نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه ارومیه. ارومیه
2 گروه زیستشناسی، دانشکده علوم، دانشگاه ارومیه،ارومیه،ایران
3 دانشکده دامپزشکی، دانشگاه ارومیه، ارومیه،ایران
چکیده
آسیب ناشی از تنش حرارتی در بیضهها یکی از علل ناباروری در مردان و اغلب پستانداران محسوب میشود. پپتیدهای زیست فعال فعالیت ضد اکسایشی قوی در برابر رادیکالهای آزاد و گونههای اکسیژن فعال دارند. در این مطالعه، 42 سر موش صحرایی نر بالغ به صورت تصادفی به6 گروه 7تایی شامل: گروه اول: شاهد (دمای 22 درجه سانتیگراد)، گروه دوم: پپتید زیست فعال ( 10 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن به صورت خوراکی، روزانه)، گروه سوم: تحت شوک حرارتی 43 درجه سانتیگراد، گروه های چهارم، پنجم و ششم تحت شوک حرارتی43 درجه سانتیگراد به همراه تیمار با پپتید زیست فعال با دوز 5 ، 10 و 20 میلی-گرم بر کیلوگرم وزن بدن به صورت خوراکی تقسیم شدند. بعد از اتمام دوره تیمار( 45روز)، بافت بیضه به منظور بررسیهای بافتشناسی و بیوشیمیایی جداسازی شد. آسیب شناسی بافتی، تخریب بافتی گستردهای را به دنبال القاء تنش حرارتی در بافت بیضه نشان داد. تنش حرارتی سبب افزایش معنیدار نیتریک اکساید گردید(P
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Effect of Sardine- drived (Sardinella sp.)Bioactive peptides on seminiferous tubules Following Heat Stress Induction in Mature Male Rat
نویسندگان [English]
1 urmia university.urmia
2 Department of Biology, Faculty of Sciences, Urmia University, Urmia, Iran
3 Department of Basic Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Urmia University, Urmia, Iran
چکیده [English]
Damage due to thermal stress in the testicles is one of the causes of infertility in men and most of the mammals. Bioactive peptides have potent antioxidant activity against free radicals and reactive oxygen species. In this study, animals were randomly categorized into 6 groups; group 1 served as a control(22 ◦C), group 2 was a bioactive peptide(10 mg kg-1 day, oral gavage, respectively) , group 3 was a heat-stressed (43 ◦C), groups 4,5 and 6 were heat-stressed(43 ◦C) along with bioactive peptides (5, 10 and 20 mg kg-1 day, oral gavage, respectively). After treatment (45 days), the testes were separated for histological and biochemical studies. Histopathological analysis revealed severe testicular damage following heat stress induction. Heat stress increased nitric oxide significantly(P
کلیدواژهها [English]
اثر پپتید زیست فعال مشتق از ماهی ساردین بر لولههای اسپرمساز متعاقب القاء تنش حرارتی در موش صحرایی نر بالغ
مهسا ولی زاده 1*، وحید نجاتی1، علی شالیزار جلالی2، ابراهیم حسین نجدگرامی1 و غلامرضا نجفی2
1 ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده علوم، گروه زیستشناسی
2 ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده دامپزشکی
تاریخ دریافت: 21/8/1399 تاریخ پذیرش: 9/9/1399
چکیده
آسیب ناشی از تنش حرارتی در بیضهها یکی از علل ناباروری در مردان و اغلب پستانداران محسوب میشود. پپتیدهای زیست فعال فعالیت ضد اکسایشی قوی در برابر رادیکالهای آزاد و گونههای اکسیژن فعال دارند. در این مطالعه، 42 سر موش صحرایی نر بالغ بهصورت تصادفی به6 گروه 7تایی شامل: گروه اول: شاهد (دمای 22 درجه سانتیگراد)، گروه دوم: پپتید زیست فعال (10 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن بهصورت خوراکی، روزانه)، گروه سوم: تحت شوک حرارتی 43 درجهسانتیگراد، گروههای چهارم، پنجم و ششم تحت شوک حرارتی43 درجه سانتیگراد به همراه تیمار با پپتید زیست فعال با دوز 5، 10 و 20 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن بهصورت خوراکی تقسیم شدند. بعد از اتمام دوره تیمار( 45روز)، بافت بیضه بهمنظور بررسیهای بافتشناسی و بیوشیمیایی جداسازی شد. آسیبشناسی بافتی، تخریب بافتی گستردهای را به دنبال القاء تنش حرارتی در بافت بیضه نشان داد. تنش حرارتی سبب افزایش معنیدار نیتریک اکساید گردید (05/0P<). در موشهای تحت تنش حرارتی درمان شده با پپتید زیست فعال دوز 5 و 10 میلیگرم بر کیلوگرم بهبودی مشاهده نشد. تیمار حیوانات با دوز 20 میلیگرم بر کیلوگرم آثار مثبتی بر اسپرماتوژنز و ساختار لولههای اسپرمساز نشان داد. نتایج بررسی میزان نیتریک اکساید،کاهش این فاکتور بیوشیمی را به دنبال تیمار با پپتید با دوز 20 میلیگرم بر کیلوگرم نشان داد (05/0P<). نتایج حاصل از این مطالعه آثار آنتیاکسیدانتی پپتید زیست فعال مشتق از ماهی ساردین را در شاخصهای بافتی و بیوشیمی بافت بیضه نشان داد.
