نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه خلیج فارس
2 گروه شیلات، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه خلیج فارس، بوشهر، ایران
3 گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه خلیج فارس، بوشهر، ایران
چکیده
اثرات نانوذرات سولفات منگنز (MnSo4) جیره بر فعالیت آنزیمهای گوارشی، پاسخ ایمنی غیراختصاصی و ترکیبات شیمیایی بدن ماهی قزلآلای رنگینکمان (Oncorhynchus mykiss) مورد بررسی قرار گرفت. تعداد 400 قطعه بچه ماهی قزلآلای رنگینکمان با میانگین وزن اولیه 1/0±8/0 گرم در قالب طرح کاملا تصادفی در 4 تیمار با 3 تکرار درون آکواریوم ها تقسیم شدند. ماهیان مورد آزمایش با جیرههای مختلف شامل جیره شاهد (فاقد منگنز)، جیره حاوی منگنز غیرنانو (Mn-M)، جیره حاوی نانو منگنز با میزان 10 mg/kg (Mn-N10)، جیره حاوی نانو منگنز با میزان 15mg/kg (Mn-N15) به مدت 6 هفته تغذیه شدند. نتایج نشان داد میانگین وزن نهایی بچه ماهیان تغذیه شده با جیره شاهد (فاقد منگنز) در مقایسه با گروههای تغذیه شده با جیره های حاوی نانو منگنز به طور معنیداری کمتر است (P<0.05). فعالیت لیزوزیم پلاسمای بچه ماهیان تغذیه شده با جیره های حاوی نانو منگنز نسبت به بچه ماهیان تغذیه شده با جیره شاهد به طور معنی داری بالاتر بود (P<0.05). فعالیت کمپلمان در تیمار Mn-M نسبت به تیمار شاهد به طور معنی داری بالاتر بود (P<0.05). میزان پروتئین خام لاشه بچه ماهیان تغذیه شده با جیرههای حاوی منگنز (به شکل نانوذره و غیرنانو) نسبت به گروه شاهد به طور معنیداری بیشتر به دست آمد (P>0.05). فعالیت آنزیمهای گوارشی بچه ماهیان مورد مطالعه اختلاف آماری معنیداری نشان نداند (P>0.05). در مجموع نتایج این مطالعه نشان داد نانو ذرات منگنز به جیره تاثیر معنیداری بر فعالیت آنزیمهای گوارشی ماهی قزلآلای رنگین کمان ندارد، اما برخی از پاسخ های ایمنی این گونه را تحت تاثیر قرار میدهد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Nonspecific immune responses, activity of digestive enzymes and body composition of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) fed diets containing manganese sulfate nanoparticles
نویسندگان [English]
2 Department of Fisheries, Faculty of Agriculture and Natural Resources, Persian Gulf University, Bushehr
3 Department of Animal Husbandry, Faculty of Agriculture and Natural Resources, Persian Gulf University, Bushehr
چکیده [English]
The effects of dietary Manganese sulfate nanoparticles on digestive enzyme activity and non-specific immune responses for rainbow trout, (Oncorhynchus mykiss) juveniles were determined. Four-hundred rainbow trout (with an initial average weight of 0.8±0.1 g) were randomly distributed into four treatments, with three replicates and fed with four diets including a control diet (without manganese), Mn-M (containing manganese sulfate), Mn-N10 (containing 10 mg/kg manganese nanoparticles), Mn-N15 (containing 15 mg/kg manganese nanoparticles) for six weeks. At the end of the experiment, the average weight of fry fed the control diet (without manganese) was lower than other treatments and was significantly different compared to the groups fed diets containing manganese sulfate nanoparticles (P<0.05). The crude protein in juveniles fed diets containing manganese was significantly higher compared to the control group (P<0.05). Amylase, lipase and protease activity did not show statistically significant differences (P> 0.05). Plasma lysozyme activity of fish fed with Mn-N10 and Mn-N15 were significantly higher than fish fed control diet (P<0.05). Plasma complement activity was significantly higher in Mn-M compared to control treatment (P <0.05) but did not show significant difference with other treatments (P> 0.05). The results obtained in this study revealed that inclusion of manganese nanoparticles has no significant impact on activities of digestive enzymes in rainbow trout, but influences some immune responses of this spices.
کلیدواژهها [English]
پاسخهای ایمنی غیراختصاصی، فعالیت آنزیمهای گوارشی و ترکیبات شیمیایی بدن ماهی قزلآلای رنگینکمان (Oncorhynchus mykiss) تغذیهشده با جیرههای حاوی نانو ذرات سولفات منگنز
ابراهیم ستوده1،2*، افسانه امیری بهروسی1، رعنا بهادری1، حسن حبیبی3 و سالم مرمضی3
1ایران، بوشهر، دانشگاه خلیجفارس، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، گروه شیلات
2ایران، بوشهر، دانشگاه خلیجفارس، دانشکده علوم و فنون دریایی، گروه شیلات
3ایران، بوشهر، دانشگاه خلیجفارس، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، گروه علوم دامی
تاریخ دریافت: 20/7/96 تاریخ پذیرش: 25/7/97
چکیده
در پژوهش حاضر اثرات نانو ذرات سولفات منگنز (MnSo4) جیره بر فعالیت آنزیمهای گوارشی، پاسخ ایمنی غیراختصاصی و ترکیبات شیمیایی بدن ماهی قزلآلای رنگینکمان (Oncorhynchus mykiss) موردبررسی قرارگرفت. تعداد 400 قطعه بچه ماهی قزلآلای رنگینکمان با میانگین وزن اولیه 1/0±8/0 گرم در قالب طرح کاملاً تصادفی در 4 تیمار با 3 تکرار درون آکواریومها تقسیم شدند. ماهیان مورد آزمایش با جیرههای مختلف شامل جیره شاهد (فاقد منگنز)، جیره حاوی منگنز غیر نانو (Mn-M)، جیره حاوی نانو منگنز با میزان 10 mg/kg (Mn-N10)، جیره حاوی نانو منگنز با میزان 15mg/kg (Mn-N15) به مدت 6 هفته تغذیه شدند. در پایان آزمایش شاخصهای رشد، پاسخهای ایمنی، فعالیت آنزیمهای گوارشی و ترکیبات شیمیایی لاشه ماهیان موردسنجش قرارگرفت. نتایج نشان داد میانگین وزن نهایی بچه ماهیان تغذیهشده با جیره شاهد (فاقد منگنز) در مقایسه با گروههای تغذیهشده با جیرههای حاوی نانو منگنز بهطور معنیداری کمتر است (05/0P<). فعالیت لیزوزیم پلاسمای بچه ماهیان تغذیهشده با جیرههای حاوی نانو منگنز (Mn-N10 و Mn-N15) نسبت به بچه ماهیان تغذیهشده با جیره شاهد بهطور معنیداری بالاتر بود (05/0P<). فعالیت کمپلمان پلاسما در تیمار Mn-M نسبت به تیمار شاهد بهطور معنیداری بالاتر بود (05/0P<) اما با سایر تیمارها اختلاف معنیداری نشان نداد (05/0P<). میزان پروتئین خام لاشه بچه ماهیان تغذیهشده با جیرههای حاوی منگنز (به شکل نانوذره و غیر نانو) نسبت به گروه شاهد بهطور معنیداری بیشتر به دست آمد (05/0P<). فعالیت آنزیمهای گوارشی آمیلاز، لیپاز و پروتئاز کل بچه ماهیان مورد مطالعه اختلاف آماری معنیداری نشان نداند (05/0P<). در مجموع نتایج این مطالعه نشان داد افزودن نانو ذرات منگنز به جیره تأثیر معنیداری بر فعالیت آنزیمهای گوارشی ماهی قزلآلای رنگینکمان ندارد، اما برخی از پاسخهای ایمنی اینگونه را تحت تأثیر قرار میدهد.
