر MBC اختلاف معنیداری نسبت به 2و 4 برابر کاهش بار باکتریایی مشاهده شد (0.05P<)، (جدول4).
جدول4- مقادیر (میانگین ± انحراف معیار) تأثیر فعالیت ضد باکتریایی غلظتهای (2و4 برابر MBC) نانوذره اکسیدروی در روزهای 1،3،5،7،10،15،25،30 تأثیر فعالیت ضد باکتریایی غلظتهای مختلف نانوذره اکسید روی باگذشت زمان‌بر بار باکتریایی کل محیط آکواریوم فاقد ماهی
|
غلظت نانوذره اکسید روی (میکروگرم در میلیلیتر) |
|
بار باکتریایی کل (CFU بر میلی لیتر) |
||||||
|
روز1 |
روز 3 |
روز 5 |
روز 7 |
روز 10 |
روز 15 |
روز 25 |
روز 30 |
|
|
0 |
Abc03/0±31/4 |
Aa14/0±57/4 |
Ade07/0±88/4 |
Acd04/0±12/4 |
Ab03/0±12/5 |
Acde06/0±24/5 |
Ade03/0±33/5 |
Ae07/0±54/5 |
|
2برابر MBC |
Ba10/0±88/3 |
Ba05/0±91/3 |
BCbc18/0±12/3 |
Bc42/0±60/2 |
Bbc43/0±04/3 |
Cb03/0±17/3 |
Cbc17/0±26/3 |
Cb06/0±37/3 |
|
4 برابر MBC |
Cab04/0±50/3 |
Cab02/0±76/3 |
Bb32/0±82/3 |
Bc25/0±66/2 |
Ba05/0±43/3 |
Bab03/0±65/3 |
Cab08/0±83/3 |
Cab10/0±67/3 |
|
8 برابر MBC |
Dd21/0±75/2 |
Dde06/0±69/2 |
Cde08/0±65/2 |
Be09/0±47/2 |
Bc09/0±03/3 |
BCb09/0±64/3 |
Ba06/0±93/3 |
Ba09/0±18/4 |
حروف کوچکa,b,c نشاندهنده اختلاف معنی‌دار بین غلظتهای مختلف نانوذره اکسیدروی(میکروگرم در میلیلیتر) با شاهد میباشد.
حروف بزرگ A,B,Cنشاندهنده اختلاف معنی‌دار بین زمانهای مختلف با شاهد میباشد.
حروف کوچک و بزرگ با همدیگر نشاندهنده اختلاف معنی‌دار غلظت نانوذره(میکروگرم در میلیلیتر) در زمانهای مختلف میباشد (0.05P<).
نتایج حاصل از خاصیت ضد باکتریایی نانوذره اکسیدروی در برابر باکتریهای گرم منفی محیط آکواریوم فاقد ماهی در جدول 5 نشاندهنده وجود اختلاف معنی‌دار در سطوح 2، 4 و 8 برابر حداقل غلظت باکتریکشی نانوذره اکسیدروی ازنظر تعداد کلنی رشد یافته در یک واحد میلیلیتر آب آکواریوم، در یک‌زمان مشخص با گروه شاهد بود (0.05P<). نانوذره اکسیدروی در برابر باکتریهای گرم منفی فعالیت ضد باکتریایی بسیار بالایی را نشان داد، به‌طوری‌که با افزایش غلظت این نانوذره از 2 برابرMBC به 4 و 8 برابرMBC روند کاهش بار باکتریایی در روز 10 مشاهده شد، همچنین باگذشت زمان این خاصیت افزایش یافت، به‌طوری‌که در انتهای دوره، محیط آکواریوم فاقد بار باکتریایی گرم منفی شد (جدول5).