واژههای کلیدی: تنش حرارتی، تنش اکسیداتیو، آنتیاکسیدانت، دستگاه تولیدمثلی نر،موش صحرایی
* نویسنده مسئول، تلفن: مهسا ولی زاده، 09033736645، پست الکترونیکی: mahsa_valizadeh20@yahoo.com
مقدمه
بهطورکلی، ناباروری در 15 درصد زوجین مشاهده میشود که در این میان باتوجه به نقش 40 درصدی ناشی از اختلالات مردان، اهمیت بررسی، شناسایی و اصلاح این اختلالات برای کمک به زوجین نابارور امری ضروری به نظر میرسد (33). در این راستا، امروزه مشخص شده است که بسیاری از عوامل ازجمله تنش اکسیداتیو (39)، تنش حرارتی (43) و تنش نیتروزاتیو (32) میتوانند منجر به ناباروری در مردان شوند. باتوجه به اینکه در زندگی امروزه بسیاری از عوامل داخلی و خارجی میتوانند موجب افزایش دمای بافت بیضه شده و روند اسپرماتوژنز طبیعی را برهم بزنند، تنش حرارتی بهعنوان یکی از مشکلات اصلی در باروری مردان مطرحشده و تلاش برای اصلاح آن همچنان ادامه دارد (16). اخیراً یک مطالعه اپیدمیولوژیک نشان داده است که دمای زیاد محیط اثرات مخربی بر بافت بیضه داشته و منجر به آپوپتوز سلولهای جنسی میشود (19). گرما علاوه بر اثرات منفی مختلف بر بافت بیضه، میزان رادیکالهای آزاد اکسیژن را نیز افزایش میدهد (47). تنش حرارتی و به دنبال آن القاء تنش اکسیداتیو در بافت بیضه و رابطه نزدیک بین این دو عامل در مطالعات مختلف بیان شده است (31) که در این راستا، مکانیسمهای مختلفی برای مقابله با آسیبهای ناشی از تنش گرمایی بر باروری مردان مورد استفاده قرارگرفته است. براساس گزارشات اخیر، اثرات مضر تنش حرارتی میتواند بصورت عمده ناشی از افزایش گونه های فعال اکسیژن (ROS) باشد که این گونههای فعال اکسیژن خود باعث پراکسیداسیون لیپیدی، دناچوره شدن پروتئینها و آسیب DNA میشوند (12و 24).
نیتریک اکساید (NO) بهعنوان مولکولی با فعالیت بالا، قابلانتشار و ناپایدار شناخته شده است که در ردههای سلولی مختلف تولید شده و عملکردهای مختلفی را بر عهده دارد. در همین راستا نشان دادهاند که این ماده بر فعالیت دستگاههای مختلف بدن ازجمله سیستمهای تولیدمثلی نر و ماده تأثیر گذاشته و همچنین نقش آن در آپوپتوز سلولهای زایا در بیضه بهخصوص در اسپرماتوسیتهای اولیه به اثبات رسیده است (52).
شواهد زیادی نشان میدهد که NO در مقادیر کم در انواع فرایندهای تولیدمثل مردان مانند اسپرماتوژنز، اسپرمیوژنز، حرکت، متابولیسم و ظرفیت اسپرم دخیل است (32) این در حالی است که همبستگی منفی بین سطح NO و تحرک اسپرم، مورفولوژی آن و قطعهقطعه شدن DNA گزارش شده است (44).
در حالت فیزیولوژیک، سیستم آنتیاکسیدانتی بدن با تکیه بر سد دفاعی آنتیاکسیدانتی خارجی و داخلی با تنش اکسیداتیو و اثرات ROS مقابله میکند، که آنتیاکسیدانتهای داخلی بدن ازجمله سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز و همچنین آنتیاکسیدانتهای آنزیمی بیرونی همانند توکوفرول و ویتامین C این نقش را ایفا میکنند (50). طبق گزارشات گذشته، ظرفیت تام آنتیاکسیدانتی نقش مهمی در غیرفعال کردن ROS دارد و درمانهای مختلف آنتیاکسیدانتی برای اندامهای مختلف ازجمله بیضه به کار میرود (14). علاوه بر این، عوامل آنتیاکسیدانتی بهعنوان روشهای درمانی برای مقابله با نارساییهای تولیدمثل ناشی از تنش اکسیداتیو معرفی شدهاند (10).
موجودات دریایی، تقریباً نیمی از کل تنوع زیستی دنیا را تشکیل داده و مخازن غنی از اجزای عملکردی ازجمله منبع غنی از پروتئین برای تولید پپتیدهای زیست فعال هستند (22). ماهیها بهعنوان منبعی از اسیدهای چرب غیراشباع، پلیساکاریدها، آنتیاکسیدانتها و پپتیدهای زیست فعال شناخته شدهاند (37). پپتیدهای زیست فعال همانند تری پپتیدهای به دست آمده از پروتئینهای ماهی ساردین (11)، مواد ارگانیک تشکیل شده از اسیدهای آمینه هستند که با پیوند کووالانسی (پیوندهای آمیدی یا پپتیدی) به هم متصل میشوند و بهعنوان قطعاتی از پروتئینهای خاص، تأثیر مثبتی بر عملکرد و شرایط بدن دارند (27). چرا که این مواد فعالیت هورمونی و دارویی از خود نشان میدهند و براساس نحوه عملکرد خود میتوانند بهعنوان ضد میکروب، ضد ترومبوتیک، ضد فشارخون، مواد افیونی، تعدیل کننده سیستم ایمنی بدن و آنتیاکسیدانت طبقهبندی شوند (9و 41). پپتیدهای زیست فعال، فعالیت ضد اکسایشی قوی در برابر رادیکالهای آزاد و سایر گونههای اکسیژن فعال دارند. مکانیسمی که پپتیدها از طریق آن اثرات ضد اکسایشی خود را ایفا میکنند بهطور کامل آشکار نشده است هرچند تحقیقات مختلف نشان میدهد که پپتیدها و پروتئینهای هیدرولیز شده با حذف رادیکالهای آزاد و شلاته کردن یونهای فلزی از اکسیداسیون آنزیمی و غیرآنزیمی ممانعت میکنند (13و 51). پتانسیل آنتیاکسیدانتی هیدرولیزهای پروتئینی بستگی به ترکیب آمینواسیدها و شکسته شدن ساختار سوم پروتئینهای والد به کمک آنزیمهای هیدرولیزی دارد که منجر به افزایش دسترسی به آمینواسیدهای با فعالیت آنتیاکسیدانتی میشود. بعضی از این ترکیبات، فعالیت فوقالعادهای را در پاکسازی رادیکالهای آزاد و غیرفعال کردن یون سوپراکسید دارا میباشند که نشان دهنده فعالیت آنتیاکسیدانتی بالای این پپتیدها میباشد (18).
باتوجه به اثرات بالقوه و متعدد پپتید زیست فعال مشتق از ماهی ساردین بهویژه اثرات آنتیاکسیدانتی آن، در مطالعه حاضر از این ماده جهت مقابله با اثرات زیانبار ناشی از تنش حرارتی استفاده گردید. در این راستا، بافت بیضهی موشهای صحرایی پس از پروسه القا تنش حرارتی و درمان با پپتید زیست فعال، ازنظر تغییرات لولههای اسپرمساز و بیوشیمیایی مورد ارزیابی قرارگرفت.