واژههای کلیدی: مکمل غذایی، نانوذره، تغذیه، لیزوزیم، کمپلمان، قزلآلای رنگینکمان
* نویسنده مسئول، تلفن: 09173740528 ، پست الکترونیکی: E.sotoudeh@pgu.ac.ir
مقدمه
باتوجه به افزایش روزافزون جمعیت و مصرف رو به رشد و محدودیت منابع غذایی، پروتئین موردنیاز سبد غذایی بهسختی در دسترس افراد قرار میگیرد. ازاینرو آبزیان بهعنوان غنیترین منابع پروتئینی در بین مواد غذایی مردم، اهمیت فوقالعادهای دارند (7). ماهی قزلآلای رنگینکمان (Oncorhynchus mykiss) یکی از عمدهترین ماهیان پرورشی در نقاط مختلف جهان شناخته شده است. از ویژگیهای بارز و مهم این ماهی، سازش خوب با شرایط پرورش متراکم است و از سرعت رشد خوبی نیز برخوردار میباشد (42). استفاده از غذا و ترکیبات مناسب اجزای جیره علاوه بر تأمین نیازهای اولیه میتواند موجب بهبود شرایط رشد، مقاومت در برابر شرایط نامناسب محیطی، کاهش تلفات، افزایش وزن و درنهایت افزایش تولید گردد. برای آنکه بتوان ماهی سالمی به بازار عرضه نمود، باید به نوع تغذیه کیفیت غذای مصرفی توجه بسیار کرد. در یک فرمول غذایی مناسب و کامل علاوه بر تأمین حداقل مواد مغذی لازم برای رشد ماهیان ازجمله پروتئین خام، چربی خام و کربوهیدراتها، جیرهی غذایی ماهیان باید حاوی افزودنیهایی برای افزایش سرعت رشد و کیفیت ماهیان نیز باشد.
مواد معدنی یکی از اجزای ضروری غذای مصرفی است که نقش مؤثری در سلامت و بسیاری از فعالیتهای فیزیولوژیک ماهیان پرورشی نظیر قزلآلای رنگینکمان دارند (16و25). بنابراین ضروری است که مقدار بهینه یک ماده معدنی باتوجه به کارکرد فیزیولوژیک آن مدنظر قرارگیرد (36). اصلیترین علت استفاده از عناصر کمیاب، افزایش رشد، کاهش مصرف غذا، افزایش تولید و بدست آوردن محصولی باکیفیت میباشد (25). منگنز یکی از مواد معدنی کممصرف است که دارای عملکرد کوفاکتوری در بسیاری از سیستمهای آنزیمی میباشد. این عنصر برای تنظیم کار دستگاه عصبی، رشد استخوان و تولیدمثل لازم است، همچنین در متابولیسم کربوهیدراتها نقش مؤثری داشته و نیز برای افزایش سلامتی ماهیها ضروری میباشد (2). کمبود منگنز سبب کاهش رشد، رشد غیرطبیعی بخش دمی و کوتاه شدن بدن در ماهی قزلآلای رنگینکمان و اختلال در تولیدمثل میشود. در مجموع کمبود این عنصر در ماهیان باعث بدشکلی و غیرطبیعی شدن استخوان و تأخیر در ساخت سلولهای خونی خواهد شد. منگنز بهعنوان یک متالوآنزیم و یک فعالکنندهی آنزیمی نقش دارد (22). علاوه براین منگنز یکی از اجزای ضروری آنزیم پیروات کربوکسیلاز بوده و بهعنوان یک کوفاکتور در فعالیت چندین سیستم آنزیمی مانند سوپراکسید دیسموتازها ضروری است (21).