جدول5- مقادیر (میانگین ± انحراف معیار) تأثیر فعالیت ضد باکتریایی غلظتهای (2و4 برابر MBC) نانوذره اکسید روی در مدت تأثیر فعالیت ضد باکتریایی غلظتهای مختلف نانوذره اکسید روی باگذشت زمان‌بر بار باکتریایی گرم منفی محیط آکواریوم فاقد ماهی
|
غلظت نانوذره اکسید روی (میکروگرم در میلیلیتر) |
|
بار باکتریایی گرم منفی (CFU بر میلی لیتر) |
||||||
|
روز1 |
روز 3 |
روز 5 |
روز 7 |
روز 10 |
روز 15 |
روز 25 |
روز 30 |
|
|
0 |
Aa07/0±06/4 |
Aab00/0±67/4 |
Abc09/0±17/5 |
Ad08/0±24/5 |
Acd22/0±12/5 |
Acd13/0±58/5 |
Ad18/0±2/5 |
Ad08/0±71/5 |
|
2برابر MBC |
Ba18/0±67/2 |
Bb03/0±30/2 |
BCc00/0±00/2 |
Bab21/0±75/1 |
Bc00/0±30/1 |
Bd00/0±00/0 |
Bd00/0±00/0 |
Bd00/0±00/0 |
|
4 برابر MBC |
Ba18/0±45/2 |
Bb00/0±02/2 |
Cc00/0±00/0 |
Cc00/0±00/0 |
Cc00/0±00/0 |
Bc00/0±00/0 |
Bc00/0±00/0 |
Bc00/0±00/0 |
|
8 برابر MBC |
C00/0±00/0 |
C00/0±00/0 |
C00/0±00/0 |
C00/0±00/0 |
C00/0±00/0 |
B00/0±00/0 |
B00/0±00/0 |
B00/0±00/0 |
حروف کوچکa,b,c نشاندهنده اختلاف معنی‌دار بین غلظتهای مختلف نانوذره اکسیدروی(میکروگرم در میلیلیتر) با شاهد میباشد.
حروف بزرگ A,B,Cنشاندهنده اختلاف معنی‌دار بین زمانهای مختلف با شاهد میباشد.
حروف کوچک و بزرگ با همدیگر نشاندهنده اختلاف معنی‌دار غلظت نانوذره(میکروگرم در میلیلیتر) در زمانهای مختلف میباشد (0.05P<).
بحث
باتوجه به استفاده گسترده از آنتیبیوتیکها در درمان عفونتها و حضور این مواد در محیطزیست باعث ایجاد مقاومت در باکتریهای بیماریزا، مشکلات زیستمحیطی و آسیب به طبیعت میشود، ازاین‌رو مواد جایگزین آنتیبیوتیکها در بهداشت آبزیان ضروری میباشد (21).
ترکیبات ضد باکتریایی دیگری نیز شناسایی‌شده که می‌توان به اثر عصاره‌ها، ترکیبات شیمیایی اشاره نمود. سیف زاده و خانی پور در سال 1394 بابررسی و مقایسه خواص ضد باکتریایی کاتچین، فرولیک اسید و عصاره دانه انگور بر باکتریهای عامل مسمومیت غذایی در میگوی پا سفید غربی پرورشی دریافتند که شمارش کلی باکتریها در نمونه‌های تیمار شده با کاتچین بیشترین مقدار و در نمونه‌های عمل‌آوری شده با عصاره دانه انگور کمترین مقدار بود (1).
باتوجه به پیشرفت فناوری نانو و کاربردهای مختلف آن در علوم جدید، جباری و همکاران در سال 1393 به بررسی تأثیر نانوذره کیتوسان در درمان سوختگی بر روی مدل موشی در روزهای 7، 14 و 28پرداخته و مشاهده نمودند که تعداد و کاهش قطر ضایعه نسبت به گروه کنترل معنی‌دار بود (2). نانوذرات نقش‌های دیگری نیز دارند که از آن جمله می‌توان به مطالعات فرانسیسکو و همکاران در سال 2008 حداقل غلظت باکتریکشی برای نانوذره اکسیدروی به‌صورت محلول 500 میکروگرم بر میلیلیتر تعیین شد در این مطالعه اندازه نانوذره مورداستفاده 500 نانومتر بود، باتوجه به استفاده گسترده از آنتیبیوتیکها در درمان عفونتها و حضور این مواد در محیطزیست باعث ایجاد مقاومت در باکتریهای بیماریزا، مشکلات زیستمحیطی و آسیب به طبیعت میشود، ازاین‌رو مواد جایگزین آنتیبیوتیکها در بهداشت آبزیان ضروری میباشد (6).