مواد و روشها
برای انجام این تحقیق، 42 سر موش صحرایی نر بالغ (20 180 گرم) از خانه حیوانات دانشکده علوم دانشگاه ارومیه تهیه شد. بهمنظور سازگاری حیوانات با شرایط محیطی، حیوانات در شرایط غذایی بدون محدودیت، تحت چرخه 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی و در دمای محیط 22 درجه سانتیگراد به مدت 14 روز قرارگرفتند. پپتید زیست فعال بکار برده شده در این مطالعه از تخمیر ماهی ساردین (Sardinella sp.) در کنار نمک تهیه گردید. بهمنظور استخراج پپتید مورد نظر، محلول تخمیر شده بهوسیله یک دستگاه خشککن انجمادی خشک گردید و با همزن الکتریکی، 1 قسمت پودر خشکشده با 5 قسمت آب مقطر در دمای 30 درجه سانتیگراد به مدت 1.5 ساعت در حمام آبی مخلوط شدند. سپس، مخلوط به دست آمده با دورg 10000 به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانترفیوژ گردید و محلول رویی بهمنظور به دست آوردن عصاره پپتیدی شفاف بهوسیله کاغذ واتمن فیلتر شد. در انتهای کار، عصاره پپتیدی بهوسیله خشککن انجمادی خشک گردیده و در دمای 18- درجه سانتیگراد نگهداری شد. برای ایجاد شوک حرارتی، در طول دوره تیمار (45 روز)، یکسوم قسمت تحتانی بدن در حمام آب گرم به مدت 20 دقیقه قرارگرفت. موشها بهصورت تصادفی به 6 گروه 7 تایی تقسیم شدند. گروه اول بهعنوان گروه شاهد روزانه 20 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 22 درجه سانتیگراد قرارگرفت، در حالیکه گروه دوم، گروه پپتید زیست فعال، روزانه 10 میلیگرم بر کیلوگرم پپتید زیست فعال بهصورت گاواژ دریافت کرد (3). گروه سوم، گروه تحت شوک حرارتی 43 درجه سانتیگراد روزانه به مدت 20 دقیقه در حمام آب گرم قرارگرفت. گروه چهارم، پنجم و ششم نیز یک ساعت بعد از القاء شوک حرارتی ( 43 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه در حمام آب گرم)، به ترتیب پپتید زیست فعال با دوز 5 میلیگرم بر کیلوگرم، 10 میلیگرم بر کیلوگرم و 20 میلیگرم بر کیلوگرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن بهصورت خوراکی( گاواژ) دریافت کردند. بعد از اتمام دوره تیمار 45 روزه، حیوانات بهمنظور بررسی میزان وزن بدن توزین شدند. موشها با زایلازین به میزان 10 میلیگرم به ازای هر کیلوگرم و کتامین به میزان 100 میلیگرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن بیهوش و سپس با جابجایی مهرههای گردنی کشته شدند. برای انجام بررسیهای بافتی و بیوشیمیایی، بیضهها از بدن حیوانات جداسازی شده و بعد از وزنکشی بیضهها، بیضه چپ برای تهیه مقاطع بافتشناسی به فرمالین 10 درصد و بیضه راست جهت اندازهگیری میزان NO بافتی، به فریزر 70- درجه سانتیگراد انتقال یافت. متعاقب 72 ساعت، بیضههای فیکس شده، پاساژ روتین بافتی شده و قالبهای پارافینه از آنها تهیه شد. در ادامه، برای بررسیهای بافتی، مقاطعی باضخامت 5 میکرون از قالبهای پارافینه تهیه و از رنگآمیزی هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) برای رنگآمیزی مقاطع بافتی استفاده شد. بهمنظور ارزیابی قطر لولههای اسپرمساز و ضخامت اپیتلیوم زایا بافت بیضه، 90 لوله اسپرمساز بهصورت تصادفی انتخاب شدند و قطر کوچک و قطر بزرگ لولهها با استفاده از عدسی مدرج چشمی اندازهگیری شد. پس از اندازهگیری، عدد حاصل در ضریب مخصوص که برای هر عدسی شیئی متفاوت است ضرب شد و اندازه نهایی برحسب میکرومتر محاسبه گردید. در ادامه، بهمنظور تعیین ضریب تمایز لولهای (TDI) درصد لولههای اسپرمسازی که بیشتر از سه ردهی سلولی اسپرماتوژنز تمایز یافته از سلولهای اسپرماتوگونی و سایر سلولهای رده اسپرماتوژنز داشتند بهعنوان لولههای TDI مثبت، محاسبه گردید (8). همچنین، درصد لولههای اسپرمسازمثبت (SPI) که در یک مرحله و در حال اسپرمیوژنز(مرحله 7 و 8 اسپرماتوژنز) بودند، ارزیابی گردید (25). در ادامه، بهمنظور محاسبه ضریب سلول سرتولی (SCI)، نسبت تعداد سلولهای زایا به تعداد سلولهای سرتولی مشخص گردید (36). بهمنظور محاسبه ضریب میوزی (MI) نسبت تعداد اسپرماتیدهای گرد به اسپرماتوسیتهای اولیه مشخص گردید (46).
سلولهای لیدیگ در بافت بینابینی و بهصورت گروهی دیده میشود. همچنین دارای هسته گرد و با موقعیت مرکزی به همراه یک یا دو هستک میباشند. برای شمارش این سلولها از عدسی مشبک چشمی استفاده شد و تعداد سلولهای لیدیگ در یک میلیمتر از بافت همبند بینابینی بیضه شمارش شد (49). برای ارزیابی بلوغ اسپرماتوژنز از مقایسه جانسن استفاده شد. بدین منظور از مقطع عرضی، 90 لوله اسپرمساز در هر نمونه استفاده شد و به هر لوله براساس فراسنجههای زیر نمره 1 تا 10 تعلق گرفت.