نانو ذرات به ذراتی اطلاق میگردد که حداقل یکی از ابعاد آن در محدودهی 1-100 نانومتر باشد. استفاده از ذرات در مقیاس نانو موجب افزایش تأثیرگذاری ترکیبات در غلظتهای پایینتر به شکلی میگردد که میتوان در زمینههای تغذیه، کنترل بیماریها و کاهش اثرات زیستمحیطی فعالیتهای مرتبط با آبزیپروری استفاده نمود (5، 8، 15و 49) اندازه کوچک این ذرات میتواند به تغییرات اساسی در ساختار و خواص این عناصر منجر شود بهطوریکه تا به امروز صدها تولیدات جدید برای اهداف مختلف در زمینه فنآوری نانو ساخته شده است. ورود این فناوری به عرصه آبزیپروری و استفاده کاربردی از آن در بسیاری از کشورها گسترشیافته است. ازآنجاکه تبدیل مواد در ابعاد نانومتری موجب ایجاد یک سطح ویژه، فعالیت سطحی بالا با مراکز فعال فراوان و کارایی کاتالیزوری شدیدی میشود، در حال حاضر مطالعات متعددی در زمینه کاربرد نانوتکنولوژی در تغذیه حیوانات در حال انجام است. بنابراین نانو ذرات ازنظر شیمیایی و فیزیکی با مواد بزرگتر متفاوت هستند و رفتارهای نوین و جالبی را در تعامل با مواد زنده ایجاد میکنند. آنها قادر به عبور از موانع بیولوژیکی هستند (10)، بهسرعت توسط سلولها جذب میشوند و قابلیت دسترسی زیستی بالاتری نسبت به نمکهای معدنی دارند (10). در آبزیان بررسیهایی در زمینه اثرات تغذیهای ترکیبات نانوذره انجامشده است. پروچرو و همکاران (2002) به بررسی اثر نانو آهن بر پارامترهای زیستی ماهی کپور و ماهی خاویاری پرداختند (39). نتایج آنها نشان داد این مکملها باعث افزایش سنتز گلبولهای قرمز و هموگلوبین میشود و میزان مرگومیر را کاهش میدهد. بهرا و همکاران (2014) نیز طی تحقیقی از نانو آهن بهعنوان ماده افزودنی در غذای کپور هندی (Labeo rohita) استفاده نمودند و پارامترهای ایمنی و خونی این ماهی را موردبررسی قراردادند (8). آنها گزارش کردند فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی و میانگین وزن نهایی ماهیان تغذیهشده با نانوذره آهن بهبودیافته است. در ماهی قزلآلای رنگینکمان نیز اثر نانو ذراتی همچون طلا و نقره آهن و منگنز موردبررسی قرارگرفته است (1، 14، 28 و 33). در یک مطالعه اثرات سطوح مختلف نانوذره آهن (0، 15، 30، 45و 60 میلیگرم نانو ذرات آهن در هر کیلوگرم غذا) بهعنوان شکل جدیدی از ترکیب آهن بر برخی فاکتورهای رشد و تغذیه ماهی قزلآلای رنگینکمان موردبررسی قرارگرفت (18). محمدی و همکاران (2016) دریک بررسی مشابه اثرات نانو ذرات منگنز با شکل اکسید منگنز (Mn2O3) بهعنوان مکمل غذایی در جیره بچه ماهی قزلآلای رنگینکمان (Oncorhynchus mykiss) پرداختند (33). نتایج آنها نشان داد که استفاده از نانوذره اکسید منگنز (12 میلیگرم بر کیلوگرم جیره) موجب بهبود عملکرد شاخصهای رشد و شاخصهای خونی بچه ماهی قزلآلای رنگینکمان میگردد. در بیشتر تحقیقات صورت گرفته شکل نانو مواد معدنی اثرات مثبتی بر عملکرد رشد و سلامتی ماهی داشته است، بااینحال اطلاعات کافی در مورد اثرات بیوشیمیایی و فیزیولوژی این ترکیبات بر ماهی وجود ندارد. باتوجه به اهمیت مواد معدنی در جیره آبزیان و اینکه تاکنون اثرات تغذیهای نانو ذرات سولفات منگنز (MnSO4) موردبررسی قرارنگرفته است، این تحقیق بمنظور بررسی اثرات بهکارگیری نانو ذرات سولفات منگنز جیره و بررسی اثرات آن بر برخی از شاخصهای عملکرد رشد و فعالیت آنزیمهای گوارشی، پاسخهای ایمنی غیراختصاصی و ترکیبات شیمیایی بدن ماهی قزلآلای رنگینکمان انجامشده است.
مواد و روشها
تهیه بچه ماهی و تیماربندی: تعداد 400 قطعه ماهی قزلآلای رنگینکمان از مرکز ژنتیک و اصلاح نژاد ماهیان سردابی شهید مطهری یاسوج تهیه و پس از انتقال به سولهی آبزیان دانشکدهی کشاورزی دانشگاه خلیجفارس به مدت 2 هفته با شرایط آزمایش سازگار شدند. پس از گذشت دوره سازگاری، ماهیان با میانگین وزنی 1/0±8/0 گرم بهطور تصادفی در 12 آکواریوم 60 لیتری (20 قطعه در 38 لیتر) بهصورت کاملاً تصادفی تقسیم گردیدند. دراین طرح از چهار تیمار (جیره غذایی) با 3 تکرار در قالب طرح کاملاً تصادفی استفاده شد. تیمارهای مورداستفاده شامل تیمار شاهد (جیره فاقد منگنز)، تیمار Mn-m (جیره حاوی سولفات منگنز غیرنانو)، تیمار Mn-N10 (جیره حاوی 10 میلیگرم بر کیلوگرم نانو منگنز) و Mn-N15 (جیره حاوی 15 میلیگرم بر کیلوگرم نانو منگنز). غذادهی روزانه در 4 وعده در ساعات 8، 12، 16 و 20 به مدت 6 هفته تا حد سیری انجام گرفت. روزانه قبل از اولین وعده غذایی غذاهای خورده نشده و مدفوع ماهیان سیفون و از آکواریوم خارج میشد. شروع و پایان دوره روشنایی کارگاه به ترتیب 8 صبح و 8 بعدازظهر بود. درجه حرارت آب روزانه 2 بار بهوسیله دماسنج الکلی اندازهگیری شد. همه بچه ماهیان در هفته سوم آزمایش و در انتهای آزمایش (هفته ششم) مورد زیستسنجی قرارگرفتند. برای اندازهگیری وزن از ترازوی دیجیتال با دقت 1/0 گرم و برای اندازهگیری طول ماهی از خطکش با دقت 1 میلیمتر استفاده شد. در طول دوره میانگین درجه حرارت 1±8/14درجه سانتیگراد، اکسیژن 6/0±7/8، اسیدیته 5/0±4/7 و شوری کمتر از 1 قسمت در هزار بود.