همچنین با توجه به مطالعات جونز، ری، رانجیت، مانا و همکاران در سال 2011 افزایش اندازه نانوذرات اکسیدروی باعث کاهش فعالیت باکتریکشی این مواد میشود. در تحقیق انجام‌شده حداقل غلظت باکتریکشی نانوذره اکسیدروی برای باکتریهای محیط آکواریوم 35/0 میکروگرم در میلیلیتر تعیین شد که این تفاوت میتواند به علت اندازه نانوذرات مورد استفاده، شرایط کشت و باکتریهای موجود در محیط آکواریوم باشد (18 و 11).
بر اساس مطالعات ابی، کارن، فرانجیتون، گلن و همکاران در سال 2008 حداقل غلظت باکتریکشی نانوذرات اکسید روی محلول، برای باکتری اشرشیا کلی 9/0 میکروگرم بر میلیلیتر بدست آمد درحالی‌که برای باکتریهای استافیلوکوکوس اورئوس، استافیلوکوکوس اپیدرمیس به ترتیب 225 و 1 میکروگرم بر میلیلیتر محاسبه شد (5).
دراین مطالعه نیز از نانوذره اکسیدروی به علت خاصیت ضد میکروبی جهت کاهش بار باکتریایی آب محیط آکواریوم استفاده شد، به‌طوری‌که با افزایش غلظت نانوذرات اکسیدروی، بار باکتریایی در مقایسه با گروه شاهد به‌سرعت کاهش یافت که بیانگر افزایش فعالیت باکتریکشی نانوذرات در غلظتهای بالاتر تا زمان 5 روز میباشد که در کلیه جداول و غلظت‌ها این کاهش بار باکتریایی نسبت به شاهد معنی‌دار است (0.05P<) (جدول های 2 و 5).
در مطالعه سوآوی و همکاران (2001) با بررسی خاصیت کشندگی محلول پودر آهک حرارت دیده بر باکتریهای استافیلوکوکوس اورئوس و اشریشیاکلی مشاهده کردند، رشد باکتریها در فواصل زمانی نمونهبرداری، دارای روند کاهشی ولی نوسان داشته، که علت این نوسان را رشد مجدد برخی باکتریها در طول دوره آزمایش بیان کردند که در این مطالعه هم نوسانات رشد باکتری در روزهای مختلف مشاهده گردید (13، 23 و 24).
در مطالعه حاضر خاصیت ضد باکتریایی نانوذره اکسیدروی در دو غلظت 2 و 4 برابر MBC این نانوذره در محیط آکواریوم دارای ماهیقرمز، برعلیه بار باکتریایی کل و بار باکتریایی گرم منفی انجام شد بیان داشتند، میزان مرگ باکتریها باافزایش زمان تماس و غلظت نانوذرات اکسیدروی در هر دو گروه باکتریهای گرم منفی و گرم مثبت افزایش مییابد که با نتایج مطالعه حاضر در خصوص خاصیت ضد باکتریایی نانوذره اکسیدروی در محیط آکواریوم دارای ماهی قرمز مطابقت دارد به‌طوری‌که با افزایش غلظت نانوذره و گذشت زمان در هر دو تیمار 2 و 4 برابر MBC نسبت به تیمار شاهد (فاقد نانوذره اکسیدروی) بار باکتریایی کل و بار باکتریایی گرم منفی تا روز 5 کاهش‌یافته است در روزهای بعدی این روند کاهش بار باکتریایی نوسان داشته و فقط در غلظت MBC2 نانوذره توانست اثر مهارکنندگی کم اما پایداری را باگذشت زمان‌بر بار باکتریایی کل ایجاد نماید (جدول های 5 و 2).