جدول 1- ارزیابی بلوغ اسپرماتوژنز با استفاده از ضریب جانسن
اسپرماتوژنز کامل |
10 |
اسپرم زیاد، حفره میانی نامنظم |
9 |
اسپرم خیلی کم |
8 |
لوله خالی از اسپرم، وجود اسپرماتید گرد زیاد |
7 |
اسپرماتید گرد کم |
6 |
تعداد زیاد اسپرماتوسیت اولیه |
5 |
تعداد کم اسپرماتوسیت اولیه |
4 |
فقط اسپرماتوگونی دیده میشود |
3 |
عدم وجود سلول زایا،حضور سلول سرتولی |
2 |
لولهها آتروفیک، عدم وجود سلول زایا و سرتولی(23). |
1 |
روشهای مختلفی برای اندازهگیری نیتریک اکساید (NO) در سیستمهای بیولوژیکی طراحی شده است که یکی از روشها شامل استفاده از واکنش دیونیزه کردن و تشخیص با اسپکتوفتومتری است که نیتریت تولید شده توسط اکسیداسیون NO تحت شرایط فیزیولوژیکی را میسنجد. برای اندازهگیری NO از کیت سنجش نیتریک اکساید (Navand salamat,Urmia,Iran) استفاده شد. مقایسه تمامی دادهها در بین گروهها توسط نرمافزار (SPSS (Version 24.00، آزمون ANOVAی یکطرفه و سپس آزمون Duncan صورت پذیرفت. تمامی دادهها براساس میانگین انحراف معیار بیان گردید و مقدار 05/0P< معنیدار در نظر گرفته شد.
نتایج
بررسیهای میانگین وزن بدن حیوانات در پایان مطالعه تفاوت معنیداری را در هیچیک از گروهها نشان نمیداد. این در حالی است که میانگین وزن بیضه، پس از اتمام تیمار در گروه تحت تنش حرارتی43 درجه سانتیگراد نسبت به گروه کنترل (01/0P<) و پپتید زیست فعال (05/0P<) نشان دهنده کاهش معنیداری بود (جدول 1). گروههای دریافتکننده پپتیدزیستفعال با دوز 5 و 10 میلیگرم بر کیلوگرم به همراه تنش حرارتی43 درجه سانتیگراد در مقایسه با گروه تنش حرارتی، اختلاف معنیداری (05/0P<) در وزن بیضه نداشتند اما نسبت به گروه کنترل کاهش معنیدار (05/0P<) را نشان دادند. در گروه 43 درجه سانتیگراد به همراه پپتید زیست فعال با دوز 20 میلیگرم بر کیلوگرم، وزن بیضه افزایش معنیداری (05/0P<) نسبت به گروه تنش حرارتی 43 درجه سانتیگراد و همچنین گروه کنترل داشت. نتایج حاصل از بررسی نسبت وزن بیضه بر کل وزن بدن، حاکی از کاهش معنادار (01/0P<) در گروه تنش حرارتی 43 درجه سانتیگراد در مقایسه با گروه کنترل است. گروههای تحت تنش حرارتی 43 درجه سانتیگراد+ دریافتکننده پپتید زیست فعال 5 و 10 میلیگرم بر کیلوگرم نیز کاهش معنیدار (05/0P<) را نسبت به گروه کنترل نشان میدهند. این در حالی است که، گروه تنش حرارتی 43 درجه سانتیگراد+ دوز 20 میلیگرم بر کیلوگرم پپتید زیست فعال توانست افزایش معنیداری (05/0P<) را در مقایسه با گروه تنش حرارتی ایجاد نماید. این گروه نیز نسبت به گروه کنترل اختلاف معنیداری را نشان داد (05/0P<) (جدول 1).
جدول2- تأثیر استرس حرارتی و پپتید زیست فعال بر وزن بدن و بیضه. مقدار بهصورت میانگین انحراف معیار بیان شده است. حروف نامشابه بیانگر اختلاف معنیدار در سطح (05/0P<) بین گروههای مختلف است.
(وزن بدن) BW: Body Weight (وزن بیضه) TW: Testis Weight
بررسیهای بافت بیضه نشان داد که ساختار لولههای اسپرمساز و اپیتلیوم زایا در گروههای کنترل دارای ساختار طبیعی است. در گروه پپتید زیست فعال نیز آسیب جزئی نسبت به گروه کنترل مشاهده شد. در بیضهی موشهای گروه تحت تنش حرارتی 43 درجه سانتیگراد، گروههای تنش حرارتی + پپتید با دوز 5 و 10 میلیگرم بر کیلوگرم، افزایش لولههای اسپرمساز آتروفی شده، کاهش ارتفاع اپیتلیوم زایا، واکوئوله شدن لولهها، التهاب تونیکا آلبوژینهآ، پرخونی عروق و ادم بافتی مشاهده گردید. کاهش ارتفاع اپیتلیوم زایا در گروه پپتید زیست فعال با دوز 10 میلیگرم بر کیلوگرم نیز دیده شد. در گروههای دریافت کننده پپتید زیست فعال دوز 5 و 10 میلیگرم بر کیلوگرم تحت تنش حرارتی به دلیل آسیب شدید بافتی، تغییر بارزی در جهت بهبودی دیده نشد. اما گروه تیمار شده با پپتید زیست فعال با دوز 20 میلیگرم بر کیلوگرم بعد از القای تنش حرارتی بهبودی معنیداری (05/0P<) را نسبت به گروه تنش حرارتی 43 درجه سانتیگراد نشان میدهد (شکل1).
در همین راستا، ارزیابیهای مورفومتریک اثبات کرد که قطر لولههای اسپرمساز و ضخامت اپیتلیوم زایا در گروه تنش حرارتی 43 درجه سانتیگراد و دو گروه 43 درجه سانتیگراد + پپتید زیست فعال با دو دوز 5 و 10 میلیگرم بر کیلوگرم کاهش معنیداری (05/0P<) نسبت به گروه کنترل دارند. گروه تنش حرارتی 43 درجه سانتیگراد درمان شده با پپتید زیست فعال با دوز 20 میلیگرم بر کیلوگرم افزایش معنیداری (05/0P<) در مقایسه با گروه تنش حرارتی 43 درجه سانتیگراد دارد. اختلاف بین گروه 43 درجه سانتیگراد + پپتید زیست فعال 20 میلیگرم بر کیلوگرم نسبت به گروه کنترل نیز معنیدار (05/0P<) بوده است. بررسی ضخامت اپیتلیوم در گروه پپتید زیست فعال نیز نسبت به گروه کنترل اختلاف معنیداری را نشان می دهد (05/0P<) (جدول 2).