آمادهسازی جیره غذایی مورد استفاده: ترکیبات اولیه غذایی از شرکت دراج بنیان دانش سیراف (بوشهر) تهیه و پس از آنالیز اقلام غذایی، جیرهها با استفاده از نرمافزار جیره نویسی لیندو فرموله شدند. اجزای خشک جیره قبل از ترکیب بهخوبی آسیاب شده و طبق جدول 1 توزین شده و بهصورت دستی باهم مخلوط شدند. نانوذره سولفات منگنز (MnSO4·H2O) مورد استفاده دراین تحقیق (با متوسط اندازه ذرات کمتر از 50 نانومتر. شرکت دانشبنیان احرار شرق، ایران، تبریز) تهیه گردید. نانوذرات سولفات منگنز و سایر ترکیبات معدنی براساس احتیاجات ماهی قزلآلای رنگینکمان (36) با ترازوی با دقت 001/0 گرم توزین و براساس طرح آزمایش چهار مخلوط ماده معدنی تهیه گردید. مخلوط حاوی mg/kg10 نانو ذرات سولفات منگنز (Mn-N10)، مخلوط حاوی mg/kg 15نانو ذرات سولفات منگنز (Mn-N15)، مخلوط حاوی 10 mg/kg سولفات منگنز غیرنانو (Mn-M) و یک مخلوط معدنی فاقد هرگونه منگنز (جیره شاهد) تهیه شد. پس از مخلوط کردن مواد خشک با دست، لیستین و روغن ماهی و روغن سویای خوراکی و آب گرم را افزوده و کاملاً با دست مخلوط گردید و مخلوط یکنواخت بدست آمده با کمک چرخگوشت بهصورت رشتههای با قطر 2 میلیمتر تهیه شد (40). رشتههای خشکشده به مدت 48 ساعت در دمای 50 درجه در آون نگهداری شد. غذاهای آماده شده در طول آزمایش در ظرفهای پلاستیکی درپوشدار قرار داده و تا زمان مصرف در فریزر 20- درجه سانتیگراد نگهداری شد.
جدول 1- ترکیبات اولیه جیرههای مورد استفاده برای تغذیه بچه ماهیان قزلآلای رنگینکمان (برحسب گرم بر کیلوگرم)
ترکیبات جیره |
تیمارهای آزمایشی مختلف |
|||
شاهد |
Mn-M |
Mn-N10 |
Mn-N15 |
|
پودر ماهی1 |
440 |
440 |
440 |
440 |
آرد سویا |
8/250 |
8/250 |
8/250 |
8/250 |
آرد گندم |
70 |
70 |
70 |
70 |
گلوتن گندم |
100 |
100 |
100 |
100 |
روغن ماهی1 |
9/46 |
9/46 |
9/46 |
9/46 |
لسیتین1 |
20 |
20 |
20 |
20 |
مواد معدنی |
10 |
10 |
10 |
10 |
ویتامین |
10 |
10 |
10 |
10 |
آنتیاکسیدان |
2/0 |
2/0 |
2/0 |
2/0 |
بایندر1 |
25 |
25 |
25 |
25 |
روغن سویا |
20 |
20 |
20 |
20 |
ترکیبات شیمیایی (درصد ماده خشک) |
||||
پروتئین خام |
5/46 |
4/46 |
5/46 |
3/46 |
چربی خام |
1/16 |
2/16 |
2/16 |
3/16 |
خاکستر |
6/9 |
9/8 |
3/9 |
1/9 |
NFE2 |
81/21 |
97/22 |
69/21 |
08/21 |
انرژی ناخالص (KJ/g)3 |
74/19 |
75/19 |
64/19 |
53/19 |
1- تهیهشده از کارخانه دراج بنیان دانش سیراف
2- (فیبر+خاکستر+چربی خام+پروتئین خام)- 100= عصاره عاری از ازت (NFE)
3- انرژی (ناخالص) کل در هر گرم جیره از طریق حاصلضرب مقدار انرژی موجود در هر گرم پروتئین ( kJ6/23)، چربی (kJ 5/39) و کربوهیدرات (kJ 2/17) تعیین گردید (36).
آنالیزهای شیمیایی: در پایان آزمایش و پس از 6 هفته تغذیه جهت اندازهگیری ترکیبات شیمیایی بدن، کل بدن بچه ماهیان (4 عدد بچه ماهی) بااستفاده از آسیاب برقی هموژن شد و فاکتورهای شیمیایی پروتئین خام، چربی خام، رطوبت و خاکستر به روش AOAC (6) مورد سنجش قرارگرفت. برای اندازهگیری رطوبت، 5 گرم از نمونهی گوشت ماهی همگن شده را در آون در دمای 105 درجهی سانتیگراد قرار داده تا نمونهها به وزن ثابت برسند. سپس میزان رطوبت برحسب درصد بیان شد. چربی خام به روش سوکسله (Soxtec 2050 ساخت کشور سوئد) و استخراج با حلال کلروفرم و میزان پروتئین خام کل به روش کلدال بااستفاده از دستگاه کجلدال اتوماتیک (Kjeltec Analyzer Unit 2300) با ضرب میزان نیتروژن بدست آمده در عدد 25/6 صورت گرفت. جهت اندازهگیری خاکستر نمونهها به مدت 5 ساعت در دمای 550 درجه سانتیگراد سوزانده شد.
سنجش فعالیت آنزیمهای گوارشی: در پایان آزمایش جهت بررسی فعالیت آنزیمهای گوارشی، غذادهی ماهیان یک روز قبل از انجام نمونهبرداری قطع شد (38). از هر تانک 3 ماهی بهصورت کاملاً تصادفی انتخاب و دستگاه گوارش آنها پس از جداسازی در فریزر 80- درجه سانتیگراد نگهداری شد. سپس جهت تهیه عصاره آنزیمی کل روده روی یخ جداسازی و با بافر 50 میلی مولار Tris-HCl، 20 میلی مولارCaCl2 و 50 میلی مولارKCl (5/8=pH) به نسبت 1 به 9 مخلوط و هموژن شده و سپس در دمای 4 درجه سانتی گراد با سرعت g30000 به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شدند (41). درنهایت سوپرناتانت حاصله جداسازی و تا زمان سنجش فعالیت آنزیمی در فریزر 80- درجه سانتیگراد نگهداری شد.
سنجش فعالیت آنزیم گوارشی لیپاز در بچه ماهیان قزلآلای رنگینکمان براساس روش ایجیما و همکاران (1998) با استفاده از پارا-نیتروفنیل مریستات بهعنوان سوبسترای اختصاصی انجام شد (19). میزان جذب نوری مخلوط واکنش در دستگاه اسپکتروفتومتر (PerkinElmer Lambda 25) در طولموج 405 نانومتر قرائت گردید. درنهایت فعالیت آنزیم لیپاز براساس U/mg protein محاسبه گردید.