بر اساس مطالعات انجام‌شده بسیاری از باکتریهای محیط آکواریوم باکتریهای گرم منفی میباشند و اکثر عفونتهای باکتریایی توسط ارگانیسمهای گرم منفی ایجاد میشوند که شامل آئرو موناس هیدروفیلا، آئروموناس سالمونیسیدا، فلاوباکتریوم کولامنار (علت بیماری کلومناریس)، ویبریو و گونههای سودوموناس میباشند (UF/IFAS Fact Sheets FA-14 Aeromonas Infections, FA-31 Vibrio Infections of Fish and FA-11 Columnaris disease). استرپتوکوکوسها گروه بزرگی از باکتریهای گرم مثبت ایجادکننده بیماری در ماهیان میباشند (UF/IFAS Circular 57 Streptococcal Infections in Fish) (12، 14 و 19) براساس مطالعه حاضر، نانوذرات اکسیدروی بر باکتریهای گرم منفی محیط آکواریوم دارای ماهی خاصیت ضد باکتریایی بالاتری را نسبت به جمعیت باکتریهای کل نشان دادند.
تأثیر نانوذره اکسیدروی بر گونههای ویبریو به‌عنوان عامل بیماریزا در محیط آکواریوم توسط سارواس و همکاران در سال 2016 مطالعه شد، این نانو ذرات توانایی حذف آلودگی باکتریایی شامل گونههای ویبریو از آبهای بخش ساحلی خلیجفارس را دارا میباشند، به‌طوری‌که نانوذره اکسید روی در غلظتg/mL ϻ 6 تا 95% باکتریها را حذف میکند (14)، همچنین یاماموتو در سال 2001 با بررسی تأثیر سایز برفعالیت ضد باکتریایی اکسیدروی نشان داد، اکسیدروی در محدوده 100 نانومتر تا 8/0 میکرومتر فعالیت ضد باکتریایی مناسبی دارد و با افزایش غلظت آن بر باکتریهای اشریشیاکلی و استافیلوکوکوس اورئوس این فعالیت ضد باکتریایی افزایش مییابد (26 و 22). در مطالعه حاضر نیز به بررسی فعالیت ضد باکتریایی نانوذره اکسیدروی با ابعاد80 نانومتر و غلظتهای 2 و 4 برابر MBC پرداخته شد و مشاهده گردید که با افزایش غلظت نانوذره اکسید روی اثر ضد باکتریایی آن در محیط آکواریوم افزایش مییابد.
بر اساس نتایج، روند کاهش بار باکتریایی کل در غلظتهای 2، 4 و 8 برابر MBC باگذشت زمان تا روز 7 مشاهده شد، این روند در غلظت 2 برابر MBC تا انتهای دوره ادامه یافت در حالی که در غلظت 4 و 8 برابر MBC فعالیت ضد باکتریایی نانوذره اکسیدروی نسبت به شاهد کاهش و بار باکتریایی کل محیط آکواریوم افزایش‌یافته است به‌طوری‌که در غلظت 8 برابر MBC این روند افزایش باشدت بیشتری مشاهده شد البته این موضوع نمیتواند بیانگر رابطه خطی بین غلظت- خاصیت ضد میکروبی نانوذرات باشد زیرا در غلظتهای بالاتر احتمال ایجاد مقاومت و سازگاری در برخی سویه‌ها وجود دارد. اینکه در تحقیقات حسین زاده و همکاران در سال 2012 باکتری سودوموناس آئروژینوزوا در غلظت 2 برابر Minimum inhibitory concentration) MIC) مقاوم بود، این باکتری ازجمله باکتریهای گرم منفی بیماریزا در آبزیپروری میباشد (9). براساس نتایج تأثیر نانوذره اکسیدروی بر بار باکتریایی گرم منفی، این نانوذره فعالیت ضد باکتریایی بسیار بالایی را نسبت به جمعیت باکتریایی گرم منفی نشان میدهد، باتوجه به اینکه باکتریهای گرم مثبت دارای لایه پپتیدوگلیکان ضخیم میباشند، بنابراین دراین مطالعه تأثیر باکتریکشی نانوذره اکسیدروی اثر بیشتری بر باکتریهای گرم منفی نسبت باکتریهای گرم مثبت نشان داد که به مکانیزم اثر اکسیدروی و تأثیرگذاری بیشتر بر غشاءسلولی اشاره دارد (17). آزمایشهای باکتری‌شناسی جهت تشخیص عوامل بیماریزای موجود درنتیجه آلودگی در آب میباشد. باکتریهای ایجادکننده آلودگی آب شامل استرپتوکوکوس فکالیس و کلستردیوم پرفرژنز، همچنین باسیلهای گرم منفی شامل اشریشیاکلی و انتروباکترآئروژنز میباشند (18، 19 و 20).