شکل1- مقطع عرضی بافت بیضه در موش صحرایی نر. (رنگآمیزی هماتوکسیلین- ائوزین).گروه کنترل: ساختار طبیعی بافت بیضه را نشان میدهد، همچنین قطر لولههای اسپرمساز، ضخامت اپیتلیوم زایا و مقدار بافت همبند بینابینی طبیعی است. گروه پپتید( 10 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن): .Aضخامت اپیتلیوم زایا کاهش را نشان میدهد. گروههای 43 درجه سانتیگراد، 43 درجه سانتیگراد+ پپتید با دوز 5 و 10 میلیگرم بر کیلوگرم : .Bلولههای اسپرمساز آتروفی شده، .Cکاهش ارتفاع اپیتلیوم زایا، .Dواکوئوله شدن لولهها، .Eادم بافتی در این سه گروه مشاهده میشود. گروه 43 درجه سانتیگراد+ پپتید با دوز 20 میلیگرم بر کیلوگرم: ساختار بافتی طبیعی میباشد. ادم بینابینی کاهشیافته، فرایند اسپرماتوژنز نیز به حالت طبیعی بازگشته است. P.SPI: Positive SPI, N.SPI: Negative SPI, P.TDI: Positive TDI, N.TDI: Negative TDI
جدول3- تأثیر استرس حرارتی و پپتید زیست فعال بر پارامترهای مورفومتریک در موش صحرایی نر بالغ.مقدار بهصورت میانگین انحراف معیار بیان شده است. حروف نامشابه بیانگر اختلاف معنیدار در سطح (05/0P<) بین گروههای مختلف است
در بررسی ضریب تمایز لولهای مثبت، کاهش معنیداری (05/0P<) در تعداد لولههای با ضریب تمایزی مثبت در گروههای تنش حرارتی 43 درجه سانتیگراد، 43 درجه سانتیگراد+ پپتید زیست فعال با دوز 5 و 10 میلیگرم بر کیلوگرم در مقایسه با گروه کنترل مشاهده شد. بررسیها نشان داد که اختلاف معنیداری بین گروههای 43 درجه سانتیگراد + پپتید زیست فعال با دوز 5 و 10میلیگرم بر کیلوگرم با گروه تحت تنش 43درجه سانتیگراد وجود ندارد. اما اختلاف معنیداری (05/0P<) بین دو گروه 43 درجه سانتیگراد و 43 درجه سانتیگراد + پپتید زیست فعال با دوز 20 میلیگرم بر کیلوگرم دیده میشود. مابین دو گروه تنش حرارتی 43 درجه سانتیگراد+ پپتید زیست فعال با دوز 20 میلیگرم بر کیلوگرم با گروه کنترل نیز اختلاف معنیداری (05/0P<) مشاهده میشود( شکل2). یافتهها نشان داد که تنش حرارتی سبب افزایش درصد لولههایی با ضریب اسپرمیوژنز منفی و کاهش درصد لولههایی با ضریب مثبت گردیده است. نتایج حاصل نشان داد که ضریب اسپرمیوژنز در گروههای 43 درجه سانتیگراد، 43 درجه سانتیگراد دریافت کننده پپتید زیست فعال با دو دوز 5 و 10 میلیگرم بر کیلوگرم کاهش معنیداری (05/0P<) را نسبت به گروه کنترل دارند. این در حالی است که، گروههای 43 درجه سانتیگراد + پپتید زیست فعال با دوز 5 و 10 میلیگرم بر کیلوگرم اختلاف معنیدار نسبت به گروه تنش حرارتی 43 درجه را نشان نمیدهد. اما گروه 43 درجه سانتیگراد تیمار شده با پپتید زیست فعال با دوز 20 میلیگرم بر کیلوگرم افزایش معنیداری (05/0P<) را نسبت به گروه تحت تنش 43 درجه سانتیگراد نشان میدهد، همچنین این گروه اختلاف معنیداری را نسبت به گروه کنترل نشان میدهد (05/0P<) (شکل2). ضریب سلول سرتولی در گروههای تنش حرارتی43 درجه سانتیگراد، 43 درجه سانتیگراد+ پپتید زیست فعال با دو دوز 5 و 10 میلیگرم بر کیلوگرم کاهش معنیداری (05/0P<) در مقایسه با گروه کنترل نشان میدهند. در گروههای 43 درجه سانتیگراد + پپتید زیست فعال با دوز 5 و 10 اختلاف معنیداری (05/0P<) در ضریب سلول سرتولی نسبت به گروه تنش حرارتی مشاهده نشده است. در گروه 43 درجه سانتیگراد+ پپتید زیست فعال با دوز 20 میلیگرم بر کیلوگرم افزایش معنیداری (05/0P<) در ضریب سلول سرتولی نسبت به گروه تنش حرارتی مشاهده شد. این گروه اختلاف معنیداری را نسبت به گروه کنترل نیز نشان میدهد (05/0P<) (شکل2). نتایج حاصل از بررسی ضریب میوزی نشان میدهد که تنش حرارتی سبب کاهش معنیدار (05/0P<) ضریب میوزی در گروههای تحت تنش حرارتی 43 درجه سانتیگراد، 43 درجه سانتیگراد تیمار شده با پپتید زیست فعال با دو دوز 5 و 10 میلیگرم بر کیلوگرم نسبت به گروه کنترلشده است. مابین گروههای پپتید زیست فعال با دوز 5 و 10 میلیگرم بر کیلوگرم با گروه تنش حرارتی 43 درجه سانتیگراد اختلاف معنیداری (05/0P<) مشاهده نگردید. گروه 43 درجه سانتیگراد+ پپتید زیست فعال با دوز 20 میلیگرم بر کیلوگرم افزایش معنیداری (05/0P<) را نسبت به گروه 43 درجه سانتیگراد نشان میداد. گروه 43 درجه سانتیگراد تیمار شده با پپتید با دوز 20 میلیگرم بر کیلوگرم اختلاف معنیداری (05/0P<) را نسبت به گروه کنترل نشان میدهد (شکل2).