مجموع فعالیت پروتئاز برطبق روش منتشرشده توسط آنسون (1938) (3) سنجش گردید. دراین روش کازئین بهعنوان سوبسترا استفاده شد. مخلوطهای واکنشی حاوی 1 میلیلیتر محلول کازئین 5/1 درصد با 7= pH در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار داده شد و پسازآن 1 میلیلیتر از یک سوپرناتانت به آن اضافه گردید. واکنش به مدت 10 دقیقه انکوبه شد و سپس 2 میلیلیتر اسید 4/0 مولار تری کلرواستیک به آن اضافه گردید. محلول فیلتر و 5/2 میلیلیتر Na2Co3 4/0 مولار و 5/0 میلیلیتر معرف فولین به آن اضافه شد. درنهایت میزان جذب نوری در طولموج 600 نانومتر اندازهگیری شد. پروتئین محلول کل توسط روش برادفورد (1976) با استفاده از آلبومین سرم گاوی بهعنوان استاندارد اندازهگیری گردید (9).
خونگیری و سنجش شاخصهای ایمنی: در انتهای آزمایش تعداد 5 قطعه ماهی از هر تکرار آزمایشی بمنظور بررسی فاکتورهای خونی توسط پودر گل میخک به میزان 250 قسمت در میلیون بیهوش و خون آنها با استفاده از سرنگ از ساقهی دمی گرفته و درون لولههای دربدار پلاستیکی حاوی هپارین ریخته شد. لولهها درون ظرف حاوی یخ به آزمایشگاه منتقل و در یخچال با دمای 4 درجهی سانتیگراد نگهداری شدند. سپس برای تهیه پلاسما نمونههای خون را در سانتریفیوژ در دمای 4 درجه سانتیگراد در دور 12000 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شده و پلاسمای تهیه شده تا زمان سنجش شاخصهای ایمنی در فریزر 80- درجه سانتیگراد نگهداری گردید. مقدار آلبومین پلاسما بااستفاده از کیت تشخیصی شرکت زیستشیمی (تهران، ایران) و با روش معرف برموکروزول گرین اندازهگیری شد. بهطور خلاصه این روش شامل واکنش آلبومین با برموکرزول گرین در شرایط اسیدی و تشکیل کمپلکس سبز مایل به آبی است که شدت رنگ آن متناسب با غلظت آلبومین موجود در نمونه است. سنجش میزان آلبومین پلاسما با استفاده از معادله زیر و برحسب گرم بر دسی لیتر محاسبه گردید.
گلوبولین(g/dl) = پروتئین کل - آلبومین
اندازهگیری فعالیت سیستم کمپلمان پلاسما با استفاده از روش الایزا غیرمستقیم (Indirect Elisa) و با بکارگیری کیت تجاری (Wielsa ®comple300 total complement functional screen kit, Sweden) انجام گرفت. کیتها با LPS (Bacterial lipopolysaccharides) باکتری Salmonela typhi (Sigma) پوشیده شده و جهت بررسی فعالیت سیستم کمپلمان از مسیر فرعی انتخاب گردیدند. 50 میکرولیتر از پلاسمای نمونه وارد کیت نموده و به مدت یک ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوباسیون صورت گرفت. بعد از شستشو با محلول بافر فسفات 05/0 درصد، به فاز جامد (پلیت) محلول آلکالین فسفاتاز متصل به آنتیبادی مونوکلونال C5b-9 افزوده و سپس به مدت 30 دقیقه دیگر انکوباسیون در دمای اتاق صورت گرفت. شستشوی نهائی با بافر فسفات صورت گرفته و به آن محلول سوبسترا اضافه گردید و برای 30 دقیقه دیگر هم انکوباسیون صورت گرفت. در نهایت میزان جذب در طولموج 405 نانومتر و با استفاده از دستگاه Elisa Reader قرائت شد.
فعالیت لیزوزیم پلاسما توسط روش کدورت سنجی بررسی شد (12). دراین روش فعالیت لایزوزیم (U/ml/min) با استفاده از نمودار استاندارد (لیزوزیم سفیده تخممرغ) تعیین شد. اساس این آزمایش تخریب لایه پپتیدوگلیکان باکتری M.lysodeikticusتوسط لایزوزیم پلاسما میباشد.
تجزیه و تحلیل آماری دادهها: نتایج مربوط به سنجش فاکتورهای مختلف بهصورت میانگین ± انحراف معیار (SD)، بیان شدهاند. اختلاف بین دادهها و مقایسه میانگین نمونهها در تیمارهای مختلف با آنالیز واریانس یکطرفه، در نرمافزار SPSS نسخه 18 بررسی شد و در صورت وجود اختلاف معنیدار بین گروهها از آزمون دانکن برای گروهبندی میانگینها استفاده شد، 05/0=alpha بهعنوان معیار معنیدار بودن نتایج تعیین شد. ترسیم نمودار در فضای نرمافزار Microsoft Excel، نسخه 2016 انجام گرفت.
نتایج
نمودار 1 میانگین اولیه، میانگین وزن بچه ماهیان در هفته سوم و میانگین وزن نهایی بچه ماهیان تغذیهشده با جیرههای آزمایشی را نشان میدهد. در هفته سوم آزمایش میانگین وزن بچه ماهیان تیمارهای مختلف اختلاف معنیداری نداشتند. اما در پایان دوره آزمایش میانگین وزن بچه ماهیان تغذیهشده با جیره شاهد (فاقد منگنز) نسبت به سایر تیمارها کمتر بود و این اختلاف در مقایسه با گروههای تغذیهشده با غذاهای حاوی نانوذره منگنز (Mn-N10 و Mn-N15) معنیدار بود (05/0P<). در طول دوره آزمایش هیچگونه مرگومیری مشاهده نشد و میزان بازماندگی در همه تیمارها 100 درصد بود.
آنالیز تقریبی لاشه در انتهای دوره پرورشی نشان داد میزان پروتئین ماهیان تیمارهای آزمایشی اختلاف معنیداری دارند (05/0P<). میزان پروتئین خام در بچه ماهیان تغذیهشده با جیرههای حاوی منگنز (به شکل نانوذره و غیرنانو) نسبت به گروه شاهد بهطور معنیداری بالاتر بود (05/0P<). میزان چربی، خاکستر و رطوبت لاشه بچه ماهیان در تیمارهای مختلف اختلاف معنیداری نشان نداد (05/0P<) (جدول 2).