با توجه به مطالعات حسین زاده و همکاران 2012 میزان کاهش جمعیت باکتری اشریشیاکلی به‌عنوان یک باکتری گرم منفی، در طی زمان با سرعت بالاتری در غلظت 2 برابرMIC صورت گرفت. همچنین زانگ در سال 2009 رفتار ضد باکتری نانوذره اکسیدروی در زمانهای ذخیره‌سازی متفاوت (1، 90 و120 روز) بررسی کردند و روند کاهش در جمعیت باکتری اشریشیاکلی پس از 1 روز ذخیره‌سازی در غلظت 2 برابر MIC مشاهده شد (21)، در حالی که در روزهای 90 و 120 کاهش جمعیت باکتریایی با سرعت بیشتری انجام شد، همچنین در غلظت 10 گرم در لیتر نانوکلوئید در زمانهای 90 و 120 روز، 100 درصد رشد باکتریها مهار شدند که با نتایج مطالعه حاضر مبتنی بر کاهش جمعیت باکتریایی گرم منفی و جمعیت باکتریایی کل در غلظت 2 برابرMBC مطابقت داشت. در خصوص اثر زمان در این مطالعه چون از کلوئید اکسیدروی استفاده‌شده که در این کار سنتزشده استفاده گردید و ویژگی کلوئید داشتن 100 درصد ماده فعال دارویی است در غلظت بسیار پایین 4/1 میکروگرم بر میلیلیتر سبب مهار گردیده ولی به دلیل خاصیت رسوبی ذرات کلوئیدی باگذشت زمان خاصیت ضد میکروبی کاهش‌یافته بود.
با توجه خاصیت ضد باکتریایی نانوذرات اکسیدروی، این ماده میتواند در غلظت 4/1 میکروگرم بر میلیلیتر و هر 5 روز یک‌بار به محیط آکواریوم، جهت ضدعفونی و مهار رشد بار باکتریایی آکواریوم استفاده گردد و میتواند در کنترل سلامت ماهیان بخصوص کنترل جمعیت باکتریهای فرصت‌طلب و بیماریزای محیط آکواریوم باشد.
تشکر و قدردانی
از کمکهای کارشناسان آزمایشگاه گروه تکثیر و پرورش آبزیان کمال تشکر میگردد، همچنین به جهت حمایت مالی از جانب معاونت علمی و فناوری ریاست جمهوری (ستاد ویژه توسعه فناوری نانو) سپاسگزاری میگردد.
(علمی)', './data/animal/coversheet/981530719745.jpg'))
دوره 31، شماره 2
شهریور 1397صفحه 178-188
- تاریخ دریافت: 01 بهمن 1395
- تاریخ بازنگری: 26 خرداد 1396
- تاریخ پذیرش: 29 شهریور 1396