شکل 2- تأثیر استرس حرارتی و پپتید زیست فعال بر فعالیتهای اسپرماتوژنز
TDI: ضریب تمایز لولهای، SPI: ضریب اسپرمیوژنز، SCI: ضریب سلول سرتولی،MI: ضریب میوزی
مقدار بهصورت میانگین انحراف معیار بیان شده است. حروف نامشابه بیانگر اختلاف معنیدار در سطح (05/0P<) بین گروههای مختلف است.
نتایج حاصل از شمارش سلولهای زایا نشان داد که میانگین تعداد سلولهای اسپرماتوگونی، اسپرماتوسیت اولیه و اسپرماتید در یک میلیمتر مربع در گروههای 43 درجه سانتیگراد و 43 درجه سانتیگراد دریافت کننده پپتید زیست فعال با دو دوز 5 و 10 میلیگرم بر کیلوگرم کاهش معنیداری (05/0P<) را در مقایسه با گروه کنترل داشتند. بررسی ردههای سلولی گروه پپتید زیست فعال با دوز 20 میلیگرم بر کیلوگرم افزایش معنیداری (05/0P<) را نسبت به گروه تنش حرارتی نشان داد. مابین گروه 43درجه سانتیگراد+ پپتید 20 میلیگرم بر کیلوگرم با گروه کنترل نیز اختلاف معنیداری مشاهده شد (05/0P<). همچنین، میانگین تعداد سلولهای سرتولی در یک میلیمتر مربع در گروه تنش حرارتی 43 درجه سانتیگراد و گروههای تحت تنش 43 درجه سانتیگراد دریافت کننده پپتید زیست فعال با دو دوز 5 و 10 میلیگرم بر کیلوگرم نسبت به گروه کنترل کاهش معنیداری (05/0P<) را نشان داد. این در حالی است که در گروه تنش حرارتی + پپتید زیست فعال با دوز 20 میلیگرم بر کیلوگرم نسبت به گروه 43 درجه سانتیگراد اختلاف مشاهده میشود اما این اختلاف معنیدار نیست. گروه تحت تنش 43 درجه تیمار شده با پپتید 20 میلیگرم بر کیلوگرم نسبت به گروه کنترل اختلاف معنیدار را نشان میدهد (05/0P<). در بررسی میانگین تعداد سلولهای لیدیگ در گروه 43 درجه سانتیگراد و گروههای تحت تنش حرارتی + پپتید زیست فعال با دوز 5 و 10 میلیگرم بر کیلوگرم نسبت به گروه کنترل کاهش معنیدار (05/0P<) مشاهده گردید. گروه 43 درجه سانتیگراد+ پپتید زیست فعال با دوز 20 میلیگرم بر کیلوگرم افزایش معنیداری (05/0P<) نسبت به گروه تنش حرارتی نشان میدهد. اختلاف معنیداری (05/0P<) بین دو گروه تنش حرارتی 43 + پپتید زیست فعال با دوز 20 میلیگرم بر کیلوگرم و کنترل نیز وجود دارد ( جدول3).
جدول4- مقایسه میانگین تعداد سلولهای اسپرماتوژنیک، سرتولی و لیدیگ در گروههای مختلف آزمایشی
مقدار بهصورت میانگین انحراف معیار بیان شده است. حروف نامشابه بیانگر اختلاف معنیدار در سطح (05/0P<) بین گروههای مختلف است
نتایج مربوط به ارزیابی بلوغ اسپرماتوژنز با استفاده از شاخص جانسن مشخص نمود که در گروه تنش حرارتی 43 درجه سانتیگراد و گروههای تنش حرارتی 43 درجه سانتیگراد + پپتید زیست فعال با دوز 5 و 10 میلیگرم بر کیلوگرم کاهش معنیدار (05/0P<) در شاخص جانسن نسبت به گروه کنترل وجود دارد. در گروه تنش حرارتی + پپتید زیست فعال با دوز 20 میلیگرم بر کیلوگرم، افزایش معنیداری در (05/0P<) بهبود اسپرماتوژنز در مقایسه با گروه تنش حرارتی مشاهده گردید. اختلاف معنیدار (05/0P<) مابین دو گروه کنترل و تنش حرارتی 43 درجه درمان شده با دوز 20 میلیگرم بر کیلوگرم نیز مشاهده شد (شکل3).
شکل3- تأثیر استرس حرارتی و پپتید زیست فعال بر شاخص جانسن
مقدار بهصورت میانگین انحراف معیار بیان شده است. حروف نامشابه بیانگر اختلاف معنیدار در سطح (05/0P<) بین گروههای مختلف است.
بررسی بیوشیمیایی مربوط به سنتز نیتریک اکساید (NO) به دنبال القای تنش حرارتی نشان داد که حرارت 43 درجه سانتیگراد سبب افزایش معنیدار (05/0P<) سنتز نیتریک اکساید در مقایسه با گروه کنترل میشود. این کاهش معنیدار (05/0P<) در دو گروه تحت تنش حرارتی 43 درجه سانتیگراد درمان شده با پپتید با دو دوز 5 و 10 میلیگرم بر کیلوگرم نیز نسبت به گروه کنترل مشاهده میشود. تیمار با پپتید زیست فعال با دوز 5 و 10 میلیگرم بر کیلوگرم بعد از القای تنش حرارتی 43 درجه سانتیگراد، اختلاف معنیداری (05/0P<) را نسبت به گروه 43 درجه سانتیگراد نشان نمیداد. درحالیکه در گروه 43 درجه سانتیگراد+ پپتید زیست فعال با دوز 20 میلیگرم بر کیلوگرم کاهش معنیدار (05/0P<) در مقایسه با گروه تنش حرارتی مشاهده گردید. بین دو گروه تنش حرارتی 43 درجه سانتیگراد درمان شده با پپتید با دوز 20 میلیگرم بر کیلوگرم و گروه کنترل نیز اختلاف معنیداری (05/0P<) مشاهده شد (شکل4).