نتایج مربوط به فعالیت آنزیمهای گوارشی ماهیان تیمارهای مورد مطالعه در پایان دوره در جدول 3 ارائهشده است. فعالیت آنزیمهای آمیلاز، لیپاز و پروتئاز کل بچه ماهیان مورد مطالعه اختلاف آماری معنیداری نشان نداند (05/0< P).
جدول 4 شاخصهای ایمنی بچه ماهیان قزلآلای رنگینکمان تغذیهشده با جیرههای مختلف را نشان میدهد.
نمودار 1- میانگین )3=n، نتایج براساس میانگین± انحراف معیار) وزن بچه ماهیان قزلآلای رنگینکمان در هفته سوم و انتهای دوره آزمایش. حروف متفاوت نشاندهنده اختلاف معنیدار بین تیمارها میباشند (05/0P<). Mn-C (جیره شاهد- فاقد منگنز)، Mn-M (جیره حاوی منگنز غیر نانو)، Mn-N10 (جیره حاوی نانو منگنز با میزان 10 mg/kg)، Mn-N15 (جیره حاوی نانو منگنز با میزان 15mg/kg )
جدول 2- میانگین و انحراف معیار (SD) پروتئین خام، چربی خام، خاکستر و رطوبت لاشه بچه ماهیان قزلآلای رنگینکمان )3=n، نتایج بر اساس میانگین± انحراف معیار)
رطوبت (%) |
خاکستر (%) |
چربی خام (%) |
پروتئین خام (%) |
تیمار |
1/0±53/73 |
2/0± 56/2 |
5/0±39/7 |
8/0± 51/13b |
شاهد |
1±43/73 |
0± 50/2 7/ |
8/1±73/7 |
4/0± 85/14a |
Mn-M |
4/1±83/71 |
4/0± 44/2 |
7/1±91/7 |
7/0± 75/14a |
Mn-N10 |
9/1±53/72 |
2/0±59/2 |
5/1±89/7 |
4/0± 10/15a |
Mn-N15 |
میانگینهای دارای علائم متفاوت در هر ستون ازنظر آماری دارای اختلاف معنیداری هستند (05/0P<)
جدول 3- میانگین و انحراف معیار (SD) فعالیت آنزیمهای گوارشی آمیلاز، لیپاز و پروتئاز بچه ماهیان قزلآلای رنگینکمان )3=n، نتایج بر اساس میانگین± انحراف معیار)
پروتئاز (U/ mg Pr) |
لیپاز (U/ mg Pr) |
آمیلاز (U/ mg Pr) |
تیمار |
1/0±14/1 |
0±022/0 |
3/0±13/1 |
شاهد |
2/0±12/1 |
0±020/0 |
8/10±11/1 |
Mn-M |
1/0±10/1 |
0±018/0 |
8/2±05/1 |
Mn-N10 |
2/0±17/1 |
0±023/0 |
4/6±06/1 |
Mn-N15 |
میانگینهای دارای علائم متفاوت در هر ستون ازنظر آماری دارای اختلاف معنیداری هستند(05/0P≤)
میزان پروتئین کل در بین هیچیک از تیمارهای آزمایشی با تیمار شاهد اختلاف معنیداری نشان نداد (05/0P>). در مورد میزان گلوبولین نیز اختلاف معنیداری میان تیمارها دیده نشد (05/0P>). بین میزان آلبومین در بچه ماهیان تیمار شاهد با تیمارهای حاوی 10 و 15 میلیگرم نانوذره منگنز اختلاف معنیداری مشاهده شد (05/0P<). علیرغم اینکه تفاوت معنیداری بین میزان آن در تیمار شاهد با تیمار حاوی 10 میلیگرم سولفات منگنز غیرنانو بدست نیامد (05/0P>). میزان لیزوزیم در تیمارهای آزمایشی یکروند افزایشی را با افزودن نانو ذرات سولفات منگنز در تیمارها نشان داد (جدول 3). بیشترین میزان لیزوزیم 9/2±50/85 در تیمار 15 و 10 میلیگرم نانو ذرات منگنز بدست آمد که به شکل معنیداری بیش از تیمار شاهد بود (05/0P<). بااینوجود تفاوت معنیداری در میزان لیزوزیم بین تیمار شاهد با تیمار حاوی سولفات منگنز بدست نیامد (05/0P>). بیشترین سطح فعالیت کمپلمان در سرم خون بچه ماهیان تغذیهشده با 12 میلیگرم سولفات منگنز به دست آمد که به شکل معنیداری بیشتر از تیمار شاهد بود (جدول 4). بااینوجود در میزان کمپلمان بچه ماهیان سایر تیمارها نسبت به گروه شاهد و گروه حاوی سولفات غیرنانو منگنز اختلاف معنیداری به دست نیامد (05/0P>).