شکل4- تأثیر استرس حرارتی و پپتید زیست فعال بر میزان نیتریک
اکساید در موش صحرایی نر
مقدار بهصورت میانگین انحراف معیار بیان شده است. حروف نامشابه بیانگر اختلاف معنیدار در سطح (05/0P<) بین گروههای مختلف است
بحث و نتیجهگیری
دراین مطالعه کاهش چشمگیر وزن بیضه به دنبال القاء یک دوره 45 روزه تنش حرارتی در مقایسه با گروه کنترل مشاهده شد. این کاهش وزن و حجم بیضه به دلیل آپوپتوز در سلولهای جنسی حساس به دما با فعالیت میوزی بالا (31)، تنش اکسیداتیو و فعال شدن کاسپاز3 (عامل آپوپتوز)(29) اتفاق میافتد و این کاهش معنیدار وزن با مطالعات قبلی تأثیر تنش حرارتی در انسان و حیوانات در یکسو قرار دارد (20، 23، 26و 28). درمان با کورکومین (30) و ویتامین E (42) بهعنوان آنتیاکسیدانت موجب افزایش وزن بیضه و درنتیجه بیانگر نقش درمانی این دو ماده آنتیاکسیدانت در مقابله با تنش حرارتی بوده است. در مطالعه حاضر استفاده از پپتید زیست فعال نیز بهعنوان مادهای با خاصیت آنتیاکسیدانتی، افزایش معنیدار در وزن بیضه را در گروه دریافت کننده این ماده با دوز 20 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن نشان داد. در حالیکه تیمار حیوانات با دو دوز 5 و 10 میلیگرم بر کیلوگرم پپتید زیست فعال تأثیر مثبتی در جهت بهبودی نشان نداد. استفاده مستمر از پپتید زیست فعال استرس ریداکتیو را به دنبال دارد یکی از علل مشاهده آسیب در گروه پپتید زیست فعال است.
تکیه بر مطالعات پیشین نشان میدهد که، بافت بیضه یک سیستم بیولوژی متأثر از دما است که به دنبال افزایش دما تغییرات مورفولوژی و مولکولی زیادی در سلولهای جنسی آن اتفاق میافتد که باعث اختلال روند اسپرماتوژنز و درنتیجه آزواسپرمی میشود (15). همچنین، اخیراً یک مطالعه پژوهشی نشان داده است که بافت بیضه در بین حیوانات مختلف و سویههای متنوع یکگونه ازنظر حساسیت به دما، تفاوتهای قابلتوجهی دارد که به نظر میرسد به دلیل اختلاف در توانایی حیوانات در حفظ دمای بیضه و اختلاف در حساسیت سلولهای زایا در گونههای مختلف نسبت به تنش حرارتی باشد (42). بعلاوه، در مطالعات دیگر نشان داده شده است که بیشترین اثرات تنش حرارتی در اسپرماتوسیتهای اولیه در مرحله پاکیتن (4) و اسپرماتیدهای گرد اتفاق میافتد (42) که در صورت افزایش تنش سایر سلولها نیز مستعد مرگ هستند (29). با افزایش درجه حرارت، علاوه بر اسپرماتوسیت، اسپرماتید و اسپرم، اسپرماتوگونیها( مقاومترین رده سلولی) نیز تحت تأثیر قرار میگیرند (42). در مطالعه حاضر، القاء استرس حرارتی 43 درجه سانتیگراد به مدت 45 روز، موجب کاهش جمعیت سلولی اسپرماتوگونی بهصورت فعال و غیرفعال در اپیتلیوم لولههای منی ساز شد. بعلاوه، اکثر لولهها بهشدت آسیب دیده و تنها تعداد کمی از سلولهای بنیادی باقیمانده بود. در همین راستا، کانتر و همکاران نشان دادهاند که احتمالاً بیشتر سلولهای مرده در تنش حرارتی از طریق فاگوسیتوز توسط سلولهای سرتولی از بین میروند (23). در مطالعهای دیگر نشان داده شده است که کاهش چشمگیر در تعداد سلولهای رده اسپرماتوژنیک وابسته به دما بوده و با افزایش دما تا 43 درجه سانتیگراد، آتروفی اپیتلیوم جنسی، توقف کامل اسپرماتوژنز و از بین رفتن کامل اسپرماتید و اسپرم دیده میشود (17). با بررسی مورفولوژی لولههای اسپرمساز دراین مطالعه، تشکیل واکوئلها در لولههای اسپرمساز، سلولهای جنسی با هسته پیکنوزه (40)، تخریب پلهای سیتوپلاسمی بین سینسشیومها و در نتیجه تخریب سلولهای سالم کناری (40) آسیب به بافت بینابینی لولههای اسپرمساز (42)، بینظمی و سستی سلولهای اسپرماتوژنیک، کاهش سلولهای سرتولی و سلولهای لیدیگ (30)، خالی شدن لولههای اسپرمزا از انواع سلول و ناپدید شدن اسپرماتوسیتها، اسپرماتیدها (30)، توقف کامل اسپرماتوژنز (28) دیده شد. پژوهش حاضر همراستا با مطالعات پیشین نشانگر کاهش قابلتوجه قطر لولهها، کاهش ضخامت اپیتلیوم زایا در لولههای اسپرمساز بیضه است (23).