جدول 4- میانگین و انحراف معیار (SD) شاخصهای خونی و ایمنی غیراختصاصی بچه ماهیان قزلآلای رنگینکمان )3=n، نتایج بر اساس میانگین± انحراف معیار)
کمپلمان (U/ml) |
لیزوزیم (U/ml/min) |
آلبومین (g/dl) |
گلوبولین (g/dl) |
پروتئین کل (g/dl) |
تیمار |
29±16/338b |
b2/3±33/71 |
b1/0±90/1 |
3/0±85/1 |
4/0±76/3 |
شاهد |
a7/12±33/398 |
ba1/9±30/79 |
b1/0±04/2 |
2/0±91/1 |
2/0±95/3 |
Mn-M |
ab2/40±66/372 |
a3/3±20/83 |
a1/0±53/2 |
6/0±61/1 |
5/0±14/4 |
Mn-N10 |
ab7/29±66/368 |
a9/2±50/85 |
a1/0±32/2 |
9/0±84/1 |
1±16/4 |
Mn-N15 |
میانگینهای دارای علائم متفاوت در هر ستون ازنظر آماری دارای اختلاف معنیداری هستند(05/0P≤)
بحث و نتیجهگیری
در فعالیت آبزیپروری میزان رشد آبزیان از مهمترین مسائل محسوب میشود، زیرا با افزایش رشد ماهی، مدت نگهداری آن و درنتیجه هزینه نگهداری کاهش مییابد. بعضی از عناصر غذایی محدودکننده رشد هستند و در صورت وجود آنها در جیره غذایی ماهی، میزان رشد هم افزایش مییابد.مواد معدنی مانند کبالت، مس، آهن، منگنز، سلنیوم، روی، کروم و ید و غیره برای فرآیندهای حیاتی عادی موردنیاز هستند و همه حیوانات ازجمله ماهی و سختپوستان به این عناصر معدنی نیاز دارند (44). یافتههای این پژوهش نشان داد که افزودن منگنز (غیرنانو یا نانوذره) بهعنوان یک ماده معدنی باعث بهبود عملکرد رشد ماهی قزلآلای رنگینکمان میشود. مطالعات گذشته نشان میدهند که افزودن مکمل منگنز در جیره رابطهی مثبتی با رشد ماهی دارد و برای رشد ماهیان آب شیرین و دریایی، مانند گربهماهی کانال(Ictalurus punctatus) (17)، قزلآلای رنگینکمان و کپور معمولی (37)، ماهی آزادماهی اقیانوس اطلس (Salmo salar) (30)، کپور طلایی (Carassius auratus gibelio) (38)، تیلاپیا (Oreochromis niloticus× O. aureus) (23)، هامور معمولی (Epinephelus coioides) (47)، گربهماهی زرد (Pelteobagrus fulvidraco) (43)، سوکلا (Rachycentron canadum) (24) و ماهی توربوت (Scophthalmus maximus) (29) ضروری است. در پایان آزمایش ماهیان تغذیه شده با جیره شاهد (فاقد منگنز) در مقایسه با سایر تیمارها بهویژه تیمارهای تغذیه شده با جیرههای نانو منگنز میانگین وزن نهایی پایینتری داشتند. در بین تیمارهای تغذیهشده با جیرههای حاوی منگنز، گروه تغذیه شده با جیره Mn-N10 بالاترین میانگین وزن نهایی را به خود اختصاص داد، هرچند این افزایش نسبت به گروه Mn-N15 و Mn-M معنیدار نبود. منگنز، مادهی غذایی است که وجود آن به مقدار کم برای تمام گونههای جانوری، ضروری است. همچنین کمبود منگنز سبب کاهش رشد، رشد غیرطبیعی بخش دمی و کوتاه شدن بدن در ماهی قزلآلای رنگینکمان و اختلال در تولیدمثل میشود. در مجموع کمبود این عنصر در ماهیان باعث بدشکلی و غیرطبیعی شدن استخوان و تأخیر در ساخت سلولهای خونی خواهد شد (23). این عنصر در سیستمهای آنزیمی نظیر سوپراکسید و آنزیمهای شرکتکننده در اکسایش آمینواسیدها، اسیدهای چرب و گلوکز شرکت مینماید. افزودن منگنز به جیره غذایی، سبب افزایش فعالیت و تنظیم متابولیسم کربوهیدراتها و برخی فعالیتهای آنزیمی میشود (2). منگنز بهعنوان یکی از مواد معدنی کمیاب در رشد و نمو آبزیان شناختهشده است. همچنین این ماده معدنی برای رشد ماهی قزلآلا و فعالیتهای متابولیک و بیولوژیک موجودات زنده ضروری است (38). پّن و همکاران (2008) در مطالعه خود نشان دادند افزودن (21/7 تا 17/22 میلیگرم در کیلوگرم) منگنز باعث افزایش رشد و میزان منگنز اسکلتی در کپور ماهی جوان (Carassius auratus gibelio) میگردد (38). همچنین در مطالعه محمدی و همکاران (2016) تأثیر نانوذره اکسید منگنز (Mn2O3) با مقدار 4، 8 و 12 میلیگرم در کیلوگرم بهعنوان مکمل معدنی غذایی بر عملکرد رشد و یاختههای خونی بچه ماهی قزلآلای رنگینکمان را بررسی کردند (33). نتایج آنها نشان داد اختلاف معنیداری در میزان افزایش وزن، ضریب رشد ویژه، نرخ کارایی پروتئین، و همچنین ضریب چاقی ماهیان بین تیمارهای مختلف وجود ندارد (05/0P>). عوامل مختلفی نظیر نوع نانوذره و اندازه آن، گونه پرورشی، مدتزمان آزمایش و همچنین مرحله زیستی مورد استفاده میتواند در تفاوت نتایج این مطالعه (شاخصهای رشد) با پژوهشهای یادشده مؤثر باشد.
بررسی نتایج آماری ترکیبات لاشهی بچه ماهیان قزلآلای رنگینکمان تغذیه شده با جیرههای حاوی نانوذره سولفات منگنز و سولفات منگنز غیرنانو در مدت 6 هفته نشان داد که بیشترین میزان پروتئین خام در بچه ماهیان تغذیه شده با تیمار حاوی 15 میلیگرم نانوذره منگنز مشاهده شد. سایر ترکیبات شیمیایی بدن مثل میزان خاکستر و رطوبت و چربی تفاوت معنیداری نشان ندادند. عاشوری و همکاران (2015) اثرات استفاده از سطوح مختلف نانو ذرات سلنیوم در رژیم غذایی بر عملکرد فاکتورهای رشد، ترکیب عضلانی، پروفیلهای بیوشیمیایی خون و وضعیت آنتیاکسیدانی کپور معمولی (Cyprinus carpio) موردبررسی قراردادند (5). نتایج حاصل از آنالیز ترکیبات عضلانی نشان داد که هیچگونه تفاوت معنیداری بین تیمارهای تغذیه شده با نانوذره سلنیوم و گروه شاهد وجود ندارد (05/0P>) که با نتایج پژوهش حاضر همخوانی دارد.
میزان فعالیت آنزیمهای گوارشی به فراسنجههای مختلفی همچون ویژگیهای ذاتی آنزیم، میزان تولید و ترشح آن وابسته است (46). بررسیهای نشان میدهد مکملهای مواد معدنی فعالیت آنزیمهای گوارشی ماهی را تحت تأثیر قرار میدهند (4، 20 و 34). دراین بررسی فعالیت آنزیمهای گوارشی ماهیان تیمارهای مختلف اختلاف معنیداری نشان نداد. برخلاف نتایج این مطالعه آسیکوتی و همکاران (2016) گزارش کردند فعالیت آنزیمهای گوارشی میگوی آب شیرین (Macrobrachium rosenbergii) تغذیه شده با جیرههای حاوی نانو ذرات اکسید منگنز نسبت بهطور معنیداری نسبت به سایر تیمارها بیشتر است (4). به نظر میرسد این تفاوت میتواند به دلیل متفاوت بودن نوع نانوذره استفادهشده در مطالعه مذکور و یا گونههای آبزی مورد آزمایش باشد.