از طرفی، در مطالعه حاضر بررسی برشهای بافتی نشان داد که تنش حرارتی بهتنهایی موجب کاهش ضریب تمایز اسپرمیوژنز، میوزی، سلولهای سرتولی و شاخص جانسن میشود. این در حالی است که پپتید زیست فعال با دوز 20 میلیگرم بر کیلوگرم توانسته است به مقدار قابلتوجهی از این روند تخریبی جلوگیری نماید. در همین راستا، نشان داده شده است که مواد با خاصیت آنتیاکسیدانتی توانایی بسیار زیادی برای مقابله با تنش اکسیداتیو ناشی از حرارت داشته و با جلوگیری از پراکسیداسیون لیپیدی، آسیب پروتئینها و DNA در مقابل تنش حرارتی، سلولهای جنسی و در رأس آنها اسپرماتوگونیها را حفظ میکنند (38). باتوجه به اینکه، مطالعات پیشین خاصیت آنتیاکسیدانتی پپتیدهای استخراج شده از پروتئینهای ماهی را اثبات میکند (35)، پپتید زیست فعال استخراج شده از مارماهی با خاصیت آنتیاکسیدانتی، میتواند از اثرات تخریبی رادیکالهای آزاد در بافت بیضه جلوگیری کند. از طرفی، باتوجه به اینکه دو دوز پایین تجویز شده اثرات مثبتی را در جهت بهبودی شاخصهای بافتی نشان ندادند، مقایسه دوزهای مختلف پپیتد زیست فعال مشتق از ماهی ساردین دراین مطالعه نشان دهنده اثرات مثبت دوز 20 میلیگرم بر کیلوگرم این ماده به دلیل خاصیت آنتیاکسیدانتی بالا بر آسیبهای ناشی از تنش حرارتی بافت بیضه است. تنش گرمایی با افزایش ROS و سرکوب بیان ژنهای در ارتباط با مکانیسمهای دفاعی در برابر آسیب DNA، باعث آسیب DNA در سلولهای جنسی میشود. همچنین، نیتریک اکساید بهعنوان یکی از رادیکالهای آزاد به شمار میرود و از طرفی تنش حرارتی منجر به تنش اکسیداتیو شده و از طریق تولید رادیکالهای آزاد همانند NO, O2- و سایر گونههای فعال اکسیژن به سلولها و بافتها آسیب میرساند. آسیب DNA ناشی از تنش بر جنبههای مختلف باروری تأثیر میگذارد (26). افزایش میزان ROS عملکرد آنزیمهای آنتیاکسیدانتی را مهار یا بیان این آنزیمها را کاهش میدهد که ممکن است باعث افزایش تنش اکسیداتیو گردد (1، 2و 45). بررسیهای تنش حرارتی ناشی از واریکوسل افزایش چشمگیر پارامترهای تنش اکسیداتیو مانند ROS و پراکسیداسیون لیپیدی را نشان داده و در نتیجه بر باروری جنس نر تأثیر میگذارد (5). در سلولهای جنسی نر، غشای پلاسمایی سرشار از اسیدهای چرب غیراشباع میباشد که نسبت به ROS بسیار حساس هستند. MDA و NO محصولات حاصل از ROS هستند که برای بررسی میزان تنش اکسیداتیو بافت بیضه استفاده میشوند. افزایش میزان NO باعث القاء آپوپتوز در سلولهای جنسی میشود. بیان بیشاز اندازه NO و در نتیجه افزایش آپوپتوز به دنبال القاء کریپتورکیدیسم در آزمایشگاه در موشهای صحرایی مشاهده شد (48). اخیراً مشخص شده است که NO عملکردهای مختلفی را در سیستم تولیدمثلی جنس نر دارد. مکانیسم اصلی آسیب اسپرم ناشی از نیتریک اکساید، مهار تنفس میتوکندریایی و بیوسنتز DNA است. مقدار کم NO برای تحرک اسپرم و بقای آن ضرروی است. همچنین بر فعالیت اسپرم موش صحرایی نیز اثر میگذارد. در مقابل، افزایش میزان NO، تنفس میتوکندریایی اسپرم را مختل کرده و مانع تحرک اسپرم میشود. همچنین میزان کم NO درصد اسپرمهای ظرفیتپذیر و واکنش آکروزومی را افزایش داده و به تلقیح اسپرم و تخمک کمک میکند. اما اثرات مخرب NO نیز بر فعالیت اسپرم و فرایند لقاح به اثبات رسیده است (45). اثرات مضر NO توسط مولکولهای فعال بیولوژیکی تولید شده توسط واکنش NO با آنیون سوپراکسید و اسید پراکسی نیتروز ایجاد میشود و این ترکیبات آسیبهای بافتی مختلفی را ایجاد میکنند (7). NO جریان خون بیضهای را نیز کنترل میکند. یکی از مکانیسمهای آپوپتوزی وابسته به NO از طریق ایجاد اختلال در جریان Bax/Bcl-2 در میتوکندری و فعال شدن مسیر مرگ سلولی مربوط به سیتوکروم c و در نتیجه آپوپتوز سلولهای زایا است (21). در این مطالعه نیز سنتز NO به دنبال القای تنش حرارتی به مدت 45 روز افزایش را نشان میدهد. استفاده از پپتید زیست فعال استخراج شده از ماهی ساردین، به دنبال القاء تنش حرارتی کاهش نسبی سنتز NO را نشان میدهد. علیرغم اینکه انتظار میرود آنتیاکسیدانتها از آسیب اکسیداتیو جلوگیری کرده یا آن را بهطور بالقوه کاهش دهند، مصرف کنترل نشده آنها میتواند منجر به آسیب شود (47). علیرغم تأثیرات مثبت پپتیدهای زیست فعال در سطوح فیزیولوژیکی و سلامت بدن، اثرات منفی و مضر بالقوهی پپتیدهای زیست فعال همانند سمیت، آلرژیزایی و جهشزایی نیز به اثبات رسیده است (34). دراین پژوهش نیز استفاده مستمر پپتیدهای زیست فعال بر بافت بیضه اثر سوء نشان داده و منجر به آسیب به بافت بیضه و اختلال روند اسپرماتوژنز شده است. همچنین، بررسیهای پیشین در مورد مصرف آنتی اکسیدانتها بهتنهایی در موشهای صحرایی نشان داده است که وجود حد نرمالی از رادیکالهای آزاد اکسیژن برای عملکرد مناسب این بافت ضروری میباشد. این در حالی است استفاده از آنتیاکسیدانتها در شرایط نرمال خود بهتنهایی میتواند باعث بروز استرس ریداکیتو (Reductive Stress) شده و از عملکرد مناسب بافت بیضه جلوگیری نمایید (6و 38).
نتایج این پژوهش نشان داد که درمان موشهای تحت تنش حرارتی 43 درجه سانتیگراد به مدت 45 روز توسط پپتید زیست فعال با دوز 20 میلیگرم باعث بهبود آسیب بافت بیضه ناشی از تنش حرارتی میشود که این اثرات مثبت به دلیل خواص آنتی اکسیدانتی پپتید زیست فعال و توانایی این ماده در از بین بردن رادیکالهای آزاد تشکیل شده به دنبال ایجاد تنش اکسیداتیو است. درنتیجه استفاده از پپتید زیست فعال بهعنوان یک ماده درمانگر جهت بهبود شرایط ناشی از آسیبهای اکسیداتیو پیشنهاد میشود.
سپاسگزاری
از معاونت پژوهشی دانشگاه ارومیه برای تأمین هزینه این مطالعه تقدیر و تشکر میشود.