در ماهیان سیستم ایمنی ذاتی یا غیراختصاصی یک مکانیسم دفاعی اساسی در برابر عوامل بیماریزا محسوب میشود. تقویت این سیستم برای ماهیان پرورشی بسیار ارزشمند است چراکه ماهیان در شرایط پرورشی به دلیل تراکم زیاد در برابر بسیاری از عوامل باکتریایی فرصتطلب آسیبپذیرند (11). یکی از فاکتورهای مورد بررسی بمنظور دستیابی به شرایط سیستم ایمنی، فعالیت لیزوزیم میباشد (31). لیزوزیم یک آنزیم تجزیهکننده قوی موجود در خون و بافتهای لنفوئید ماهیان است. این آنزیم دارای نقش زیادی در ایمنی ماهی بوده و یکی از مهمترین فاکتورها در مقاومت طبیعی ماهیان محسوب میشود (27). نقش لیزوزیم در عفونت بهعنوان آنتی باکتریال، حمله به دیواره سلولی باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی و تجزیه آنها و همچنین تحریک فاگوسیتوز میباشد (35). باتوجه به نتایج بهدستآمده دراین مطالعه میزان لیزوزیم در تیمارها با افزایش میزان منگنز یکروند افزایشی داشت و بیشترین میزان لیزوزیم در ماهیان تیمار حاوی 15 میلی گرم نانوذره منگنز مشاهده گردید. این افزایش میتواند نشاندهنده افزایش مقاومت ماهی در هنگام مواجهه با پاتوژن باشد. مطالعات اِل باسونی و همکاران (2017) در زمینه اثرات نانو ذرات مس و ویتامین C بر عملکرد رشد و پاسخ ایمنی ذاتی و مقاومت در برابر استرس در رژیم غذایی ماهی سی بریم (Pagrus major) با میزان 8/0، 10/0، 12/0، 8/2، 1/2 و 12/2 میلیگرم نانوذره مس بر کیلوگرم جیره نشان داد میزان لیزوزیم در جیرههای حاوی نانو ذرات مس یا رژیم دارای مکمل مس بطور قابلتوجهی نسبت به گروه شاهد بالاتر بود (05/0P<) (13)، که با نتایج این آزمایش همخوانی دارد. آلبومین پروتئینی است که در کبد سنتز میشود و اندازهگیری آن معیار قابلاطمینانی است که در جهت پیشبینی و تعیین شدت اختلالات کبدی به کار میرود. نتایج این بررسی نشان داد که بیشترین میزان آن به ترتیب در تیمارهای حاوی 10 و 15 میلیگرم نانوذره منگنز بوده است و اختلاف معنیداری با سایر تیمارها و تیمار شاهد نشان داد (05/0P<). سیستم کمپلمان نقش کلیدی در ایمنی غیراختصاصی داشته و در فاگوسیتوزیس، کموتاکسی و لیزسلولی دخالت دارد. افزایش مقادیر کمپلمان موجب افزایش فعالیت فاگوسیتوزی میشود. C3 ترکیب اصلی در آبشار کمپلمان است و در گروه پروتئینهای فاز حاد جای داشته و در فرآیندهای التهابی حاد بهشدت افزایش مییابد. عمدهی محل تولید C3 کبد است ولی در پستانداران مونوسیت – ماکروفاژ نیز از منابع مولد خارج کبدی آن هستند (32). میزان کمپلمان در ماهیان تغذیه شده با جیره حاوی سولفات غیرنانو منگنز بهطور معنیداری در مقایسه با تیمار شاهد بیشتر بود. ولی نسبت به ماهیان تغذیه شده با جیرههای حاوی نانو منگنز تفاوت معنیداری مشاهده نشد. تاکنون تحقیقی در زمینه اثرات نانو منگنز بر عملکرد سیستم ایمنی ماهیان انجامنشده است. منگنز جزء مهمی از متالوآنزیم منگنز سوپراکسیداز دیسموتاز (MnSOD) است. آنزیم MnSOD بهعنوان یک جمعآوریکننده رادیکالهای آزاد و جلوگیری کننده از بروز استرس اکسیداتیو، مهمترین آنزیم حاوی منگنز میباشد (26). آزمایشات انجامشده در ماهی نشان میدهد که فعالیت آنزیم MnSOD با مقادیر منگنز رژیم غذایی تنظیم میشود (23، 24 و 47). در نتیجه میتوان گفت احتمالاً بهبود فعالیت این آنزیم آنتیکسیدانی در ماهیان تغذیه شده با جیرههای حاوی منگنز غیرنانو و جیرههای حاوی نانو ذرات منگنز در مقایسه با جیره فاقد منگنز موجب بهبود شرایط تولید پروتئینهای سیستم کمپلمان در کبد گردیده است. مطالعه بهرا و همکاران (2014) نشان داد میزان کمپلمان کپور ماهی روهو
(Labeo rohita) تغذیه شده با جیرههای حاوی نانو ذرات آهن و سولفات آهن نسبت به گروه شاهد بهطور معنیداری افزایش یافت (8)، این نتایج با نتایج آزمایش حاضر همخوانی دارد. در سایر شاخصههای ایمنی غیراختصاصی مثل گلوبولین و پروتئین کل اختلاف معنیداری در تیمارهای مختلف با گروه شاهد مشاهده نگردید. بهطورکلی نتایج این مطالعه نشان داد گنجاندن نانوذرات منگنز تأثیر معنیداری بر ترکیبات شیمیایی بدن و فعالیت آنزیمهای گوارشی ماهی قزلآلای رنگینکمان ندارد، اما برخی از پاسخهای ایمنی اینگونه را تحت تأثیر قرار میدهد.
تشکر و قدردانی
از ریاست محترم شرکت دانش بنیان احرار شرق سرکار
خانم دکتر دیوبندی به دلیل فراهم نمودن نانو ذرات سولفات منگنز سپاسگزاریم. این تحقیق با حمایت مالی دانشگاه خلیجفارس انجامشده است.